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Sezione B La cellula: l’unità del vivente Dentro Ricerca Dal microscopio messo a punto da Leeuwenhoek a oggi, la cellula ha rivelato in modo sempre più completo la sua architettura interna grazie al perfezionamento degli strumenti. Al microscopio ottico si è infatti aggiunto il microscopio elettronico. Oltre all’ingrandimento, che consiste nel rapporto tra le dimensioni dell’oggetto e quelle dell’immagine, una caratteristica fondamentale del microscopio è il suo potere di risoluzione, ossia la nitidezza dell’immagine. Questo parametro esprime la distanza minima al di sotto della quale non siamo in grado di vedere due punti come distinti. L’occhio umano non è in grado di distinguere dettagli più piccoli di un decimo di millimetro. Strumenti con potere di risoluzione sempre più elevato permettono di esplorare strutture sempre più fini. Le foto di immagini ottenute con il microscopio vengono dette microfotografie. 84 L’osservazione al microscopio Il microscopio ottico Ha un potere di risoluzione di 0,2 m: al di sotto di questo valore ogni contorno appare sfumato e nebuloso. Ingrandisce la visione a occhio nudo di circa 500 volte (fig. 1a). È composto da un tubo dotato di due sistemi di lenti, uno posto sul fondo e detto obiettivo e uno posto in cima e detto oculare. L’obiettivo è rivolto verso un tavolino portaoggetti sul quale viene posto il preparato da osservare. Uno specchio dirige un fascio di luce attraverso il preparato e l’obiettivo ne proietta un’immagine ingrandita verso l’oculare (fig. 1b), che la ingrandisce a sua volta. L’ingrandimento globale è quindi il prodotto dei due ingrandimenti: quello dell’obiettivo e quello dell’oculare. I tessuti sono però troppo spessi e opachi per potere essere posti direttamente sotto l’obiettivo del microscopio. Devono perciò essere tagliati a fettine molto sottili (1-10 µm) in modo da potere permettere il passaggio di un fascio di luce. Impiegando metodi diversi di illuminazione e colorazione del preparato, si riesce a evidenziare un maggior numero di dettagli. Per la colorazione si usano sostanze che reagiscono con alcune parti della cellula e non con altre (per esempio, con il nucleo e non con il citoplasma), permettendo un contrasto migliore tra le varie strutture cellulari. Le immagini così ottenute mostrano la forma delle cellule, ma non consentono di visualizzarne in dettaglio la struttura interna (fig. 1c). Il microscopio elettronico Sfrutta gli elettroni, anziché la luce, per ricavare un’immagine dell’oggetto osservato. In questo modo riesce a raggiungere un potere risolutivo superiore al microscopio ottico. Gli strumenti di questo tipo più utilizzati sono il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) e il microscopio elettronico a scansione (SEM). Le immagini sono in bianco e nero, ma spesso vengono colorate per risultare più leggibili. TEM È uno strumento dotato di un potere di risoluzione di 0,2 nm. Migliora la visione a occhio nudo ingrandendola di circa 500.000 volte (fig. 2a). Al posto della luce usa un fascio di elettroni provenienti da un filamento di tungsteno riscaldato a temperatura molto alta. Invece delle lenti di vetro utilizza delle lenti magnetiche che agiscono sulle cariche negative degli elettroni. Il campione viene posto sotto vuoto: infatti, poiché gli elettroni vengono facilmente assorbiti dalla materia, nell’aria non percorrerebbero distanze utili. Per permettere il passaggio degli elettroni, che sono dotati di uno scarso potere di penetrazione, lo spessore dei campioni deve essere ultrasottile (50 nm). Per con- Fig. 1 Microscopio ottico. Fig. 2 Microscopio elettronico a trasmissione (TEM). a. b. occhio a. b. generatore del fascio generatore di elettroni di elettroni c. Microfotografia di spermatozoo al microscopio ottico oculare obiettivo campione condensatore fonte luminosa c. Microfotografia di spermatozoo al microscopio TEM membrana nucleo condensatore campione campione obiettivo proiettore schermo schermo visore visore o lastra oculare fotografica
trastare le diverse parti del campione si esegue una colorazione a base di metalli pesanti che assorbono gli elettroni, diffondendoli anziché farsi attraversare. Gli elettroni generati nel cannone vengono direzionati dalle lenti condensatrici sul campione. Alcuni di essi vengono assorbiti, altri lo attraversano e vengono deviati dagli atomi del campione sull’obiettivo, a formare una prima immagine. Questa viene ulteriormente ingrandita da una lente proiettore, e infine visualizzata su uno schermo che, sottoposto al bombardamento degli elettroni, diviene fluorescente. In alternativa, si può disporre una lastra fotografica al posto dello schermo: si otterrà così una microfotografia dell’immagine elettronica (fig. 2b). Il risultato finale è un’ immagine bidimensionale dell’oggetto osservato, che consente di distinguerne bene la struttura interna (fig. 2c) Volendo localizzare una determinata molecola, si sfrutta la capacità degli anticorpi (molecole proteiche) di legarsi in modo specifico ad altre molecole. In particolare, si prende l’anticorpo specifico per la molecola da localizzare, lo si fa reagire con minuscole particelle d’oro, dense agli elettroni, in modo da “marcarlo” e poterne seguire il percorso; infine, lo si pone a contatto con il campione. L’anticorpo riconosce la molecola e la lega, “marcandola” a sua volta e la rende così facilmente individuabile. Un’applicazione particolare è l’immunofluorescenza. Se l’anticorpo viene “marcato” con una sostanza fluorescente, per esempio la fluorescina, quando entrerà in contatto con la struttura cellulare specifica, la legherà rendendola osservabile grazie alla propria luminescenza. Questa viene prodotta quando le molecole della sostanza fluorescente vengono eccitate dalla luce ultravioletta con cui si illumina il campione. SEM Ha un potere di risoluzione di 10 nm. A differenza del TEM, restituisce una visione tridimensionale dell’oggetto, grazie a una diversa tecnica di costruzione dell’immagine. In questo ca- so sono gli elettroni del campione e non quelli del fascio a fornire le informazioni da cui verrà ricavata la rappresentazione dell’oggetto (fig. 3a). Il fascio di elettroni proveniente dal cannone non rimane fisso, ma viene deviato da un generatore della scansione, in modo da colpire, punto per punto in tempi successivi, l’intera superficie del campione, che viene rivestita da un velo sottilissimo di un metallo pesante. L’intera superficie del campione viene così analizzata. Sottoposti alla scansione elettronica da parte del fascio, gli elettroni del campione acquistano energia, rompono i legami atomici e producono dei segnali che vengono poi misurati da un rivelatore e visualizzati su uno schermo televisivo (fig. 3b). Questo tipo di microscopio consente di osservare campioni di dimensioni assai diverse, da microscopici insetti a parti di cellule. Lo spessore del campione ha minore importanza rispetto al TEM, in quanto gli elettroni non lo attraversano ma ne Fig. 3 Microscopio elettronico a scansione (SEM). Fig. 4 Microscopio a forza atomica (AFM). a. generatore di elettroni generatore b. del fascio di elettroni a. b. rilevatore della deflessione della sonda c. Microfotografie di spermatozoi al SEM generatore del pennello di elettroni condensatore deflettore del fascio rivelatore ricettore diffusione di elettroni del campione apitolo 4 La cellula: struttura e funzioni C scansionano la superficie (fig. 3c). Microscopio a forza atomica (AFM) Tra i molti altri tipi di microscopi, si distingue il microscopio a forza atomica (AFM), dotato di un potere risolutivo di circa 2 nm. Appartiene alla famiglia dei microscopi a sonda. Questi, a differenza dei microscopici ottici ed elettronici, sfruttano l’interazione tra una sonda miscrosopica e una piccola porzione della superficie di un campione per ottenere un’immagine tridimensionale dell’oggetto (fig. 4a). Nell’AFM, gli strati atomici superficiali del campione vengono scansionati da una puntina posta all’estremità di una leva, che a sua volta si flette quando la puntina incontra le sporgenze e le rientranze del campione. I movimenti della leva vengono misurati da un rivelatore (fig. 4b) e tradotti da un elaboratore in immagini tridimensionali particolarmente dettagliate (fig. 4c). sonda campione schermo visore microleva Scienza VIVA c. Microfotografie di spermatozoo all’AFM 85
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