Revista Fedhemo nº 62 - Hemofilia

REAL FUNDACIÓN VICTORIA EUGENIA
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más grandes y complejos descritos en humanos. Adicionalmente
existe una serie de factores que dificultan de manera
considerable la caracterización molecular de la EvW y que
han hecho que la secuenciación directa no se haya considerado
el método de referencia para el diagnóstico. En primer
lugar, el gen del FvW es altamente polimórfico lo que puede
dificultar la identificación de las mutaciones y, en segundo
lugar, existe un pseudogén en el cromosoma 22 muy similar
(>96% de homología) a los exones del 23 al 34 del gen
FvW. Con el objetivo de facilitar el análisis genético de la EvW,
estos autores han diseñado un procedimiento simplificado
basado en la secuenciación completa del gen FvW. La optimización
de este procedimiento permite la amplificación
simultánea de todos los exones y las regiones intrónicas flanqueantes
de dos pacientes bajo las mismas condiciones de
termociclado, lo que ofrece la posibilidad de realizar el diagnóstico
genético de 2 pacientes en menos de 48 horas. Esta
metodología se ha usado para identificar la mutación en un
total de 40 familias y ha demostrado su validez como método
rutinario de diagnóstico molecular ya que ha permitido
la identificación de un total de 58 mutaciones (41 diferentes),
19 de las cuales no se habían descrito previamente. Entre
los diferentes tipos de mutación responsables de la EvW,
aquellas que modifican la región codificante del gen, tienen
un claro efecto deletéreo, pero las consecuencias de las mutaciones
que afectan potencialmente al splicing (PSSM) son
menos evidentes. Con el objeto de estudiar el efecto de estas
mutaciones se desarrolló, en este trabajo, un nuevo método
para la secuenciación completa del cDNA del gen FvW
y aunque este tipo de estudios se han desarrollado tradicionalmente
en plaquetas, al aplicarlos a leucocitos, se ha demostrado
su utilidad para identificar mecanismos moleculares
como el exon skipping o la activación de sitios crípticos
de splicing que no son visibles en plaquetas cuando se
activa el mecanismo conocido como degradación del mRNA
mediada por mutaciones de terminación.
Por otro lado, las perspectivas en el diagnóstico molecular
han cambiado drásticamente en los últimos años con
la aparición de las plataformas de secuenciación de nueva
generación (NGS), que son hasta 200 veces más rápidas y
económicas que la secuenciación tradicional y han plantea -
do nuevos retos en el diagnóstico molecular de las enfermedades
hereditarias.
Con el objetivo de examinar la viabilidad de la secuenciación
del gen FvW mediante las tecnologías de NGS, se han
evaluado dos estrategias principales: la amplificación del gen
FvW mediante el diseño de un nuevo protocolo de PCRs largas
que cubren alrededor del 70% del total del locus, y la amplificación
del gen FvW mediante PCRs cortas desarrolladas
previamente. A partir de los resultados obtenidos, se ha
observado que ambas estrategias de amplificación son válidas
para el estudio de diferentes pacientes. Por otro lado,
las PCRs largas implican ciertas dificultades técnicas para
su normalización y ofrecen un volumen de información adicional
que todavía resulta difícil de interpretar. Por ello, se
optó por la estrategia de PCRs cortas a la hora de desarrollar
la prueba de concepto para el análisis simultáneo de 50
pacientes con EvW. Para minimizar los costes, se ideó una
estrategia para reducir el número de librerías necesarias,
de tal forma que el DNA genómico de 5 pacientes se mezcló
a concentraciones equimolares y se realizó la amplificación
del gen FvW por PCR convencional a partir de cada
mezcla de DNAs. Durante la construcción de las librerías se
añadió una “etiqueta” diferente para cada mezcla de PCRs
con el objetivo de poder secuenciar las muestras de 50 pacientes
en 1/8 de la placa de secuenciación y poder identificarlas
posteriormente por secuenciación tradicional del exón
correspondiente en todos los pacientes incluidos en cada
mezcla. Esta estrategia permite el análisis simultáneo de 400
muestras, de pacientes y familiares, de forma más rápida
y económica que por secuenciación tradicional ya que el tiempo
de manipulación y secuenciación de 50 pacientes mediante
la NGS se mide en días y el coste ponderado final fue inferior
a 100€por muestra, 10 veces menor que el coste de
la secuenciación tradicional.
Estas dos tecnologías se han diseñado con distintos objetivos.
De una parte la secuenciación tradicional ofrece un diagnóstico
de calidad para los pacientes que requieren de un estudio
genético más o menos rápido, mientras que la NGS permite
el estudio de un gran número de pacientes de forma simultánea
a un coste muy reducido, lo que resulta de especial
relevancia en el momento de plantear estudios epidemiológicos
a nivel nacional. Dado el gran volumen de datos que se pueden
obtener con la aplicación de estas tecnologías y con el objetivo
de recopilar y hacer accesible toda la información generada
a partir del diagnóstico molecular de los pacientes con
EvW, se ha diseñado un nuevo apartado dentro de Hemobase
(registro de mutaciones para las Hemofilias A y B) dedicado
a la EvW (www.vwf.hemobase.com). Esta página de acceso
libre por Internet, contiene un registro de las mutaciones
identificadas en pacientes con EvW después de la secuenciación
directa del gen FvW y permite realizar búsquedas, relacionar
cualquier mutación con la base de datos internacional
y acceder directamente a las publicaciones sobre el tema. Se
pretende que el estudio molecular de los pacientes permita
una mejor comprensión de los mecanismos implicados en la
fisiopatología de la enfermedad y ofrezca una visión más amplia
de la epidemiología molecular.
Bibliografía
1. Corrales I, Catarino S, Ayats J, Arteta D, Altisent C, Parra R, Vidal F. High-throughput
molecular diagnosis of von Willebrand diseaseby next generation sequencing methods.
Haematologica 2012 [En prensa].
fedhemo nº62 junio 2012