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スパイダーシルクの 局 所 構 造 に 関 する 安 定 同 位 体 ラベルモデルペプチドを 用 いた 固 体 NMR 構 造 解 析Structural analysis of the Gly-rich region in spider dragline silk using stable-isotope labeled sequential model peptidesand solid-state NMR東 京 農 工 大 学 工 学 府 生 命 工 学 専 攻 山 口 恵 理 香 、 山 内 一 夫 、 朝 倉 哲 郎Erika Yamaguchi, Kazuo Yamauchi and Tetsuo AsakuraDepartment of Biotechnology, Tokyo University of Agriculture and Technology, Tokyo, Japanウエストバージニア 大 学 化 学 科 Terry GullionDepartment of Chemistry, West Virginia University, Morgantown, USAAbstract:The secondary structure of the Gly-rich region of model peptides that mimic spider dragline silk was examined.Solid-state NMR experiments were performed in combination with selective stable-isotope labeling. Comparison of theREDOR distances found for the model peptides with the equilibrium structural distances determined from data in PDBsuggests that there is no dominant structure for the Gly-rich region of the peptides. We suggest that the lack of stronginteractions between the molecular chains in Gly-rich region lead to the moderate elasticity found in native dragline silks.Keywords: spider silk, stable-isotope labeled model peptide, solid-state NMRE-mail: asakura@cc.tuat.ac.jp【 緒 言 】クモの 牽 引 糸 (dragline silk) は、 鋼 鉄 線 を 超 える 強度 と 適 度 な 弾 性 を 持 つ 絹 である。 牽 引 糸 を 構 成 するタンパク 質 である MaSp1 (Major Ampullate Spidroin 1) は、Ala 連 鎖 領 域 と Gly リッチ 領 域 から 成 り、よく 保 存 されたモチーフが 繰 り 返 している。Ala 連 鎖 領 域 が 逆 平行 β-sheet 構 造 の 結 晶 であることは 明 らかにされているが、 非 晶 部 である Gly リッチ 領 域 に 関 しては 未 だ 議論 の 渦 中 にあり、random coil である、Gly-Gly-Xaa 配列 のほとんどが 3 1 -helix である、 一 部 β-turn を 形 成 している、など 様 々な 議 論 がなされている。これらは 全て、クモから 直 接 採 取 した 牽 引 糸 をサンプルとしているため、 多 様 な 一 次 構 造 が 平 均 化 された 構 造 情 報 として 得 られていることに 起 因 すると 考 えられる。そこで 本 研 究 では、アメリカジョロウグモ (Nephilaclavipes) の MaSp1 の 一 次 構 造 を 再 現 した、Ala 連 鎖 領域 と Gly リッチ 領 域 からなるモデルペプチドを 合 成 し、固 体 NMR の 特 徴 を 生 かして 構 造 解 析 を 行 うことによって、 本 問 題 を 明 らかにすることを 目 的 とした。その際 、モデルペプチドの N, C 端 に Glu 連 鎖 を 導 入 することで 水 溶 性 を 付 与 し、 天 然 の 牽 引 糸 に 近 い 環 境 下 で 構造 解 析 を 行 った。【 実 験 】一 連 のノンラベルおよび 安 定 同 位 体 ラベルモデルペプチドは、ラベル 部 位 を 変 えて F-moc 固 相 合 成 法 により合 成 した。 二 次 構 造 の 情 報 を 化 学 シフト 値 から 得 るために 13 C CP/MAS NMR の 測 定 を 行 い、さらに 13 C- 15 Nラベル 核 間 の 原 子 間 距 離 を 測 定 によって 決 定 した。【 結 果 および 考 察 】13 C CP/MAS NMR から、 今 回 合 成 した 一 連 のモデルペプチドは、pH 処 理 によって Ala 連 鎖 領 域 が α-helixから β-sheet へ 構 造 転 移 することがわかった。 一 方 、 選択 的 に 安 定 同 位 体 ラベルした 試 料 の 構 造 解 析 から、pH処 理 後 も β-sheet を 形 成 しない Ala 残 基 が 存 在 し、それが Ala 連 鎖 に 隣 接 した、GGA, GAG と Gly 領 域 中 央 に存 在 する Ala 残 基 に 由 来 することがわかった。次 に、 一 連 の 安 定 同 位 体 ラベルモデルペプチドのGly リッチ 領 域 において、 13 C CP/MAS NMR の 解 析 から、Gly-Xaa-Gly は、random coil あるいは 3 1 -helix のどちらかであることが 示 唆 された。そこで、さらに、Glyリッチ 領 域 の 二 次 構 造 解 析 を 詳 細 に 行 うため、REDORによる 原 子 間 距 離 測 定 を 行 った。 一 例 として、EEEEAAAAAAGGAGQGGYGGLGSQGAGRG[1- 13 C]GL[ 15 N]GGQGAGAAAAAAEEEE の 一 次 構 造 を 有 するモデルペプチドの 解 析 例 を Figure 1 に 示 した。 得 られたFull echo と REDOR 測 定 のピーク 強 度 の 差 を Figure 2のようにプロットすることによって、 原 子 間 距 離 を 決定 することが 出 来 た。この 値 は、Figure 3 に 示 した 典型 的 な 二 次 構 造 の 場 合 の 距 離 とは 一 致 せず、ランダムな 構 造 のみの 場 合 と 一 致 した(the arrow in Figure 3)。PDB のデータから、ラベル 部 位 を 変 えた 一 連 のGly-Xaa-Gly ごとに random coil の 距 離 の 理 論 値 を 計 算し、REDOR による 原 子 間 距 離 の 決 定 データと 各 々 比較 すると、よく 一 致 した。 以 上 から、MaSp1 の Gly リッチ 領 域 は、Ala 連 鎖 近 傍 に 存 在 する 配 列 が 結 晶 部 にも 非 晶 部 にも 存 在 できるフレキシブルな 部 位 として 存在 する 一 方 、その 他 の 配 列 においては random coil であると 結 論 することができた。 1- 93 -