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Special: Zellbiologie / Zellanalytik
linschicht letztendlich überhaupt nicht repariert
wird, bleibt trotzdem schleierhaft.
Ungeduldig hofft Czopka jetzt auf die
Bestellung eines Lichtscheiben-Mikroskops.
„Diese Art des Live Cell Imaging ist
schonender für die Zellen. Man kann damit
Langzeit-Mikroskopie machen, da das Ausbleichen
der Fluoreszenz verhindert wird
– ein Phänomen, das generell ein großes
Problem bei der Fluoreszenzmikroskopie
biologischer Proben
darstellt“, so Czopka.
Auf diese Weise ist die Lichtscheibenmikroskopie
auch geeignet,
ganze Organe oder komplette
Organismen zu beobachten. Andererseits
kann man mit ihr zur Darstellung
einzelner Zellen oder gar
Moleküle die Auflösung mit Hilfe
spezieller Gitter auf die Spitze treiben
– bis in den Nanometerbereich,
wie die Arbeitsgruppe von Nobelpreisträger
Eric Betzig am HHMI
Janelia Research Campus zeigte.
Letztes Jahr publizierten 27 Forscher
aus USA, Europa und Japan
gemeinsam ein Paper, in dem sie
die Leistungsfähigkeit dieser hochauflösenden
Gitter-Lichtscheiben-Mikroskopie
anhand zwanzig
verschiedener biologischer Systeme
dokumentierten „… from single-molecule
binding kinetics to cell
migration and division, immunology, and
embryonic development.“ (Science 346:
1257998-1–1257998-12). Entsprechend
will Czopka jetzt testen, ob er mit einem
solchen Mikroskop ähnlich viel Neues über
die Myelinisierung von Axonen herausfinden
kann.
100 Mikrometer pro Stunde
Jetzt zu Beispiel Nummer zwei. Während
man unter Live Cell Imaging die Mikroskopie
lebender Zellen in Kultur versteht,
ist die Intravital-Mikroskopie eine
Technologie, mit der man das Geschehen
tatsächlich am und im lebenden Organismus
beobachten will. Voraussetzung dafür
ist natürlich, dass man unter die Haut
oder in das Gewebe schauen kann. Mit
klassischer Fluoreszenzmikroskopie ist das
nicht möglich, da das Anregungs-Laser licht
(350 bis 750 nm Wellenlänge) Fluoreszenzmoleküle
nicht nur in der Fokusebene anregt,
sondern den Lichtstrahl entlang auch
darüber und darunter – was letztlich in
einem starken Rauschen resultiert.
Zu allem Überfluss wird das Licht am
Gewebe stark gestreut. Konfokalität hilft
zwar, aber nicht gut genug. Besser geeignet
ist vielmehr die Zwei-Photonen (2P)-
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(oder auch Multiphotonen-) Mikroskopie.
In diesem Fall wird mit nahem Infrarotlicht
(780 bis 1400 nm) belichtet, dessen Energie
nicht ausreicht, um Fluoreszenzmoleküle
anzuregen. Daher müssen mindestens
zwei Photonen gleichzeitig im Fokus auf
ein Fluoreszenzmolekül treffen, damit sie
gemeinsam genug Energie für ein Signal
erzeugen können. Wegen der geringeren
Plasmazellen (grün) wandern im Knochenmark
Konzentration an Photonen außerhalb der
fokalen Ebene wird dort keine Fluoreszenz
angeregt und das Problem des Photobleaching
damit weitgehend umgangen. Das
heißt, es wird weniger Streulicht detektiert.
Da diese Art der Anregung zudem weniger
Hitze produziert, ist die Technologie zudem
sehr gewebeschonend.
Die 2P-Mikroskopie war auf diese Weise
allerdings erst mit der Erfindung gepulster
Femtosekunden-Laser in Kombination
mit einer gezielten Fokussierung des Laserstrahls
im Gewebe möglich, denn nur
auf diese Weise werden ausreichend hohe
Photonen-Konzentrationen erzeugt. Da das
Infrarotlicht aber bis zu einem Millimeter
tief in das Gewebe eindringen kann, ist sie
jetzt die Technologie der Wahl für die Intravital-Mikroskopie.
„Fährt man den Fokus entlang der
z-Achse durch das Gewebe, erhält man einen
Bildstapel, aus dem sich mit entsprechender
Software die dreidimensionale
Darstellung errechnen lässt“, erklärt Anja
Hauser, die heute am Deutschen Rheuma-Forschungszentrum
(DRFZ) und der
Charité in Berlin arbeitet. Bereits während
ihres Postdoc-Aufenthalts an der Yale Universität
machte sie sich mit der 2P-Mikroskopie
vertraut. Ihr Ziel damals war, die
Entwicklung von naiven B-Lymphozyten
zu langlebigen Plasmazellen zu verfolgen.
Und tatsächlich konnte sie an lebenden,
narkotisierten Mäusen beobachten, wie
B-Lymphozyten zu Antikörper-produzierenden
Plasmazellen heranreifen und
währenddessen mit einer Geschwindigkeit
von etwa 100 Mikrometer pro Stunde vom
Inneren des Lymphknotens, aus den Keimzentren,
an dessen Rand wandern
(Immunity 26: 695-99, Nat. Rev.
Immunol. 7: 499-504).
Das weitere Schicksal der Plasmazellen
verläuft in zwei Bahnen:
entweder enden sie als kurzlebige
Plasmazellen oder sie verbringen,
angelockt durch Chemokine, viele
Jahre als Antikörper-produzierende
Gedächtniszellen in speziellen
Nischen im Knochenmark. Damit
sich die Plasmazelle wohl fühlt,
muss diese Nische mit Stromazellen
ausgestattet sein – wie auch
mit einem wechselnden Set hämatopoetischer
Zellen, beispielsweise
Eosinophilen (Nat. Immunol.
12: 151-59, Eur. J. Immunol.
8: 2306-17). In ihrer Wohlfühlzone
angelangt, verliert die langlebige
Plasmazelle ihre Motilität
und reagiert auch nicht mehr auf
Chemokine. Sie befindet sich in
ständigem Kontakt mit residenten
Stromazellen, ist extrem gut behütet und
produziert Antikörper. „Das sind wahre Antikörper-Kraftwerke“,
so Hauser. Im Falle
von Autoimmunerkrankungen wie dem Lupus
erythematosus ist der gute Schutz, den
die Nische bietet, allerdings von Nachteil,
denn selbst immunsuppressive Behandlungen
machen den Zellen dort nicht viel
aus, so dass sie jederzeit neue Krankheitsschübe
auslösen können.
Dank Multiphotonen-Mikroskopie hat
man in den letzten 13 Jahren – die ersten
drei Paper erschienen 2002 zusammen in
Science – viel herausfinden können über
das Leben und Verhalten von Immunzellen
(Frontiers Immunol., doi 10.3389/fimmu.2015.00240,
Current Opin. Cell Biol.
30: 17-24). Im Fokus war beispielsweise
die Wanderlust von T-Lymphozyten in den
Lymphknoten, die durch ein komplexes Signalsystem
von kleinen GTPasen gesteuert
wird. Die „Raser“ unter den T-Zellen sind
jedoch natürliche T-Killerzellen: mit 600
bis 1.200 Mikrometern pro Stunde flitzen
sie entlang der Wände der kleinen Lebergefäße
(PLoS Biol., doi 10.1371/journal.
pbio.0030113).
Regelrechte Actionstreifen drehte der
aus Österreich stammende und jetzt in Sydney
tätige Wolfgang Weninger mit 2P-Intra­
Foto: Sandra Zementiere
11/2015 Laborjournal