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Special: Zellbiologie / Zellanalytik
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auswählen, welche Zellen man aussortieren will – ganz
nach dem Motto „die Guten ins Töpfchen, die schlechten ins
Kröpfchen.“ Dazu wird der erkannte Wassertropfen elektrostatisch
aufgeladen und in einem elektrischen Feld abgelenkt. Die
sortierten lebenden Zellen stehen dann für weitere Experimente
und Anwendungen zur Verfügung.
Wie schon erwähnt: nicht alles, was Zellen sortiert, trägt ein
„FACS“ in der Gerätebezeichnung. Ob es reiner Zufall ist, dass
Miltenyi Biotec ihr in den späten 1980ern entwickeltes magnetic-activated
cell sorting-System mit dem phonetisch ähnlichen
Akronym „MACS“ versehen haben, sei dahingestellt. Deren
System verwendet ursprünglich magnetische Partikel, die an
Oberflächenmarker gekoppelt sind. Markierte Zellen konnte
man dann magnetisch fixieren und das restliche Zellmaterial
herauswaschen. ‚MACS’ ist ebenfalls ein eingetragener Markenname
und wird heute für diverse Miltenyi-Zellsortierer verwendet,
die heute auch fluoreszenzbasiert arbeiten.
Mario Rembold
Durchflusszytometrie
Spektral
statt klassisch
Während klassische Durchflusszytometer
die Partikel einer Probe mit definierten
Wellenlängen anregen, verfolgt
die spektrale Durchflusszytometrie ein
anderes Konzept: Die einzelnen Zellen
werden mit Licht aus einem breiten
Spektrum beleuchtet. Das von der Zelle
emittierte Licht geht anschließend durch
ein Prisma oder ein Beugungsgitter und
wird dort in seine einzelnen Wellenlängen
zerlegt. Das aufgefächerte Licht fällt
dann auf ein Array linear angeordneter
Detektoren; je mehr Detektoren und je
dichter diese zusammenliegen, desto
genauer kann man die spektrale Zusammensetzung
des emittierten Lichts
erfassen. Idealerweise ergeben sich aus
diesem Spektrum dann alle Wellenlängen,
die innerhalb einer Zelle angeregt
werden, ohne dass man verschiedene
Laser einsetzen muss.
Beflügelte Methode
Vor knapp drei Jahren verfassten
John Nolan und Danilo Condello vom
Scripps Institute in La Jolla einen Review
zum Thema (Curr. Protoc. Cytom. 2013
Jan; Chapter 1: Unit 1.27). Sie stellen
fest, dass sich die Methode noch in der
Entwicklung befindet, doch beflügelt
wird von den Fortschritten in der Detektor-Technologie.
Die Autoren nennen
CCD- und PMT-Sensoren als besonders
geeignet. Koji Futamura et al. aus Tokio
stellten dieses Jahr ein Verfahren zur
spektralen Durchflusszytometrie vor,
dass das Emissionsspektrum zwischen
grün und rot mit einer PMT-Einheit erfasst
(Cytometry A. 87(9):830-42). Sony
Biotechnology bietet mit dem SA3800
Spectral Analyzer ein Zytometer an, das
Wellenlängen zwischen 420 und 800 Nanometern
analysiert. Mario Rembold
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Zytometrie
Gut sortiert für den Patienten
Nicht immer geht es um möglichst viele
Farben. Andrea Hauser kommt in der Regel
mit vier verschiedenen Markern aus. Klingt
simpel, ist es aber nicht. Denn die sortierten
Zellen werden später Patienten per Infusion
verabreicht. Entsprechend hoch sind
die Anforderungen.
Mastzellen
Foto: NIAID/NIH
Hauser ist die operative Leiterin am
José-Carreras-Centrum für Somatische
Zelltherapie an der Uniklinik Regensburg.
In einer laufenden Phase I/II-Studie von
Matthias Edinger versucht ihr Team, Patienten
zu helfen, die nach einer Stammzelltransplantation
im Zuge einer Leukämietherapie
Komplikationen bekommen
haben; Patienten, bei denen sich diese Komplikationen
nicht konventionell behandeln
lassen. Normalerweise sollen die Spenderzellen
ein neues Immunsystem aufbauen
und helfen im Idealfall dabei, verbliebene
Krebszellen zu bekämpfen. Es kann aber
auch zu ‚Graft-versus-Host’-Reaktionen
kommen, bei denen die übertragenen Immunzellen
den Wirtsorganismus im großen
Stil angreifen. Übeltäter sind Effektor-T-Zellen,
und meistens ist dabei vor allem der
Darm betroffen. „Es kommt zu einer überschießenden
Immunantwort mit starken
Entzündungsreaktionen“, erklärt Hauser.
Neben kampflustigen Immunzellen gibt
es aber auch regulatorische T-Zellen, die
entzündliche Prozesse bremsen. Und genau
diese Leukozyten isolieren die Regensburger
bei der Zellsortierung. „Sie müssen
vom ursprünglichen Stammzell-Spender
der Leukämiepatienten stammen“, betont
Hauser, damit es nicht zu neuen Komplikationen
komme.
Dass man Zellen aus dem Sorter weiter
kultiviert oder in Tierversuchen verwendet,
wäre keine große Sache. Sehr wohl
aber, dass diese Zellen menschlichen Patienten
verabreicht werden. „Da sind wir
in Deutschland die einzigen, die das machen“,
so Hauser. Im juristischen Sinne
stellt man ein Arzneimittel her, in diesem
Fall ein ‚Arzneimittel für neuartige Therapien’.
„Das bringt eine ganze Latte von
Regularien mit sich“, weiß Hauser. Daher
kann man nicht einfach einen beliebigen
Zellsorter verwenden. „Alle Teile, die mit
dem Zellmaterial in Kontakt kommen, darf
man nur einmal verwenden“, nennt Hauser
eine Anforderung. Daher nutzen sie den
Influx der Firma BD Biosciences. Hauser:
„Bei diesem Gerät kann man alle Schläuche
komplett austauschen, die mit der Zellsuspension
in Kontakt kommen; ich kenne
kein Gerät, bei dem das noch möglich
ist.“ Leider betrifft das auch die ‚Nozzle’,
das Bauteil, das die Flüssigkeit fokussiert
und die Zellen vereinzelt. Ein sehr teurer
Wegwerfartikel sei das, da lande man bei
einem niedrigen vierstelligen Eurobetrag.
Die Kanälchen und Schläuche einfach mit
Desinfektionsmittel auszuwaschen, erfüllt
nicht die behördlichen Anforderungen, Autoklavieren
scheitert an den Plastikteilen
des Schlauchsystems, und andere Alternativen
wie radioaktive Bestrahlung sind laut
Hauser im Umfeld der Arzneimittelherstellung
sehr aufwändig und kostspielig.
Der lange Weg zum Sorter
Damit nicht genug: Das Betreten des
Raums, in dem der Sorter steht, braucht
etwa 20 Minuten. „Das gilt aber nur für
geübte Mitarbeiter“, schränkt Hauser ein.
Der Weg endet nach drei Schleusen in
einem Reinraum. Mitarbeiter müssen sich
11/2015 Laborjournal