Emprego da Lâmina de Imunofluorescência na ... - NewsLab

apresentam a evolução cronológica
destes estudos.
Bialek et al. (50) realizaram um
trabalho que pode ser considerado
como pioneiro e de referência para os
demais. Eles realizaram uma Nested-
PCR tendo como alvo uma pequena
subunidade do RNAr 18s e avaliaram
a infecção em cobaias. Os resultados
promissores deste trabalho estimularam
uma seqüência de outros.
O próximo passo foi utilizar regiões
de genes mais específicos. Bialek et al.
(48) desenvolveram uma Nested-PCR
tendo como alvo genes codificadores
de uma proteína de 100 KDa. Esta
proteína é específica e essencial para
a sobrevivência de H. capsulatum em
células humanas. Este estudo demonstrou
uma maior especificidade
desta região alvo quando comparada
com as reações que utilizaram a
região 18S do RNAr como alvo para
detecção da espécie em 100 amostras
biológicas.
Guedes et al. (51) desenharam
quatro seqüências de oligonucleotídeos
para serem utilizados na PCR para
detecção de Histoplasma capsulatum
var capsulatum. Estas utilizam como
alvo o antígeno M. Produtos de PCR
de 111 e 279 bp foram amplificados
com os primers denominados de
Msp1F-Msp1R e Msp2F-Msp2R, respectivamente.
A PCR identificou corretamente 31
linhagens de H. capsulatum isoladas
de humanos, animais e solo. A especificidade
dos primers foi confirmada
pela ausência de amplificação de produtos
genômicos de Paracoccidiodes
brasiliensis, Candida spp., Sporothrix
schenckii, Cryptococcus neoformans,
Blastomyces dermatitidis, Coccidioides
immitis, Aspergillus niger e Aspergillus
fumigatus.
Bracca et al., 2003 (52) desenvolveram
uma seminested PCR para o
diagnóstico da histoplasmose. Utilizaram
como alvo o gene do antígeno H
de H. capsulatum. O ensaio demonstrou-se
sensível e específico. Foi capaz
de detectar material correspondente
a menos de 10 células leveduriformes
sem apresentar reação cruzada com
o DNA de fungos e bactérias patógenos
(Aspergillus flavus, Aspergillus
fumigatus, Aspergillus niger, Geotrichum
sp., Cryptococcus neoformans,
Candida albicans, Trichosporon sp.,
P. brasiliensis, Nocardia asteroides,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella sp., Streptococcus
pneumoniae, Mycobacterium bovis
e M. tuberculosis).
Maubon et al. (53) avaliaram
Nested-PCR utilizando a metodologia
descrita por Bialek et al. (48)
em 40 amostras de pacientes com
suspeita de histoplasmose disseminada.
Todas as amostras com reação
de PCR positivas também tiveram
culturas positivas. A Nested PCR
permitiu a obtenção do resultado
final em 48 horas. Neste estudo,
a microscopia permitiu a detecção
imediata do microrganismo somente
em 38% dos pacientes. Os demais
pacientes tiveram que esperar, em
média, 28 dias para o diagnóstico
definitivo da cultura. No entanto, a
Nested-PCR permitiu a obtenção do
resultado final de todos os pacientes
em apenas 48 horas. Este resultado
veloz implicou na diminuição dos
custos de hospitalização, em um
número menor de exames invasivos
e, eventualmente, em tratamentos
incorretos.
Quando foi avaliada a especificidade,
a reação amplificou apenas o
DNA de H. capsulatum. Estes autores
concluíram que o uso desta Nested-
PCR permite o diagnóstico laboratorial
e tratamento mais rápido dos
pacientes.
PCR em tempo real
A PCR em tempo real é uma ferramenta
poderosa que apresenta como
grandes vantagens a possibilidade de
se quantificarem os microrganismos
e a não necessidade de revelação
em eletroforese. Os ensaios de PCR
de tempo real possuem potencial
para serem utilizados como método
alternativo para confirmação da cultura
e possuem potencial para serem
utilizados diretamente em amostras
biológicas.
Villamil et al. (54) descreveram um
ensaio para detecção de H. capsulatum.
Eles identificaram corretamente
107 culturas fúngicas. A metodologia
apresentou 100% de sensibilidade e
100% de especificidade para detectar
as culturas de H. capsulatum. A metodologia
foi utilizada diretamente em
três amostras biológicas e apresentou
resultados satisfatórios em relação
às culturas. Estes resultados com as
amostras biológicas são promissores,
no entanto, não são numericamente
significativos, sendo necessários estudos
maiores.
Comparação entre o diagnóstico
convencional e o diagnóstico
molecular
O diagnóstico molecular baseado
na PCR ainda não é utilizado rotineiramente
na maioria dos laboratórios de
patologia e micologia. Alguns laboratórios
desenvolveram protocolos próprios
para detecção de toxoplasmose,
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NewsLab - edição 91 - 2008