Emprego da Lâmina de Imunofluorescência na ... - NewsLab

considerável atraso no diagnóstico e
terapia. Outro problema é a manipulação
das culturas em laboratório.
As culturas de H. capsulatum apresentam
risco para os laboratoristas
exigindo grande preocupação com a
biossegurança.
Os procedimentos de diagnósticos
são numerosos e bem descritos, no
entanto, suas deficiências justificam
novas pesquisas (30).
Diagnóstico molecular: técnicas
baseadas na reação de cadeia de
polimerase (PCR)
Protocolos baseados em PCR têm
sido descritos para uma variedade
de fungos clinicamente importantes
incluindo Cryptococcus neoformans,
espécies de Aspergillus, espécies de
Candida e H. capsulatum. (38). Eles
podem ser especialmente úteis em
laboratórios inadequados para realização
de culturas ou com inexperiência
no isolamento de Histoplasma
capsulatum e, o mais importante,
apresentam potencial para serem
metodologias de diagnóstico mais
específicas, sensíveis e rápidas.
Duas variações das metodologias
têm sido especialmente úteis para o
diagnóstico molecular e estudos de
variabilidade: Nested-PCR e o PCR em
tempo real.
Nested-PCR
Numerosos métodos moleculares
têm sido desenvolvidos para identificar
rapidamente fungos isolados e
cultivados em meio sólido (39, 40)
e diretamente de hemoculturas (41-
44). Os alvos moleculares para a
amplificação e detecção pelo PCR são
usualmente regiões conservadas com
informação filogenética como os genes
do RNAr. RNAr genes são também alvo
de seqüenciamento para identificação
dos fungos (36, 45-47).
A PCR simples com primers específicos
para H. capsulatum foi bem
descrita. Culturas deste fungo podem
ser identificadas com alta especificidade
pelo uso desta metodologia. No
entanto, a detecção de H. capsulatum
em amostras biológicas é uma tarefa
difícil devido à baixa concentração e
qualidade do DNA fúngico extraído de
tecidos. Por outro lado, a PCR seguida
de seqüenciamento, além de sofrer os
mesmos problemas de sensibilidade
que a PCR simples, é uma técnica de
difícil execução em rotina laboratorial,
principalmente devido aos equipamentos
(50).
O protocolo da Nested-PCR baseiase
em realizar duas PCR seguidas.
A primeira gera um fragmento de
oligonucleotídeos que será alvo da segunda
PCR. A realização de duas PCR
com dois pares de primers aumenta
a quantidade de DNA amplificado/
sensibilidade e a especificidade da
reação. Portanto, a Nested-PCR possui
aplicabilidade em amostras biológicas.
Outra vantagem desta técnica é a
utilização de materiais mais simples
e acessíveis quando comparada às
técnicas de seqüenciamento ou ao PCR
de tempo real (48).
Estudos foram realizados com
genes que possuem uma única cópia
no genoma ou ainda com genes
ribossomais. O ensaio da PCR tendo
como alvo genes do RNAr demonstrou
alta sensibilidade. No entanto,
a natureza conservada dos genes do
RNAr causaram amplificações não específicas
e levaram os pesquisadores
a buscarem novos alvos para amplificação
(49). Os trabalhos a seguir
NewsLab - edição 91 - 2008
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