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64 Zuchtanleitung 17-19 Beimpfen von Nährböden Haarnetz und Gesichtsmaske Latex-Handschuhe Spiritus-Brenner Skalpell mit sterilen Klingen Arbeitsflächen-Desinfektion Hand-Desinfektion Antibiotische Agarplatten in Petrischalen Parafilm zum Versiegeln der Petrischalen Glove Bag (steriler Arbeitsraum) Für das Klonen werden die schönsten und vitalsten Fruchtkörper ausgewählt. Wenn man die Fruchtkörper nicht gleich verwendet, sollten diese möglichst sauber im Kühlschrank gelagert werden und innerhalb von maximal 48 Stunden nach der Ernte verarbeitet werden. Bei älteren Fruchtkörpern ist es schwieriger, die Myzelbildung anzuregen, dazu sind diese oft schon mit Bakterien und anderen Kontaminationen „belastet“. Wie bei jedem Arbeitsschritt ist auch hier möglichst steriles, sauberes und schnelles Arbeiten eine Voraussetzung für den Erfolg! Vor Arbeitsbeginn die Hände und Unterarme gründlich waschen und desinfizieren. Wir empfehlen das Tragen von Handschuhen, Mundschutz und Haarnetz und das Arbeiten in einer Impfbox/Glovebox oder vor einem HE- PA-Filter. Werden mehrere Fruchtkörper geklont, ist es wichtig, vor jedem neuen Klon Hände und Arbeitsfläche zu desinfizieren und dabei Handschuhe und Skalpellklinge zu wechseln. Da die Fruchtköper im Wesentlichen aus komprimiertem Myzel bestehen, kann man grundsätzlich Fruchtfleisch von jedem Teil des Pilzes verwenden. Am besten eignet sich jedoch der Hutbereich. Der Stiel wird mit einem Skalpell etwa 0,5 cm tief eingeschnitten und der Länge nach auseinandergezogen, ohne dass das Innere mit den Fingern berührt wird. Das Skalpell wird wieder über den Spiritusbrenner gehalten und eine frische Klinge aufgesetzt. Das Gewebestück für das Klonen entnimmt man von ganz innen, wo man sich größte Sauberkeit verspricht. Es genügt pro Petrischale ein 3x3 mm großes Pilzstück. Mit Hilfe des Skalpells soll nun dieses Stück Fruchtfleisch im antibiotischen Agar-Nährboden „versenkt“ werden. Die fertig inokulierten Petrischalen rasch mit Parafilm versiegeln. Um das Myzelwachstum anzuregen, sollen die Klone dunkel und je nach Gattung bei der richtigen Temperatur gelagert werden. Nach einigen Tagen bis zu einer Woche setzt das Myzelwachstum ein. Wir empfehlen von jedem Klon mehrere Petrischalen zu beimpfen und das Arbeiten mit antibakteriellem Agar-Nährboden (das Antibiotikum darin erschwert das Wachstum von Bakterien mehr als das des Pilzes). Auch unter besten Laborbedingungen muss man mit Ausfällen von rund 10 % rechnen. Als Anfänger darf man sich aber auch nicht entmutigen lassen, sollten 25 % oder mehr der geklonten Petrischalen ausfallen. Üblicherweise werden die Petrischalen mit Datum, Gattung, Strain (Strains sind unterschiedliche Sorten innerhalb derselben Gattung – vergleichbar mit verschiedenen Apfelsorten) und evtl. ei-
Zuchtanleitung 65 ner fortlaufenden Nummer beschriftet (Lackstifte oder CD-Marker halten gut auf der Petrischale). mrca-science.org.: „BEIMPFEN DES NÄHRBODENS MIT DEM KLON“ In: mrca-science. Stand: 15. Januar 2018. http://mrca-science.org/index.php/de/pilzzucht-fuer-jedermann/43-zuchtanleitungen/64-klonen-von-pilzen Fig. 17, 18, 19 S. 68, 69, 70, 71 20-24 Beimpfen von Körnerbrut Agarplatte in Petrischale (min. zu 3/4 besiedelt und nicht mutiert) Sterilisiertes Roggensubstrat Skalpell Latexhandschuhe Gesichtsmaske und Haarnetz Hände- und Arbeitsflächendesinfekt Steriler Arbeitsraum: Glove Bag/Box, oder steriler Luftstrom (HEPA, Laminar Flow) Bei diesem Arbeitsschritt muss besonders sauber und steril gearbeitet werden, damit die Körnerbrut nicht von Schimmelpilzen oder Bakterien befallen wird. Bitte vor Arbeitsbeginn die Hände und Arme gründlich waschen, Arbeitsfläche reinigen und desinfizieren. Nun legen Sie Haarnetz, Mundschutz und Latexhandschuhe an. Direkt vor Arbeitsbeginn werden nochmals die Hände desinfiziert. Verwenden Sie für Roggensubstrat im Glas (rund 400 g Substratgewicht) 1 Petrischale mit Myzel, für Substrat in Säcken entsprechend mehr. Es ist zu vermeiden, verschiedene Klone auf dasselbe Substrat zu impfen. Entfernen Sie den Parafilm von der Petrischale innerhalb eines sterilen Luftstromes (bzw. in der Glove Bag/Box). Schneiden Sie mit dem Skalpell sternförmig durch den mit Pilzmyzel besiedelten Agar. Sie erhalten so 16 kleine Stücke. Öffnen Sie den Deckel des Roggenglases bzw. die Oberseite des Autoklav-Bags, spießen Sie die Agarstücke mit einem sauberen Skalpell mit Klinge auf und transferieren Sie sie vorsichtig auf das sterilisierte Roggensubstrat. Danach wird das Glas/der Sack sofort verschlossen. Durch leichtes Schütteln werden die Agarstücke gleichmäßig im Roggensubstrat verteilt, um ein schnelles und gleichmäßiges Durchwachsen zu erzielen. Falls Myzelstücke am Glas/am Sack kleben bleiben, können Sie diese durch leichtes Klopfen von außen wieder lösen, damit sie wieder ins Substrat gemischt werden können. Die fertig beimpften Gläser oder Säcke werden für die Wachstumsphase des Myzels an einem sauberen, dunklen Ort bei der für die jeweilige Pilzgattung empfohlenen Temperatur gelagert. Im Brutraum oder -kasten muss für ausreichend Frischluftzufuhr gesorgt werden. Schon wenige Tage später kann man beobachten, wie sich das Myzel der Agarstücke auf das umliegende Korn ausbreitet. Nach 1-2 Wochen werden die Gläser/Säcke mit der Körnerbrut geschüttelt. Dadurch mischen sich besiedelte und unbesiedelte Körner, was das weitere Durchwachsen beschleunigt. Die Körnerbrut sollte nach rund 3 bis 4 Wochen vollständig besiedelt sein. Sobald alle Roggenkörner mit weißem Myzel bewachsen sind, ist die Körnerbrut bereit
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