Avaliação da reconstituição imunológica em pacientes com diabete ...

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUERMEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA AFONTE.FICHA CATALOGRÁFICAFarias, Kelen Cristina Ribeiro Malmegrim deAvaliação da reconstituição imunológica em pacientes com diabete melito do tipo 1 eesclerose múltipla após transplante autólogo de células tronco hematopoéticas.Ribeirão Preto, 2006.286 p.Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidadede São Paulo.Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada.Orientador: Voltarelli, Júlio César1. Transplante de células tronco hematopoéticas 2. Doenças auto-imunes 3. Reconstituiçãoimunológica 4. Diabete melito do tipo 1 5. Esclerose múltipla 6. Repertório de células T

Aos meus pais, Ronaldo e MariléaAo meu marido, Cléver

Aos pacientes transplantados,Doutores na arte da vida,que incansáveis, tornam o desejo de luta maior que o próprio medoque sedentos de vida, assumem por ela todos os riscos,o risco mesmo de perdê-la.Com vocês, estamos sempre aprendendoque a luta, nem sempre seguida de vitória,é o que importa e torna preciosa nossa efêmera existência.Aos que vitoriosos alcançaram o objetivo de viver,Aos que persistentes continuam lutando,Aos que perderam a batalha, mas engrandeceram seu espíritoe deixaram em nossa memória a lembrança de sua coragem.(Autor desconhecido)

AGRADECIMENTOSAo Prof. Dr. Júlio César Voltarelli pela orientação, confiança e oportunidade de trabalhar em sua linhade pesquisa. Admiro muito a maneira como conduz sua pesquisa clínica e sua equipe do TMO.Aproveito a oportunidade para parabenizar-lhe pelos avanços e sucessos conquistados nos últimosquatro anos nos ensaios clínicos de transplante autólogo de células tronco em doenças auto-imunes.À diretoria científica e administrativa do Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto do HC-FMRP-USP, em cujos laboratórios de pesquisa esse trabalho foi desenvolvido.Ao coordenador do Centro de Terapia Celular (CEPID da FAPESP), Prof. Dr. Marco Antônio Zago,pela oportunidade de trabalhar nesse centro de referência em pesquisa, o qual tem obtido muitosucesso pela sua capacidade de liderança e empenho na formação dos pesquisadores.Ao Programa de Pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada, do Departamento de Imunologia eBioquímica da FMRP-USP, pelos excelentes professores e pela qualidade de formação que éoferecida. Agradeço em especial à Ana, que sempre me ajudou com muita atenção, eficiência ecarinho em todos os momentos em que precisei.À FAPESP, Finep e CNPq pelo apoio financeiro, imprescindível para a realização deste trabalho.Ao Laboratório de Citometria de Fluxo do Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto do HC-FMRP-USP. À Patrícia e Fabiana pela dedicação, presteza e ajuda, que foram imprescindíveis para arealização deste trabalho. Agradeço pelas centenas de tubinhos marcados, “passados” e analisados,e também pelos conselhos e discussões sobre os experimentos. Mas, principalmente, agradeço pelaamizade sincera, carinho, conversas, pelos ótimos momentos que passamos e pelas inúmerasrisadas que demos juntas nesses últimos quatro anos!Ao Laboratório de Biologia Celular do Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto do HC-FMRP-USP. À Maristela, Ane Rose e Karina pela ajuda na realização deste trabalho, pela discussãodos experimentos, e principalmente, pela amizade, apoio e carinho nesses últimos anos. Agradeçoespecialmente à Aline, minha estagiária, pela amizade, carinho, dedicação e ajuda imensurável nosexperimentos nesse último um ano e meio.

Ao Laboratório de Biologia Molecular do Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto do HC-FMRP-USP. À Dra. Simone e Luciene pela ajuda na realização dos experimentos. Agradeço tambémà Carmen pela amizade e por sempre me ajudar com muita atenção e eficiência na parte burocráticanos momentos em que precisei.À equipe médica da Unidade de Transplante de medula Óssea do Hospital das Clínicas da FMRP-USP, em especial à Dra. Maria Carolina de Oliveira, Dra. Beatriz Stracieri, Dra. Daniela Moraes, Dra.Belinda Simões e ao Dr. Fabiano Pieroni, pela atenção e presteza no acompanhamento dospacientes, encaminhamento das amostras e no fornecimento dos dados clínicos.À equipe de enfermagem da Unidade de Transplante de medula Óssea do Hospital das Clínicas daFMRP-USP pela atenção, dedicação, paciência e presteza na coleta das amostras dos pacientes.À equipe médica do Setor de Doenças Neuromusculares, em especial à Dra. Doralina Brum e ao Dr.Amilton Barreira, pela colaboração nesse projeto, atenção e presteza no acompanhamento dospacientes com esclerose múltipla.À equipe médica da Divisão de Endocrinologia e Metabolismo do HC-FMRP-USP, em especial ao Dr.Eduardo Couri e ao Dr. Milton César Foss, pela colaboração nesse projeto, atenção e presteza noacompanhamento dos pacientes com diabete melito do tipo 1.Ao Prof. Dr. Jorge Kalil, Prof. Dra. Luiza Guilherme, Prof. Dra. Verônica Coelho e Dra. Kellen Faé, doLaboratório de Imunologia do Instituto do Coração da FM-USP, pela oportunidade que me deram depoder desenvolver parte de meu trabalho de doutorado em um grupo de excelência em pesquisa emImunologia no Brasil, iniciando-me no estudo do repertório de linfócitos T. Agradeço em especial àDra. Kellen pela colaboração nesse trabalho, pelos ensinamentos e explicações, pela ajuda narealização dos experimentos e na discussão dos resultados. Agradeço pelo carinho e cuidado noperíodo em que trabalhei em seu laboratório. Agradeço também a todos os outros companheiros dolaboratório que me receberam com carinho, e de alguma forma contribuíram para realização destaparte do meu trabalho.Aos pacientes que participaram deste estudo pela compreensão e paciência. Espero ter contribuído,um pouco que seja, para o entendimento dos mecanismos de ação do transplante autólogo de células

tronco em doenças auto-imunes, para que no futuro essa nova abordagem terapêutica para otratamento de doenças auto-imunes possa ser melhorada.A todos meus companheiros dos laboratórios de pesquisa do Hemocentro que de diferentes formascontribuíram para este trabalho. Agradeço pela amizade, força e ajuda nos experimentos. Emespecial, agradeço à minha amiga Keikinho pela amizade e carinho, por me escutar tantas vezes, porcompartilhar sonhos e esperanças, e pela ajuda incondicional.Aos meus “amigos da imuno” (vocês sabem quem são...) pela amizade e carinho sinceros, pela força,conselhos e apoio nos momentos em que precisei, pelos bons momentos compartilhados em nossassaídas e encontros, e também pelas nossas conversas sobre nossa paixão que é a Imunologia. Foimuito bom conviver com vocês nesses últimos quatro anos!Aos meus queridos pais, Ronaldo e Mariléa, pelo amor e apoio incondicionais que sempre recebi parair em busca de meus sonhos. Obrigada por compreenderem minha ausência nesses últimos tempos.Saibam que cada conquista minha é um triunfo de vocês.Ao meu querido Cléver, meu amor, minha referência... Agradeço a Deus, sempre, por ter colocadovocê em minha vida. Obrigada pela compreensão, carinho, apoio e ajuda incondicionais,principalmente nesses últimos tempos. Essa conquista também é sua, assim como a sua (lembra?)também foi minha, e tenho certeza de que outros tantos sonhos nós conquistaremos juntos.A Deus pela minha existência, pelo amor incondicional, pela saúde, força e capacidade que me dátodos os dias.

“The marvelous richness of human experience would losesomething of rewarding joy if there were no limitations toovercome. The hilltop hour would not be half so wonderful ifthere were no dark valleys to traverse”.Helen Keller (1880 – 1968)

RESUMOFarias, K.C.R.M. Avaliação da reconstituição imunológica em pacientes com diabete melito dotipo 1 e esclerose múltipla após transplante autólogo de células tronco hematopoéticas. 2006.286p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,Ribeirão Preto, 2006.Ensaios clínicos têm demonstrado que a imunoablação seguida de transplante autólogo decélulas tronco hematopoéticas (TACTH) é capaz de suprimir a atividade inflamatória em pacientescom doenças auto-imunes (DAIs) e pode induzir remissões clínicas prolongadas nesses pacientes,mas o mecanismo de ação do TACTH ainda não é bem esclarecido. O racional do TACTH em DAIsbaseia-se na idéia de que a imunoablação intensa possa eliminar as células auto-reativas e que onovo sistema imune reconstituído dos precursores hematopoéticos possa restabelecer tolerância. Oobjetivo deste trabalho foi avaliar a reconstituição imunológica em pacientes com diabete melito tipo 1(DM, N=11) e pacientes com esclerose múltipla (EM, N=18), seqüencialmente após o TACTH. Areconstituição imunológica observada nos pacientes com DM (um ano de seguimento póstransplante)e nos pacientes com EM (dois anos de seguimento pós-transplante), foi caracterizada pormecanismos periféricos timo-independentes. Após o transplante, houve uma predominância decélulas T de memória central, memória efetora e também de células T efetoras diferenciadas,principalmente de linfócitos T CD8 + . Essas células provavelmente se originam da expansãohomeostática periférica de linfócitos T de memória residuais que sobreviveram ao regime decondicionamento ou foram re-infundidos com as células tronco no momento do transplante. Osnúmeros de linfócitos T CD4 + e CD8 + naive, incluindo as células T CD4 + CD45RA + CD31 +recémimigrantesdo timo, não recuperaram os níveis basais durante o período pós-transplante analisado.Após o TACTH, houve uma predominância de células T CD4 + e CD8 + produtoras de citocinas dopadrão T H 1 (INF-γ e TNF-α). Por outro lado, foi observado um aumento da porcentagem de células TCD4 + e CD8 + produtoras de citocinas do padrão T H 2 (IL-4, IL-5 e IL-10) no pré-condicionamento e emalguns períodos após o TACTH. Análises espectrais do repertório da cadeia Vβ dos receptores decélulas T (TCRs), por TCRBV CDR3 spectratyping, identificaram quatro padrões básicos dereconstituição do repertório. O padrão que consistiu na reconstituição da diversidade a partir de um

ABSTRACTFarias, K.C.R.M. Analysis of immune reconstitution in type 1 diabetes and multiple sclerosispatients following hematopoeitic stem cell transplantation. 2006. 286p. Thesis (Doctoral) –Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.Clinical trials have indicated that autologous hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) canpersistently suppress inflammatory disease activity in a subset of patients with autoimmune diseases(AIDs), but the mechanism of action of the AHSCT has not yet been totally elucidated. The rationalefor HSCT in autoimmune diseases has been the notion that intensive immune depletion couldeliminate autoreactive immune cells irrespective of antigenic specificity and that regenerating theimmune system from hematopoietic precursors could reestablish tolerance. The goal of this work wasto evaluate the immune reconstitution in patients with type 1 diabetes mellitus (DM1; N=11) andmultiple sclerosis (MS; N=18) who received AHSCT. The immune reconstitution observed in the DM1patients (one year follow-up) and in the MS patients (two years follow-up) was characterized byperipheral thymic-independent mechanisms. After transplantation, there was a predominance ofcentral-memory T cells, effector-memory T cells and differentiated-effector T cells, mainly of the CD8 +T cell subset. These cells probably originate from peripheral homeostatic proliferation of residualmemory T cells that have survived the conditioning chemotherapy or were reinfused with the HSCgraft. The numbers of naive CD4 + and CD8 + T cells, including the recent-thymic emigrantsCD4 + CD45RA + CD31 + , did not revert to baseline levels during follow-up. After transplant, there was apredominance of T H 1 cells, mainly CD8 + T cells, producing INF-γ e TNF-α. In contrast, it was observedan increased percentage of CD4 + and CD8 + T cells producing T H 2 cytokines (IL4, IL-5 and IL-10) atpre-conditioning and at some time points after AHSCT. Analysis of the T cell receptor Vβ repertoire byTCRBV CDR3 spectratyping identified four basic patterns of repertoire reconstitution. The pattern thatconsisted of reconstitution of diversity from a normally diverse repertoire was the most dominant in theanalyzed patients. For some Vβ families were observed a pattern that consisted of recovery ofdiversity from a restricted repertoire, suggesting increased repertoire diversity after AHSCT. Therewere changes in the composition of the T cell repertoire post-AHSCT, evidenced by qualitative andquantitative alterations in the CDR3 peaks, which might explain the induction of the remission of the

autoimmune disease, observed for the majority of the patients. A rapid reconstitution of CD4 + CD25 highT cells and an increased expression of the Foxp3 gene, a specific molecular marker for regulatoryCD4 + CD25 high T cells, were observed in the majority of the analyzed patients. These results suggestan improvement of the regulatory mechanisms, which might contribute to reestablishment ofimmunological tolerance in the DM1 and MS patients submitted to the AHSCT.Keywords: Hematopoeitic stem cell transplantation, Auto-immune diseases, Immune reconstitution,Type 1 diabetes, Multiple Sclerosis, T cell repertoire.

LISTA DE ILUSTRAÇÕESFigura 1. Reconstituição de leucócitos totais, linfócitos, monócitos e granulócitos em pacientes comdiabete melito do tipo 1 após o TACTH ....................................................................................... 72Figura 2. Reconstituição de linfócitos T e B em pacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH . 73Figura 3. Reconstituição de linfócitos T, células NK, células NKT-like, e de células dendríticas empacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH.. .................................................................. 74Figura 4. Reconstituição de linfócitos T CD4 naive, de memória, de memória efetora e efetoresdiferenciados em pacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH ........................................ 75Figura 5. Reconstituição de linfócitos T CD8 naive, de memória, de memória efetora e efetoresdiferenciados em pacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH ........................................ 76Figura 6. Expressão de Fas e FasL em linfócitos T CD4 + ou TCD8 + , ou em linfócitos B reconstituídosem pacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH .............................................................. 77Figura 7. Expressão de marcadores de ativação celular em linfócitos T CD4 + , T CD8 + e linfócitos Breconstituídos, e reconstituição de linfócitos T CD4+ recém-imigrantes do timo, em pacientes comdiabete melito tipo 1 após o TACTH ............................................................................................ 78Figura 8. Reconstituição de linfócitos T CD4 + CD25 + e linfócitos T CD4 + CD25 high em pacientes comdiabete melito tipo 1 após o TACTH ............................................................................................ 79Figura 9. Expressão de CTLA-4 e GITR em linfócitos T CD4 + CD25 high em pacientes com diabetemelito tipo 1 antes e após o TACTH ............................................................................................ 80Figura 10. Reconstituição de leucócitos totais, linfócitos, monócitos e granulócitos em pacientes comesclerose múltipla após o TACTH ............................................................................................... 88Figura 11. Reconstituição de linfócitos T e B em pacientes com esclerose múltipla após o TACTH .. 89Figura 12. Reconstituição de linfócitos T, células NK, células NKT-like, e de células dendríticas empacientes com esclerose múltipla após o TACTH........................................................................ 90Figura 13. Reconstituição de linfócitos T CD4 naive, de memória, de memória efetora e efetoresdiferenciados em pacientes com esclerose múltipla após o TACTH............................................ 91Figura 14. Reconstituição de linfócitos T CD8 naive, de memória, de memória efetora e efetoresdiferenciados em pacientes com esclerose múltipla após o TACTH............................................ 92Figura 15. Expressão de Fas e FasL em linfócitos T CD4 + ou TCD8 + , ou em linfócitos B reconstituídosem pacientes com esclerose múltipla após o TACTH.................................................................. 93

Figura 16. Expressão de marcadores de ativação celular em linfócitos T CD4 + , T CD8 + e linfócitos Breconstituídos, e reconstituição de linfócitos T CD4+ recém-imigrantes do timo, em pacientes comesclerose múltipla após o TACTH ............................................................................................... 94Figura 17. Reconstituição de linfócitos T CD4 + CD25 + e linfócitos T CD4 + CD25 high em pacientes comesclerose múltipla após o TACTH ............................................................................................... 95Figura 18. Expressão de CTLA-4 e GITR em linfócitos T CD4 + CD25 high em pacientes com esclerosemúltipla antes e após o TACTH ................................................................................................... 96Figura 19. Porcentagem de células T CD4 + e T CD8 + produtoras de citocinas intracelulares do padrãoT H 1 em pacientes com diabete melito tipo 1 pré- e pós-TACTH ................................................ 100Figura 20. Porcentagem de células T CD4 + e T CD8 + produtoras de citocinas intracelulares do padrãoT H 2 em pacientes com diabete melito tipo 1 pré- e pós-TACTH ................................................ 101Figura 21. Porcentagem de células T CD4 + e T CD8 + produtoras de citocinas intracelulares do padrãoT H 1 em pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-TACTH ................................................... 104Figura 22. Porcentagem de células T CD4 + e T CD8 + produtoras de citocinas intracelulares do padrãoT H 2 em pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-TACTH ................................................... 105Figura 23. Padrões de reconstituição do repertório da cadeia Vβ do TCR pós-TACTH nos pacientescom diabete melito do tipo 1...................................................................................................... 114Figura 24. Mudanças qualitativas na composição do repertório da cadeia Vβ do TCR após o TACTHnos pacientes com diabete melito do tipo 1. .............................................................................. 116Figura 25. Padrões de reconstituição do repertório da cadeia Vβ do TCR pós-TACTH nos pacientescom esclerose múltipla .............................................................................................................. 127Figura 26. Mudanças na composição do repertório da cadeia Vβ do TCR após TACTH nos pacientescom esclerose múltipla .............................................................................................................. 129Figura 27. Expressão gênica de Foxp3 em células mononucleares do sangue periférico de pacientescom diabete melito do tipo após o TACTH. ............................................................................... 133Figura 28. Expressão gênica de Foxp3 em células mononucleares do sangue periférico de pacientescom esclerose múltipla após o TACTH...................................................................................... 134Figura A.1. Análise de subpopulações linfócitárias do sangue periférico.......................................... 187Figura A.2. Análise de subpopulações de células T do sangue periférico ........................................ 188Figura A.3. Análise de subpopulações de células T do sangue periférico ........................................ 189

Figura A.4. Análise de células T naive, efetoras e de memória, e de células dendríticas do sangueperiférico.................................................................................................................................... 190Figura A.5. Análise de populações de células T reguladoras CD4+CD25+ do sangue periférico ..... 191Figura A.6. Análise de subpopulações linfócitárias do sangue periférico.......................................... 192Figura B.1. Produção de citocinas intracelulares do padrão TH1 e TH2 por subpolulações linfócitárias.................................................................................................................................................. 193Figura B.2. Produção de citocinas intracelulares do padrão TH1 e TH2 por subpolulações linfócitárias.................................................................................................................................................. 194Figura B.3. Análise da expressão de CD69 por células T CD3+ estimuladas com PMA e Inonomicina.................................................................................................................................................. 195Figura C.1. Método de TCRBV CDR3 Spectratyping........................................................................ 196Figura C.2. Imagem de um gel de seqüenciamento.......................................................................... 197Figura H.1. Reação de Real time PCR para genes GAPDH (A) e Foxp3 (B).................................... 212Figura I.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com diabete melito do tipo 1 LSM (DM1), prée pós-TACTH............................................................................................................................. 214Figura J.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com diabete melito do tipo 1 ALSR (DM2),pré e pós-TACTH ...................................................................................................................... 219Figura K.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com diabete melito do tipo 1 WSL (DM3),pré e pós-TACTH ...................................................................................................................... 224Figura L.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com diabete melito do tipo 1 MGB (DM4),pré e pós-TACTH ...................................................................................................................... 229Figura M.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com diabete melito do tipo 1 RFLS (DM5),pré e pós-TACTH. .................................................................................................................... 233Figura N.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla GG (EM1), pré epós-TACTH................................................................................................................................ 238Figura O.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla SSS (EM3), pré epós-TACTH................................................................................................................................ 243Figura P.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla DFG (EM4), pré epós-TACTH................................................................................................................................ 248

Figura Q.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla ARJTA (EM5), pré epós-TACTH................................................................................................................................ 252Figura R.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla SHGE (EM6), pré epós-TACTH................................................................................................................................ 257Figura S.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla MFM (EM8), pré epós-TACTH................................................................................................................................ 261Figura T.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla GG (EM1), pré epós-TACTH................................................................................................................................ 266Figura U.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla OLP (EM10), pré epós-TACTH................................................................................................................................ 270Figura V.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT nos indivíduos-controle saudáveis DN12 e DN20 ...... 274Figura W.1. Freqüência das famílias Vβ do RCT em linfócitos T do sangue periférico do paciente comdiabete melito do tipo 1 ALSR (DM2), pré- e pós-TACTH.......................................................... 278Figura W.2. Freqüência das famílias Vβ do RCT em linfócitos T do sangue periférico do paciente comdiabete melito do tipo 1 LSM (DM1) (A) e WLS (DM3) (B) pré- e pós-TACTH........................... 279Figura W.3. Freqüência das famílias Vβ do RCT em linfócitos T do sangue periférico do paciente comdiabete melito do tipo 1 MGB (DM4) (A) e RLFS (DM5) (B) pré- e pós-TACTH ........................ 280Figura X.1. Freqüência das famílias Vβ do RCT em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla GG (DM1) (A) e SSS (EM3) (B) pré- e pós-TACTH...................................... 281Figura X.2. Freqüência das famílias Vβ do RCT em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla DFG (EM4) (A) e ARJTA (EM5) (B) pré- e pós-TACTH............................... 282Figura X.3. Freqüência das famílias Vβ do RCT em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla SHGE (EM6) (A) e MFM (EM8) (B) pré- e pós-TACTH ............................... 283Figura Y.1. Freqüência das famílias Vβ do RCT em linfócitos T do sangue periférico dos indivíduoscontrolesaudáveis DN12 e DN20.............................................................................................. 285

Tabela E.1. Valores de média, desvio padrão e mediana das subpopulações celulares analisadas noscontroles saudáveis e pacientes com esclerose múltipla, pré- e pós-transplante ...................... 203Tabela E.2. Valores de média, desvio padrão e mediana das subpopulações celulares analisadas noscontroles saudáveis e pacientes com esclerose múltipla, pré- e pós-transplante ...................... 204Tabela E.3. Valores de média, desvio padrão e mediana das subpopulações celulares analisadas noscontroles saudáveis e pacientes com esclerose múltipla, pré- e pós-transplante ...................... 205Tabela E.4. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controlessaudáveis e de pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-transplante, para cada subpopulaçãocelular analisada........................................................................................................................ 206Tabela E.5. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controlessaudáveis e de pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-transplante, para cada subpopulaçãocelular analisada........................................................................................................................ 207Tabela F.1. Valores da média, desvio padrão e mediana das populações de células T CD4+ ou CD8+produtoras de citocinas nos controles saudáveis e pacientes com diabete melito do tipo 1, pré- epós-transplante.......................................................................................................................... 208Tabela F.2. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controlessaudáveis e de pacientes com diabete melito do tipo 1 pré- e pós-transplante, para aspopulações de células T CD4+ ou CD8+ produtoras de citocinas ............................................. 209Tabela G.1. Valores da média, desvio padrão e mediana das populações de células T CD4+ ou CD8+produtoras de citocinas nos controles saudáveis e pacientes com esclerose múltipla, pré- e póstransplante.................................................................................................................................210Tabela G.2. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controlessaudáveis e de pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-transplante, para as populações decélulas T CD4+ ou CD8+ produtoras de citocinas ..................................................................... 211Tabela I.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comdiabete melito do tipo 1 LSM (DM1), pré- e pós-TACTH............................................................ 215Tabela J.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comdiabete melito do tipo 1 ALSR (DM2), pré- e pós-TACTH.......................................................... 220

Tabela K.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comdiabete melito WSL (DM3), pré- e pós-TACTH.......................................................................... 225Tabela L.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comdiabete melito do tipo 1 MGB (DM4), pré- e pós-TACTH........................................................... 230Tabela M.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comdiabete melito do tipo 1 RLFS (DM5), pré- e pós-TACTH.......................................................... 234Tabela N.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla GG (EM1), pré- e pós-TACTH...................................................................... 239Tabela O.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla SSS (EM3), pré- e pós-TACTH .................................................................... 244Tabela P.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla DFG (EM4), pré- e pós-TACTH.................................................................... 249Tabela Q.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente com comesclerose múltipla ARJTA (EM5), pré- e pós-TACTH ................................................................ 252Tabela R.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla SHGE (EM6), pré- e pós-TACTH ................................................................. 258Tabela S.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla MFM (EM8), pré- e pós-TACTH ................................................................... 262

Tabela T.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla WRS (EM9), pré- e pós-TACTH ................................................................... 267Tabela U.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla OLP (EM10), pré- e pós-TACTH .................................................................. 271Tabela V.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico dos indivíduoscontrolesaudáveis DN12 e DN20.............................................................................................. 275

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS• aa - aminoácido• APC - do inglês “antigen presenting cell” ou célula apresentadora de antígeno• ATG - do inglês “anti-thymocyte-globulin” ou globulina anti-linfocitária• BEAM - BCNU, etoposídeo, aracitin, melfalan• CD - do inglês "cluster of differentiation", ou grupamento de diferenciação• CDR - do inglês “complementary determinant region”, ou região determinante decomplementariedade• CTLA-4 - do inglês “citotoxic T lymphocyte-associated molecule-4”, ou molécula 4 associada aolinfócito T citotóxico• DAIs - Doenças auto-imunes• DEPC - dietilpirocarbonato• DM - Diabete melito do tipo 1• DMSO - dimetilsulfóxido• DNA - do inglês “desoxirobonucleic acid” ou ácido desoxirribonucléico• dNTP - desoxi-nucleotídeos trifosfato• EAE - do inglês “experimental autoimmune encephalomyelitis”, ou encefalite auto-imuneexperimental• EDSS - Expanded Disability Status Score• EDTA - sal di-sódico do ácido etilenodiaminotetracético• EM - Esclerose Múltipla• FACS - do inglês "Fluorescence-Activated Cell Sorter"• FITC - do inglês "fluorescein isothiocyanate" ou isotiocianato de fluoresceína• G-CSF - do inglês “granulocyte-colony stimulating factor” ou fator estimulador de colônias degranulócitos• GM-CSF - do inglês “granulocyte macrophage-colony stimulating factor” ou fator estimulador decolônias de granulócitos e macrófagos• HLA - do inglês “Human Leukocyte Antigens” ou antígenos leucocitários humanos• IFN-γ - do inglês “gamma interferon” ou interferon gama• IL - interleucina• LES - Lúpus eritematoso sistêmico• MBP - do inglês “myelin basic protein” ou proteína básica de mielina• MHC - do inglês “Major Histocompatibility Complex” ou Complexo Principal deHistocompatibilidade• PBMCs - do inglês “peripheral blood mononuclear cells”, ou células mononucleares de sangueperiférico• PBS - do inglês “phosphate buffer saline”, ou tampão salina fosfato• PE - "PhycoErythrin" ou ficoeritrina

• PCR - do inglês "polymerase chain reaction" ou reação de polimerização em cadeia• Pré-cond - pré-condicionamento• Pré-mob - pré-mobilização• q.s.p - quantidade suficiente para• TCR - inglês “T cell receptor”, ou receptor de célula T• RNA - do inglês “ribonucleic acid” ou ácido ribonucléico• RNAm - ácido ribonucléico mensageiro• RPMI - meio Roswell Park Memorial Institute• SBF - soro bovino fetal• TA - temperatura ambiente• TACTH - Transplante autólogo de células tronco hematopoéticas• TCTH - Transplante de células tronco hematopoéticas• T H - T "helper” - células T auxiliadoras• TNF-α - do inglês “tumor necrosis factor alpha” ou fator de necrose tumoral alfa• Treg - célula T reguladora• Tris - Tris-hidroximetil aminometano básico• Tx - transplante• Vα - região variável da cadeia alfa do receptor de célula T• Vβ - região variável da cadeia beta do receptor de célula T

SUMÁRIO1 Introdução ..................................................................................................................................... 11.1 Auto-imunidade e doenças auto-imunes.................................................................................. 21.2 Diabete melito do tipo 1 ........................................................................................................... 91.3 Esclerose múltipla.................................................................................................................. 131.4 Transplante de células tronco hematopoéticas em doenças auto-imunes ............................. 171.5 Mecanismos de ação do TCTH autólogo em doenças auto-imunes ...................................... 231.6 Repertório do receptor de células T em doenças auto-imunes .............................................. 282 Objetivos ..................................................................................................................................... 312.1 Objetivo geral......................................................................................................................... 322.2 Objetivos específicos ............................................................................................................. 323 Casuística, Material e Métodos.................................................................................................... 333.1 Delineamento do estudo ........................................................................................................ 343.2 Casuística .............................................................................................................................. 343.3 Controles saudáveis .............................................................................................................. 373.4 Isolamento das células mononucleares do sangue periférico ................................................ 373.5 Imunofenotipagem das subpopulações celulares do sangue periférico ................................. 393.6 Detecção de citocinas intracelulares em linfócitos T ativados................................................ 413.7 Extração de RNA pelo método de Trizol ................................................................................ 433.7.1 Eletroforese de amostras de RNA em gel de agarose sob condições desnaturantes.... 443.8 Transcrição reversa ............................................................................................................... 453.8.1 Validação da transcrição ............................................................................................... 453.9 Método de TCRBV CDR3 Spectratyping................................................................................ 463.9.1 Reação de PCR (Vβ-Cβ) para determinação das famílias Vβ do Receptor de Células(TCR) ...................................................................................................................................... 463.9.2 Reação de elongação Vβ-Cβ (Run-off).......................................................................... 473.9.3 Preparo do gel de seqüenciamento............................................................................... 473.9.4 Preparo das amostras e aplicação no gel de seqüenciamento...................................... 48

3.9.5 Perfil da região CDR3 do RTC, cálculo do tamanho da região CDR3 do RTC e dafreqüência das famílias Vβ, pelo método de TCRBV CDR3 Spectratyping.................................. 493.10 Análise da expressão de Foxp3 por Real Time RT- PCR .................................................. 513.11 Análise estatística.............................................................................................................. 534 Resultados................................................................................................................................... 554.1 Resultados Clínicos ............................................................................................................... 564.1.1 Pacientes com esclerose múltipla ................................................................................. 564.1.2 Pacientes com diabete melito do tipo 1 ......................................................................... 574.2 Avaliação da reconstituição imunológica após o TACTH ....................................................... 624.2.1 Pacientes com diabete melito do tipo 1 ......................................................................... 624.2.2 Pacientes com esclerose múltipla ................................................................................. 814.3 Avaliação do perfil de citocinas após o TACH........................................................................ 974.3.1 Pacientes com diabete melito do tipo 1 ......................................................................... 984.3.2 Pacientes com esclerose múltipla ............................................................................... 1024.4 Análise da diversidade do repertório de linfócitos T............................................................. 1064.4.1 Pacientes com diabete melito do tipo 1 ....................................................................... 1094.4.2 Pacientes com esclerose múltipla ............................................................................... 1194.5 Análise da expressão do gene Foxp3 em células mononucleares....................................... 1324.5.1 Pacientes com diabete melito do tipo 1 ....................................................................... 1324.5.2 Pacientes com esclerose múltipla ............................................................................... 1335 Discussão.................................................................................................................................. 1355.1 Avaliação da reconstituição imunológica após o TACTH ..................................................... 1365.2 Perfil de citocinas após o TACTH ........................................................................................ 1545.3 Diversidade do repertório de células T após o TACTH ........................................................ 1575.4 Análise da reconstituição de células T reguladoras e da expressão de Fopx3 após o TACTH............................................................................................................................................... 1626 Conclusões................................................................................................................................ 166Referências ...................................................................................................................................... 170Apêndices e Anexo........................................................................................................................... 186

1 Introdução

Introdução 21.1 Auto-imunidade e doenças auto-imunesAs doenças auto-imunes (DAIs) constituem um grupo complexo e heterogêneo de doençasque ocorrem em 3-5% da população geral. As DAIs são caracterizadas pela perda da tolerânciaimunológica a antígenos próprios e conseqüente destruição tecidual por células auto-reativas e autoanticorpos(revisado por Davidson e Diamond, 2001; Marrack et al., 2001). Nas doenças auto-imunesórgão-específicas (por exemplo, diabete melito do tipo 1 e esclerose múltipla), as células autoreativase auto-anticorpos são direcionados contra componentes próprios expressos somente numtecido ou tipo celular específico. Nas doenças auto-imunes sistêmicas (por exemplo, lúpuseritematoso sistêmico, esclerose sistêmica e artrite reumatóide), as células auto-reativas e autoanticorpossão direcionados contra vários auto-antígenos que são usualmente expressos numagrande variedade de tecidos, estando presentes no núcleo, no citoplasma ou na superfície celular(revisado por Davidson e Diamond, 2001; Marrack et al., 2001). Critérios para auto-imunidade foramdefinidos por Rose e Bona (1993), que postularam que a prova direta da auto-imunidade emhumanos é a capacidade de transferir adotivamente a doença pela transferência de células imunes;prova indireta é a capacidade de transferir uma doença auto-imune experimental (que mimetiza adoença auto-imune humana) pela transferência adotiva de células imunes, e a demonstração de quea doença responde a agentes imunossupressores.As DAIs constituem uma importante causa de morbidade e mortalidade ao redor do mundo.Várias dessas doenças são muito difíceis de tratar e impossíveis de curar, pela razão óbvia de que osalvos da resposta imune, os auto-antígenos, não podem ser eliminados. As DAIs representam umproblema econômico-social relevante, pois afetam freqüentemente adultos jovens, principalmentemulheres (revisado por Rioux e Abbas, 2005).Durante vários anos o dogma central da imunologia baseava-se na deleção clonal de célulasauto-reativas como único mecanismo de tolerância imunológica para a prevenção da auto-imunidade.A visão atual sobre tolerância imunológica reconhece que um nível baixo de auto-reatividade éfisiológico (Dighiero e Rose, 1999) e crucial para o funcionamento normal do sistema imune. Autoantígenosajudam a formar o repertório de linfócitos maduros e a sobrevivência das células T naive ede células B na periferia requer exposições contínuas a antígenos próprios (Goldrath e Bevan, 1999).Uma vez que não existem diferenças fundamentais entre as estruturas de antígenos próprios e deantígenos não-próprios, a idéia é que os linfócitos evoluíram não para distinguir o “próprio” do “não-

Introdução 3próprio”, com tinha sido proposto anteriormente, mas para responder a antígenos somente em certosmicroambientes, geralmente na presença de citocinas e outros fatores inflamatórios. Assim,atualmente a auto-reatividade não é mais vista mais como patológica, mas sim como fisiológica. Umavez que a auto-reatividade é fisiológica, o desafio é entender como isso se torna um processopatológico e como as células imunes, principalmente células T e B, contribuem para a injúria tecidual(Davidson e Diamond, 2001).Portanto, as DAIs se desenvolvem quando linfócitos auto-reativos escapam dos mecanismosde tolerância imunológica, são ativados e começam a atacar os tecidos próprios. Embora osmecanismos pelos quais isso ocorre ainda não sejam completamente esclarecidos, acredita-se que odesenvolvimento de DAIs é resultante de uma interação entre fatores genéticos, fatores ambientais eeventos estocásticos (revisado por Rioux e Abbas, 2005). As baixas taxas de concordância para asDAIs entre gêmeos idênticos sugerem uma contribuição fundamental de fatores ambientais paradesenvolvimento da auto-imunidade. Os genes de suscetibilidade descritos são relacionados amoléculas de HLA, citocinas, moléculas co-estimuladoras, vias de sinalização de apoptose,receptores de antígenos, células reguladoras, depuração de imunocomplexos, e dentre outros(revisado por Marrack et al., 2001).De acordo com a suscetibilidade genética, as DAIs podem ser classificadas como simples oucomplexas. As DAIs simples são causadas por alterações num único gene, tais como as doenças:ALPS (autoimmune lymphoproliferative syndrome; causada por mutações nos genes Fas ou FasL,que levam à ausência de apoptose de linfócitos T e B auto-reativos), a IPEX (immune dysregulation,polyendocrinopathy, enteropathy , X-linked syndrome; causada por mutação do gene Foxp3, que levaà ausência de geração de células T reguladoras) e a APS-1 (autoimmune polyendocrine syndrome;causada por mutação do gene AIRE, que leva à expressão diminuída de auto-antígenos no timo,resultando na seleção negativa defeituosa de células T auto-reativas).Por outro lado, as DAIs complexas resultamda combinação de vários alelos desuscetibilidade (de lócus diferentes), fatores ambientais (tais como níveis de hormônios, infecçõesvirais ou microbianas, dieta) e de eventos estocásticos. Exemplos de DAIs complexas são o lúpuseritematoso sistêmico, esclerose sistêmica, artrite reumatóide, diabete melito do tipo 1, esclerosemúltipla, doença de Crohn, dentre outras (revisado por Rioux e Abbas, 2005).

Introdução 4Mecanismos de tolerância imunológicaTolerância central e periféricaA diversidade dos repertórios de células T e B são gerados durante o desenvolvimentodessas células no timo e na medula óssea, respectivamente, através de mecanismos derecombinação somática que envolvem o rearranjo dos genes dos TCRs (T cell receptors, oureceptores de células T) e dos BCRs (B cell receptors, ou receptores de células B), resultando emuma diversidade enorme de células T ou B que expressam receptores de diferentes especificidades.Cada célula T ou B apresenta um único receptor rearranjado entre de bilhões de possibilidades. Nocaso das células B, diversidade adicional é gerada pelo processo de hipermutação somática, queconsiste na substituição de nucleotídeos nos genes dos BCRs, e ocorre nos órgãos linfóidesperiféricos durante fases tardias da resposta imune.O repertório de células T é determinado pelos processos de seleção positiva e negativa queocorrem no timo, durante os quais os timócitos são selecionados e amadurecem. A afinidade do TCRpor complexos MHC-peptídeo próprio é o parâmetro crucial que determina o destino do timócito econstitui a base dos processos seleção positiva e negativa. Assim, timócitos cujos TCRs nãoreconhecem ou reconhecem com afinidade muito baixa os complexos MHC-peptídeos-próprios,morrem por negligência, sendo este o destino da maioria dos timócitos. Os timócitos duplo-positivosque expressam TCRs com baixa afinidade por complexos MHC-peptídeos próprios, apresentados porcélulas epiteliais do córtex tímico do indivíduo, recebem sinais para sobreviver e se diferenciar emcélulas T maduras. Esse processo é chamado de seleção positiva. Já, os timócitos duplo-positivoscujos TCRs apresentam alta afinidade por complexos MHC-peptídeos próprios são selecionados peloprocesso de seleção negativa que será discutido adiante.Entre 20 a 50% dos TCRs e dos BCRs gerados pela recombinação V(D)J ligam-se comafinidade potencialmente perigosa à auto-antígenos (revisado por Goodnow et al., 2005). Uma vezque somente 3-5% da população desenvolve doenças auto-imunes, é notável que esse númeroimenso de receptores auto-reativos é tão bem regulado na maioria das pessoas. Esta regulaçãodeve-se a mecanismos de tolerância imunológica que lidam com as células T e B que expressamesses receptores auto-reativos com alta afinidade por antígenos próprios. Os mecanismos detolerância imunológica pode ser divididos em mecanismos de tolerância central e mecanismos detolerância periférica. Na tolerância central, linfócitos imaturos que reconhecem antígenos próprios

Introdução 5com alta afinidade nos órgãos linfóides centrais (medula óssea para as células B e timo para ascélulas T) morrem por apoptose (deleção clonal), ou fazem “edição” do receptor, ou sãofuncionalmente “inativados” (anergia clonal). Na tolerância periférica, os linfócitos auto-reativosmaduros que encontram auto-antígenos na periferia são mortos por apoptose induzida por ativação,ou são funcionalmente “inativados” (anergia clonal), ou são controlados por mecanismos supressoresmediados por células T reguladoras (revisado por Walker e Abbas, 2002; Goodnow et al., 2005).O principal mecanismo de tolerância central é a deleção clonal, que constitui a morte doslinfócitos que apresentam receptores “proibidos” ou auto-reativos com alta afinidade por antígenospróprios, por apoptose. Outro mecanismo é a edição do receptor, ou seja, a célula que apresenta umreceptor com alta afinidade por antígenos próprios pode “editar” esse receptor, passando por outrarecombinação V(D)J para apresentar um receptor diferente que não seja auto-reativo. Esse é um dosprincipais mecanismos de tolerância no desenvolvimento de células B. O terceiro mecanismo detolerância central constitui em mudanças bioquímicas intrínsecas e mudanças na expressão gênicaque reduzem a capacidade da célula de ser ativada através do receptor auto-reativo. Esse fenômenoé chamado de anergia clonal, ou seja, um estado de não-responsividade ao antígeno específico,mesmo em condições ótimas de estimulação (revisado por Hogquist et al., 2005).Em relação às células T, o mecanismo principal da tolerância central é a deleção clonal, ouseja, a eliminação dos timócitos que expressam TCRs com alta afinidade por antígenos própriosapresentados por células dendríticas e células epiteliais da medula do timo (deleção clonal). Osmecanismos de tolerância central por anergia clonal e edição de receptor também ocorrem, mas têmum papel menos importante. Esses três mecanismos “inativam” ou eliminam células T auto-reativasde alta afinidade e são considerados os mecanismos de seleção negativa (revisado por Hogquist etal., 2005). No entanto, vale notar que durante a seleção negativa no timo, algumas células T queapresentam afinidade alta por auto-antígenos são selecionadas por mecanismos ainda nãocompletamente esclarecidos, resultando na diferenciação de células T com fenótipo “regulador”(revisado por Hogquist et al., 2005).Finalmente, se células T e B auto-reativas evadirem os três mecanismos de tolerância centraldescritos acima, fenômeno chamado de “ignorância imunológica”, mecanismos de tolerânciaperiférica se tornam responsáveis pelo controle das mesmas na periferia (revisado por Walker e

Introdução 6Abbas, 2002; Goodnow et al., 2005). Dentre eles, vale destacar o mecanismo periférico de supressãoativa das células auto-reativas por células T reguladoras que será discutido a seguir.Células T reguladorasComo discutido anteriormente, o sistema imune desenvolveu vários mecanismos paraestabelecer e sustentar a auto-tolerância imunológica (a ausência de resposta a antígenos próprios),incluindo eliminação física (deleção clonal) ou inativação funcional (anergia). Existem váriasevidências de que a supressão ativa de células T auto-reativas, mediada por células T, constitui umoutro mecanismo essencial de auto-tolerância (revisado por Shevach, 2000; Maloy e Powrie, 2001;Coutinho et al., 2001; Sakaguchi, 2004). Embora a idéia de células T que controlam negativamenterespostas imunes não seja nova para os imunologistas, já houve grande controvérsia em relação àsua existência e se elas constituem uma entidade celular funcionalmente distinta. Além disso, houvedúvidas de sua importância no controle de desordens imunológicas como as doenças auto-imunes.Nos últimos anos, entretanto, ressurgiu o interesse pelas células T supressoras ou reguladoras emvárias áreas da imunologia básica e clínica (revisado por Sakaguchi, 2004; Baecher-Allan e Hafler,2004). Este interesse é parcialmente devido ao melhor entendimento de que o sistema imune normalproduz endogenamente, uma subpopulação de células T que é altamente especializada para funçãosupressora e que anormalidades no número ou função dessas células podem ser a causa dedoenças auto-imunes ou inflamatórias em animais ou em humanos (revisado por Sakaguchi, 2004).A co-existência de células T auto-reativas e protetoras foi revelada pela auto-imunidadesistêmica observada em camundongos linfopênicos após a transferência de células T CD4 + naive, oupela proteção contra o desenvolvimento da auto-imunidade conferida pela co-transferência de umasubpopulação de células T CD4 + que expressa cadeia α do receptor de IL-2 (CD25) (Sakaguchi et al.,1995). Evidências recentes sugerem que as próprias células T CD4 + CD25 + são auto-reativas, e queesta propriedade tem um papel essencial no desenvolvimento da linhagem de células T reguladoras(Tregs). Assim, a auto-reatividade pode ser benéfica como parte de um mecanismo celular dedicadoà prevenção da auto-imunidade (revisado por Kronenberg e Rudensky, 2005).A maioria das Tregs são CD4 + e expressam constitutivamente a molécula CD25 (cadeia α doreceptor de IL-2, IL-2Rα) (Sakaguchi et al., 1995). São produzidas normalmente pelo timo como umasubpopulação de células T funcionalmente distintas e maduras, e constituem aproximadamente 2-

Introdução 710% da população de células T CD4 + (revisado por Sakaguchi, 2004). Além da geração tímica decélulas Tregs CD4 + CD25 + , células T periféricas não-Treg podem adquirir a expressão de Foxp3 econverter-se em células Tregs in vivo após estimulação antigênica crônica ou em condições delinfopenia (Apostolou e Boehmer, 2004; Curotto de Lafaille et al., 2004; Walker et al., 2003).As células Tregs CD4 + CD25 + produzem citocinas reguladoras tais como IL-10, IL-4 e TGF-β(transforming growth factor-β), e também expressam preferencialmente as moléculas CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4, regulador negativo da ativação de células T; receptor para CD80 eCD86), GITR (glucocorticoid-induced TNFR-family related receptor) e PD-1 (programmed death-1).Entretanto, a identificação de Tregs durante respostas imunes ou em tecidos inflamados é complicadaporque a maioria desses marcadores, inclusive o CD25, são também expressos em células T recémativadasnão-reguladoras (revisado por Sakaguchi, 2004). Recentemente, a molécula CD27 foiidentificada como um marcador estável em células Tregs que pode ser usado em conjunto com CD25para distinguir Tregs de células T efetoras em tecidos inflamados (Ruprecht et al., 2005).As Tregs CD4 + CD25 + são funcionalmente competentes quando isoladas ex vivo, e apósestimulação pelo TCR são capazes de suprimir a proliferação e produção de IL-2 de células TCD4 + CD25 - ou células T CD8 + de maneira contato-dependente (revisado por Shevach, 2000;Sakaguchi, 2004). Experimentos de transferência adotiva usando células marcadas revelaram que ascélulas Tregs proliferam in vivo e sobrevivem por longos períodos, mostrando sua capacidade deauto-renovação (Gavin et al., 2002). Vale ressaltar que, após expansão, as células Tregs mantém ouaté aumentam sua capacidade supressora. Estes dados, em combinação com a origem tímica dascélulas Tregs, sugerem que estas células constituem mesmo uma linhagem celular específica.Vários mecanismos tentar explicar a supressão mediada por células Tregs in vivo.Primeiramente, a expressão elevada pelas células Tregs do IL-2R de alta afinidade pode resultar nacompetição pela IL-2 com as outras células. No entanto, é improvável que esse seja o principalmecanismo, pois mesmo na presença de IL-2 exógena, as células Tregs inibem a regulação positivade RNAm de IL-2 em células T respondedoras (Thornton et al., 2004). Além da privação de IL-2, duascitocinas imunossupressoras, IL-10 e TGF-β, foram implicadas num mecanismo supressor ativomediado por células Tregs in vivo (revisado por Sakaguchi, 2004). No entanto, outros tipos celulares,incluindo células T não-reguladoras, produzem essas citocinas.

Introdução 8Estudos in vitro mostraram que as células Tregs suprimem respostas de células T CD4 + ou TCD8 + por um mecanismo contato-dependente, mas independente de IL-10 e TGF-β (revisado porShevach, 2000). Foi sugerido que esse mecanismo envolve a sinalização “reversa” pelo crosslinkingde moléculas B7 na superfície de células dendríticas ou de células T, após ligação à CTLA-4 (oreceptor de alta afinidade para as moléculas B7 que é expresso em níveis elevados pelas célulasTregs). Em células dendríticas, o crosslinking das moléculas B7 leva à indução de indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO), resultando na depleção local de triptofano (Mellor et al., 2004). Em células T, asconseqüências bioquímicas da ligação das moléculas B7 pelo CTLA-4 expresso nas células Tregssão desconhecidas. Foi mostrado também que, em camundongos e humanos, células Tregs ativadassão capazes de matar células T-alvo pela via dependente da perforina e granzima (Grossman et al.,2004). Em resumo, apesar do acúmulo de informação sobre os mecanismos moleculares da funçãosupressora das células Tregs CD4 + CD25 + , estes ainda não foram totalmente identificados eesclarecidos (revisado por Kronenberg e Rudensky, 2005).Embora a expressão de CD25 venha sendo essencial para o isolamento e enumeração dascélulas Tregs CD4 + CD25 + , seu emprego como um marcador fenotípico de células Tregs CD4 + CD25 +durante respostas imunes é muito limitado, pois células T CD4 + e T CD8 + recém-ativadas, nãoreguladoras,expressam transientemente a molécula CD25. A busca por um marcador específico decélulas Tregs em camundongos resultou na identificação do fator de transcrição Foxp3, que éexpresso em células Tregs mas não em células T recentemente ativadas. Foi mostrado que ascélulas Tregs CD4 + CD25 + expressam especificamente o gene regulador Foxp3, que codifica um fatorde transcrição chamado de forkhead transcription factor 3, que controla seu desenvolvimento efunção (Hori et al., 2003; Fontenot et al., 2003; Khattri et al., 2003). A expressão retroviral do geneFoxp3 em células T periféricas CD4 - CD25 + de camundongos ou humanos resultou na aquisição dafunção supressora por essas células. Portanto, a expressão de Foxp3 pode ser usada como ummarcador molecular específico para células Tregs CD4 + CD25 + (revisado por Kronenberg e Rudensky,2005).Alguns anos antes da identificação do Foxp3 como marcador específico de células Tregs,mutações no gene Foxp3 (localizado no cromossomo X) tinham sido identificadas como causa deuma desordem auto-imune fatal observada em pacientes (denominada IPEX, immune dysregulation,polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome) e em camundongos mutantes que desenvolvem

Introdução 9espontaneamente esta doença auto-imune (denominados scurfy mice). A doença se manifesta emhomens, mas não em mulheres heterozigotas. No entanto, aproximadamente 50% das células Tdessas mulheres não expressam Foxp3 (Bennett et al., 2001; Brunkow et al., 2001).Durante o desenvolvimento das células T, timócitos com alta afinidade por complexos MHCpeptídeopróprio podem vir a regular positivamente o gene Foxp3 em resposta ao aumento do tempoou da força de sinalização pelo TCR, em combinação com a sinalização por CD28 e com outrossinais desconhecidos. Após a indução de Foxp3, timócitos se transformam numa linhagem de célulasTregs e têm função de manter as respostas de células T sob controle, desse modo prevenindo a autoimunidade(revisado por Fontenot e Rudensky, 2005; Kronenberg e Rudensky, 2005).Embora outras populações de células T potencialmente supressoras tenham sido descritas(células NKT, T R 1, T H 3 e outras), seus mecanismos de geração e função ainda não estão bemesclarecidos, bem como suas funções supressoras ainda não foram realmente comprovadas(revisado por Bach, 2003). Desse modo, atualmente, os pesquisadores têm se concentrado no estudodas funções das células Tregs CD4 + CD25 + Foxp3 + . Existem várias evidências atuais de que as célulasTregs CD4 + CD25 + Foxp3 +atuam na supressão da ativação imune, funcionando como mediadorescríticos da homeostasia imune e da auto-tolerância (Fontenot e Rudensky, 2005). Assim, tem sidomostrado que a população de células Tregs CD4 + CD25 + Foxp3 + é ativamente engajada no controle deuma variedade de respostas imunes fisiológicas e patológicas e podem ser exploradas não somentepara a prevenção de ou tratamento de doenças auto-imunes, mas também para a indução detolerância a antígenos não-próprios (tolerância a transplantes), controle negativo de respostas imunesaberrantes (como alergias) e aumento da defesa do hospedeiro (por exemplo, na imunidade tumoral eimunidade microbiana) (revisado por Sakaguchi, 2004; Sakaguchi, 2005).1.2 Diabete melito do tipo 1O diabete melito do tipo 1 (DM), é uma doença auto-imune órgão-específica mediada porcélulas T de padrão T H 1, e caracterizada pela destruição seletiva de células β pancreáticasprodutoras de insulina. A doença clínica manifesta-se somente após destruição de aproximadamente80-90% das células β. O processo destrutivo das células β leva à falta do hormônio insulina, queresulta num estado de hiperglicemia, devido ao aumento da produção hepática de glicose ediminuição da captura de glicose da circulação. Na ausência de insulina, também ocorre um aumento

Introdução 10da quebra de gordura e da oxidação de ácidos graxos, que resulta numa excessiva produção decetonas. Se não tratados, os distúrbios metabólicos levam progressivamente à depressão do sistemanervoso central, coma e morte. Assim, pacientes necessitam de tratamento permanente com insulinaexógena para sobrevivência. Algumas complicações crônicas graves são os problemas vascularesque levam à insuficiência renal, cegueira, doença cardíaca e úlceras crônicas. A taxa de destruiçãodas células β varia de paciente para paciente, mas tende a ser mais agressiva em crianças eadolescentes. O diabete melito do tipo 1 desenvolve-se mais freqüentemente durante a infância eadolescência, mas pode aparecer na idade adulta também (revisado por Notkins et al., 2002).O DM é tratado pela terapia convencional com insulina ou terapia intensiva com insulina(conhecida como ITT). Ensaios clínicos de tratamentos com ciclosporina, azatioprina/corticóides, ouanticorpo monoclonal anti-CD3, visando à preservação funcional das células β, vêm sendo realizadoscom resultados significativos, mas insuficientes para aplicação clínica rotineira (revisado por Palmeret al, 2004). Mais recentemente, o transplante de ilhotas pancreáticas vem sendo proposto comoalternativa terapêutica para o DM.A suscetibilidade ao DM é determinada por fatores genéticos e ambientais. A importância daherança genética do DM foi determinada por estudos de incidência da doença em famíliasacometidas. O risco de desenvolvimento de DM em parentes de indivíduos diabéticos de primeirograu é de 5-6%, comparado com o risco de 0,4% na população geral. Além disso, a taxa deconcordância para a doença é muito maior em gêmeos monozigóticos (30-40%) do que em gêmeosdizigóticos (6%) (revisado por Notkins e Lernmark, 2001; Notkins, 2002; Kelly et al., 2003). Emboraesta observação seja indicativa da grande contribuição genética para o risco de desenvolvimento deDM, a relativa baixa taxa de concordância entre gêmeos idênticos sugere que os genes desuscetibilidade têm baixa penetrância, ou seja, nem todos os indivíduos de alto risco para DM irãodesenvolver a doença.Os primeiros genes de suscetibilidade para DM encontrados foram os genes que codificampara o sistema HLA, localizados no cromossomo 6p21. Dentre os alelos de HLA que conferemsuscetibilidade estão o DRB1 (que codificam as moléculas DR3 e DR4) e os alelos DQA1 e DQB1(que codificam as moléculas DQ2 e DQ8, respectivamente). Estudos subseqüentes demonstraramuma associação entre o DM e a região do gene da insulina no cromossomo 11p. Embora outros lócusde suscetibilidade tenham sido descritos posteriormente, estudos demonstraram que o lócus IDDM1

Introdução 11(situado na região dos genes do HLA) é o principal determinante genético do risco dedesenvolvimento de DM, responsável por 42% da herança genética familiar de DM. Por outro lado, olócus IDDM2 (região do gene da insulina) contribui com 10% da suscetibilidade genética (revisado porNotkins et al., 2002; Kelly et al., 2003).A discordância entre gêmeos idênticos reflete a geração de diferentes repertórios de célulasimunes através dos rearranjos randômicos dos genes que codificam os receptores das células T e B,e a ocorrência de eventos estocásticos ou de mutações somáticas. Além disso, indica a importânciados fatores não-genéticos ou ambientais no desenvolvimento do DM. A importância dos fatoresambientais é apoiada pela variação sazonal da incidência do DM, com a maioria dos casos ocorrendoentre o outono ou inverno, e a variação geográfica da incidência da doença. Os fatores ambientaisrelacionados ao o risco de desenvolvimento do DM incluem infecções virais (principalmente pelosvírus coxsackie B4 e da rubéola), dieta na infância, vacinação, influências climáticas, toxinas eestresse (Knip e Akerblom , 1999).O estágio precoce do DM é caracterizado por uma insulite, devida à infiltração das ilhotaspancreáticas por células mononucleares imunes, incluindo linfócitos T e B, monócitos, célulasdendríticas e células NK (Itoh et al, 1993). Embora ela possa refletir uma resposta inflamatória normalem resposta à injúrias teciduais causadas por infecções virais por exemplo, foi mostrado que oinfiltrado celular contribui diretamente para a destruição das células β pancreáticas (revisado porRoep, 2003). Macrófagos e células dendríticas são as primeiras células a infiltrarem as ilhotaspancreáticas. Além de apresentaram antígenos das células β aos linfócitos, uma vez ativadosproduzem citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF-α e INF-β) e óxido nítrico, e contribuemtambém para a destruição das células β (revisado por Mathis et al., 2001). A detecção de células Tauto-reativas contra auto-antígenos presentes nas células β pancreáticas, que incluem a insulina, oGAD (glutamic acid decarboxylase) e a IA-2 (protein tyrosine phosphatase 2), no sangue periférico deindivíduos diabéticos recém-diagnosticados, demonstrou que mecanismos de auto-imunidade estãoenvolvidos na destruição das células β (Naquet et al., 1988; Atkinson et al., 1992; Hawkes et al.,2000).Estudos em animais demonstraram que as células T têm um papel essencial na patogênesedo DM. Os camundongos NOD (Non-Obese Diabetic) desenvolvem espontaneamente diabeteinsulino-dependente e compartilham várias características imunológicas e patológicas com a doença

Introdução 12humana (revisado por Anderson e Bluestone, 2005). O desenvolvimento da doença nesses animaisrequer a presença de ambas células T CD4 + e CD8 + . Camundongos NOD sem timo ou NOD/scid(severe combined immundeficiency) não desenvolvem insulite ou diabete (Ogawa et al., 1985;Christianson et al., 1993). Além disso, células T isoladas de camundongos NOD são capazes detransferir a doença para animais não-diabéticos e acelerar o início da diabete em camundongos NODneonatos (Wicker et al., 1986; Bendelac et al., 1987). Embora ambas as células T CD4 + T H 1 e célulasT CD8 + sejam importantes na patogênese do DM, trabalhos mostraram que as células T CD8 +citotóxicas são as principais células efetoras na destruição das células β pancreáticas.Citocinas do padrão T H 1 produzidas pelas células T CD4 + e também por T CD8 + são essenciaispara patogênese da DM, pois potencializam respostas imunes mediadas por células, incluindo aativação de macrófagos. Dois mecanismos celulares de destruição das células β foram descritos, omecanismo associado ao reconhecimento (1) e o mecanismo associado à ativação (2) (revisado porMathis et al., 2001; Roep et al., 2003; Jun et al., 2002). No mecanismo (1) a célula T CD8 + é ativadadiretamente pelo reconhecimento de antígenos das células β apresentados por moléculas de MHC declasse I presentes nas próprias células β pancreáticas. A ativação das células T CD8 +conseqüentemente provoca a morte das células β por contato célula-célula através das vias desinalização por Fas/FasL (Itoh et al., 1997) ou perforina/granzima (Kagi et al., 1997). De acordo com osegundo mecanismo (2), as células T CD4 + ou T CD8 + reconhecem antígenos das células βindiretamente, apresentados por APCs (células dendríticas ou macrófagos) no contexto de moléculasde MHC de classe II ou classe I, respectivamente. A ativação resultante das células T leva à mortedas células β mediada por células T CD8 + citotóxica (através de receptores de superfície Fas/FasL ouTNF-α/TNF-R), à liberação de citocinas pró-inflamatórias e mediadores de morte celular pelas célulasT, à ativação de macrófagos com conseqüente aumento de sua capacidade citotóxica, e à ativaçãodas células β e estimulação da produção de mediadores de morte célula por elas mesmas (revisadopor Mathis et al., 2001; Roep et al., 2003; Jun et al., 2002).A etiologia auto-imune do DM é também demonstrada pela presença de auto-anticorposcirculantes específicos contra antígenos das células β pancreáticas. Estes auto-anticorpos sãodetectados em 85-90% dos indivíduos com DM ao diagnóstico. Ainda não está claro se elesparticipam diretamente da destruição das células β ou aparecem secundariamente devido à liberação

Introdução 13de auto-antígenos das ilhotas danificadas por outros componentes do sistema imune. Não obstante,os auto-anticorpos são ótimos marcadores da patogênese do DM. O aparecimento deles precede oinício da doença clínica, freqüentemente em vários meses a vários anos (revisado por Notkins, 2002),o que explica o fato dos pacientes apresentarem auto-anticorpos contra vários antígenos das célulasβ no momento em que os sintomas clínicos se tornam aparentes. Desse modo, a presença de váriosauto-anticorpos pode ser usada como um marcador sensível para prever os riscos dedesenvolvimento do DM, embora alguns indivíduos positivos para auto-anticorpos não desenvolvam adoença auto-imune (Bingley et al., 1997).1.3 Esclerose múltiplaA esclerose múltipla (EM) é uma doença auto-imune inflamatória, mediada por células T depadrão T H 1, que afeta especificamente o sistema nervoso central (SNC). A EM, assim como outrasDAIs, geralmente se manifesta em adultos jovens, acometendo principalmente mulheres.Em seu início, a EM é clinicamente caracterizada como EM surto-remissiva (EM-SR,observada em 85-90% dos pacientes) ou EM progressiva primária (EM-PP, observada em 10-15%dos pacientes). As recaídas (ou “ataques”, ou “surtos”) são tipicamente subagudas, uma vez que ossintomas se desenvolvem durante algumas horas a vários dias, persistem por vários dias a semanas,e depois se dissipam gradualmente. Os surtos são provavelmente causados pela entrada de células Tauto-reativas ativadas (anti-mielina) no SNC, causando inflamação aguda associada à edema. Acapacidade dos esteróides de rapidamente interromper os sintomas da EM, sugere que o edemaagudo e sua subseqüente resolução correspondem à recaída clínica (surto) e à remissão,respectivamente.A progressão dos pacientes com EM-SR é muito variável. Em geral, se não forem tratadosaproximadamente 50% dos pacientes necessitarão de apoio para caminhar dentro de dez anos apóso início da EM. No início da doença, as lesões que capturam gadolíneo por ressonância magnéticanuclear (RMN) são freqüentes e consistentes com o influxo de células auto-reativas ativadas no SNC,causando uma perturbação da barreira hemato-encefálica. O aumento na freqüência dos surtos erecuperação inadequada nos primeiros anos da doença clínica predizem uma deterioração maisrápida. A observação de múltiplas lesões que capturam gadolíneo por RMN também prediz um cursomais grave da doença. (revisado por Hafler, 2004; Hemmer et al, 2002; Compston e Coles, 2002).

Introdução 14Entretanto, com o tempo, a capacidade de recuperação após os surtos diminui e aincapacidade neurológica começa a piorar. Aproximadamente 40% dos pacientes com EM-SR paramde apresentar os surtos e desenvolvem uma desordem neurodegenerativa progressiva secundária,associada à inflamação crônica do SNC, conhecida como EM progressiva secundária (EM-PS). Aevolução da forma progressiva secundária da doença é associada com uma diminuição significanteda freqüência de lesões que capturam gadolíneo e do volume do parênquima cerebral (atrofiacerebral). Enquanto no início, a forma EM-SR era sensível à imunossupressão, à medida que o tempopassa, a resposta da EM à imunoterapia diminui e pode desaparecer em formas tardias da EM-PS.Atualmente, ao invés de ser considerada como uma doença com duas formas, a EM vemsendo considerada uma doença contínua, mas caracterizada inicialmente por eventos inflamatóriosagudos, e posteriormente pela indução secundária de um processo neurodegenerativo, refratário àimunoterapia. Já a forma primária progressiva é caracterizada desde o início pela ausência de surtos,mas por um declínio gradual da incapacidade neurológica. Clinicamente, essa forma de EM estáassociada à falta de resposta a qualquer forma de imunoterapia (revisado por Hafler, 2004; Hemmeret al, 2002; Compston e Coles, 2002).O conceito da EM como uma doença auto-imune inflamatória deriva do fato que a EMresponde a tratamentos imunomoduladores ou imunosupressores. Glucocorticóides sãoadministrados em altas doses durante as exacerbações clínicas da doença e atuam reduzindo ainflamação, o edema e produção de citocinas pró-inflamatórias. O tratamento com INF-β ou comGlatiramer-acetate (GA, copolymer-1, Cop-1) constituem terapias aprovadas para a EM-SR. Ademais,vários agentes quimioterapêuticos que apresentam efeitos imunossupressores mais intensos eduradouros, tais como a ciclofosfamida, mixantrone e azatioprina, são usados em estágios maisavançados da doença, ou seja, na transição de EM-SR para EM-PS, ou em pacientes que nãorespondem às terapias aprovadas (revisado por Hemmer et al, 2002; Hafler, 2004; Sospedra e Martin,2005).A etiologia da EM ainda não foi esclarecida, mas com base no conhecimento atual, acreditaseque a doença se desenvolve em indivíduos geneticamente suscetíveis e requer odesencadeamento por fatores ambientais. A EM é altamente prevalente em caucasianos (0,05 -0,15%), mas raramente observada em asiáticos e africanos. Parentes de primeiro grau de indivíduosafetados têm um risco aproximadamente 20-50 vezes maior de desenvolver de doença (2-5%), e a

Introdução 15taxa de concordância entre gêmeos idênticos varia entre 20-35% em diferentes estudos (25% nosestudos mais recentes) (revisado por Hemmer et al, 2002; Sospedra e Martin, 2005). Indivíduossuscetíveis apresentam um ou mais genes de suscetibilidade na região do HLA no cromossomo6p21, que são responsáveis por 10-60% do risco genético para EM (Haines et al., 1998).Similarmente a outras DAIs mediadas por células T, os genes do HLA que conferem suscetibilidade àEM são o HLA-DR, o HLA-DQ, o haplótipo HLA-DR15 em caucasianos (DRB1*1501, DRB5*0101,DQA1*0102, DQB1*0602), e outros DRs em populações etnicamente mais distantes (Haines et al.,1998; Dyment et al., 2004).Entre os fatores ambientais relacionados à etiologia da EM estão os agentes infecciososvirais ou bacterianos (principalmente o herpesvírus 6, o Epstein-Barr vírus e a bactéria Chlamydiapneumoniae), além de influências hormonais, comportamentais, climáticas e geográficas (revisadopor Coo e Aronson, 2004). Dois principais mecanismos foram propostos para explicar como infecçõesvirais ou bacterianas poderiam induzir a EM (bem como outras DAIs): (1), mimetismo molecular,ativação de células auto-reativas pela reatividade cruzada entre antígenos próprios e não-próprios;(2), bystander activation, assume que células auto-reativas sejam ativadas em decorrência deeventos inflamatórios não-específicos que ocorrem durante as infecções. Uma terceira proposta seriaque as infecções induziriam a EM através da combinação desses dois mecanismos descritos(revisado por Sospedra e Martin, 2005).Rivers et al. (1933) mostraram que a injeção de suspensões de medula espinhal ou cérebroem macacos saudáveis induzia uma doença similar à EM, levando à hipótese de que a EM tratava-sede uma doença auto-imune. Várias décadas depois, pesquisadores mostraram que a injeção decomponentes protéicos da bainha de mielina, juntamente com um adjuvante em camundongos naivesuscetíveis, causava encefalomielite, que atualmente é conhecida como EAE (experimentalautoimmune encephalomyelitis, ou encefalomielite auto-imune experimental) (Pettinelli e McFarlin,1981; Ben-Nun e Cohen, 1982). Trabalhos mostraram que a EAE era induzida em camundongosnaive pela transferência adotiva de células T anti-mielina, mas não pela transferência de autoanticorpos.Esse fato levou os pesquisadores a concluírem que a EM constitui uma doença autoimunemediada por células T.As células T CD4 + T H 1 auto-reativas apresentam um papel central na patogênese da EMdevido a várias observações: (1), células T CD4 + contribuem para o infiltrado de células inflamatórias

Introdução 16encontradas no SNC e líquor, em pacientes com EM; (2), o risco genético para EM é conferido emgrande parte por moléculas HLA-DR e HLA-DQ; (3), a produção de auto-anticorpos, ativação decélulas T auto-reativas CD8 + e vários outros aspectos das respostas adaptativa e inata são, pelomenos em parte, controladas por células T CD4 + T H 1 (revisado por Hemmer et al, 2002; Sospedra eMartin, 2005). No contexto de funções efetoras, as células T CD8 + são mais diretamente envolvidasna injúria do SNC do que as células T CD4 + , pelas seguintes razões, dentre outras: (1), exceto para amicroglia, nenhuma célula residente do SNC expressa MHC de classe II; (2), expansões oligoclonaisproeminentes de células T CD8 +são encontradas no líquor e no SNC de pacientes com EM(Jacobsen et al, 2002); (3), a expressão de MHC de classe I é induzida em neurônios danificados. Emresumo, ambas respostas de células T CD4 + e T CD8 + contribuem para patogênese da EM, emboraem diferentes estágios e com funções distintas (revisado por Hemmer et al, 2002; Sospedra e Martin,2005).A MBP (myelin basic protein), a PLP (proteolipid protein) e a MOG (myelin oligodendrocyteglycoprotein) constituem os principais auto-antígenos alvos de células T auto-reativas e de autoanticorposem pacientes com EM. Embora a MBP seja a proteína da mielina mais estudada, elaconstitui a segunda proteína mais abundante da mielina (30-40%), após a PLP (revisado por Hemmeret al, 2002; Sospedra e Martin, 2005).A observação de que os níveis de imunoglobulinas encontram-se elevados no líquidocefalorraquidiano de pacientes com EM, mas não no soro, indica uma produção local por células B.Além disso, as imunoglobulinas apresentam uma distribuição oligoclonal, ou seja, são produzidas porcélulas B em expansão clonal (Qin et al., 1998). Essas observações sugerem um papel importantepara as células B e auto-anticorpos na patogênese da EM. Além de células B servirem como APCspara células T auto-reativas, as células B auto-reativas produzem auto-anticorpos anti-mielina quepodem ser encontrados em áreas de desmielinização ativa no SNC do paciente com EM (Genain etal, 1999). Os auto-anticorpos podem causar desmielinização pela opsonização da mielina parafagocitose ou via ativação do sistema complemento (revisado por Hemmer et al, 2002; Sospedra eMartin, 2005).

Introdução 171.4 Transplante de células tronco hematopoéticas em doenças auto-imunesA maioria dos pacientes com DAIs tem uma expectativa de vida quase normal. No entanto,alguns pacientes sofrem com formas de auto-imunidade graves e progressivas, resistentes a terapiasconvencionais. O transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH) tem sido nos últimos anosuma alternativa terapêutica para pacientes com essas DAIs graves e refratárias aos tratamentosconvencionais.O TCTH envolve a administração de células tronco hematopoéticas (CTHs), que têm acapacidade de auto-renovação e de originar todos os tipos celulares maduros do sistemahematopoético, imunológico e possivelmente alguns tipos celulares não-hematopoéticos (Kondo etal., 2003). O receptor é preparado para o transplante por um tratamento imunossupressor potente,geralmente quimioterapia ou radioterapia, seguido pela infusão de células hematopoéticas autólogas(TCTH autólogo; células coletadas do próprio paciente antes da imunossupressão) ou de célulashematopoéticas alogênicas (TCTH alogênico; células coletadas de um doador compatível), pararestaurar o sistema hematopoético e imunológico do receptor rapidamente, evitando citopeniasprolongadas (Burt et al., 2002; Popat et al., 2005; Hough et al., 2005; Sykes e Nikolic, 2005).Foi mostrado que este procedimento consegue curar DAIs em modelos animais e há algunsanos tem sido explorado em vários ensaios clínicos de faseI/II (Sykes e Nikolic, 2005; Popat et al.,2005; Hough et al., 2005). Até agora, o TCTH autólogo tem sido preferido ao TCTH alogênico devidoà elevada toxicidade e grande potencial de rejeição observados em transplantes alogênicos. Alémdisso, o risco da ocorrência de GVHD (“Graft-Versus-Host-Disease”) em TCTH alogênicos, que édevido ao ataque de células T alogênicas do doador contra alo-antígenos do receptor, é relacionado ataxas de mortalidade e morbidade significantes.A iniciativa de se empregar imunossupressão em altas doses seguida de TCTH autólogo notratamento de DAIs partiu de dois conjuntos de evidências. O primeiro derivou da observação decasos isolados de pacientes que apresentavam concomitantemente doença auto-imune e neoplasiahematológica ou aplasia de medula óssea e que, após serem submetidos a transplante de medulaóssea alogênico para tratamento da doença hematológica, obtiveram remissões prolongadas dadoença auto-imune, sem recaídas da mesma (Nelson et al.,1997). Vale ressaltar que o transplanteautólogo não-manipulado, nesta mesma situação, não produziu os mesmos resultados benéficos emalguns estudos, provavelmente devido à re-inoculação das células auto-reativas com o enxerto (Euler

Introdução 18et al., 1996). O segundo conjunto de evidências originou-se de estudos de auto-imunidade emmodelos animais, que discutiremos a seguir.Modelos animais de auto-imunidade e TCTHEstudos em modelos animais estabeleceram a base racional para o transplante de célulastronco hematopoéticas em DAIs, mas também demonstraram que a suscetibilidade para DAIs pareceresidir nas células hematopoéticas. O transplante de células da medula óssea de camundongos NZB(lupus-prone) em linhagens de camundongos não-suscetíveis letalmente irradiados, induziu síndromelúpica nesses camundongos (Morton e Siegel, 1974). A transferência de DAIs por meio de célulashematopoéticas foi subseqüentemente confirmada para várias doenças, através de vários modelosanimais de lúpus eritematoso sistêmico (LES), encefalomielite auto-imune experimental (EAE), artriteinduzida por adjuvante, síndrome anti-fosfolípide e diabete melito do tipo 1 (Ikehara et al., 1990).Por outro lado, resistência a DAI pode ser também transferida para linhagens de camundongossuscetíveis por meio de células hematopoéticas. Em camundongos, o transplante de célulashematopoéticas alogênicas de linhagens de animais não-suscetíveis preveniram o desenvolvimentode LES, diabete tipo 1, EAE e outras DAIs (Ikehara et al., 1985; Ikehara et al., 1998). Em humanos, opapel das células hematopoéticas e das células estromais no desenvolvimento da patologia autoimunenão é muito esclarecido. No entanto, alguns relatos clínicos sugerem uma contribuição críticade células tronco hematopoéticas defectivas no desenvolvimento da patologia auto-imune (Bargetzi etal., 1997; Lampeter etal., 1998).Infelizmente, estudos em animais mostram que a prevenção do início da auto-imunidade émuito mais fácil do que a reversão da doença auto-imunes já estabelecida. Até 2004, por exemplo,mais de 195 métodos para prevenção ou retardo do início de diabete tipo 1 em camundongos NODforam identificados (Roep et al., 2004). No entanto, somente poucas abordagens terapêuticas foramefetivas na reversão de diabete tipo 1 e LES já estabelecidos, sendo uma delas o TCTH alogênico(Ikehara et al., 1989; Yasumizu et al., 1987).Os estudos que revelaram o potencial da imunossupressão em altas doses e do TCTH para otratamento da auto-imunidade foram realizados em vários modelos experimentais diferentes dedoenças auto-imunes (van Bekum, 2000a; van Bekum, 2000b; van Bekum, 2002), pois não existia umconsenso em relação a quais modelos seriam os mais representativos da doença auto-imune

Introdução 19humana. Existem dois tipos distintos de modelos experimentais de doenças auto-imunes, os modelosde doenças auto-imunes hereditárias ou espontâneas e os modelos de doenças auto-imunesinduzidas por auto-antígenos (van Bekkum, 2002). Nas doenças da primeira categoria, os fatoresgenéticos predominam na patogênese da doença, e os sintomas desenvolvem com a idade namaioria ou em todos dos membros da linhagem. Esses modelos incluem síndromes lúpus-like emcamundongos, diabete medito insulino-dependente em camundongos e ratos, e uma síndromecomplexa de artrite/colite/dermatite em ratos transgênicos para HLA-B27.Na segunda categoria, as doenças auto-imunes não se desenvolvem espontaneamente, masrequerem indução pela imunização com antígenos de tecidos específicos (por exemplo, antígenos decérebro, no caso da encefalomielite auto-imune experimental (EAE), que constitui um modelo da EMhumana; antígenos teciduais como o colágeno, no caso da artrite induzida por colágeno; ouantígenos bacterianos como do Mycobacterium tuberculosis, no caso da artrite induzida poradjuvantes). Foi demonstrado em experimentos de cruzamento, que a suscetibilidade e a resistênciaà indução da doença auto-imunes, são amplamente determinadas geneticamente, por isso asdoenças auto-imunes só podem ser induzidas em linhagens específicas de camundongos. Entretanto,influências ambientais também são envolvidas nas formas de doenças auto-imunes induzidas (vanBekkum, 2003). Uma vez que a etiologia das doenças auto-imunes humanas complexas émultifatorial, como discutido anteriormente, onde os fatores dominantes são genéticos tanto quantoambientais, a visão atual é que as doenças auto-imunes induzidas representem modelos de doençasmais realísticos para investigações pré-clínicas.No caso de DAIs espontâneas, o TCTH singênico (isto é, TCTH de um doador geneticamenteidêntico), realizado em animais jovens, não conseguiu prevenir a auto-imunidade clínica, entretanto, oTCTH alogênico de uma linhagem resistente para outra suscetível, preveniu a doença, e em algunscasos, quando realizado logo após o início da doença, melhorou as manifestações auto-imunes(Yasumizu et al, 1987). Esses resultados levaram alguns pesquisadores a concluir que a autoimunidadedecorre de alterações nas células tronco hematopoéticas (Good e Ikehara, 1997).Em contraste, estudos em modelos de doenças auto-imunes induzidas realizados por vanBekkum e colaboradores (2000) mostraram uma resposta terapêutica de transplante singênicos oupseudoautólogos no tratamento dessas doenças. Em modelos animais o TCTH singênico (isto é,TCTH de um doador geneticamente idêntico) pode ser usado ao invés de TCTH autólogo. Por

Introdução 20exemplo, a recuperação da paresia induzida pela EAE foi mais rápida em animais tratados comirradiação corpórea total e transplante singênico comparada à recuperação observada em animaisnão-tratados, embora transplantes alogênicos fossem melhores na prevenção de recaídasespontâneas ou induzidas pela imunização com mielina (van Gelder e van Bekkum, 1995; van Gelderet al., 1993).Os resultados dos estudos de van Bekkum e colaboradores (2003) sugeriram que o sucesso dotransplante de células tronco autólogo depende da completa erradicação dos componentes efetoresda doença auto-imune, ou seja, das células T efetoras ativadas e de memória. Quando traduzidospara a clínica, os dados experimentais indicaram que os pacientes deveriam ser submetidos a umregime de condicionamento (ou imunossupressão) que induzisse o máximo de linfoablação e que oenxerto fosse depletado de células T (van Bekkum, 2003). Quanto maior foi a intensidade da terapiade condicionamento usada, maior foi o sucesso do auto-TCTH na EAE (van Bekkum, 2003; Burt etal., 1998a).Foi mostrado também que o período no qual o transplante é realizado é muito importante. Porexemplo, no tratamento de EAE em camundongos SLJ, o transplante autólogo somente foi efetivo serealizado precocemente no início da doença, antes de ocorrerem injúrias significativas do tecido alvoNesse caso, quase reversão completa foi conseguida, mas nenhum efeito do transplante autólogo foiobservado em estágios mais avançados da doença (Burt et al., 1998a).Em resumo, enquanto o TCTH alogênico mostrou-se muito efetivo em reverter auto-imunidadeem todos os modelos animais estudados, o TCTH autólogo não foi capaz de reverter com sucesso,diabete melito do tipo 1 e LES. No entanto, surpreendentemente, níveis variáveis de remissão foramconseguidos após o TCTH autólogo em vários modelos experimentais de DAIs, como miasteniagravis, artrite induzida por adjuvante e EAE (van Bekkum, 2003).Assim, essas várias observações em modelos animais de TCTH autólogos ou alogênicossugeriram que ambas abordagens seriam benéficas para a terapia de pacientes com DAIs refratárias,embora o TCTH autólogo seja mais seguro. Não obstante, os estudos em animais indicam que aresistência à DAIs reside na célula tronco hematopoética e pode ser transferida por ela (Ikehara et al.,1985; Ikehara et al., 1990; Ikehara et al., 1998). Desse modo, o transplante de células troncohematopoéticas alogênicas poderia resultar na possível cura da DAI, e além disso, na tolerância a

Introdução 21antígenos do doador, permitindo a aceitação de outros tecidos do doador (por exemplo, ilhotaspancreáticas), sem o uso de terapia imunossupressora crônica.Além disso, a maior eficácia do TCTH alogênico em alguns modelos animais de DAIs sugereque células T alogênicas do doador sejam capazes de eliminar linfócitos auto-reativos do receptor, eportanto mediar a forma benéfica de imunoterapia chamada de GVA (“graft-versus autoimmunity”).Porém, não existe razão para esperar que essas respostas imunes sejam específicas para linfócitosauto-reativos. Após o TCTH alogênico, podem ocorrer concomitantemente respostas imune deletériasdo enxerto contra o hospedeiro (“graft-versus-host response”). Desse modo, dadas as complicaçõescomo GVHD e falha de enxertia após o TCTH alogênico e os resultados positivos do TCTH autólogoem modelos animais descritos acima, o TCTH autólogo é a abordagem mais lógica para o resgatehematopoético e vem sendo amplamente utilizado em ensaios clínicos.Mais recentemente, vários grupos têm utilizado protocolos de condicionamento nãomieloablativosou em doses reduzidas em TCTH alogênicos, para indução de tolerância aotransplante e restabelecimento da auto-tolerância em modelos animais de DAIs (revisado por Sykes eNikolic, 2005). Embora estes avanços recentes têm tornado o TCTH alogênico menos tóxico, eleainda constitui um procedimento de risco que muito provavelmente não irá substituir os tratamentosatuais para formas de DAIs menos graves e tratáveis.Ensaios clínicos de TCTH autólogo em doenças auto-imunesCom base em todos os fatores discutidos acima, o TCTH autólogo é atualmente preferido aoTCTH alogênico em ensaios clínicos. Nos últimos anos, vários ensaios clínicos de imunossupressãoem altas doses seguida de TACTH foram iniciados em pacientes com esclerose múltipla (EM),esclerose sistêmica, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico e miastenia gravis (Burt et al.,1998b, Burt et al., 2003; Popat et al., 2005; Hough et al., 2005; Tyndall et al., 2005).Esses ensaios têm utilizado regimes de condicionamento de intensidade variável, variáveistipos de depleção de células T (in vivo ou ex vivo) e diferentes fontes de células tronco e protocolosde mobilização. Para obtenção das células para o TACTH, antes do condicionamento as célulastronco são mobilizadas da medula para o sangue periférico, o que permite a coleta dessas célulassem uso de anestesia geral. A maioria dos protocolos usa o G-CSF (granulocyte colony-stimulatingfactor) e/ou ciclofosfamida, uma droga mielossupressora mas que leva a uma expressiva mobilização

Introdução 22das células tronco. O protocolo do TACTH permite que tratamentos imunoablativos intensos sejamusados nos pacientes com DAIs refratárias aos tratamentos convencionais.Dados obtidos desses ensaios clínicos sugerem que o TACTH é viável e pode levar a remissãodas DAIs (Burt et al., 2003; Popat et al., 2005; Hough et al., 2005; Tyndall et al., 2005). Embora osresultados variem de doença para doença, mais de um terço dos pacientes tem apresentadoremissões completas e prolongadas, freqüentemente sem necessidade de uso de drogasimunossupressoras (Tyndall et al., 2005). Em algumas doenças, no entanto, recaídas sãorelativamente freqüentes. No entanto, dos pacientes que recaem, vários passam a responder aostratamentos convencionais que não eram efetivos antes do transplante.Desde 1996, ao redor de 1000 transplantes já foram realizados mundialmente em váriosensaios clínicos de fase I/II. A toxicidade e mortalidade relacionada ao transplante diminuiu ao longodo tempo com o aumento da experiência na aplicação desse tratamento, melhor seleção de pacientese modificações nos protocolos de tratamento. Ensaios clínicos randomizados de fase III que irãocomparar o TACTH com a terapia convencional, foram recentemente iniciados nos Estados Unidos eEuropa (Popat et al., 2005; Hough et al., 2005; Tyndall et al., 2005). Idealmente, esses resultadosirão ajudar a esclarecer se os benefícios do TACTH devem-se somente à depleção temporária oslinfócitos auto-reativos pela imunossupressão intensa ou ao restabelecimento de mecanismos deregulação imune que limitam a auto-imunidade. Além disso, estes estudos fornecerão prova deeficácia, que é necessária para uma aplicação mais ampla do TACTH no tratamento de DAIs.Os pacientes com EM constituem o maior grupo de pacientes com doenças auto-imunes que jáforam tratados com TACTH até o momento (Burt et al., 2005). Estudos clínicos de fase I e II têm sidoconduzidos em pacientes com EM progressiva primária e secundária. A mobilização das célulastronco hematopoéticas é realizada com ciclofosfamida combinada com fator estimulador de colônia degranulócitos (G-CSF) ou somente com G-CSF. O primeiro e maior grupo de transplantes foi realizadoem 85 pacientes com EM, cujos resultados foram registrados no EBMT (European Group for Bloodand Marrow Transplantation). Neste ensaio clínico, foi utilizado o regime de condicionamento BEAM(BCNU, etoposídeo, aracitin, melfalan). Cerca de 6% dos pacientes faleceram devido a fatorestóxicos, foi observada melhora neurológica em 21% dos pacientes e uma sobrevida livre deprogressão em 74% dos pacientes com doença progressiva secundária ou primária (Tyndall et al.,2005).

Introdução 23Nesse estudo, as lesões inflamatórias agudas do tecido nervoso, detectadas utilizando aimagem de ressonância magnética nuclear (RMN) por captura de gadolíneo, foram significativamentereduzidas, demonstrando a eficácia do TACTH no tratamento da EM. No entanto, foi observado que adeterioração da função neuronal pode continuar no caso de doença em fase avançada. Um estudorandomizado de fase III, denominado ASTIMS (Autologous Stem Cell Transplantation InternationalMultiple Sclerosis trial), foi iniciado na Europa em 2004 e irá avaliar aproximadamente 200 pacientesao longo de vários anos após o TACTH utilizando a RMN para avaliação da função neuronal dospacientes (Tyndall et al., 2005).No Brasil, o TACTH em DAIs vem sendo realizado desde 2001 em alguns centros, masprincipalmente na Unidade de Transplante de Medula Óssea do Hospital das Clínicas da Faculdadede Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e no Hospital Israelita Albert Einsteinem São Paulo. Pacientes portadores de formas graves e progressivas de esclerose múltipla edoenças reumáticas (lúpus eritematoso sistêmico, esclerose sistêmica e arterite de Takayasu),refratárias às terapias convencionais, são tratados com terapia de imunossupressão em altas dosesseguida pelo TACTH (Voltarelli e Ouyang, 2003; Voltarelli et al., 2004b; Voltarelli et al., 2005a;Voltarelli et al., 2005b). Desde o início de 2004, o TACTH está sendo realizado como tratamento depacientes com diabete melito do tipo 1 recém-diagnosticados, exclusivamente no Brasil (Voltarelli etal., 2004a; Voltarelli, 2004c; Voltarelli, 2006). O objetivo do TACTH nesses pacientes é de preservar aquantidade residual de células β das ilhotas pancreáticas (Burt et al., 2002a; Voltarelli, 2004c), umavez que quando a doença clínica é diagnosticada já houve a perda de aproximadamente 80-90% dascélulas β pancreáticas (Notkins, 2002). O TACTH é realizado nos pacientes dentro de no máximo seissemanas após o diagnóstico. Entre os vários critérios de inclusão, um dos mais importantes, além dodiagnóstico recente, é positividade para anticorpos anti-GAD65 ao diagnóstico.1.5 Mecanismos de ação do TCTH autólogo em doenças auto-imunesConforme discutido anteriormente, as DAIs são determinadas por fatores genéticos eambientais. Se e quando um indivíduo geneticamente predisposto desenvolverá uma doença autoimune,orgão-específica ou sistêmica, dependerá do contato com agentes ambientais, infecciosos ounão-infecciosos (revisado por Marrack et al., 2001; Davidson e Diamond, 2001). Estudosretrospectivos de pacientes que migraram de áreas de alta incidência para áreas de baixa incidência

Introdução 24de DAIs sugerem que existe um período latente, caracterizado por um atraso de vários anos entre ocontato com o agente ambiental hipotético e o início da doença clínica (revisado por Openshaw et al.,2002). Esses conceitos de fatores ambientais e período latente foram importantes para a constituiçãoda base racional do TCTH autólogo como tratamento de DAIs.Conforme proposto por Openshaw et al. (2002), se somente a predisposição genética forsuficiente para o desenvolvimento de auto-imunidade clínica, então a predisposição para a doençareside exclusivamente nas células tronco hematopóeticas, e o melhor resultado que pode seresperado do TCTH autólogo seria um efeito anti-inflamatório temporário conferido pelaimunossupressão em altas doses. Em contraste, se exposições a fatores ambientais específicos emperíodos críticos são importantes, então a terapia de imunossupressão em altas doses seguida peloTCTH autólogo poderia levar a uma “mudança cronológica” (“time-shift” ou “re-setting”) da doençaauto-imune clínica para um período mais precoce, análogo ao período latente, restaurando a autotolerânciano paciente. Esta hipótese pressupõe que respostas a re-exposição às circunstânciasambientais que levaram ao desencadeamento da auto-imunidade serão suficientemente diferentes,de modo que auto-imunidade clínica não irá reaparecer (Tyndall e Koike, 2002; Openshaw et al.,2002).Com base nessa primeira hipótese proposta, outras três hipóteses não mutuamenteexclusivas, foram formuladas para explicar o mecanismo de ação do TACTH em DAIs (Burt et al.,2002b; Muraro e Martin, 2003): (1) a imunoablação intensa elimina a resposta imune patogênica, (2) oTACTH reconstitui um sistema imune novo e tolerante, (3) as células tronco hematopoéticaspromovem reparo tecidual. No entanto, apesar do rápido acúmulo de experiência clínica durante osúltimos dez anos, dados sobre o mecanismo de ação do TACTH em doenças auto-imunes humanaseram muito escassos até 2004, quando os primeiros estudos mais elaborados de reconstituiçãoimunológica começaram a aparecer na literatura (Sun et al., 2004; Muraro et al., 2005; Farge et al.,2005; de Kleer et al., 2005; Kötter et al., 2005). Atualmente, esses trabalhos apresentam informaçõesque começam a explicar os mecanismos de ação do TACTH baseando-se em observações dareconstituição imunológica nos pacientes.Atualmente, o mecanismo mais aceito e que vem sendo demonstrado nos trabalhos recentes éa “reprogramação” do sistema imune após o TACTH, e constitui uma junção das duas primeirashipóteses citadas anteriormente (Burt et al., 2002b; Muraro e Martin, 2003). De acordo com esse

Introdução 25mecanismo, primeiramente a imunossupressão em altas doses elimina as células B e T auto-reativasde memória. Em seguida, baseando-se no fato de que fatores ambientais desconhecidos tenham umpapel essencial no desencadeamento da DAI, é possível que a eliminação do repertório de células Be T pré-existente permita que o sistema imune do paciente reinicie do zero, gerando novas células Be T que sejam auto-tolerantes após o TACTH (revisado por Sykes e Nikolic, 2005).Porém, não está claro se as células T e B de memória são completamente removidas dosistema hematopoético, linfóide e de órgãos alvos, por qualquer que seja o regime decondicionamento. Assim, a imunoablação incompleta pode ser responsável pelas elevadas taxas derecaída precoce observada em alguns ensaios clínicos de TACTH (Tyndall et al, 2005). Não obstante,há evidências de melhora e remissão da DAI após TACTH mesmo com imunoablação incompleta(revisado por Muraro e Douek, 2006).A manutenção de reações auto-imunes depende de múltiplas populações celulares e existemvárias evidências de alterações em número e função de algumas populações celulares após oTACTH. Por exemplo, a quimioterapia intensa induz uma redução significativa e prolongada decélulas T CD4 + , que é caracterizada pela inversão da razão CD4 + :CD8 + , predominância de células Tde memória e regeneração de células T predominantemente por mecanismos timo-independentes(revisado por Guillaume et al., 1998; Jameson et al., 2002). Estas células T reconstituídas podemexibir suscetibilidade aumentada à apoptose e funções alteradas (Hakim et al., 1997; Singh et al.,1999; Muraro et al., 2005). Assim, a imunoablação intensa e a reconstituição imunológica alteradapodem levar à remissão clínica da DAI nos primeiros meses após o TACTH.Um estudo recente (Muraro et al., 2005) mostrou pela primeira vez que a remissão clínicaobservada em pacientes com EM após o TACTH, que é acompanhada pela supressão da atividadeinflamatória, não é decorrente somente da imunossupressão que esses pacientes recebem, mas demudanças qualitativas profundas no sistema imunológico que demonstram uma renovação docompartimento de células T nesses pacientes. Dois anos após o TACTH, os pacientes apresentaramuma diversidade clonal mais ampla do repertório do TCR e uma extensa renovação dasespecificidades clonais comparadas com o pré-transplante, que é devida à produção de novas célulasT naive pelo timo desses pacientes.No entanto, concomitante ao reaparecimento de novas células T naive, dois outros trabalhosmostraram a reconstituição tímica de células T auto-reativas após o TACTH. Openshaw et al. (2000)

Introdução 26mostraram que a resposta proliferativa de células mononucleares à MBP (myelin basic protein) oupeptídeos imunodominantes da MBP estava significantemente suprimida em pacientes com EM pelomenos até 20 meses pós-TACTH, no entanto houve uma mudança no padrão de reconhecimentoantigênico após o transplante. Mais recentemente, Sun et al. (2004) demonstraram o reaparecimentode células T auto-reativas anti-mielina por volta de 12 meses após o TACTH também em pacientescom EM, concomitante à reconstituição de novas células T naive produzidas pelo timo. Vale ressaltarque os pacientes com EM desses estudos continuaram em remissão clínica da doença mesmo com oreaparecimento de células T auto-reativas anti-mielina, demonstrando que a remissão da doençaapós o transplante não deve-se somente à eliminação das células auto-reativas patogênicas mastambém a outras mudanças determinadas pelo TACTH.Traynor et al. (2000) mostraram que ocorrem mudanças significativas no padrão de citocinasem pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES) após o TACTH. A expressão de interleucina-4(IL-4), citocina do tipo T H 2, foi encontrada aumentada em linfócitos de pacientes com lúpuseritematoso sistêmico antes do transplante e normalizou após o TACTH. Por outro lado, os níveis deinterferon-γ (IFN-γ), que estavam abaixo do normal nesses pacientes antes do transplante,aumentaram para níveis normais após o TACTH. Num estudo mais recente, de Kleer et al. (2005)mostraram evidências que sugerem uma “reprogramação” de células auto-reativas em crianças comartrite juvenil idiopática (AJI) após o TACTH. Usando APCs artificiais (lipossomas conjugados comcomplexos MHC-peptídeo) para isolar células auto-reativas contra um peptídeo da Hsp60 (heat shockprotein 60; auto-antígeno importante na AJI), eles demonstraram que o TACTH induz a mudança dofenótipo pró-inflamatório (caracterizado por elevados níveis de RNAm de IFN-γ e T-bet) das célulasauto-reativas pré-transplante para um fenótipo tolerante pós-transplante (caracterizado por elevadosníveis de RNAm de IL-4 e GATA-3).Dois trabalhos recentes mostraram uma restauração de células T reguladoras (Tregs)CD4 + CD25 high após o TACTH. Verda et al. (2005) mostraram um aumento significante do númeroabsoluto de células T CD4 + CD25 highem pacientes com doença de Crohn após TCTH nãomieloablativo.Em outro estudo recente, de Kleer et al. (2005) mostraram também a restauração dafreqüência de células Tregs CD4 + CD25 highem crianças com artrite juvenil idiopática (AJI) após oTACTH, de números significantemente reduzidos antes do TACTH (comparando-se aos de indivíduossaudáveis) para níveis normais após o transplante. Os autores sugerem que esta recuperação deve-

Introdução 27se à proliferação homeostática das células CD4 + CD25 highdurante os primeiros meses dareconstituição imunológica, e à produção tímica de novas células Tregs CD4 + CD25 high que expressamFoxp3 numa etapa posterior da reconstituição. Estes trabalhos indicam que a restauração das célulasTregs CD4 + CD25 high poderia contribuir para o restabelecimento da homeostasia imune, indução datolerância imune e remissão da DAI após o TACTH.Os conceitos de homeostasia imune e proliferação homeostática são importantes para oentendimento dos mecanismos de reconstituição imunológica que serão discutidos nesse trabalho. Ahomeostasia imune é um processo auto-regulador que visa à manutenção da estabilidade do sistemaimunológico. Nesse contexto, a homeostasia de células T refere-se à manutenção/preservação donúmero de células T ao longo do tempo. Isto pode ser conseguido pela simples sobrevivência dascélulas ou por um balanço entre morte e proliferação celular. A proliferação homeostática ouexpansão homeostática constitui um dos mecanismos homeostáticos que controlam o tamanho ecomposição da população de células T maduras. A proliferação homeostática ocorre comoconseqüência de uma deficiência periférica de linfócitos (linfopenia) em resposta a fatoreshomeostáticos, que incluem citocinas (IL-7 e IL-15) e sinais provenientes da estimulação porcomplexos MHC-peptídeo próprio (Jameson, 2002; Muraro e Douek, 2006).Em resumo, os trabalhos recentes descritos acima substanciam a indução da “regeneração” deum sistema imune novo e tolerante como o racional do TACTH em DAIs, e provêem a base racionalpara os ensaios clínicos, futuros ou em andamento, dessa estratégia terapêutica em DAIs.Além da restauração da auto-tolerância, há a hipótese de que o TACTH poderia também levarà regeneração de tecidos que são destruídos pela DAI. Teoricamente, isto poderia ser possível pelaregeneração tecidual por células tronco endógenas uma vez que a auto-imunidade fosse revertida, oupela diferenciação de células tronco hematopoéticas (CTHs) ou de outras células tronco re-infundidasno paciente no transplante, em tecidos não-hematopoéticos. Após o TCTH alogênico emcamundongos NOD no início da doença, foi mostrado que ocorre uma regeneração endógena deilhotas pancreáticas (Zorina et al., 2003). Foi também mostrado que células tronco transplantadaspromoveram a regeneração endógena pancreática (Mathews et al., 2004; Hess et al, 2003).Entretanto, estudos em camundongos NOD após TCTH alogênico para diabete já estabelecidamostraram que a regeneração endógena das ilhotas não consegue manter normoglicemia e sugeremque o transplante de ilhotas seja necessário para corrigir a doença (Nikolic et al, 2004).

Introdução 28Recentemente, vários grupos demonstraram que CTHs podem diferenciar-se em células hepáticas,células do miocárdio, dos rins e em outros tipos de células não-hematopoéticas, incluindo células dasilhotas pancreáticas (Zulewski et al., 2001; Jiang et al., 2002), mas é possível que estes estudosreflitam fusão celular ao invés de diferenciação a partir de CTHs infundidas no transplante (Terada etal., 2002). Portanto, o potencial das CTHs para a regeneração tecidual após o TACTH em pacientescom DAIs é ainda controverso e consiste uma área de intensa investigação.1.6 Repertório do receptor de células T em doenças auto-imunesO receptor de células T (TCR) é um heterodímero de membrana, formado por cadeias α e βou por cadeias γ e δ. Cada cadeia α, β, γ ou δ é formada por um domínio variável e um domínioconstante. O TCR αβ é formado por duas cadeias polipeptídicas com domínios variáveis (Vα e Vβ) edomínios constantes (Cα e Cβ). Análises da estrutura tridimensional do TCR αβ mostraram que osdomínios variáveis Vα e Vβ formam três alças que interagem com o complexo MHC/peptídeo (Garciaet al., 1996). Estas alças correspondem às Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR). Osgenes Vα e Vβ codificam as regiões CDR1 e CDR2, e a região CDR3 é gerada pela recombinaçãosomática dos segmentos V e J para Vα, e os segmentos V, D e J para Vβ, sendo esta a região demaior variabilidade e está envolvida no reconhecimento dos peptídeos apresentados pelas moléculasde MHC (Davies e Bjorkman, 1988; Garcia et al., 1999; Goldrath et al., 1999). A região CDR3 variaem extensão dependendo da adição ou remoção de nucleotídeos nas ligações VD e DJ durante oprocesso de recombinação. Assim, a diversidade do repertório de TCR resulta do rearranjo dediferentes segmentos gênicos, de sua ligação imprecisa, da adição de nucleotídeos durante oprocesso de recombinação e da combinação de diferentes cadeias α e β ou γ e δ (Davis e Bjorkman,1988). Teoricamente, o limite da diversidade do repertório do TCR seria de mais de 1 x 10 13especificidades. No entanto, não pode haver mais especificidades de TCR do que o número decélulas T totais num indivíduo. Assim, foi mostrado que a diversidade em camundongos é de 1-2 x10 8 especificidades diferentes, e em humanos é de 1 x 10 12 (Nikolich-Zugich et al., 2004).Atualmente, o repertório do TCR pode ser analisado por citometria de fluxo, pelo uso deanticorpos monoclonais anti-Vβ ou Vα específicos ou por técnicas de PCR (Reação em Cadeia daPolimerase) e Real Time PCR. Essas técnicas permitem a identificação e quantificação de famílias

Introdução 29preferencialmente expandidas. Alternativamente, o repertório do TCR pode ser analisado pela técnicade Immunoscope ou CDR3 Length Spectratyping. Considerando que o padrão de distribuição dospicos de CDR3 da cadeia Vβ do TCR numa população policlonal normal de células T segue umacurva de Gauss, esta técnica permite detectar variações no padrão de distribuição desses segmentosnuma dada população celular. Assim, qualquer expansão clonal anormal no repertório pode serdetectada como picos que se desviam da distribuição gaussiana normal dos segmentos de CDR3(Pannetier, 1993; Pannetier, 1995).Vários estudos indicam que pacientes com DAIs apresentam restrição (skewing) do repertóriode linfócitos T, com expressão anormal de algumas famílias Vβ. Essas anormalidades são causadaspor expansões oligoclonais de algumas populações de células T, que são instáveis epreferencialmente observadas no início das DAIs. Essas perturbações do repertório de células Tnaive podem contribuir para a predisposição do indivíduo ao desenvolvimento da DAI (revisado porDavidson e Diamond, 2001; Sospedra e Martin, 2005).Holbrook et al. (1996) mostraram que linfócitos do sangue periférico de pacientes com lúpuseritematoso sistêmico apresentam restrições do repertório da cadeia Vβ do TCR. Igualmente, empacientes com doença de Crohn, as células T encontradas nos segmentos do trato intestinal afetadosapresentam restrição do repertório, mas não as encontradas nos segmentos não-envolvidos (Posnettet al., 1990).Mais recentemente, Gran et al (1998) mostraram anormalidades do repertório de células Tisoladas do sangue periférico de pacientes com EM, com expansões significantes das famílias Vβ9,Vβ1, Vβ11 e Vβ22. Em outro estudo, expansões oligoclonais de células T foram encontradas nolíquido cefalorraquidiano de pacientes com EM (Gestri et al., 2001). Muraro et al. (2002) mostraramque pacientes com EM-SR apresentam expansões de linfócitos circulantes expressandodeterminadas famílias Vβ mais freqüentemente do que em controles normais, além disso 80% essasexpansões são oligoclonais e correlacionam-se significantemente com atividade inflamatória da EMdetectada por RMN e com respostas imunes contra a MBP. Matsumoto et al. (2003) tambémmostraram a presença de células T em expansões oligoclonais, particularmente expressando afamília Vβ5.2, no sangue periférico de pacientes com EM. Em outro estudo recente em pacientes comEM, foi mostrado um aumento da reatividade à mielina e da secreção de IFN-γ por células T CD4 + e T

Introdução 30CD8 + com distribuição alterada dos picos de CDR3 (Laplaud et al., 2004). Em pacientes com diabetemelito do tipo 1 recém-diagnosticado, Luppi et al (2000) demonstraram uma restrição do repertório doTCR, com expressão preferencial da família Vβ7.Interessantemente, Traynor et al. (2002) mostraram, pela primeira vez, que o TACTH poderiacausar mudanças na composição do sistema imune e levar à normalização do repertório de células Tem pacientes com DAIs. Os autores analisaram a diversidade do repertório de células T em pacientescom lúpus eritematoso sistêmico submetidos à terapia de imunossupressão em altas doses seguidapelo TACTH, e mostraram que o repertório de células T que era restrito nesses pacientes antes dotransplante apresentou uma distribuição normal (comparável a de um indivíduo controle saudável)após o TACTH.

2 Objetivos

Objetivos 322.1 Objetivo geralAvaliar a reconstituição imunológica em pacientes com as doenças auto-imunes diabete melitodo tipo 1 e esclerose múltipla, submetidos à terapia de imunossupressão em altas doses seguida pelotransplante autólogo de células tronco hematopoéticas.2.2 Objetivos específicosAvaliar, previamente e seqüencialmente após o transplante:1. Diversas subpopulações celulares do sistema imune no sangue periférico.2. O perfil de produção de citocinas intracelulares por linfócitos T do sangue periférico.3. A diversidade de linfócitos T do sangue periférico, por meio do estudo do repertório da cadeiaVβ do receptor de células T.4. A expressão do gene Foxp3 em células mononucleares do sangue periférico.

3 Casuística, Material e Métodos

Casuística, Materiais e Métodos 343.1 Delineamento do estudoTratou-se um estudo prospectivo conduzido com o objetivo de se estudar a reconstituiçãoimunológica em pacientes com doenças auto-imunes (diabete melito do tipo 1 e esclerose múltipla)submetidos ao tratamento com imunossupressão em altas doses seguida de transplante autólogo decélulas tronco hematopoéticas. Este trabalho foi desenvolvido no Centro de Terapia Celular (CEPIDFAPESP) do Centro Regional de Hemoterapia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina deRibeirão Preto da Universidade de São Paulo (HC-FMRP-USP) em colaboração com a Unidade deTransplante de Medula Óssea (TMO) do HC-FMRP-USP, o Setor de Doenças Neuromusculares e aDivisão de Endocrinologia e Metabolismo do HCFMRP.3.2 CasuísticaForam incluídos nesse estudo pacientes com diabete melito do tipo 1 e esclerose múltipla, queforam submetidos ao tratamento com imunossupressão em altas doses seguida de transplanteautólogo de células tronco hematopoéticas, na Unidade de TMO do Hospital das Clínicas da FMRP-USP, de dezembro de 2002 a dezembro de 2005. Foram estudados onze pacientes com diabetemelito do tipo 1 e dezoito pacientes com esclerose múltipla transplantados.As Tabelas 1 e 2 sumarizam as principais características dos pacientes, dados clínicos deantes do transplante e dados sobre o procedimento do transplante. Os protocolos de transplanteespecíficos para essas doenças auto-imunes foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital dasClínicas da FMRP-USP (Diabetes melito do tipo 1 - Proc. 10095/02, Esclerose múltipla - Proc.2693/2001) e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (Diabetes melito do tipo 1 - RG 7160,Esclerose múltipla - RG 2944), e os pacientes assinaram o termo de consentimento livre eesclarecido. Nesses protocolos, estão definidos os critérios de seleção dos pacientes.Os pacientes com esclerose múltiplos submetidos ao TACTH, apresentavam formasprogressivas da doença (Poser et al, 1983), refratárias ao tratamento com corticosteróides e IFN-β.Entre os dezoito pacientes, quatorze tinham a forma de esclerose múltipla progressiva secundária(EM-PS), três apresentavam esclerose múltipla progressiva primária (EM-PP) e uma paciente tinha aforma surto-remissiva da doença (EM-SR) (Hafler et al., 2004; Compston e Coles, 2002).Os pacientes com diabete melito do tipo 1 submetidos ao TACTH foram pacientes recémdiagnosticados.O TACTH foi realizado nesses pacientes dentro de no máximo seis semanas após o

Casuística, Materiais e Métodos 35diagnóstico. Com exceção do primeiro paciente, que foi diagnosticado após episódio de cetoacidosediabética, foram excluídos do protocolo todos pacientes que já tinham apresentado episódios decetoacidose diabética antes do diagnóstico. Todos os pacientes apresentavam anticorpos anti-GAD65positivos ao diagnóstico.O esquema do tratamento de imunossupressão em altas doses seguida de TACTH constituiusede quatro fases: fase de mobilização das células tronco hematopoéticas, fase de condicionamento(imunossupressão), infusão das células tronco hematopoéticas (ou transplante propriamente dito) e oseguimento do paciente após o transplante.Fase de mobilização das células tronco hematopoéticas. As células tronco hematopoéticasforam mobilizadas da medula óssea para o sangue periférico nesses pacientes com ciclofosfamida eG-CSF (granulocyte-colony stimulating factor). A ciclofosfamida (2 g/m 2 ) foi infundida em duas doses(12 em 12 horas) e o G-CSF (10μg/Kg/dia) foi administrado em duas doses (12 em 12 horas), 24horas após última dose de ciclofosfamida e continuado até o término da coleta das CTH porleucoaférese. O início da coleta foi determinado pela contagem de leucócitos e de células CD34 + nosangue periférico: leucócitos >1000/mm 3 e células CD34 + >10 células/mm 3 . A aférese foi realizada emuma ou duas vezes até atingir o valor mínimo de 3,0 x 10 6 CD34 + /kg de peso. Foram coletadas entre3,4-25,1 x 10 6 células CD34 + /kg (média 8,5x10 6 /kg) dos pacientes com EM, e entre 5,8-23,1 x 10 6células CD34 + /kg (média 10.6 x 10 6 /kg) dos pacientes com DM. Após a coleta, as células troncohematopoéticas foram criopreservadas em solução crioprotetora contendo 10% de dimetilsulfóxido earmazenadas em nitrogênio líquido até o momento do transplante.Fase de condicionamento. Os regimes de condicionamento foram diferentes para as duasdoenças auto-imunes transplantadas (Tabelas 1 e 2). Os pacientes com diabete melito do tipo 1receberam ciclofosfamida e globulina anti-timocitária (ATG, antithymocyte globulin) de coelho. Aciclofosfamida foi administrada em quatro doses de 50 mg/kg/dia nos dias -6, -5, -4 e -3 antes dotransplante. A ATG de coelho foi administrada na dose de 0,5 mg/dia no dia -6, e na dose de 1 mg/dianos dias -5, -4, -3 e -2.Os onze primeiros pacientes com esclerose múltipla (pacientes 1 - 11) receberam um regimede condicionamento constituído de poliquimioterapia denominado BEAM (BCNU, 300 mg/m 2 no dia -6; etoposide, 200 mg/m 2 nos dias -5 a -2; ARA-C, 200 mg/m 2 nos dias -5 a -2; e melphalan, 200mg/m 2 nos dias -5 a -1) associado a ATG de cavalo (15 mg/kg/dia nos dias -5, -3, -1, +1, +2 e +3

Casuística, Materiais e Métodos 36(Tabela 1). O segundo grupo de pacientes com esclerose múltipla (pacientes 12 - 18) foi submetidoao mesmo regime de condicionamento dos pacientes com diabete melito do tipo 1, constituído deciclofosfamida e ATG de coelho.Infusão das células tronco hematopoéticas. A infusão das células tronco hematopoéticasocorreu no dia 0 (data do transplante) e G-CSF (5μg/Kg/day) foi administrado do dia +5 até que acontagem de neutrófilos atingisse valor >1,000/mm 3 . Na maioria do pacientes, foi infundida aquantidade total de células CD34 + coletada.A enxertia da medula após o TACTH foi definida como: 1, enxertia de leucócitos: primeiro diaentre três dias consecutivos em que o número de neutrófilos foi >500 células/μl; 2, enxertia deplaquetas: primeiro dia em que o número de plaquetas foi >20.000, sem que o paciente tenharecebido infusão de plaquetas nos últimos 7 dias.Seguimento do paciente após o transplante. Os pacientes permaneceram internados naUnidade de TMO do HC-FMRP-USP até a ocorrência da enxertia e em seguimento ambulatorialintensivo (de diário a semanal) no Hospital-Dia até aproximadamente 60 dias após o transplante.Após esse período, os pacientes retornaram às suas casas, e compareceram a consultas periódicasde acompanhamento no ambulatório da Unidade de TMO do HC-FMRP-USP.Foram colhidas amostras de sangue periférico dos pacientes nos seguintes períodos: prémobilização(ou basal, ou pré-transplante), pré-condicionamento (amostras são colhidas poucashoras antes do início do condicionamento), e dias D+60, D+100, D+180, D+270, D+360, D+540,D+720 pós-transplante. As coletas das amostras de sangue periférico foram adaptadas aos retornosdos pacientes ao hospital após o transplante. Portanto, nem sempre a data das coletas coincidiramexatamente com as datas programadas citadas anteriormente. Além disso, nem todos os pacientespossuem amostras coletadas de todos os períodos citados acima, devido principalmente ao estadoclínico do paciente ou ao não comparecimento do paciente aos retornos determinados. O primeiropaciente com esclerose múltipla (GG) foi transplantado antes do início desse estudo, portanto nãoforam coletadas amostras de pré-mobilização, pré-condicionamento e dos primeiros meses após oTACTH desse paciente.

Casuística, Materiais e Métodos 373.3 Controles saudáveisAs amostras de sangue periférico de indivíduos-controle saudáveis foram obtidas de doadoresde sangue de repetição do Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto do Hospital dasClínicas da FMRP-USP, sob consentimento informado. Foram colhidas amostras de sangue periféricode 10 doadores com idade menor que 30 anos (Grupo 1; que foi usado para comparação com ogrupo dos pacientes com diabete melito do tipo 1) e de 10 doadores com idade entre 30 - 55 anos(Grupo 2; que foi usado para comparação com o grupo de pacientes com esclerose múltipla).3.4 Isolamento das células mononucleares do sangue periféricoAmostras de 50 ml sangue periférico de pacientes pré ou pós-TACTH, colhidas na presença deheparina sódica (14UI/ml), foram separadas por centrifugação em gradiente de densidade, técnicadescrita por Boyum (1974). As amostras foram diluídas 1:2 em tampão fosfato salina (PBS), aplicadascuidadosamente sobre o gradiente de Ficoll Hypaque (d=1,077, Amersham-Pharmacia, Uppsala,Suécia), e centrifugadas a 500g por 30 minutos a temperatura ambiente (TA) para obtenção dacamada de células mononucleares. As células presentes na interfase plasma-Ficoll Hypaque foramcuidadosamente coletadas e lavadas duas vezes com PBS, ressuspensas em RPMI 1640 (GIBCO-BRL, Life Technologies, New York, USA) contendo 10% soro bovino fetal (Hyclone, Logan, USA) econtadas em câmara de Newbauer. Para congelamento, 5x10 6células mononucleares foramressuspensas em solução de congelamento gelada, constituída de soro bovino fetal (Hyclone, Logan,USA) + 10% de DMSO (Dimetilsulfóxido, Sigma-Aldrich, Steinhein, Alemanha) gelada. As célulasforam aliquotadas em tubos de congelamento de 1 ml gelados e colocadas em freezer a -20°C por 30minutos, transferidas para freezer -80°C overnight e depois para um tanque de nitrogênio líquido.

Casuística, Materiais e Métodos 38Tabela 1. Pacientes com esclerose múltipla submetidos ao TACTH.PACIENTESEXO/IDADE(ANOS)TIPOEMEDSSPRÉ-TACTHRMN PRÉ-TACTHREGIME CONDICIONAMENTODATATACTHTEMPO PÓS-TACTH(MESES)1. GG M/50 PS 5,5 Ausência BEAM +ATG cavalo 21.08.02 402. SAF F/48 PS 6,0 Ausência BEAM +ATG cavalo 29.01.03 OB3. SSS M/37 PS 6,5 Ausência BEAM +ATG cavalo 19.05.03 314. DFG M/51 PS 6,5 Ausência BEAM +ATG cavalo 16.06.03 305. ARJTA M/51 PS 6,5 Presença BEAM +ATG cavalo 04.10.03 276. SHGE F/42 PS 6,5 Ausência BEAM +ATG cavalo 19.02.04 227. RMVL F/37 PS 6,0 Ausência BEAM +ATG cavalo 22.03.04 OB8. MFM F/42 PS 7,0 ND BEAM +ATG cavalo 02.06.04 189. WRS M/21 PP 6,5 Presença BEAM +ATG cavalo 22.07.04 1710. OLP M/52 PP 6,5 Ausência BEAM +ATG cavalo 09.09.04 1511. LST M/28 PS 6,5 Ausência BEAM +ATG cavalo 03.11.04 OB12. SHC M/45 PS 6,5 Ausência Ciclofosfamida + ATG coelho 11.05.05 713. MAFC F/48 SR 4,5 Ausência Ciclofosfamida + ATG coelho 10.06.05 614. RPS M/54 PP 6,5 Ausência Ciclofosfamida + ATG coelho 21.06.05 615. CMBM F/36 PS 6,5 Ausência Ciclofosfamida + ATG coelho 24.08.05 416. LFL F/34 PS 6,5 Ausência Ciclofosfamida + ATG coelho 23.08.05 417. LBSL F/42 PS 6,0 Ausência Ciclofosfamida + ATG coelho 20.10.05 218. CC M/50 PS 6,5 Ausência Ciclofosfamida + ATG coelho 04.11.05 1TACTH, Transplante autólogo de células tronco hematopoéticas; EM, esclerose múltipla; PS, esclerose múltipla progressivasecundária; PP, esclerose múltipla primária progressiva; SR, esclerose múltipla surto-remissiva; EDSS, Expanded DisabilityStatus Score (Anexo 1); RMN, Ressonância Magnética Nuclear; Ausência, ausência de lesões de atividade inflamatória porRMN; Presença, presença de lesões de atividade inflamatória por RMN; BEAM, BCNU, etoposídeo, aracitin, melfalan; ATG,Antithimocyte globulin, G-CFS, Granulocyte-colony stimulating factor; OB, óbito; ND, não determinado. Regime de mobilização:Ciclofosfamida (2g/m 2 ) + G-CSF (10 μg/Kg/dia). Regime de condicionamento: BEAM + ATG cavalo (6x 15mg/kg/dia), ouCiclofosfamida (4 x 50 mg/Kg/dia) + ATG coelho (4,5 mg).

Casuística, Materiais e Métodos 39Tabela 2. Pacientes com diabete melito do tipo 1 submetidos ao TACTH.PACIENTESEXO/IDADE(ANOS)ANTICORPOANTI-GAD65(UI/ML)DOSE INICIAL DEINSULINA (IU/KG/DIA)DATA TACTHTEMPO PÓS-TACTH (MESES)1. LSM M/24 36,0 0,48 12.01.04 232. ALSR M/27 49,0 0,29 15.03.04 203. WSL M/21 1,1 0,39 03.05.04 194. MGB M/15 22,0 0,36 05.07.04 175. RLFS M/16 51,0 0,52 03.02.05 106. CPS M/14 17,0 0,26 03.05.05 77. TAS F/20 4,0 0,48 25.05.05 78. RAOA M/16 48,0 0,35 12.09.05 39. PMR F/18 102,0 0,42 20.09.05 310. CTO F/17 44,0 0,61 10.10.05 211. VTR M/16 11,0 0,10 22.11.05 1TACTH, Transplante autólogo de células tronco hematopoéticas. Níveis séricos de anticorpos anti-GADantibodies foram dosados por radioimnunoensaio usando kits comerciais (R.S.R. Limited, Cardiff, UK),laboratórios do Hospital das Clínicas da FMRP-USP. Resultados foram considerados positivos se >1U/ml. Regime de Mobilização: Ciclofosfamida (2g/m 2 ) + G-CSF (10 μg/Kg/dia). Regime decondicionamento: Ciclofosfamida (4X 50 mg/Kg/dia) + ATG coelho (4,5 mg).3.5 Imunofenotipagem das subpopulações celulares do sangue periféricoAmostras de 5 ml sangue periférico dos pacientes pré ou pós-TACTH foram coletadas napresença de EDTA (8.55 mg/tubo) para a realização de contagens hematológicas eimunofenotipagem por citometria de fluxo. As contagens hematológicas foram realizadas em contadorde células automático (Coulter, Beckman Coulter Inc., Miami, USA) para obtenção do númeroabsoluto de glóbulos brancos, linfócitos, monócitos e granulócitos.Alíquotas de 100 μl de sangue periférico total foram incubadas por 20 minutos a TA no escurocom 5 μl de anticorpos monoclonais ou isotipos controles diretamente conjugados a fluorocromos(isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), peridinin chlorophyl protein (PercP) ouficoeritrina-CY5 (PE-CY5)), adquiridos da Becton-Dickinson (San Diego, CA, USA) ou Pharmingen(BD Bioscience, San Diego, CA, USA), e previamente titulados. Foram feitas marcações duplas outriplas para a análise das diversas subpopulações linfocitárias. Todas as incubações foram realizadasno escuro para evitar perda de fluorescência. Em seguida as amostras de sangue foram incubadascom 1 ml de solução de fixação e lise (FACs lysing solution, Becton-Dickinson, San Diego, CA, USA)por 10 minutos a TA, para fixação das células e lise dos eritrócitos. As células foram centrifugadas por5 minutos a 500 g, lavadas duas vezes com tampão FACS (PBS, 0.2% de soro bovino fetal, 0.02% de

Casuística, Materiais e Métodos 40azida sódica), ressuspensas em 200 μl de tampão FACS e analisadas imediatamente no citômetro defluxo FACSort (Becton-Dickinson, San Diego, CA, USA).As seguintes subpopulações linfocitárias foram analisadas: CD3 +(linfócitos T totais),CD3 + CD4 + (linfócitos T helper ou auxiliares), CD3 + CD8 + (linfócitos T citotóxicos), CD19 + (linfócitos B),CD3 - CD16 + ,56 + (células “natural killer”, NK), CD3 + CD16 + ,56 + (células NKT-like), CD3 + CD69 + ,CD3 + HLADR + e CD3 + CD25 + (marcadores de ativação celular em linfócitos T), CD19 + CD38 +(marcadores de ativação celular em linfócitos B), CD4 + CD45RA + CD31 + (linfócitos T auxiliares virgens,recém-imigrados do timo), CD4 + (CD8 + )CD27 + CD45RO - (linfócitos T naive), CD4 + (CD8 + )CD27 +CD45RO + (linfócitos T de memória central), CD4 + (CD8 + )CD27 - CD45RO + (linfócitos T de memóriaefetora), CD4 + (CD8 + )CD27 - CD45RO -(linfócitos T efetores diferenciados), CD4 + CD25 high (células Treguladoras), CD4 + CD25 high CTLA-4 + (células T reguladoras que expressam CTLA-4 ou CD152),CD4 + CD25 high GITR + (células T reguladoras que expressam GITR), CD3 + TCRαβ + e CD3 + TCRγδ +(expressão de receptor de célula T αβ ou γδ), CD3 + CD4 + Fas + , CD3 + CD8 + Fas + , CD3 + CD19 + Fas + ,CD3 + CD4 + FasL + , CD3 + CD8 + FasL + (expressão de moléculas relacionadas à apoptose, Fas (CD95) eFasL (CD178) em linfócitos T e B).Populações de monócitos CD45 + CD14 + e CD14 + CD25 + também foram analisadas paraverificar e excluir contaminação de monócitos na gate de linfócitos. Foram analisadas também duassubpopulações de células dendríticas do sangue periférico, as células dendríticas linfóides (LIN -CD11c - HLADR + ) e células dendríticas mielóides (LIN - CD11c + HLADR + ). LIN (lineage) corresponde auma mistura de anticorpos contra vários antígenos de superfície característicos de algumas linhagenscelulares (os quais são ausentes em células dendríticas): CD3, CD19, CD20, CD14, CD45, CD34,CD16, CD56. Controles isotípicos (IgG 1 -FITC, IgG 2a -PE e IgG 1 -PercP) foram incluídos em todos osexperimentos para determinação de marcações inespecíficas.Durante a aquisição das células, foi desenhada uma gate na população de linfócitos (R1),estabelecida com base nos parâmetros de tamanho (FSC) e granularidade (SSC). Foram adquiridos20.000 eventos/amostra. As análises foram realizadas utilizando-se o software Cellquest (Becton-Dickinson, San Diego, CA, USA). As células mortas foram excluídas por tamanho e granularidade. Asdiversas subpopulações celulares foram analisadas usando-se dois ou três tipos de fluorocromos. Nocaso de marcações duplas, os eventos da gate de linfócitos (R1) foram analisados para marcaçãocom os diferentes anticorpos por dot plots de fluorescência 1 (FL1, FITC - isotiocianato de

Casuística, Materiais e Métodos 41fluoresceína) versus fluorescência 2 (FL2, PE - ficoeritrina). Ou então, em outro tipo de análise demarcação dupla, foi selecionada uma determinada subpopulação por uma gate R2 (por exemplo,FL1), e a marcação de fluorescência 2 (FL2, PE) nessa gate R2 foi representada por um histogramade FL2.No caso de marcações triplas, foram feitos dot plots de FL1 versus FL2, em seguida foidesenhada uma gate R2 na população duplo-positiva. A marcação de fluorescência 3 (FL3, PercP ouPE-CY5) nessa gate R2 foi representada por um histograma de FL3. Ou então, em outro tipo deanálise de marcações triplas, foi selecionada uma determinada subpopulação por uma gate R2 (porexemplo, FL1), e foram feitos dot plots de FL1 versus FL2 para análise dos eventos da gate R2.Para análise das subpopulações de células dendríticas do sangue periférico, foi feito um dotplot de FL3 versus FL2 (HLADR-Percp versus LIN-FITC), em seguida foi desenhada uma gate R1 napopulação de células HLADR high LIN - . Em seguida, a marcação de fluorescência na gate R1 foianalisada por um dot plot de FL3 versus FL2 (HLADR-Percp versus CD11c-PE). As célulasdendríticas linfóides são LIN - CD11c - HLADR + (gate R3) e as células dendríticas mielóides são LIN -CD11c + HLADR + (gate R2).Os resultados das análises de imunofenotipagem foram expressos em porcentagem de célulaspositivas ou valores absolutos que foram calculados multiplicando-se o valor da porcentagem obtidapelo número de linfócitos/μl, que foi determinado pelas contagens hematológicas da amostra desangue periférico. Exemplos dessas análises de experimentos de imunonofenotipagem por citometriade fluxo encontram-se representadas no Apêndice A.3.6 Detecção de citocinas intracelulares em linfócitos T ativadosA produção de citocinas por linfócitos T CD4 (CD3 + CD8 - ) ou CD8 (CD3 + CD8 + ) ativados foidetectada por citometria de fluxo, realizando-se marcação intracelular das citocinas produzidas peloslinfócitos após ativação com um estímulo policlonal (Jung et al., 1993; Masher et al., 1999). Apadronização do ensaio (concentração dos reagentes, tempo de incubação) foi feita utilizando-secélulas de indivíduos-controle saudáveis. Células mononucleares do sangue periférico foram isoladase criopreservadas como descrito anteriormente. Para o ensaio de produção de citocinas intracelularesas células mononucleares foram descongeladas, lavadas duas vezes com RPMI 1640 (GIBCO-BRL,Life Technologies, New York, USA) contendo 10% de soro bovino fetal (Hyclone, Logan, USA) e

Casuística, Materiais e Métodos 42ressuspensas nesse meio de cultura (2x10 6 células/ml). Em seguida, as células foram estimuladascom 25 ng/ml de PMA (forbol-miristato-acetato; Sigma-Aldrich, Steinhein, Alemanha) e 1 μg/ml deIonomicina (Sigma-Aldrich, Steinhein, Alemanha), na presença ou não de Brefeldina A (Sigma-Aldrich, Steinhein, Alemanha) por 6 horas. A Brefeldina A (10 μg/ml) foi adicionada à cultura nasúltimas 4 horas do ensaio. A Brefeldina A é um metabólito fúngico que interfere com o transportevesicular do retículo endoplasmático rugoso para o complexo de Golgi, servindo como um inibidor dotransporte de proteínas, e desse modo promovendo o acúmulo das citocinas sintetizadas de novo nocomplexo de Golgi.Foram feitos três tipos de amostras: 1, controle não-estimulado (células + Brefeldina A), usadopara determinar o nível de síntese residual de citocinas devido à ativação in vivo; 2, amostraestimulada (células + Brefeldina A + PMA + Ionomicina); 3, controle da ativação (células + PMA +Ionomicina), usado para determinar o nível de ativação celular por meio da expressão do marcador deativação precoce CD69 (Nakamura et al., 1989), cuja expressão de superfície é significantementeinibida na presença de Brefeldina A. O cálculo da resposta específica das células ao estímulopoliclonal foi calculado da seguinte maneira: (AE - ICAE) - (CNE - ICCNE), onde AE = amostraestimulada; ICAE = isotipo controle da amostra ativada; CNE = controle não-estimulado; ICCNE =isotipo controle do controle não-estimulada.Após incubação de 6 horas com os estímulos, as células (0,5x10 6células/amostra) foramincubadas com 200 μl de 0.5 M EDTA por 15 minutos a TA, e em seguida marcadas com anticorposmonoclonais, previamente titulados, contra os antígenos de superfície (CD3/CD8 ou CD3/CD69) ouisotipos controles, por 20 minutos a TA. Os anticorpos são diretamente conjugados a fluorocromos, eforam adquiridos da Becton-Dickinson (San Diego, CA, USA) ou Pharmingen (BD Biosciences, SanDiego, CA, USA). Todas as incubações foram realizadas no escuro para evitar perda defluorescência. Após a marcação, as células foram lavadas com tampão FACS, centrifugadas por 5minutos a 500 g, ressuspensas em 1 ml de solução de fixação e lise (FACs lysing solution, BD, SanDiego, CA, USA), incubadas por 10 minutos a TA e congeladas a -80°C overnight. Em seguida, ascélulas rapidamente descongeladas, centrifugadas por 5 minutos a 500g, ressupensas em 500 μl desolução de permeabilização (FACS permeabilizing solution, BD, San Diego, CA, USA) e incubadaspor 10 minutos a TA. Após lavagem com tampão FACS, as células foram incubadas com anticorposanti-citocinas (IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-5 e IL-10) ou isotipos controles intracelulares diretamente

Casuística, Materiais e Métodos 43conjugados a fluorocromos por 30 minutos a TA. As células foram então lavadas novamente,ressuspensas em 200 μl de tampão FACS e analisadas no citômetro de fluxo FACSort (Becton-Dickinson, San Diego, CA, USA). Controles isotípicos (IgG 1 -FITC, IgG 2a -PE e IgG 1 -Percp) foramincluídos em todos os experimentos para determinação de marcação inespecífica.Durante a aquisição das células, foi desenhada uma gate na população de linfócitos (R1),estabelecida com base nos parâmetros de tamanho (FSC) por granularidade (SSC). Foramadquiridos 20.000 eventos/amostra. As análises foram realizadas utilizando-se o software Cellquest(Becton-Dickinson, San Diego, CA, USA). Os eventos da gate de linfócitos (R1) foram analisados pordot plots de fluorescência 1 (FL1, anti-CD8-FITC) versus fluorescência 3 (FL3, anti-CD3-PercP). Emseguida, foram desenhadas uma gate R2 na população duplo-positiva (CD3 + CD8 + , de linfócitos TCD8 + ) e uma gate R3 na população CD3 + CD8 - (que contém linfócitos T CD4 + em sua grandemaioria). Esse tipo de marcação foi escolhido pois a expressão da molécula CD4 é drasticamentediminuída em linfócitos ativados com PMA e ionomicina. A expressão de CD8 também diminui, noentanto em proporções bem menores. A marcação de fluorescência 2 (FL2, anti-citocinas-PE) na gateR2 foi representada por um histograma de FL2. Exemplos dessas análises de experimentos decitocinas intracelulares por citometria de fluxo encontram-se representadas no Apêndice B.3.7 Extração de RNA pelo método de TrizolA extração do RNA das células mononucleares do sangue periférico foi realizada pelo métododescrito por Chomzynski et al. (1987), o qual utiliza solução de Trizol (GIBCO BRL Life Technologies,Grand Island, NY, USA) para isolamento de RNA total. Trizol é uma solução monofásica de fenol eisotiocianato de guanidina que rompe a célula mantendo a integridade do RNA. Partindo de umasuspensão de aproximadamente de 5x10 6 células mononucleares resuspensas em 200 μl de soluçãofisiológica previamente tratada com DEPC (Dietilpirocarbonato; Sigma-Aldrich, Steinhein, Alemanha),adicionou-se 1ml de Trizol. Esta solução foi homogeneizada e então incubada por 5 minutos atemperatura ambiente, para permitir completa dissociação de complexos de nucleoproteínas. Emseguida adicionou-se 0,2 ml de clorofórmio para cada ml de trizol, seguido de agitação vigorosa poraproximadamente 15 segundos. O material foi posteriormente incubado por 2 a 3 minutos àtemperatura ambiente e centrifugado por 15 minutos a 1120 g a 4 o C.

Casuística, Materiais e Métodos 44Após esta centrifugação ocorre a separação da solução em três fases (aquosa, interface eorgânica). A fase aquosa foi transferida para um novo tubo contendo 0,5 ml de álcool isopropílicopara cada ml de trizol, para a precipitação do RNA. Este tubo foi homogeneizado por inversão,seguido de incubação por 10 minutos ou overnight a -80°C e então centrifugado novamente a 1120 gpor 15 minutos a 4 o C. O sobrenadante foi removido e o “pellet” de RNA lavado com etanol 75%diluído em água DEPC seguido de centrifugação a 640 g por 5 minutos a 4 o C. O RNA assim obtido foideixado secar por 5 minutos para evaporação do etanol e então ressuspendido em 10μl de águaDEPC. Este material foi mantido a -80 o C até o momento da transcrição. Após extração, o RNA obtidofoi quantificado através de leitura em espectrofotômetro (Beckman, DU530, Fullerton, CA, USA) noscomprimentos de onda (λ) de 260 e 280 nm. O grau de pureza da amostra foi verificado através daanálise da relação entre 260 e 280nm, sendo considerada uma boa extração aquela que apresentouvalores entre 1,8 a 2,0. Para o cálculo da concentração da amostra considerou-se que a densidadeótica (DO) igual a 1 corresponde a 40 μg de RNA /ml no comprimento de onda de 260 nm.3.7.1 Eletroforese de amostras de RNA em gel de agarose sob condiçõesdesnaturantesApós a quantificação das amostras de RNA foi preparado um o gel sob condiçõesdesnaturantes para visualização da integridade do RNA. Um volume total de 70 ml de agarosefundida foi misturado a 20 ml de formaldeído 37% e 22 ml de tampão de migração MOPS 5X (20,6gde MOPS dissolvidos em 800 mL de acetato de sódio 50mM, pH 7,0 ajustado com NaOH 2N eadicionado 10 ml de EDTA 0,5M pH 8,0; volume final ajustado para 1000 ml). Durante o tempo desolidificação do gel, as amostras de RNA (4,5 μl de solução de RNA, com cerca de 3 μg RNA) foramdesnaturadas em 2,0 μl de tampão MOPS 5X, 3,5 μl de formaldeído 37% (Merck, Alemanha) e 10,0 μlde formamida, por 15 minutos a 65°C. Após esse tempo, as amostras foram colocadasimediatamente no gelo, sendo adicionados 1,0 μl de brometo de etídeo diluído 3:1 (solução estoque10mg/mL) e 2,0 μl de dye loading solution (1/10 do volume). Após eletroforese a 80 V durante 90minutos, as bandas de RNA foram visualizadas em transiluminador UV.

Casuística, Materiais e Métodos 453.8 Transcrição reversaApós constatação da qualidade e pureza do RNA, a transcrição reversa do RNA para cDNA foirealizada utilizando um kit comercial (Superscript III First Strand Synthesis System for RT-PCR,Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Foram adicionados num tubo de 0,2 ml: 2μg de RNA total (em 2μl),1μl de oligo(dT) 20 (50 μM/μl), 1μl 10 mM dNTP mix e água DEPC q.s.p. 8 μl. Esta mistura foi incubadaa 65 o C por 5 minutos em termociclador para remoção de estruturas secundárias, e então colocadaem gelo por pelo menos 1 minuto. Em seguida foi preparada a mistura de síntese de cDNA: 2 μltampão para PCR 10X (200 mM Tris-HCl pH 8.4, 500 mM KCl), 4 μl 25 mM MgCl 2 , 2 μl 0,1 M DTT,1μl RNaseOUT TM (40U/μL), e 1 μl da enzima transcriptase reversa SuperScript III RT (200 U/μl).Foram adicionados 10 μl dessa mistura de síntese à mistura de RNA/primer. Os componentes dareação foram gentilmente misturados e centrifugados brevemente, incubados por 50 minutos a 50°Ce a reação foi terminada a 85°C por 5 minutos e colocada em gelo. Em seguida, o tubo de reação foicentrifugado brevemente e incubado por 20 min com 1 μl de RNase H, e o cDNA foi estocado a -20 o C.3.8.1 Validação da transcriçãoO gene da β-actina tem sido comumente utilizado como controle da reação de transcrição doRNA em cDNA. Para esta reação foram utilizados 2 μl do cDNA transcrito, 2,5 μl de tampão paraPCR 10X, 1,0 μl de 1,5 mM MgCl 2 , 3 μl de 10 mM dNTP mix, 1 μl de cada primer (10 μM), 0,3 μl deTaq polimerase (5 unidades/μl) e água DEPC q.s.p. 25μl. Os reagentes foram misturados ecentrifugados brevemente, colocados em termociclador pré-aquecido a 94 o C, e submetidos a umpasso de desnaturação inicial por 2 minutos a 94 o C, seguido por 30 ciclos de PCR (desnaturação a94 o C por 40 segundos, anelamento a 55 o C por 1 minuto e extensão a 72 o C por 1 minuto,completados por uma extensão final de 10 minutos a 72 o C). Em seguida, o produto da reação foimantido a 4°C e carregado em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo (0,5μg/ml) esubmetido à corrida eletroforética a 100 V durante 30 minutos. O tamanho esperado do produto dePCR é de 353 pb.

Casuística, Materiais e Métodos 463.9 Método de TCRBV CDR3 SpectratypingEste método permite analisar a diversidade do repertório de linfócitos T e detectar depopulações celulares em expansão clonais (Pannetier et al., 1993; Pannetier et al.,1995). Esta técnicaé iniciada por uma amplificação por PCR dos segmentos Vβ-Cβ do TCR utilizando primersespecíficos para cada uma das famílias Vβ. O produto desta reação é submetido à outra amplificaçãopor PCR que inclui um primer adicional marcado com fluorocromo. Nesta reação amplifica-se osegmento gênico que contém a região CDR3 (do inglês Complementarity-Determining Regions) doTCR, uma vez que esta região está localizada entre os segmentos V-D-J. Em seguida, estessegmentos amplificados por PCR são separados em gel de seqüenciamento e, com o auxílio de umseqüenciador automático e do software Gene Mapper TM (Applied Biosystem), é possível calcular otamanho (em pares de bases) dos diferentes segmentos (picos) de CDR3, o número de picos deCDR3, estimar a freqüência de cada família Vβ no repertório do TCR, e analisar a clonalidade edistribuição (gaussiana ou não-gaussiana) dos picos na região CDR3. Um esquema do método deTCRBV CDR3 Spectratyping é mostrado na Figura C.1 (Apêndice C).3.9.1 Reação de PCR (Vβ-Cβ) para determinação das famílias Vβ do Receptor deCélulas (TCR)Esta reação de PCR possibilita a amplificação do segmento gênico Vβ-Cβ do TCR. Para umvolume final de reação de 50μl, foram utilizados 4% de cDNA transcrito, tampão 10X (500mM KCl e100mM Tris-HCl), 2mM MgCl 2 , 200μM dNTP, 0,5μM do primer CB e 0,5μM do primer Vβ específico,1 U Taq polimerase e água qsp 50μl. Esta reação foi processada em termociclador por 1 minuto e 30segundos a 94 o C, seguidos de 40 ciclos de 30 segundos a 94 o C, 45 segundos a 60 o C, 45 segundosa 72 o C, completados com uma extensão final de 4 minutos a 72 o C. A Tabela 3 mostra a seqüênciados primers utilizados para a amplificação das 24 famílias Vβ, bem como o tamanho esperado doproduto de PCR. O produto de amplificação foi carregado em gel de agarose 1,5% corado combrometo de etídeo (0,5μg/ml) e submetido à corrida eletroforética de 100 V por 1 h 30 min.

Casuística, Materiais e Métodos 473.9.2 Reação de elongação Vβ-Cβ (Run-off)Inicialmente, foi realizada uma reação de PCR amplificando o segmento gênico Vβ-Cβ do TCRconforme protocolo descrito acima e o produto de PCR assim gerado foi utilizado para a reação deelongação. Esta reação foi realizada utilizando primer Cβ interno marcado com fluorocromo (FAM) [5´CAC AGC GAC CTC GGG TGG G 3´]. Para a reação de elongação utilizou-se tampão 10x contendo500mM KCl e 100mM Tris-HCl, 3mM MgCl 2 , 200μM dNTP, 0,5μM primer CB marcado, 0,2U Taqpolimerase e água qsp 8μL, seguido da adição separadamente de 2μL do produto de PCR de cadauma das 24 famílias Vβ. Esta reação foi então processada em termociclador por 1 minuto e 30segundos a 94 o C, seguidos de 8 ciclos de 30 segundos a 94 o C, 45 segundos a 60 o C, 45 segundos a72 o C, completados com uma extensão final de 45 minutos a 72 o C.3.9.3 Preparo do gel de seqüenciamentoA análise do tamanho (pares de bases) dos diferentes segmentos (picos) de CDR3amplificados pelas reações de PCR foi realizada em gel de seqüenciamento (6% de poliacrilamida, 8M de uréia e 1x tampão Tris-Borato-EDTA (TBE)). As placas de vidro foram lavadas com detergentenão abrasivo e enxaguadas com água corrente e depois com água destilada. Antes do acoplamentodas placas no suporte de migração, as mesmas foram limpas novamente com água destilada quentepara completa remoção de resíduos. Para uma solução de 50 ml de gel foram pesados 18g de uréia e1,3 a 1,4g da resina Amberlite (Sigma-Aldrich, Steinhein, Alemanha), acrescidos de 24,5 ml de águadestilada e 5,2 ml de solução 40% de acrilamida/bis-acrilamida 19/1 (BioRad, Hercules, CA, USA).Esta solução foi colocada em agitação leve até dissolução completa da uréia. Em seguida, estasolução foi filtrada em filtro de 0,22 μm contendo em sua parte inferior 5 ml de tampão Tris-Borato-EDTA (TBE 10x). O volume da solução foi completado para 50 ml com água destilada. Por último,acrescentou-se 250 μl de solução de persulfato de amônia 10% e 35μl de TEMED (Amresco, Solon,Ohio, USA) e homogeneizou-se lentamente. Com o auxílio de uma seringa, o gel foi carregado nasplacas de vidro e utilizado após completa polimerização (aproximadamente 1h).

Casuística, Materiais e Métodos 48Tabela 3. Seqüência dos primers utilizados na amplificação das famílias Vβ do TCRFAMÍLIAVBSEQÜÊNCIAS DOS PRIMERSVB-CB(PARES DEBASES)ESPECIFICIDADES AMPLIFICADASVB1 5’ CCGCACAACAGTTCCCTGACTTGC 3’ 322 VB1S1VB2 5’ GGCCACATACGAGCAAGGCGTCGA 3’ 360 VB2S1, S2VB3 5’ CGCTTCTCCCTGGATTCTGGAGTCC 3’ 299 VB3S1VB4 5’ TTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAA 3’ 325 VB4S1VB5 5’ AAGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCC 3’ 299 VB5S1, S2, S3, S5, S6, S7, S8VB6 5’ CTCTGAAGATCCAGCGCACAGAGC 3’ 292 VB6S1, S3, S4, S5, S7, S11, S14VB7 5’ CCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTC 3’ 320 VB7S1, S2, S3VB8 5’ CCATGATGCGGGGACTGGAGTTGC 3’ 406 VB8S1, S2, S3VB9 5’ TTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGC 3’ 279 VB9S1, S2VB10 5’ CCACGGAGTCAGGGGACACAGCAC 3' 277 VB10S1VB11 5’ TGCCAGGCCCTCACATACCTCTCA 3’ 276 VB11S1VB12 5’ TGTCACCAGACTGGGAACCACCAC 3’ 449 VB12S2, S3, S4VB13 5’ CACTGCGGTGTACCCAGGATATGA 3’ 456 VB13S1, S2, S3, S4, S6, S7, S8, S9VB14 5’ GGGCTCGGCTTAAGGCAGACCTAC 3’ 398 VB14S1VB15 5’ CAGGCACAGGCTAAATTCTCCCTG 3’ 311 VB15S1VB16 5’ GCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGG 3’ 279 VB16S1VB17 5’ TCCTCTCACTGTGACATCGGCCCA 3’ 295 VB17S1VB18 5’ CTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCC 3’ 322 VB18S1VB19 5’ TCTCAATGCCCCAAGAACGCACCC 3’ 320 VB19S1VB20 5’ TGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCA 3’ 337 VB20S1VB21 5’ TCCAGCCTGCAAAGCTTGAGGACT 3’ 283 VB21S1, S3, S4VB22 5’ GATCCGGTCCACAAAGCTGG 3’ 287 VB22S1VB23 5’ TGAACTGAACATGAGCTCCTTGG 3’ 295 VB23S1VB24 5’ GACATCCGCTCACCAGGCCTG 3’ 288 VB24S1CB 5’ CGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG 5’3.9.4 Preparo das amostras e aplicação no gel de seqüenciamentoO produto de PCR da reação de run-off foi diluído (1:10) em água. Em seguida 2μl destadiluição, acrescidos de 1μl de marcador de peso molecular (Gene Scan - 500 Rox standard,Applied Biosystems) e 2μl de tampão para carregar amostra (loading buffer - formamida, acrescida deblue dextan, 50 mg/ml e EDTA, 25 mM na proporção 5:1). Esta solução foi colocada em termociclador

Casuística, Materiais e Métodos 49a 95 0 C por 2 minutos para completa desnaturação do produto de PCR. As amostras foram mantidasem gelo até o momento da aplicação no gel de seqüenciamento, no qual foram carregados 5μl deamostra/poço. Os produtos de PCR da reação de run-off foram submetidos à corrida eletroforética por2 h 30 min em um seqüenciador de DNA automático (ABI 377 Prism DNA Sequencer, AppliedBiosystem, Foster City, CA, USA).3.9.5 Perfil da região CDR3 do RTC, cálculo do tamanho da região CDR3 do RTC e dafreqüência das famílias Vβ, pelo método de TCRBV CDR3 SpectratypingConsiderando que a região CDR3 está compreendida entre os resíduos de aminoácidos 95-106 da cadeia variável β do TCR (Pannetier et al., 1993; Pannetier et al., 1995) e que a posição dosprimers VB e CB utilizados são fixas, o tamanho observado para o produto de PCR VB-CB marcadodepende do tamanho da junção V(D)J de cada TCR específico. O tamanho (em pares de bases) dosegmento CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos para cada família Vβ foi estimado previamente(Pannetier et al., 1993; Pannetier et al., 1995), como mostrado na Tabela 4.Estes valores são utilizados para o cálculo de cada segmento de CDR3 pelo software GeneMapper (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA), sendo comparados com um marcador de pesomolecular conhecido (Gene Scan - 500 Rox standard, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)que é carregado juntamente com as amostras a serem analisadas na corrida eletroforética. Estemarcador de peso molecular é conjugado com o fluorocromo denominado “Rox”, diferente dofluorocromo denominado “Fam” utilizado na reação de run-off para os segmentos VB-CB. Istopossibilita a discriminação de diferentes tamanhos (em pares de bases) detectados pelos raios lasersemitidos pelo seqüenciador automático. Como mencionado anteriormente, o pico correspondente a10 resíduos de aminoácidos é definido por um número de pares de bases conhecido. Assim, comocada 3 pares de base correspondem a 1 resíduo de aminoácido, é possível portanto definir o númerode aminoácidos de cada segmento de CDR3 para uma determinada família Vβ. No entanto, adefinição exata do tamanho e seqüência dos segmentos de CDR3 é possível somente após oseqüenciamento desta região.A distribuição dos segmentos de CDR3 pode apresentar um perfil policlonal normal comdistribuição como uma Curva de Gauss, com segmentos variando de 4 a 16 resíduos de aminoácidos,sendo os tamanhos de 8 a 10 resíduos de aminoácidos os mais freqüentes. Ou ainda, pode

Casuística, Materiais e Métodos 50apresentar um perfil policlonal anormal, diferente de uma distribuição de Gauss, podendo chegar aum perfil oligoclonal (com poucos picos de CDR3) ou monoclonal (pico de CDR3 únicocorrespondente a uma população de células T em expansão clonal).Tabela 4. Tamanho esperado do produto de PCR da amplificação VB-CB (em pares de bases) para o segmento CDR3 de 10 aminoácidosFAMÍLIA VBTAMANHO PRODUTO(PARES DE BASES)FAMÍLIA VBTAMANHO PRODUTO(PARES DE BASES)VB1 189 VB13 323VB2 227 VB14 265VB3 166 VB15 178VB4 192 VB16 146VB5 166 VB17 161VB6 159 VB18 189VB7 187 VB19 187VB8 273 VB20 204VB9 146 VB21 150VB10 144 VB22 153VB11 143 VB23 161VB12 316 VB24 154A Figura C.2 (Apêndice C) mostra exemplo de imagem gerada após a corrida eletroforéticados produtos de PCR obtidos após a reação de elongação (run-off) num gel de seqüenciamento.Essa imagem foi analisada pelo software Gene Mapper (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA),gerando os gráficos de distribuição dos segmentos da região CDR3. (Apêndices I-M: pacientes comdiabete melito; Apêndices N-U: pacientes com esclerose múltipla; Apêndices V: indivíduos-controlesaudáveis). Os gráficos (ou espectros) representam a intensidade de fluorescência em unidadesarbitrárias em função do comprimento da região CDR3 em pares de bases. A análise fornecida pelosoftware inclui o tamanho do pico (expresso em pares de bases), e a altura e área de cada pico.Foram considerados positivos os picos com área de intensidade de fluorescência ≥500 unidadesarbitrárias. Nos gráficos, os picos destacados em azul correspondem ao segmento de CDR3 com 10resíduos de aminoácidos. A partir desses gráficos, foi calculada a freqüência de cada pico de CDR3de cada família Vβ e a freqüência total de cada família Vβ para uma determinada amostra, a partir dovalor da área dos picos de fluorescência, segundo as seguintes fórmulas: % VBn = (área pico VBn/ Σárea todos VB) X 100, % VB total = (Σ área todos picos VB/ Σ área todos VB) X 100, respectivamente.

Casuística, Materiais e Métodos 51Em nosso trabalho, a diversidade do repertório da cadeia Vβ do TCR foi analisada com base nocomplexity score descrito por Wu et al. (2000). O complexity score é um sistema de pontuação quequantifica as mudanças no repertório Vβ do TCR ao longo do tempo.De acordo com esse sistema, primeiramente a complexidade dentro de cada família Vβ édeterminada pela contagem do número de picos. Então as famílias são classificadas com umapontuação de 0 a 8, baseada no grau de complexidade (ou diversidade). A complexidade normal écaracterizada por uma distribuição gaussiana dos diferentes tamanhos de transcritos para umadeterminada família, e pela quantidade de 8-10 picos para cada família Vβ. A pontuação 0 é dada sea família é ausente, a pontuação 1 é atribuída se a família Vβ apresentar somente um único picomonoclonal, a pontuação 2 é dada se a família apresentar um perfil biclonal, a pontuação 3 é dada sea família apresentar 3 picos, e assim por diante. Finalmente, a pontuação 8 é atribuída a umspectratype de 8 picos ou mais, com uma aparência diversa, complexa e policlonal. Assim, ocomplexity score geral é calculado pela soma dos complexity scores de cada família Vβ. No nossotrabalho, o complexity score máximo é de 192 (8 X 24 famílias Vβ).3.10 Análise da expressão de Foxp3 por Real Time RT- PCRA análise da expressão do gene Foxp3 nas células mononucleares do sangue periférico dospacientes, antes e após o transplante, foi feita por Real Time RT-PCR. As reações foram realizadasem placas de 96 poços, utilizando os reagentes SYBR-Green PCR Master Mix (Applied Biosystems,Foster City, CA, USA) e o equipamento 7500 Real Time PCR system (Applied Biosystems, FosterCity, CA, USA). O RNA foi extraído das células mononucleares dos pacientes pelo método de Trizol eo cDNA foi sintetizado e validado para a amplificação do gene da β-actina. O gene endógeno GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) foi utilizado como gene de referência para normalizaras reações de PCR para a quantidade e qualidade de RNA total usada nas reações de transcriçãoreversa.A determinação da intensidade de fluorescência na reação foi feita pelo cálculo do ΔRn (ΔRn =Rn + - Rn - ), onde Rn + = intensidade de emissão do SYBR-Green intensidade de emissão do ROX emum dado momento da reação, e Rn - = intensidade de emissão do SYBR-Green intensidade deemissão do ROX, antes da amplificação. O composto ROX é utilizado como controle interno passivo,pois a fluorescência que emite tem intensidade constante durante toda a reação, enquanto que o a

Casuística, Materiais e Métodos 52fluorescência emitida pelo SYBR-Green aumenta à medida que este se liga nas duplas fitas de DNA.Durante os ciclos iniciais da reação, não há acúmulo de produtos de amplificação e os valores de ΔRnpermanecem na linha de base (fluorescência do ROX > SYBR-Green). Na fase logarítmica da reaçãoocorre acúmulo dos produtos de amplificação e a ΔRn ultrapassa a linha de base. Para aquantificação relativa, após a reação foi estabelecido um valor de ΔRn, que é uma linha de corte(threshold) para cada curva de amplificação de um dado par de primers, definida acima dafluorescência inespecífica. O número do ciclo em que a ΔRn da amostra cruza o thresholdcorresponde ao Ct (cycle threshold) da amostra. O valor de Ct é preditivo da quantidade de RNAmalvo presente na amostra.Os primers utilizados nas reações de amplificação foram desenhados pelo programa PrimerExpress (Applied Biosystems, EUA). Na padronização das reações de real time RT-PCR, os cDNAs eprimers foram titulados e foi calculada a eficiência da amplificação para o gene endógeno (GAPDH) epara gene alvo (Foxp3). Os pares de primers utilizados foram: GAPDH (5’-TGG TCT CCT CTG ACTTCA-3’, 5’-AGC CAA ATT CGT TGT CAT-3’); Foxp3 (5’-GAG AAG GGC AGG GCA CAA T-3’, 5’-GTGCCA TGC AGG CCC ACC-3’). O produto de amplificação do gene GAPDH é 117 bp e do gene Foxp3de 101 bp. Os primers foram usados na concentração final de 200 nM. As reações foram preparadasem triplicatas num volume final de 10 μl. A reação de real time RT-PCR foi iniciada a 95ºC por 10minutos, seguida de 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC e 1 minuto a 60ºC, de acordo com o manual deinstruções do fabricante ABI PRISM 7500. O máximo coeficiente de variação permitido entre astriplicatas foi de 1%, caso contrário o experimento foi repetido.A especificidade dos primers foi avaliada pela curva de dissociação dos produtos de PCR, quepode detectar amplificações inespecíficas, incluindo primer-dimers (Apêndice H). Para isso, após areação, a placa foi submetida a um segundo programa: 95°C por 1 minuto, 60°C por 1 minuto e 95°Cpor 1 minuto. A curva de dissociação consiste na monitorização da fluorescência das amostras emrelação ao aumento de temperatura. A fluorescência das amostras decresce com o aumento datemperatura, pois à medida que as pontes de hidrogênio, que mantém as duplas fitas unidas serompem (devido ao aumento de temperatura), o SYBR-Green é liberado. A fluorescência é emitidasomente quando o DNA está em dupla fita. Assim, quando observamos somente um pico defluorescência em uma dada temperatura significa que houve amplificação de um produto específico.Esta temperatura é a temperatura de anelamento ou melting point (Tm) do produto de amplificação.

Casuística, Materiais e Métodos 53A normalização e quantificação relativa da expressão gênica foram realizadas pelo método de2 -ΔΔC T (Livak et al., 2001), onde C T = threshold cicle (ciclo da reação em que a fluorescência daamostras excede o threshold), e ΔΔC T = (C T, alvo - C T, endógeno ) pós-transplante - (C T, alvo - C T, endógeno ) prétransplante.Usando o método de 2 -ΔΔC T, os dados são representados como diferença (em vezes) naexpressão gênica, que foi normalizada para um gene endógeno de referência e é relativa a umcontrole ou calibrador. Em nossos experimentos, o calibrador usado foi o valor basal ou prétransplante.Para o calibrador, o ΔΔC T é igual a zero e 2 0 é igual a um, assim mudança na expressãogênica relativa ao período pré-transplante é igual a um. Para os períodos pós-transplante, o valor de2 -ΔΔC T indica a diferença (em vezes) na expressão gênica relativa ao período pré-transplante.O método 2 -ΔΔCt para cálculo da expressão gênica assume que a eficiência de amplificação dogene alvo e do gene de referência é igual a 2, ou seja, 100%. Para o cálculo da eficiência foi utilizadaa equação E = 10 (-1/slope) , onde E corresponde à eficiência e slope corresponde ao coeficiente deangulação da curva (Bustin, 2000; Pfaffl, 2001). Para cada gene estudado foi realizada uma reaçãocom diluições seriadas de amostra de cDNA (1/5 a 1/1250) e o primers de interesse. Os valores de Ctobtidos foram plotados em gráfico para cálculo do slope e da eficiência. A eficiência de amplificaçãodo gene GAPDH foi igual a 2,07 e do gene Foxp3 foi igual a 2,05. A correlação entre a eficiência dasamplificações foi de 0,998. O Apêndice H mostra as curvas de amplificação, as curvas dedissociação, as curvas de amplificação com o threshold e o cálculo da eficiência de amplificação dosgenes estudados.3.11 Análise estatísticaA significância estatística das mudanças imunológicas foi avaliada longitudinalmente pormodelos de efeitos mistos. Os modelos lineares de efeitos mistos (efeitos aleatórios e fixos) sãoutilizados na análise de dados onde as respostas de um mesmo indivíduo estão agrupadas e asuposição de independência entre observações num mesmo grupo não é adequada (Schall et al.,1991). Foi utilizado o procedimento PROC MIXED do software SAS (SAS/STAT® User’s Guide,Version 8.02, SAS Institute Inc., 1999, Cary, Carolina do Norte, EUA). Os box-plots foram preparadosutilizando o software estatístico MINITAB ® Release 14 (Minitab Inc., USA). As extremidades das caixasindicam o primeiro e terceiro quartis, as linhas dentro das caixas indicam a mediana, os pontos dentrodas caixas a média, e as barras se estendem do valor máximo ao mínimo. Os valores "máximos" e

Casuística, Materiais e Métodos 54"mínimos" são calculados, respectivamente, pelas expressões: Upper limit = Q3 + 1.5 (Q3 - Q1) eLower limit = Q1- 1.5 (Q3 - Q1), onde Q1 é o primeiro quartil e Q3 é o terceiro quartil. Qualquer valorfora desses limites são os outliers, acusado nos gráficos com um círculo cheio. Os asteriscos no eixoX indicam significância estatística (p

4 Resultados

Resultados 564.1 Resultados ClínicosNo período de dezembro de 2002 a dezembro de 2005, foram acompanhados neste estudo,dezoito pacientes com formas progressivas de esclerose múltipla (Tabelas 1 e 5) e 11 pacientes comdiabete melito do tipo I recém-diagnosticado (Tabelas 2 e 6). Dentre os 29 transplantes realizadosnesse período em pacientes com esclerose múltipla e em pacientes com diabete melito do tipo I,ocorreram três óbitos, todos em pacientes com esclerose múltipla condicionados com BEAM + ATGde cavalo.4.1.1 Pacientes com esclerose múltiplaAs avaliações neurológicas foram realizadas com base no exame clínico, que inclui a avaliaçãodo EDSS (Expanded Disability Status Score) (Kurtzke, 1983). O EDSS constitui uma escala demedida da incapacidade, ou seja, uma avaliação das condições neurológicas do paciente, que variade 0 (exame neurológico normal) a 10 (óbito) (vide Anexo 1). O aumento de 1,0 ou mais pontos naescala EDSS em dois exames repetidos, num intervalo mínimo de três meses, caracteriza progressãoneurológica na EM.Dentre os dezoito pacientes com EM transplantados, sete pacientes encontram-se emremissão clínica sem uso de imunossupressão (seguimentos entre 6 a 40 meses), quatro pacientessofreram progressão neurológica após o transplante (seguimentos entre 18 a 30 meses), quatropacientes apresentam ainda um seguimento ainda muito curto (1 a 4 meses) e três pacientes foram aóbito devido a complicações decorrentes do transplante (Tabelas 1 e 5). Todos os óbitos eprogressões neurológicas foram observados em pacientes condicionados com BEAM + ATG decavalo. Vale notar que, dentre os quatro pacientes condicionados com BEAM + ATG de cavalo quesofreram progressão neurológica após o transplante, três deles tiveram piora após apresentaremcomplicações infecciosas graves, embora não fatais, decorrentes do transplante (Tabela 5).De maio de 2005 em diante, os pacientes com EM passaram a ser imunossuprimidos com umnovo regime de condicionamento: ciclofosfamida (200 mg/kg/d) associada a ATG de coelho. Setepacientes foram transplantados com esse novo esquema e os resultados obtidos, embora ospacientes tenham um seguimento mais curto (1-7 meses), são muito mais favoráveis do que osobservados com o esquema anterior de imunossupressão, constituído de poliquimioterapia (BEAM)mais ATG de cavalo. Como se pode verificar na Tabela 5, com o novo esquema, não houve

Resultados 57mortalidade precoce causada por complicações agudas do transplante. Entretanto, maisrecentemente, duas dessas pacientes (nº 13 e 15) apresentaram deterioração neurológica associadacom complicação infecciosa (nº 15) ou não (nº 13). A paciente nº 13 foi submetida a um pulso demetilpredinisolona, e mostrou resposta clínica.Espera-se que com a redução da toxicidade devida ao novo esquema de condicionamento,ocorra também uma diminuição na freqüência de pacientes que deterioram neurologicamente após otransplante. Esta hipótese será testada com a observação de um maior número de pacientes por umtempo mais prolongado, na continuidade desses protocolos clínicos.Dos quinze pacientes com EM transplantados em seguimento, três tiveram uma diminuição doEDSS, sendo dois pacientes transplantados com o novo regime de condicionamento (ciclofosfamida +ATG de coelho). Cinco pacientes apresentaram um aumento do EDSS, e sete mostraram umaestabilização do EDSS após o transplante.Após o transplante, todos os pacientes não apresentaram ocorrência de novas lesõesinflamatórias agudas no tecido nervoso (lesões de atividade), detectadas através de imagens deressonância magnética por captura de gadolíneo. A ausência de lesões de atividade ou de novaslesões após o TACTH, indica um efeito profundo do TACTH nos componente inflamatórios dapatogênese da EM, consistente com outros estudos (Mancardi et al., 2001; Carreras et al., 2003;Saccardi et al., 2004; Muraro et al., 2005). Por outro lado, houve a permanência de lesõesdesmielinizantes sequelares antigas já encontradas nos pacientes antes do transplante. A progressãoneurológica observada em quatro pacientes com EM transplantados foi provavelmente conseqüênciade processos degenerativos axonais que podem ocorrer em estágios avançados da doença (mesmona ausência de inflamação), potenciados por complicações do transplante (Burt et al., 2003; Nash etal., 2003; Inglese et al., 2004).4.1.2 Pacientes com diabete melito do tipo 1Os onze pacientes com diabete do tipo 1 transplantados apresentam seguimento póstransplantede 1 a 23 meses. Dentre eles, oito deles tornaram-se insulino-dependentes em curtoespaço de tempo após o transplante (Tabelas 2 e 6). A necessidade de insulina exógena diminuiuprogressivamente com o tempo, e suspensão da insulina ocorreu nesses pacientes entre os dias -6 e+34 após o transplante (média + 2,9 dias). Dois pacientes tiveram respostas parciais, reduzindo as

Resultados 58necessidades de insulina em relação ao período pré-transplante (pacientes 7 e 10, com seguimentosde 7 e 2 meses, respectivamente). O primeiro paciente que foi transplantado ainda está fazendo usode alta dose de insulina, mas sem imunossupressão. (Voltarelli et al., 2004a; Voltarelli et al., 2004b;Voltarelli et al., 2006, Voltarelli et al., 2006 submetido).Os pacientes 1, 7 e 10 ainda estão na dependência do uso de insulina exógena para um bomcontrole glicêmico, mas os últimos dois necessitam atualmente de 70 e 50%, respectivamente, dadose inicial de insulina. Por outro lado, o paciente 1 está usando uma dose de insulina 3,5 vezesmaior do que a dose inicial. Nesse paciente, o TACTH não apresentou resposta, provavelmentedevido ao seguimento irregular desse paciente por causa de sérios problemas sociais e pelo uso dealtas doses de corticosteróides durante o condicionamento. Além disso, esse paciente já haviaapresentado episódios de cetoacidose diabética ao diagnóstico, indicando uma reserva muito baixade células β pancreáticas, que foi confirmada pela dosagem baixa de peptídeo-C no soro dessepaciente.Conforme mostrado na Tabela 6, antes do transplante, dentre os pacientes transplantados, oitoapresentaram valores de hemoglobina glicada (HbA 1C ) acima de 7%. Três meses logo após otransplante, com exceção do paciente 1, todos os pacientes apresentaram níveis de HbA 1C abaixo de7%, e permaneceram em bom controle glicêmico durante o seguimento pós-transplante. Os níveis deHbA 1C do paciente 1 aumentaram após o transplante (8.2, 8.9, 9.7 and 11.1% nos meses 3, 6, 9 e 12,respectivamente).Os títulos de auto-anticorpos anti-GAD65 foram avaliados em todos os pacientes antes dotransplante e em 7 pacientes seis meses após o TACTH. Os níveis de anti-GAD65 diminuíram em 4pacientes transplantados, mantiveram o mesmo nível em um paciente, aumentaram em um paciente(Tabela 6) e se negativaram em um paciente. A persistência dos autoanticorpos anti-GAD65 namaioria dos pacientes indica que o regime de condicionamento não foi completamente ablativo paraos clones de células B auto-reativas. No entanto em nossos pacientes, como observado também emoutros estudos (Palmer et al., 2004), a resposta imune humoral não foi prognóstica da remissãoclínica.Os níveis de peptídeo-C (relacionado à massa de células β pancreáticas) foram dosados pré eem vários períodos pós-transplante (dados não mostrados; Voltarelli et al., 2006 submetido). Demaneira geral, os níveis de peptídeo-C foram significativamente aumentados nos pacientes após o

Resultados 59transplante. Nenhum paciente transplantado apresentou diminuição dos valores do peptídeo-Cdurante o seguimento. Este resultado é muito favorável, pois a preservação de células β pancreáticaspode levar a benefícios clínicos a longo prazo (Palmer et al. 2004).Um seguimento maior desses pacientes é necessário para se confirmar se a interrupção do usoda insulina observada na maioria desses pacientes é devida ao restabelecimento de tolerânciaimunológica aos antígenos das células β pancreáticas, ou à uma remissão clínica temporária devidoaos efeitos da imunossupressão em altas doses.

Resultados 60Tabela 5. Avaliação clínica pós-TACTH nos pacientes com esclerose múltipla.PACIENTETIPOEMEDSS PRÉ-TACTHEDSS PÓS-TACTH1. GG† PS 5,5 6,02. SAF PS 6,0 OB3. SSS PS 6,5 6,04. DFG PS 6,5 7,55. ARJTA PS 6,5 7,06. SHGE PS 6,5 7,57. RMVL PS 6,0 OB8. MFM PS 7,0 8,59. WRS PP 6,5 6,510. OLP PP 6,5 6,511. LST PS 6,5 OB12. SHC‡ PS 6,5 6,513. MAFC SR 4,5 2,514. RPS PP 6,5 5,515. CMBM PS 6,5 6,516. LFL PS 6,5 6,517. LBSL PS 6,0 6,0AVALIAÇÃO CLÍNICA PÓS- TACTH• Remissão clínica• Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas• Complicações decorrentes do transplante• Óbito após o transplante por hemorragia esofágica• Remissão clínica• Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas• Progressão neurológica• Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas• Progressão neurológica após infeção fúngica pulmonar• Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas• Progressão neurológica após cardiopatia autonômica• Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas• Complicações decorrentes do transplante• Óbito após o transplante por hemorragia alveolar• Progressão neurológica após H. zoster e pericardite bacteriana• Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas• Remissão clínica• Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas• Remissão clínica• Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas• Complicações decorrentes do transplante• Óbito após o transplante por septicemia• Remissão clínica• Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas• Remissão clínica• Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas• Remissão clínica• Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas• Seguimento muito curto• Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas• Seguimento muito curto• Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas• Seguimento muito curto• Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigas• Seguimento muito curto18. CC PS 6,5 6,5 • Ausência de lesões de atividade por RMN• Permanência de lesões desmielinizantes sequelares antigasTACTH, Transplante autólogo de células tronco hematopoéticas; EM, esclerose múltipla; EDSS, Expanded Disability StatusScore (Anexo 1); RMN, Ressonância Magnética Nuclear; PS, esclerose múltipla progressiva secundária; PP, esclerosemúltipla primária progressiva; SR, esclerose múltipla surto-remissiva.; OB, óbito. O EDSS pós-transplante refere-se ao últimovalor de EDSS avaliado em cada paciente. # Pacientes 1-11: condicionados com BEAM + ATG de cavalo. ‡ Pacientes 12-18:condicionados com ciclofosfamida + ATG de coelho.

Resultados 61Tabela 6. Avaliação clínica pós-TACTH nos pacientes com diabete melito do tipo 1.PACIENTEANTI-GAD65(U/ML)PRÉ-TACTHANTI-GAD65(U/ML)PÓS-TACTH(6 MESES)A 1C (%)PRÉ-TACTHA 1C (%)PÓS-TACTH(3 MESES)TEMPOLIVRE DEINSULINA1. LSM 36.0 9.9 7.6 8.2 0†2. ALSR 49.0 19.0 7.5 6.3 193. WSL 1.1 0.0 9.3 5.1 164. MGB 22.0 20.0 8.0 6.1 175. RLFS 51.0 51.0 7.7 5.9 106. CPS 17.0 4.6 7.3 5.2 77. TAS 4.0 14.0 10.0 5.3 0‡8. RAOA 48.0 ND 5.4 4.8 39. PMR 102.0 ND 6.7 5.1 310. CTO 44.0 ND 8.9 4.5 0†11. VTR 11.0 ND 5.4 5.2 1AVALIAÇÃO CLÍNICA PÓS-TACTH• Uso de doses altas deinsulina• Interrompeu seguimento 12meses após o TACTH• Remissão clínica• Sem uso de insulina• Remissão clínica• Sem uso de insulina• Remissão clínica• Sem uso de insulina• Remissão clínica• Sem uso de insulina• Remissão clínica• Sem uso de insulina• Remissão clínica• Uso de doses baixas deinsulina• Seguimento muito curto• Sem uso de insulina• Seguimento muito curto• Sem uso de insulina• Seguimento muito curto• Uso de doses baixas deinsulina• Seguimento muito curto• Sem uso de insulinaTACTH, Transplante autólogo de células tronco hematopoéticas. Níveis séricos de anticorpos anti-GAD foramdosados por radioimnunoensaio usando kits comerciais (R.S.R. Limited, Cardiff, UK). Resultados foramconsiderados positivos valores > 1U/ml. A porcentagem de hemoglobina glicada (A 1c) foi medida pelo método decromatografia líquida de alta performance. Essas avaliações clínico-laboratoriais foram realizadaslaboratórios do Hospital das Clínicas da FMRP-USP, sob a coordenação da equipe da Divisão deEndocrinologia e Metabolismo. ND, não determinado. † Sem período livre de insulina. ‡ Período transiente de7 dias livre de insulina.

Resultados 64O número de linfócitos B CD19 + recuperou níveis basais três meses pós-tx e persistiu estávelaté um ano de seguimento pós-tx (Figura 2D, Tabelas D.1 e D.4). Houve uma diminuição significante(p0,05) (Tabelas D.1 e D.4).Avaliamos também o número de células dendríticas linfóides (Lin - CD11c - HLADR + ) e mielóides(Lin - CD11c + HLADR + ) (Arpinati et al., 2000; Klangsinsirikul e Russel, 2002) antes e após o TACTH. Onúmero de células dendríticas linfóides encontrou-se diminuído no pré-cond e em todos períodos póstxanalisados, porém essa diminuição não foi estatisticamente significante, exceto do D+270(p=0,0178) (Figura 3E, Tabelas D.3 e D.5). Já, o número de células dendríticas mielóides diminuiunos primeiros meses pós-tx, mas aumentou seis meses após o TACTH, embora essas diferenças nãotenham sido estatisticamente significantes (Figura 3F, Tabelas D.3 e D.5).Com o objetivo de avaliar o efeito do TACTH nas subpopulações de linfócitos T naive, efetorese de memória, usamos marcadores fenotípicos que permitem distinguir vários estágios dediferenciação funcional de linfócitos T CD4 +e T CD8 + . Esses estágios incluem linfócitos T naiveCD27 + CD45RO - , linfócitos T de memória central CD27 + CD45RO + , linfócitos T de memória efetoraCD27 - CD45RO +e de linfócitos T efetores diferenciados CD27 - CD45RO - (CD45RA + ) (Fallen et al.,2003a, Fallen et al., 2003b, Hamann et al., 1996; Hamann et al., 1997; Muraro et al., 2005; Sallusto etal., 2004). As células T naive CD4 ou CD8 (CD27 + CD45RO - ) são também CD45RA + CCR7 + CD62L hi .As populações de células T de memória central e memória efetora podem ser subdivididas pordiferenças na capacidade de migração e capacidade efetora (Sallusto et al., 1999; Sallusto et al.,2004).

Resultados 65A diferença de capacidade de migração para os linfonodos entre essas populações é baseadana expressão diferencial do receptor de quimiocina CCR7 e da molécula de adesão L-selectina(CD62L). As células T CD4 ou CD8 de memória central (CD27 + CD45RO + ) expressam tambémCD45RA - CCR7 + CD62L hi(T CM ). As T CM são células T primadas que migram para órgãos linfóidessecundários, e após estímulo secundário com antígeno, são capazes de estimular células dendríticase células B eficientemente e diferenciam-se em células T de memória efetora CCR7 - (Sallusto et al.,1999; Sallusto et al., 2004). Já, as células T de memória efetora (CD27 - CD45RO + ) são tambémCD45RA - CCR7 - CD62L lo (T EM ). As T EM apresentam receptores para migração para tecidos inflamados,portanto entram tecidos periféricos e podem conter rapidamente a inflamação ou infecção. Elasconstituem uma população de células T primadas com função efetora imediata, produzem citocinasrapidamente e as células T EM CD8 +têm elevados níveis de perforina. As células T de efetorasdiferenciadas (CD27 - CD45RO - ) são principalmente células T CD8, que expressam CD45RA + CCR7 -CD62L lo(também chamadas de T EMRA ). As células T CD8 T EMRA apresentam elevados níveis deperforina (Sallusto et al., 1999; Sallusto et al., 2004).A análise dessas diferentes subpopulações linfocitárias é de grande relevância, uma vez quea eliminação ou redução dos números de células T de memória possa reduzir o número de célulasauto-reativas patogênicas no paciente com doença auto-imune. Em contraste, o influxo de células Tnaive geradas de novo pelo timo é considerado um importante componente para a tolerânciaimunológica (Berzins et al., 2002). A análise longitudinal do número absoluto dessas subpopulaçõesde linfócitos T antes e após o transplante está mostrada na Figura 4 (para linfócitos T CD4+) eFigura 5 (para linfócitos T CD8+).O número de linfócitos T naive CD4 + CD27 + CD45RO -diminuiu significativamente nospacientes no pré-cond e em todos os seguimentos analisados (p

Resultados 665A mostra uma diminuição significativa de linfócitos T CD8 + naive no período pré-cond e em todos osseguimentos pós-tx, exceto no D+360 (Tabelas D.2 e D.4).Como podemos observar nas Figuras 4 e 5, ocorreu após o transplante uma predominância decélulas T de memória central e efetora e também de células T efetoras diferenciadas, principalmentede linfócitos T CD8 + . Essa predominância de células T de memória deve-se provavelmente àexpansão homeostática periférica de linfócitos T de memória residuais que sobreviveram ao regimede condicionamento (Guillaume et al., 1998; van Laar, 2000; Thiel et al., 2004). A proliferaçãohomeostática ocorre em condições de linfopenia, tal qual encontrada nos pacientes nos primeirosmeses após o TACTH (revisado por Jameson, 2002; Murali-Krishna e Ahmed, 2000; Goldrath et al.,2000).No período de pré-cond o número linfócitos T CD8 + de memória central diminuiu, mas emseguida aumentou, em relação aos valores pré-tx, em todos os seguimentos pós-tx avaliados. Noentanto, esse aumento foi significante somente nos D+60 e D+100 pós-tx (p=0,0029 e p=0,0068,respectivamente) (Figura 5B, Tabelas D.2 e D.4). Por outro lado, os linfócitos T CD4 + de memóriacentral diminuíram no pré-cond e permaneceram diminuídos até um ano pós-tx. Essa diminuição foiestatisticamente significante em todos os períodos analisados (Figura 4B, Tabelas D.2 e D.4).Como podemos observar na Figura 4C, o número de linfócitos T CD4 + de memória efetoresaumentou no período de pré-cond e em todos os períodos pós-tx, mas esse aumento não foiestatisticamente significante (Tabela D.2 e D.4). Vale notar que o número de linfócitos T CD4 + dememória efetores estava diminuído nos pacientes (pré-tx) quando comparado aos valores doscontroles saudáveis (p=0,0204). O número de linfócitos T CD8 +de memória efetores começouaumentar no D+60 pós-tx e apresentou um aumento estatisticamente significante do D+100 ao D+360pós-tx (Figura 4C, Tabelas D.2 e D.4).Similarmente, o número de linfócitos T CD8 + CD27 - CD45RO - (CD45RA + ) efetores diferenciadosaumentou após o TACTH, porém o aumento foi significante do D+180 ao D+360 pós-tx (Figura 5D,Tabelas D.2 e D.4). Os linfócitos T CD4 + efetores diferenciados também aumentaram a partir de trêsmeses pós-tx, mas esse aumento não foi significante mesmo no D+270, no qual houve um aumentode 9,1x em relação ao pré-tx (Figura 4D, Tabelas D.2 e D.4). Vale ressaltar que as células T efetorasdiferenciadas CD27 - CD45RO - (CD45RA + ) são células T efetoras atípicas, altamente diferenciadas,chamadas de CD45RO “revertants” ou de células T EMRA , pois perdem a expressão de CD45RO após

Resultados 67intensa proliferação homeostática (Fallen et al., 2003a; Sallusto et al.,1999; Baars et al., 2000,Sallusto et al., 2004).Nós avaliamos também a freqüência de uma outra população de células T de memória efetoraatípica, que não expressa CD28 e expressa CD57. Essa população de células T CD8 + CD28 - CD57 + foidescrita recentemente como uma população caracterizada por um estado de senescência replicativa,decorrente da divisão excessiva in vivo e conseqüente perda de TRECs (Brenchley et al., 2003). Alémdisso, essas células são incapazes de expandir após estimulação e são altamente suscetíveis aapoptose (Brenchley et al., 2003; Koehne et al., 1997). Observamos que a freqüência das célulasCD8 + CD28 - CD57 + aumentou acentuadamente após o transplante (de 0,45-3,6% pré-tx para 11,8-28,4% pós-tx) (dados não mostrados). No entanto, como não avaliamos a freqüência dessas célulasem todas as amostras dos pacientes acompanhados nesse trabalho, não foi possível fazer análiseestatística e gráficos dos resultados.Avaliamos também a reconstituição após o TACTH de células T CD4 + recém-emigrantes dotimo. Não existem marcadores fenotípicos específicos para células que recém imigraram do timo, masfoi recentemente demonstrado (Kimmig et al., 2002) que um subgrupo de células T CD4 + CD45RA +que co-expressa o marcador CD31, contém células recém-imigrantes tímicas que apresentamelevados níveis de TRECs (T cell excision circles). Os TRECs são fragmentos de DNA excisados naforma de DNA circular, gerados durante o rearranjo gênico do receptor da célula T. Os TRECs sãoestáveis dentro das células, mas não se replicam e são diluídos com a divisão celular, portanto sãoótimos marcadores de células T naive recém-imigrantes do timo (Douek et al, 1998; Douek et al.,2000).A Figura 7E mostra que a porcentagem de células T CD4 + CD45RA +que co-expressam omarcador CD31, diminuiu no pré-cond e em todos os períodos avaliados após o TACTH, em relaçãoà porcentagem destas células pré-tx. No entanto, essa diminuição foi estatisticamente significantesomente no pré-cond, D+60 e D+100 pós-tx. Também o número absoluto de células TCD4 + CD45RA + CD31 + diminuiu significantemente pós-tx (

Resultados 68Avaliamos também alguns marcadores imunológicos envolvidos na ativação celular e nasinalização de apoptose (CD95/Fas, CD95L/FasL, CD69, HLADR e CD38) em linfócitos T, B esubpopulações de linfócitos T dos pacientes (Guillaume et al., 1998; Reimer et al., 2003). Afreqüência de linfócitos T CD3 + CD4 +que expressam Fas aumentou no pré-cond e em todos osperíodos pós-tx, embora o aumento na freqüência dessas células tenha sido significante somente nosperíodos pré-cond, D+60 e D+100 pós-tx (Figura 6A, Tabelas D.3 e D.5). A freqüência de linfócitos TCD3 + CD4 + Fas + pré-tx aumentou 57,8% no dia D+60 pós-tx. Similarmente, a porcentagem de linfócitosT CD3 + CD8 + Fas + também aumentou em todos os períodos analisados (73,6 ± 31,0 no D+60) emrelação à porcentagem de células pré-tx (47,3 ± 31,8), porém o aumento na freqüência dessas célulasnão foi estatisticamente significante, provavelmente devido a grande variabilidade entre os pacientes(Figura 6B, Tabelas D.3 e D.5).A Figura 6C mostra que freqüência de linfócitos B CD19 + Fas + aumentou no pré-cond e apóso TACTH, mas retornou aos níveis basais nove meses pós-tx. Entretanto essas diferenças não foramsignificantes (p>0,05). A porcentagem de linfócitos T CD3 + CD4 + e T CD3 + CD8 + que expressam oligante de Fas (ou CD178) também aumentou em relação à porcentagem de células pré-tx (47,3 ±31,8) em alguns dos períodos analisados (pré-cond e D+180), porém o aumento na freqüênciadessas células não foi estatisticamente significante, devido a grande variabilidade encontrada entreos pacientes (Figura 6D e 6E, Tabelas D.3 e D.5). Esse aumento da freqüência de células T e B Fas +durante vários meses após o transplante nesses pacientes sugere um aumento da suscetibilidade aapoptose mediada por Fas/FasL .Na Figura 7B podemos observar um aumento proeminente e significante na porcentagem decélulas T CD3 + que expressam HLA-DR (p

Resultados 69aumentou após o TACTH. Entretanto, esse aumento foi significante nos D+60 e D+100 pós-tx(p=0,156 e p=0,008, respectivamente) (Figura 7C, Tabelas D.3 e D.5).Interessantemente, alguns pacientes apresentaram subpopulações de linfócitos e monócitosativadas (caracterizadas pelo grande aumento de tamanho, no dot plot de tamanho versusgranularidade) com expressão elevada da maioria dos marcadores de ativação, como HLA-DR, CD38e CD25. Essas subpopulações ativadas estavam presentes em alguns pacientes antes do TACTH,aumentaram logo após o transplante, mas desapareceram gradativamente após o TACTH (dados nãomostrados).As células T reguladoras (Tregs) CD4 + CD25 high são geradas pelo timo (Sakaguchi, 2004) epodem ser reconstituídas no período de reativação da atividade tímica após o transplante. Alémdisso, podem ser geradas na periferia onde células T periféricas não-Treg podem adquirir aexpressão de Foxp3 e se converter em células Tregs após estimulação antigênica crônica ou emcondições de linfopenia (Apostolou e Boehmer, 2004; Curotto de Lafaille et al., 2004; Walker et al.,2003). As Tregs podem ter um papel importante no restabelecimento da tolerância e na remissãoduradoura da doença auto-imune após o TACTH (Thiel et al., 2004; Muraro et al, 2006), portanto nósavaliamos a reconstituição dessas células após o transplante. As células Tregs CD4 + CD25 highexpressam, dentre outros marcadores, os receptores CTLA-4 (ou CD152) e GITR (Kronenberg eRudensky, 2005). Nós quantificamos a porcentagem e o valor absoluto das células T CD4 + CD25 + eCD4 + CD25 highreconstituídas nos pacientes após o TACTH, e também a porcentagem e o valorabsoluto das células T CD4 + CD25 high reconstituídas que co-expressam CTLA-4 ou GITR.O número absoluto de células T CD4 + CD25 + aumentou no período pré-cond e diminuiu apóso TACTH. Essa diminuição foi estatisticamente significante no D+60 ao D+270 pós-tx, mas não noD+360 (Figura 8B, Tabelas D.2 e D.4). Também a porcentagem de células T CD4 + CD25 + aumentouno período pré-cond e diminuiu após o TACTH. Essa diminuição foi estatisticamente significante emtodos os períodos pós-tx (Figura 8A, Tabelas D.2 e D.4).A Figura 8D mostra que o número absoluto de células Tregs CD4 + CD25 high apresentou umadiminuição significante no período pré-cond e em todos os períodos pós-tx, exceto no D+360.Similarmente, a freqüência das células Tregs CD4 + CD25 high diminuiu após o TACTH, mas essadiminuição foi significativa somente no D+60 ao D+180 e no D+360 pós-tx (Figura 8C, Tabelas D.2 e

Resultados 70D.5). Os números absolutos e relativos das células T CD4 + CD25 +e de células T CD4 + CD25 highmostraram uma tendência a aumentar a partir do D+270 pós-tx.A freqüência das células T CD4 + CD25 high que co-expressam CTLA-4 aumentou no período préconde em todos os períodos pós-tx analisados, porém esse aumento foi estatisticamente significantesomente no D+180 (p=0,0392), provavelmente devido à grande variabilidade de expressãoencontrada nos pacientes. Houve um aumento de 78% e de 93% na freqüência das células TCD4 + CD25 high que co-expressam CTLA-4 no D+180 e D+270 pós-tx, respectivamente. (Figura 9A,Tabelas D.2 e D.5). Já, o número absoluto de células T CD4 + CD25 high CTLA-4 + apresentou umadiminuição nos primeiros meses após o TACTH, aumentou no D+270 e diminuiu em seguida noD+360. Entretanto, essas diferenças não foram significantes (Figura 9B, Tabelas D.2 e D.5).Avaliamos também a expressão intracelular de CTLA-4 em células fixadas e permeabilizadas.Observamos que 80-100% das células T CD4 + CD25 high foram positivas para a marcação intracelularde CTLA-4 (dados não-mostrados). No entanto, como não avaliamos a freqüência dessas células emtodas as amostras dos pacientes acompanhados nesse trabalho, não foi possível fazer análiseestatística e gráficos dos resultados.A Figura 9C mostra que freqüência das células T CD4 + CD25 high que co-expressam GITRtambém aumentou no período pré-cond e em todos os períodos pós-tx analisados, no entanto esseaumento foi significante somente no D+180 (p=0,0063). No entanto, vale ressaltar que observamosum aumento de 471% e de 288% na freqüência das células T CD4 + CD25 high que co-expressam GITRno D+180 e D+270 pós-tx, respectivamente. (Figura 9C, Tabelas D.3 e D.5). O número absoluto decélulas T CD4 + CD25 high GITR + apresentou uma diminuição nos primeiros meses após o TACTH,aumentou no D+270 e diminuiu em seguida no D+360, embora essas diferenças não tenham sidoestatisticamente significantes (Figura 9D, Tabelas D.3 e D.5).Embora não tenha havido um aumento do número absoluto de células Tregs CD4 + CD25 high , acinética de reconstituição das células Tregs CD4 + CD25 high foi mais rápida do que a das células TCD4 + totais. Como podemos observar nas Tabelas D.1 e D.2 que a diminuição do número absolutode células T CD4 + em relação ao número de células T CD4 + pré-tx, foi de 49,1%, 81,3%, 77,6%,77,5%, 68,4% e 55% nos períodos pré-cond, D+60, D+100, D+180, D+270 e D+360,respectivamente. Enquanto que a diminuição do número absoluto de células Tregs CD4 + CD25 high , foide 39,4%, 64%, 66,7%, 57,4%, 64% e 34,4% nos períodos pré-cond, D+60, D+100, D+180, D+270 e

Resultados 71D+360, respectivamente. Essa observação pode ser também visualizada nas Figuras 2B e 8C,D. Arecuperação mais rápida do número de células Tregs CD4 + CD25 highsugere que após o TACTHocorra uma expansão homeostática preferencial dessas células, dentro da população de células TCD4 + totais, durante a fase linfopênica da reconstituição imunológica.

Resultados 72A9000B3500Leucócitos Totais/ul80007000600050004000300020001000Linfócitos/ul300025002000150010000ISPre-mob*Pre-condD+6D+60D+100D+180D+270*D+360500*IS*Pre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270D+360C1400D700012006000Monócitos/ul10008006004002000ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360Granulócitos/ul50004000300020001000ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270*D+360Figura 1. Reconstituição de leucócitos totais, linfócitos, monócitos e granulócitos em pacientes comdiabete melito do tipo 1 após o TACTH. Valores absolutos (células/μl) de leucócitos totais (A), linfócitos (B) emonócitos (C) e de granulócitos (D). (E).As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhasdentro das caixas indicam a mediana, os pontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro seestendem do menor ao maior valor. Os círculos cheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicamp

Resultados 73A2500B18001600Linfócitos T CD3+/ul200015001000500Linfócitos T CD4+/ul1400120010008006004002000ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360C1600D800Linfócitos T CD8+/ul140012001000800600400200Linfócitos B CD19+/ul7006005004003002001000ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100D+180D+270D+3600ISPre-mob*Pre-condD+60D+100D+180D+270D+360E3,53,0Razão CD4+:CD8+2,52,01,51,00,50,0ISPre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360Figura 2. Reconstituição de linfócitos T e B em pacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH.Valores absolutos (células/μl) de linfócitos T CD3 + (A), linfócitos T auxiliares CD3 + CD4 + (B) e linfócitos Tcitotóxicos CD3 + CD8 + (C), de linfócitos B CD19 + (D). (E). Razão dos valores absolutos de linfócitos TCD4 + /CD8 + . As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro das caixas indicam amediana, os pontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem do menor ao maiorvalor. Os círculos cheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 74AT CD3+TCR alfa beta+/ul2500200015001000500ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360BT CD3+TCR gama delta+/ul250200150100500ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360CDCélulas NK CD3-D16+CD56+/ul9008007006005004003002001000ISPre-mob*Pre-condD+60D+100D+180D+270D+360Células CD3+CD16+CD56+/ul4003002001000ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360ECélulas LIN-CD11c-HLADR+/ul302520151050FCélulas LIN-CD11c+HLADR+/ul5004003002001000ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180*D+270D+360IS*Pre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360Figura 3. Reconstituição de linfócitos T, células NK, células NKT-like, e de células dendríticas empacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH. Valores absolutos (células/μl) de linfócitos TCD3 + TCRαβ + (A), linfócitos T CD3 + TCRγδ + (B), células NK CD3 - CD16 + CD56 + (C), de células NKT-likeCD3 + CD16 + CD56 + (D), de células dendríticas linfóides LIN - CD11c - HLADR + (E), e de células dendríticasmielóides LIN - CD11c + HLADR + (F). As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhasdentro das caixas indicam a mediana, os pontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro seestendem do menor ao maior valor. Os círculos cheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicamp

Resultados 75A800B800T CD4+CD27+CD45RO-/ul7006005004003002001000IS*Pre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360T CD4+CD27+CD45RO+/ul7006005004003002001000ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360CT CD4+CD27-CD45RO+/ul300250200150100500DT CD4+CD27-CD45RO-/ul350300250200150100500IS*Pre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360Figura 4. Reconstituição de linfócitos T CD4 naive, de memória, de memória efetora e efetoresdiferenciados em pacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH. Valores absolutos (células/μl) delinfócitos T naive CD4 + CD27 + CD45RO - (A), linfócitos T de memória central CD4 + CD27 + CD45RO + (B), linfócitos Tde memória efetores CD4 + CD27 - CD45RO + (C), e de linfócitos T efetores diferenciados CD4 + CD27 - CD45RO - (D).As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro das caixas indicam a mediana, ospontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem do menor ao maior valor. Os círculoscheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 76A600B700T CD8+CD27+CD45RO-/ul5004003002001000ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270D+360T CD8+CD27+CD45RO+/ul6005004003002001000ISPre-mobPre-cond*D+60*D+100D+180D+270D+360CT CD8+CD27-CD45RO+/ul6005004003002001000DT CD8+CD27-CD45RO-/ul7006005004003002001000ISPre-mobPre-condD+60*D+100*D+180*D+270*D+360ISPre-mob*Pre-condD+60D+100*D+180*D+270*D+360Figura 5. Reconstituição de linfócitos T CD8 naive, de memória, de memória efetora e efetoresdiferenciados em pacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH. Valores absolutos (células/μl) delinfócitos T naive CD8 + CD27 + CD45RO - (A), linfócitos T de memória central CD8 + CD27 + CD45RO + (B), linfócitos Tde memória efetores CD8 + CD27 - CD45RO + (C), e de linfócitos T efetores diferenciados CD8 + CD27 - CD45RO - (D).As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro das caixas indicam a mediana, ospontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem do menor ao maior valor. Os círculoscheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 77AB% Linfócitos T CD3+CD4+Fas+100908070605040302010ISPre-mobPre-cond*D+60*D+100D+180D+270D+360% Linfócitos T CD3+CD8+Fas+100806040200ISPre-mobPre-cond*D+60D+100D+180D+270D+360CD% Linfócitos B CD19+Fas+100806040200ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360% Linfócitos T CD3+CD4+FasL+403020100ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360E% Linfócitos T CD3+CD8+FasL+706050403020100ISPre-mobPre-condD+60*D+100D+180D+270D+360Figura 6. Expressão de Fas e FasL em linfócitos T CD4 + ou TCD8 + , ou em linfócitos B reconstituídos empacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH. Porcentagens (gate em linfócitos) de linfócitos TCD3 + CD4 + que expressam Fas (A), linfócitos T CD3 + CD8 + que expressam Fas (B), e de linfócitos B CD19 + queexpressam Fas (C), linfócitos T CD3 + CD4 + que expressam FasL (D), linfócitos T CD3 + CD8 + que expressam FasL(E). As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro das caixas indicam amediana, os pontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem do menor ao maiorvalor. Os círculos cheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 78A% Linfócitos T CD3+CD69+76543210ISPre-mobPre-condD+60*D+100D+180D+270D+360B% Linfócitos T CD3+HLA-DR+706050403020100IS*Pre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360C% Linfócitos B CD19+CD38+50403020100ISPre-mob*Pre-condD+60*D+100*D+180D+270D+360D% T CD4+CD45RA+CD31+1009080706050403020ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100D+180D+270D+360E800T CD4+CD45RA+CD31+/ul7006005004003002001000IS*Pre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360Figura 7. Expressão de marcadores de ativação celular em linfócitos T CD4 + , T CD8 + e linfócitos Breconstituídos, e reconstituição de linfócitos T CD4+ recém-imigrantes do timo, em pacientes comdiabete melito tipo 1 após o TACTH. Porcentagens (gate em linfócitos) de linfócitos T CD3 + que expressam CD69 (A),linfócitos T CD3 + que expressam HLADR (B), linfócitos B CD19 + que expressam CD38 (C), e de linfócitos T CD4 + CD45RA + queexpressam CD31 (D). Valor absoluto (células/μl) de linfócitos T CD4 + CD45RA + CD31 + (E). As extremidades das caixas indicamo 25th e o 75th percentis, as linhas dentro das caixas indicam a mediana, os pontos dentro das caixas indicam a média, e asbarras de erro se estendem do menor ao maior valor. Os círculos cheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicamp

Resultados 79A% Linfócitos T CD4+CD25+2520151050BLinfócitos T CD4+CD25+/ul5004003002001000ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360ISPre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360CD% Linfócitos T CD4+CD25high2,52,01,51,00,50,0Linfócitos T CD4+CD25high/ul6050403020100IS*Pre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180D+270*D+360IS*Pre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270D+360Figura 8. Reconstituição de linfócitos T CD4 + CD25 + e linfócitos T CD4 + CD25 high em pacientes com diabetemelito tipo 1 após o TACTH. Porcentagens (gate em linfócitos) de linfócitos T CD4 + que expressam CD25 (A), ede linfócitos T CD4 + que expressam CD25 high (C). Valores absolutos (células/μl) de linfócitos T CD4 + CD25 + (B) ede linfócitos CD4 + CD25 high (D). As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentrodas caixas indicam a mediana, os pontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem domenor ao maior valor. Os círculos cheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 80AB% T CD4+CD25highCTLA-4+100806040200T CD4+CD25highCTLA-4+/ul20151050ISPre-mobPre-condD+60D+100*D+180D+270D+360ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360C% T CD4+CD25highGITR+100806040200DT CD4+CD25high+GITR+/ul1086420ISPre-mobPre-condD+60D+100*D+180D+270D+360ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360Figura 9. Expressão de CTLA-4 e GITR em linfócitos T CD4 + CD25 high em pacientes com diabete melito tipo1 antes e após o TACTH. Porcentagens (gate em linfócitos) de linfócitos T CD4 + CD25 high que expressam CTLA-4 (A) e de linfócitos T CD4 + CD25 high que expressam GITR (C). Valores absolutos (células/μl) de linfócitos TCD4 + CD25 high CTLA-4 + (B) e de linfócitos CD4 + CD25 high GITR + (D). As extremidades das caixas indicam o 25th eo 75th percentis, as linhas dentro das caixas indicam a mediana, os pontos dentro das caixas indicam a média, eas barras de erro se estendem do menor ao maior valor. Os círculos cheios indicam os valores outlyers. Osasteriscos indicam p

Resultados 814.2.2 Pacientes com esclerose múltiplaO número de leucócitos totais diminuiu já período de pré-cond, embora não significativamente.Logo após o transplante (D+6), o número de leucócitos diminuiu drasticamente de 6293 ± 2098células/μl para 200 ± 93,5 células/μl (mediana 200 células/μl) (p=

Resultados 82D.4). O número de células T CD4 + começou a aumentar seis meses pós-tx, mas mesmo dois anosapós o TACTH ainda apresentou uma diminuição de 58,4% em relação ao pré-tx. Por outro lado, umaumento proeminente de linfócitos T CD8 + foi observado no D+60 (

Resultados 83O número absoluto das subpopulações de células T naive, de memória central, memóriaefetora e de células T efetoras diferenciadas foi avaliado nos pacientes com EM antes e após oTACTH. As Figuras 13 e 14 mostram a reconstituição dessas diferentes subpopulações de linfócitosT CD4+ e em linfócitos T CD8+, respectivamente. O número de linfócitos T naiveCD4 + CD27 + CD45RO - diminuiu significativamente nos pacientes no pré-cond (p=0,0056) e em todosos seguimentos pós-tx analisados (p

Resultados 84linfócitos T CD4 + efetores diferenciados diminuíram, em relação ao pré-tx, em todos os períodos apóso TACTH (Figura 13D, Tabelas E.2 e E.4).Avaliamos também nos pacientes com EM transplantados, a freqüência de uma outrapopulação de células T de memória efetora atípica, que não expressa CD28 e expressa CD57.Observamos que a freqüência das células CD8 + CD28 - CD57 +aumentou acentuadamente após otransplante (de 1,2-7,8% pré-tx para 16,4-38,1% pós-tx) (dados não mostrados). No entanto, comonão avaliamos a freqüência dessas células em todos os pacientes com EM acompanhados nessetrabalho, não foi possível fazer análise estatística e gráficos dos resultados.A reconstituição por células T CD4 + recém-emigrantes do timo foi avaliada após o TACTH, ecomo mostra Figura 16D (Tabelas D.3 e D.5) a porcentagem de células T CD4 + CD45RA + que coexpressamo marcador CD31 mostrou-se diminuída, em relação à porcentagem destas células pré-tx,no pré-cond e em todos os períodos após o TACTH, exceto no D+540. No entanto, essas diferençasnão foram estatisticamente significantes. Também o número absoluto de células TCD4 + CD45RA + CD31 + diminuiu significantemente no pré-cond e após o TACTH (Figura 16E, TabelasD.3 e D.5). Houve uma diminuição de 57,3% de células T CD4 + CD45RA + CD31 + dois anos após oTACTH, comparando-se aos valores pré-tx. Nos D+270 e D+720 foram encontrados os maioresnúmeros de células T CD4 + CD45RA + CD31 + no sangue periférico dos pacientes transplantados.Em seguida, avaliamos a expressão de alguns marcadores imunológicos de ativação celular eapoptose em subpopulações de linfócitos T e B. A freqüência de linfócitos T CD3 + CD4 + que expressaFas aumentou no pré-cond e em todos os períodos pós-tx. O aumento na freqüência dessas célulasfoi estatisticamente significante em todos os seguimentos pós-tx, exceto no D+540 e D+720 (Figura15A, Tabelas E.3 e E.5). Similarmente, a porcentagem de linfócitos T CD3 + CD8 + que expressa Fasaumentou em todos os períodos analisados, em relação à porcentagem de células positivas pré-tx,porém o aumento na freqüência dessas células foi estatisticamente significante no pré-cond e noD+60 ao D180 pós-tx (Figura 15B, Tabelas E.3 e E.5). A freqüência de linfócitos T CD3 + CD8 + Fas +aumentou em 78,8% no dia D+60 pós-tx, em relação à freqüência pré-tx.A Figura 15C mostra que freqüência de linfócitos B CD19 + Fas + aumentou acentuadamenteno pré-cond e após o TACTH, mas começou a decrescer um ano após o transplante. Entretanto,essas diferenças não foram significantes (p>0,05). A porcentagem de linfócitos T CD3 + CD4 + e TCD3 + CD8 + que expressam o ligante de Fas (ou CD178) também aumentou, em relação à

Resultados 85porcentagem de células pré-tx, em alguns dos períodos analisados (principalmente no pré-cond,D+180, D+360 e D+540), porém o aumento na freqüência dessas células não foi estatisticamentesignificante, devido a grande variabilidade encontrada entre os pacientes (Figura 15D e 15E, TabelasE.3 e E.5). Esse aumento da freqüência de células T e B Fas + durante vários meses após otransplante nesses pacientes sugere um aumento da suscetibilidade a apoptose mediada porFas/FasL .Na Figura 16B podemos observar um aumento acentuado e estatisticamente significante naporcentagem de células T CD3 + que expressam HLA-DR no pré-cond e em todos os seguimentospós-tx avaliados (Tabelas E.3 e E.5). O aumento na porcentagem dessas células foi maior entre doisa nove meses pós-tx. Um ano após o TACTH, a porcentagem de células T CD3 + HLA-DR + começou adecrescer. Já, a freqüência de células T CD3 + que expressam CD69, aumentou significantemente noperíodo de pré-cond (p=0,325), como mostra a Figura 16A. Vale notar que a porcentagem de célulasT CD3 + CD69 + pré-tx estava diminuída em relação à porcentagem nos controles saudáveis (p=0,0460)(Tabelas E.3 e E.5).A porcentagem de células B CD19 + que expressam CD38 apresentou uma diminuição no préconde nos três primeiros meses pós-tx. Seis meses após o transplante, a freqüência dessas célulasaumentou em relação ao pré-tx, entretanto esse aumento não foi estatisticamente significante (Figura16C, Tabelas E.3 e E.5). Vale ressaltar que, assim como nos pacientes com DM, alguns pacientescom EM apresentaram subpopulações de linfócitos e monócitos ativadas (caracterizadas pelo grandeaumento de tamanho, no dot plot de tamanho versus granularidade), que apresentam expressãoelevada da maioria dos marcadores de ativação, como HLA-DR, CD38 e CD25. Essas subpopulaçõesativadas estavam presentes em alguns pacientes antes do TACTH, aumentaram logo após otransplante, mas desapareceram gradativamente após o TACTH (dados não mostrados).Avaliamos também a porcentagem e o valor absoluto das células T CD4 + CD25 +eCD4 + CD25 highreconstituídas nos pacientes após o TACTH, e também a porcentagem e o valorabsoluto das células T CD4 + CD25 high reconstituídas que co-expressam CTLA-4 ou GITR. O númeroabsoluto de células T CD4 + CD25 + aumentou no período pré-cond e diminuiu após o TACTH, excetono D+270 no qual aumentou em 1,25%. Essa diminuição foi estatisticamente significante no D+60 aoD+180 pós-tx, e nos D+360 e D+540 (Figura 17B, Tabelas E.2 e E.5). A porcentagem de células TCD4 + CD25 + também aumentou no período pré-cond e diminuiu após o TACTH. Essa diminuição foi

Resultados 86estatisticamente significante no pré-cond e nos D+60 ao D+180 (Figura 17A, Tabelas D.2 e D.4). NoD+270 observamos a maior porcentagem de células T CD4 + CD25 + encontrada após o transplante.A Figura 17D mostra que o número absoluto de células Tregs CD4 + CD25 high apresentou umadiminuição no período pré-cond e em todos os períodos pós-tx, no entanto essa diminuição só foiestatisticamente significante no D+60 (p=0,0103) (Tabelas E.2 e E.5). Já, a porcentagem de células TCD4 + CD25 high mostrou um aumento significante no pré-cond (p=0,0300) e em seguida um decréscimono D+60 (p=0,0267). A partir do D+100 pós-tx a porcentagem de células T CD4 + CD25 high aumentou,mas esse aumento não foi significante (Figura 17C, Tabelas E.2 e E.5).A freqüência das células T CD4 + CD25 high que co-expressam CTLA-4 diminuiu no pré-cond eaumentou em alguns períodos pós-tx analisados, porém esse aumento não foi estatisticamentesignificante, provavelmente devido à grande variabilidade de expressão encontrada nos pacientes.Houve um aumento de 72,6% e de 51,9% na freqüência das células T CD4 + CD25 highque coexpressamCTLA-4 no D+360 e D+540 pós-tx, respectivamente. (Figura 18A, Tabelas E.2 e E.5). Já,o número absoluto de células T CD4 + CD25 high CTLA-4 + aumentou no pré-cond, diminuiu nos doisprimeiros meses após o TACTH, voltou a aumentar no D+100 (2,3X), D+270 (5,4X) e D+360 (2,8X) eem seguida diminuiu novamente.Entretanto, essas diferenças não foram estatisticamentesignificantes (Figura 18B, Tabelas E.2 e E.5). Avaliamos também a expressão intracelular de CTLA-4em células fixadas e permeabilizadas. Observamos que 70-100% das células T CD4 + CD25 high forampositivas para a marcação intracelular de CTLA-4 (dados não mostrados). No entanto, como nãoavaliamos a freqüência dessas células em todas as amostras dos pacientes acompanhados nessetrabalho, não foi possível fazer análise estatística e gráficos dos resultados.A Figura 18C mostra que freqüência das células T CD4 + CD25 high que co-expressam GITRaumentou nos D+270 (187%), D+540 (12%) e D+720 (43,7%) pós-tx, no entanto esse aumento nãofoi significante (Tabelas E.3 e E.5). O número absoluto de células T CD4 + CD25 high GITR + diminuiu emtodos os seguimentos analisados após o TACTH, embora essas diferenças não tenham sidoestatisticamente significantes (Figura 18D, Tabelas E.3 e E.5).Embora não tenha havido um aumento do número absoluto de células Tregs CD4 + CD25 highapós o transplante, a cinética de reconstituição das células Tregs CD4 + CD25 high foi mais rápida doque a das células T CD4 + totais. Como podemos observar nas Tabelas E.1 e E.2, a diminuição donúmero absoluto de células T CD4 + em relação ao número de células pré-tx, foi de 45,4%, 69,3%,

Resultados 8771,5%, 58,6%, 59,5%, 65,8%, 55.1% e 58,4% nos períodos pré-cond, D+60, D+100, D+180, D+270,D+360, D+540 e D+720, respectivamente. Enquanto que a diminuição do número absoluto de célulasTregs CD4 + CD25 high , foi de 23,1%, 67,8%, 51,9%, 49,2%, 32,8%, 59,9%, 27% e 36,7% nos períodospré-cond, D+60, D+100, D+180, D+270 e D+360, D+540 e D+720, respectivamente. Essa observaçãopode ser também visualizada nas Figuras 11B e 17C,D. A recuperação mais rápida do número decélulas Tregs CD4 + CD25 highsugere que após o TACTH ocorra uma expansão homeostáticapreferencial dessas células, dentro da população de células T CD4 + totais, durante a fase linfopênicada reconstituição imunológica.

Resultados 88A12000B4500Leucócitos totais/ulCMonócitos/ul100008000600040002000100080060040020000IS*Pre-mobPre-condD+6D+60*D+100D+180D+270D+360D+540D+720IS*Pre-mobPre-condD+60*D+100*D+180D+270*D+360D+540*D+720Linfócitos/ulGranulócitos/ul400035003000250020001500100050010000900080007000600050004000300020001000ISPre-mob*Pre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720IS*Pre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270D+360D+540D+720Figura 10. Reconstituição de leucócitos totais, linfócitos, monócitos e granulócitos em pacientes comesclerose múltipla após o TACTH. Valores absolutos (células/μl) de leucócitos totais (A), linfócitos (B) emonócitos (C) e de granulócitos (D). (E).As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhasdentro das caixas indicam a mediana, os pontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro seestendem do menor ao maior valor. Os círculos cheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicamp

Resultados 89A3000B1800Linfócitos T CD3+/ul2500200015001000500Linfócitos T CD4+/ul16001400120010008006004002000ISPre-mob*Pre-condD+60*D+100D+180D+270D+360D+540D+7200ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360*D+540D+720C2500D700Linfócitos T CD8+/ul200015001000500Linfócitos B CD19+/ul6005004003002001000ISPre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360*D+540*D+7200ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100D+180D+270D+360*D+540D+720E4Razão CD4+:CD8+3210ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360*D+540*D+720Figura 11. Reconstituição de linfócitos T e B em pacientes com esclerose múltipla após o TACTH. Valoresabsolutos (células/μl) de linfócitos T CD3 + (A), linfócitos T auxiliares CD3 + CD4 + (B) e linfócitos T citotóxicosCD3 + CD8 + (C), de linfócitos B CD19 + (D). (E). Razão dos valores absolutos de linfócitos T CD4 + /CD8 + . Asextremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro das caixas indicam a mediana, ospontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem do menor ao maior valor. Os círculoscheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 90ABT CD3+TCR alfa beta+/ul300025002000150010005000ISPre-mob*Pre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720T CD3+TCR gama delta+/ul250200150100500ISPre-mobPre-cond*D+60*D+100D+180*D+270D+360D+540*D+720CDCélulas NK CD3-D16+CD56+/ul6005004003002001000Células CD3+CD16+CD56+/ul4003002001000ISPre-mobPre-cond*D+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720ECélulas LIN-CD11c-HLADR+/ul403020100FCélulas LIN-CD11c+HLADR+/ul9008007006005004003002001000ISPre-cond*Pre-mobD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720ISPre-cond*Pre-mobD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720Figura 12. Reconstituição de linfócitos T, células NK, células NKT-like, e de células dendríticas empacientes com esclerose múltipla após o TACTH. Valores absolutos (células/μl) de linfócitos T CD3 + TCRαβ +(A), linfócitos T CD3 + TCRγδ + (B), células NK CD3 - CD16 + CD56 + (C), de células NKT-like CD3 + CD16 + CD56 + (D),de células dendríticas linfóides LIN - CD11c - HLADR + (E), e de células dendríticas mielóides LIN - CD11c + HLADR +(F). As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro das caixas indicam amediana, os pontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem do menor ao maiorvalor. Os círculos cheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 91A800B1200CD4+CD27+CD45RO-/ul7006005004003002001000ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360*D+540*D+720CD4+CD27+CD45RO+/ul10008006004002000ISPre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180D+270*D+360D+540D+720C600D70CD4+CD27-CD45RO+/ul500400300200100CD4+CD27-CD45RO-/ul60504030201000ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720Figura 13. Reconstituição de linfócitos T CD4 naive, de memória, de memória efetora e efetoresdiferenciados em pacientes com esclerose múltipla após o TACTH. Valores absolutos (células/μl) delinfócitos T naive CD4 + CD27 + CD45RO - (A), linfócitos T de memória central CD4 + CD27 + CD45RO + (B), linfócitos Tde memória efetores CD4 + CD27 - CD45RO + (C), e de linfócitos T efetores diferenciados CD4 + CD27 - CD45RO - (D).As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro das caixas indicam a mediana, ospontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem do menor ao maior valor. Os círculoscheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 92A400B1400CD8+CD27+CD45RO-/ul300200100CD8+CD27+CD45RO+/ul120010008006004002000ISPre-mob*Pre-cond*D+60D+100D+180D+270*D+360D+540D+7200ISPre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270D+360D+540D+720C2000DCD8+CD27-CD45RO+/ul150010005000ISPre-mobPre-cond*D+60D+100*D+180*D+270*D+360*D+540D+720CD8+CD27-CD45RO+/ul4003002001000ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270*D+360D+540D+720Figura 14. Reconstituição de linfócitos T CD8 naive, de memória, de memória efetora e efetoresdiferenciados em pacientes com esclerose múltipla após o TACTH. Valores absolutos (células/μl) delinfócitos T naive CD8 + CD27 + CD45RO - (A), linfócitos T de memória central CD8 + CD27 + CD45RO + (B), linfócitos Tde memória efetores CD8 + CD27 - CD45RO + (C), e de linfócitos T efetores diferenciados CD8 + CD27 - CD45RO - (D).As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro das caixas indicam a mediana, ospontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem do menor ao maior valor. Osasteriscos indicam os valores outlyers. IS, valores de referência obtidos de 10 indivíduos-controle saudáveis comidade entre 30-55 anos. Pré-mob, período pré-mobilização ou pré-transplante. Pré-cond, período précondicionamento.D+60, D+100, D+180, D+270, D+360, D+540 e D+720, dias pós-transplante.

Resultados 93AB% Linfócitos T CD3+CD4+Fas+100806040200ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360D+540D+720% Linfócitos T CD3+CD8+Fas+100806040200ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180D+270D+360D+540D+720C% Linfócitos B CD19+Fas+100806040200ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720D% Linfócitos T CD3+CD4+FasL+403020100ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720E% Linfócitos T CD3+CD8+FasL+80706050403020100ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720Figura 15. Expressão de Fas e FasL em linfócitos T CD4 + ou TCD8 + , ou em linfócitos B reconstituídos empacientes com esclerose múltipla após o TACTH. Porcentagens (gate em linfócitos) de linfócitos T CD3 + CD4 +que expressam Fas (A), linfócitos T CD3 + CD8 + que expressam Fas (B), e de linfócitos B CD19 + que expressamFas (C), linfócitos T CD3 + CD4 + que expressam FasL (D), linfócitos T CD3 + CD8 + que expressam FasL (E). Asextremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro das caixas indicam a mediana, ospontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem do menor ao maior valor. Os círculoscheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 94A% Linfócitos T CD3+CD69+20151050B% Linfócitos T CD3+HLA-DR+80706050403020100IS*Pre-mob*Pre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360*D+540*D+720C% Linfócitos T CD19+CD38+302520151050ISPre-mob*Pre-cond*D+60D+100D+180D+270D+360*D+540D+720D% T CD4+CD45RA+CD31+1009080706050403020ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720ET CD4+CD45RA+CD31+/ul5004003002001000ISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360*D+540*D+720Figura 16. Expressão de marcadores de ativação celular em linfócitos T CD4 + , T CD8 + e linfócitos Breconstituídos, e reconstituição de linfócitos T CD4+ recém-imigrantes do timo, em pacientes comesclerose múltipla após o TACTH. Porcentagens (gate em linfócitos) de linfócitos T CD3 + que expressam CD69(A), linfócitos T CD3 + que expressam HLADR (B), linfócitos B CD19 + que expressam CD38 (C), e de linfócitos TCD4 + CD45RA + que expressam CD31 (D). Valor absoluto (células/μl) de linfócitos T CD4 + CD45RA + CD31 + (E). Asextremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro das caixas indicam a mediana, ospontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem do menor ao maior valor. Os círculoscheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 95A% Linfócitos T CD4+CD25+35302520151050BLinfócitos T CD4+CD25+/ul8007006005004003002001000CISPre-mob*Pre-cond*D+60*D+100*D+180D+270D+360D+540D+720DISPre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180D+270*D+360*D+540D+720% Linfócitos T CD4+CD25high6543210Linfócitos T CD4+CD25high/ul180160140120100806040200ISPre-mob*Pre-cond*D+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720ISPre-mobPre-cond*D+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720Figura 17. Reconstituição de linfócitos T CD4 + CD25 + e linfócitos T CD4 + CD25 high em pacientes comesclerose múltipla após o TACTH. Porcentagens (gate em linfócitos) de linfócitos T CD4 + que expressam CD25(A), e de linfócitos T CD4 + que expressam CD25 high (C). Valores absolutos (células/μl) de linfócitos T CD4 + CD25 +(B) e de linfócitos CD4 + CD25 high (D). As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhasdentro das caixas indicam a mediana, os pontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro seestendem do menor ao maior valor. Os círculos cheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicamp

Resultados 96AB% T CD4+CD25highCTLA-4+100806040200T CD4+CD25highCTLA-4+/ul50403020100ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720C% T CD4+CD25high+GITR+100806040200DT CD4+CD25high+GITR+/ul121086420ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720Figura 18. Expressão de CTLA-4 e GITR em linfócitos T CD4 + CD25 high em pacientes com esclerosemúltipla antes e após o TACTH. Porcentagens (gate em linfócitos) de linfócitos T CD4 + CD25 high queexpressam CTLA-4 (A) e de linfócitos T CD4 + CD25 high que expressam GITR (C). Valores absolutos (células/μl) delinfócitos T CD4 + CD25 high CTLA-4 + (B) e de linfócitos CD4 + CD25 high GITR + (D). As extremidades das caixasindicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro das caixas indicam a mediana, os pontos dentro das caixasindicam a média, e as barras de erro se estendem do menor ao maior valor. Os círculos cheios indicam osvalores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 974.3 Avaliação do perfil de citocinas após o TACHCom o objetivo de investigar possíveis alterações do padrão de citocinas que poderiampromover tolerância após o TACTH, por exemplo, uma mudança de resposta T H 1 para T H 2 nospacientes com diabete melito do tipo 1 e esclerose múltipla. Para tal, nós avaliamos a capacidadefuncional de produção de citocinas pelas subpopulações de linfócitos T CD4 + e T CD8 + nessespacientes.Avaliamos por citometria de fluxo (Jung et al., 1993; Masher et al., 1999), a freqüência delinfócitos positivos para citocinas intracelulares do padrão T H 1 ou pró-inflamatórias (IFN-γ, IL-2, TNFα)ou do padrão T H 2 ou anti-inflamatórias (IL4, IL-5, IL-10) após ativação das células com estímulopoliclonal (PMA e Ionomicina), conforme descrito em Material e Métodos. A produção de citocinas foiavaliada pelas subpopulações de linfócitos T CD4 + (CD3 + CD8 - ) e T CD8 + (CD3 + CD8 + ) ativados.As Figuras 19 e 20 mostram a avaliação a porcentagem de células T CD4 + e T CD8 +produtoras de citocinas do padrão T H 1 e T H 2, respectivamente, nos pacientes com diabete melito dotipo 1. A porcentagem de células T CD4 + e T CD8 + produtoras de citocinas do padrão T H 1 e T H 2, nospacientes com esclerose múltipla é mostrada nas Figuras 21 e 22, respectivamente.Após a estimulação das células T, o marcador de ativação precoce CD69 é rapidamenteregulado positivamente, dentro de 30 minutos após a estimulação, e atinge o máximo de expressãoda superfície da célula após 18-24 horas (Nakamura et al., 1989). Em cada ensaio, a determinaçãoda expressão de CD69 foi usada somente como um controle da ativação das células, a fim de seavaliar o funcionamento dos reagentes usados na estimulação das células. Em geral, uma menorporcentagem de células T CD3 + expressou CD69 após estimulação nos pacientes (31-98%)comparando-se aos controles saudáveis (85-99%), principalmente nos primeiros meses após oTACTH. No entanto, isso não interferiu na detecção de citocinas intracelulares nas células dospacientes após a ativação policlonal. Eyrich et al. (2004) também observou esse defeito na ativaçãocelular de células T naive e de memória, avaliada pela indução reduzida da expressão de CD69 apósestímulo com PMA e ionomicina, que persistiu por pelo menos um ano após transplante alogênico decélulas tronco em pacientes com doenças hematológicas.Em seguida, apresentaremos os resultados obtidos para os pacientes com DM e EMseparadamente.

Resultados 984.3.1 Pacientes com diabete melito do tipo 1A porcentagem de células T CD4 + e CD8 + positivas para INF-γ aumentou acentuadamente noperíodo pré-cond e em todos os seguimentos pós-tx. Esse aumento foi significante em todos osperíodos pós-TACTH (Tabelas F.1 e F.2). Como mostra as Figura 19A e B, o INF-γ foipredominantemente detectado nos linfócitos T CD8 + .Observamos uma diminuição significante na porcentagem de células T CD4 + e CD8 + positivaspara a citocina IL-2 no pré-tx em relação à porcentagem encontrada nos controles saudáveis(p=0,0245 para CD4 + IL-2 + , e p=0,0022 para T CD8 + IL-2 + ). Em todos os períodos houve umapreponderância de células T CD4 + positivas para IL-2. A porcentagem de células T CD4 + IL-2 +aumentou em relação ao pré-tx, no pré-cond, D+100 e D+360, mas esse aumento não foiestatisticamente significante. Em contraste, a freqüência de células T CD8 +positivas para IL-2diminuiu significantemente após o TACTH, no D+60, D+100, D+270 e D+360 pós-tx (Figuras 19C eD, Tabelas F.1 e F.2).A citocina TNF-α foi produzida após estimulação numa elevada porcentagem de ambassubpopulações de células T CD4 + e CD8 + . Após o transplante, houve um aumento acentuado naporcentagem de células T CD4 + produtoras de TNF-α, aumento que foi significante no período dedois a seis meses pós-tx (Figura 19E, Tabelas F.1 e F.2). Similarmente, houve um aumentosignificante na porcentagem de células T CD8 + TNF-α + após o TACTH, em todos os seguimentosavaliados (Figura 19E, Tabelas F.1 e F.2).Citocinas do padrão T H 2 foram detectadas, após o estímulo policlonal, em uma baixaporcentagem de células T CD4 + e CD8 + , nos pacientes com DM e também nos controles saudáveis. Aporcentagem de células T CD4 + positivas para IL-4 aumentou no pré-cond e após o TACTH, em todosos seguimentos, embora esse aumento tenha sido significante somente no período de pré-cond(p=0,0480) e no D+270 pós-tx (p=0,0238). A freqüência de células T CD8 + IL-4 + também mostrou umaumento significante no pré-cond (p=0,0400) e logo após o TACTH (D+60) (Figura 20A e B, TabelasF.1 e F.2).Na Figura 20C, podemos observar um aumento porcentagem de células T CD4 + positivas paraIL-5 no pré-cond e em todos os seguimentos após o TACTH. Esse aumento foi estatisticamentesignificante no D+270 pós-tx (p=0,0014) (Tabelas F.1 e F.2). No período de pré-cond e logo após o

Resultados 99transplante, houve um aumento na porcentagem de células T CD8 + produtoras de IL-5, aumento quefoi significante no período de pré-condicionamento (p= 0,0369) (Figura 20D, Tabelas F.1 e F.2).Observamos um aumento da porcentagem de células T CD4 + positivas para a citocina IL-10todos os períodos pós-tx e no pré-cond. O aumento das células T CD4 + IL-10 + foi significante noD+180 (p=0,0020) e no D+270 (p=0,0015) (Figura 20E, Tabelas F.1 e F.2). Similarmente, afreqüência de células T CD8 + produtoras de IL-10 encontrou-se aumentada no pré-cond e até seismeses pós-tx. O aumento de células T CD8 + IL-10 + foi estatisticamente significante no período de précondicionamento(p=0,0461) (Figura 20F, Tabelas F.1 e F.2).

Resultados 100AT CD4 + T CD8 +B% Células T CD3+CD8-INF-gama+908070605040302010ISPre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360% Células T CD3+CD8+INF-gama+100806040200ISPre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360CD% Células T CD3+CD8-IL-2+706050403020100IS*Pre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360% Células T CD3+CD8+IL-2+302520151050IS*Pre-mobPre-cond*D+60*D+100D+180*D+270*D+360EF% Células T CD3+CD8-TNF-alfa+9080706050403020100ISPre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180D+270D+360% Células T CD3+CD8+TNF-alfa+100806040200ISPre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360Figura 19. Porcentagem de células T CD4 + e T CD8 + produtoras de citocinas intracelulares do padrão T H1em pacientes com diabete melito tipo 1 pré- e pós-TACTH. Porcentagens (gate em linfócitos) de células TCD3 + CD8 - INF-γ + (A) e CD3 + CD8 + INF-γ + (B), células T CD3 + CD8 - IL-2 + (C) e CD3 + CD8 + IL-2 + (D), e de células TCD3 + CD8 - TNF-α + (E) e CD3 + CD8 + TNF-α + (F), após estímulo in vitro de 6 horas com PMA e ionomicina, napresença de brefeldina A. As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro dascaixas indicam a mediana, os pontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem domenor ao maior valor. Os círculos cheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 101AT CD4 + T CD8 +B% Células T CD3+CD8-IL-4+3,02,52,01,51,00,50,0% Células T CD3+CD8+IL-4+2,01,51,00,50,0ISPre-mob*Pre-condD+60D+100D+180D+270D+360ISPre-mob*Pre-condD+60D+100D+180D+270D+360CD% Células T CD3+CD8-IL-5+14121086420ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180*D+270D+360% Células T CD3+CD8+IL-5+543210ISPre-mob*Pre-condD+60D+100D+180D+270D+360EF% Células T CD3+CD8-IL-10+14121086420% Células T CD3+CD8+IL-10+6543210ISPre-mobPre-condD+60D+100*D+180*D+270D+360ISPre-mob*Pre-condD+60D+100D+180D+270D+360Figura 20. Porcentagem de células T CD4 + e T CD8 + produtoras de citocinas intracelulares do padrão T H2em pacientes com diabete melito tipo 1 pré- e pós-TACTH. Porcentagens (gate em linfócitos) de células TCD3 + CD8 - IL-4 + (A) e CD3 + CD8 + IL-4 + (B), células T CD3 + CD8 - IL-5 + (C) e CD3 + CD8 + IL-5 + (D), e de células TCD3 + CD8 - IL-10 + (E) e CD3 + CD8 + IL-10 + (F), após estímulo in vitro de 6 horascom PMA e ionomicina, na presençade brefeldina A. As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro das caixasindicam a mediana, os pontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem do menor aomaior valor. Os Os círculos cheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 1024.3.2 Pacientes com esclerose múltiplaNos pacientes com EM, a citocina INF-γ foi produzida após estimulação policlonal por umaelevada porcentagem de ambas subpopulações de células T CD4 + e CD8 + . No entanto, como mostraa Figura 21A e B, o INF-γ foi predominantemente detectado nos linfócitos T CD8 + . Após otransplante, houve um aumento significante na porcentagem de células T CD4 + produtoras de INF-γ,em todos os seguimentos avaliados pós-tx até dois anos pós-tx (Figura 21A, Tabelas G.1 e G.2).Similarmente, houve um aumento acentuado na porcentagem de células T CD8 + INF-γ +após oTACTH, estatisticamente significante em todos os seguimentos avaliados (Figura 21B, Tabelas G.1 eG.2).Observamos uma diminuição significante na porcentagem de células T CD8 + positivas paraINF-γ, e de células T CD4 + e CD8 + positivas para IL-2 e TNF-α, no período pré-tx em relação àporcentagem encontrada nos controles saudáveis (Figura 21, Tabelas G.1 e G.2).Houve uma preponderância de células T CD4 +positivas para IL-2 em todos os períodosanalisados. A porcentagem de células T CD4 + IL-2 +aumentou em vários seguimentos pós-tx, emrelação à porcentagem pré-tx, mas esse aumento não foi estatisticamente significante. Em contraste,a freqüência de células T CD8 + positivas para IL-2 diminuiu nos primeiros seis meses após o TACTH,diminuição esta que não foi significante (Figuras 21C e D, Tabelas G.1 e G.2).Como podemos observar na Figura 21, após o transplante, houve um aumento acentuado naporcentagem de células T CD4 +produtoras de TNF-α, aumento que foi significante em todosperíodos pós-tx, exceto no D+270 (Figura 21E, Tabelas G.1 e G.2). Da mesma forma, houve umaumento significante na porcentagem de células T CD8 + TNF-α +após o TACTH, em todos osseguimentos avaliados (Figura 21F, Tabelas G.1 e G.2). A produção de TNF-α foipredominantemente detectada na subpopulação de células T CD4 + .Nos pacientes com EM e também nos controles saudáveis do grupo 2, as citocinas do padrãoT H 2 foram detectadas em uma baixa porcentagem de células T CD4 + e CD8 + estimuladas. Aporcentagem de células T CD4 + e CD8 + positivas para IL-4 aumentou no D+100 e D+180 após oTACTH, embora esse aumento não tenha sido significante (Figura 22A e B, Tabelas G.1 e G.2).Na Figura 22C, podemos observar um aumento da porcentagem de células T CD4 + e CD8 +produtoras de IL-5 no pré-cond e em nos primeiros seis meses após o TACTH, no entanto esseaumento não foi estatisticamente significante (Tabelas G.1 e G.2).

Resultados 103A Figura 22E mostra um aumento da porcentagem de células T CD4 + positivas para a citocinaIL-10 todos os períodos pós-tx avaliados (Figura 22E, Tabelas G.1 e G.2). Similarmente, afreqüência de células T CD8 + produtoras de IL-10 encontrou-se aumentada no pré-cond e até seismeses pós-tx (Figura 22F). No entanto, o aumento de células T CD4 + e CD8 + positivas para IL-10observado não foi estatisticamente significante (Tabelas G.1 e G.2).

Resultados 104AT CD4 + T CD8 +B% Células T CD3+CD8-INF-gama+9080706050403020100ISPre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360*D+540*D+720% Células T CD3+CD8+INF-gama+100908070605040302010IS*Pre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180*D+270*D+360*D+540*D+720CD% Células T CD3+CD8-IL-2+8070605040302010IS*Pre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720% Células T CD3+CD8+IL-2+80706050403020100IS*Pre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720EF% Células T CD3+CD8-TNF-alfa+100806040200IS*Pre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180D+270*D+360*D+540D+720% Células T CD3+CD8+TNF-alfa+100806040200IS*Pre-mobPre-cond*D+60*D+100*D+180D+270*D+360*D+540D+720Figura 21. Porcentagem de células T CD4 + e T CD8 + produtoras de citocinas intracelulares do padrão T H1em pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-TACTH. Porcentagens (gate em linfócitos) de células TCD3 + CD8 - INF-γ + (A) e CD3 + CD8 + INF-γ + (B), células T CD3 + CD8 - IL-2 + (C) e CD3 + CD8 + IL-2 + (D), e de células TCD3 + CD8 - TNF-α + (E) e CD3 + CD8 + TNF-α + (F), após estímulo in vitro de 6 horas com PMA e ionomicina, napresença de brefeldina A. As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro dascaixas indicam a mediana, os pontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem domenor ao maior valor. Os círculos cheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 105AT CD4 + T CD8 +B% Células T CD3+CD8-IL-4+9876543210% Células T CD3+CD8+IL-4+9876543210ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360*D+540D+720C% Células T CD3+CD8-IL-5+6543210D% Células T CD3+CD8+IL-5+9876543210EISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720FISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720% Células T CD3+CD8-IL-10+2520151050% Células T CD3+CD8+IL-10+876543210ISPre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720IS*Pre-mobPre-condD+60D+100D+180D+270D+360D+540D+720Figura 22. Porcentagem de células T CD4 + e T CD8 + produtoras de citocinas intracelulares do padrão T H2em pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-TACTH. Porcentagens (gate em linfócitos) de células TCD3 + CD8 - IL-4 + (A) e CD3 + CD8 + IL-4 + (B), células T CD3 + CD8 - IL-5 + (C) e CD3 + CD8 + IL-5 + (D), e de células TCD3 + CD8 - IL-10 + (E) e CD3 + CD8 + IL-10 + (F), após estímulo in vitro de 6 horascom PMA e ionomicina, na presençade brefeldina A. As extremidades das caixas indicam o 25th e o 75th percentis, as linhas dentro das caixasindicam a mediana, os pontos dentro das caixas indicam a média, e as barras de erro se estendem do menor aomaior valor. Os círculos cheios indicam os valores outlyers. Os asteriscos indicam p

Resultados 1064.4 Análise da diversidade do repertório de linfócitos TCom o objetivo de estudar a diversidade do repertório de linfócitos T nos pacientes com diabetemelito do tipo 1 e esclerose múltipla, antes e seqüencialmente após o TACTH, e avaliar se ocorremmudanças na composição do repertório de células T nesses pacientes após o transplante, nósutilizamos a metodologia de TCRBV CDR3 spectratyping descrita por Pannetier et al. (1993). Estametodologia permite a análise da composição clonal de uma população de células T e de suadiversidade geral baseada na distribuição dos segmentos de CDR3 (do inglês Complementarity-Determining Regions) do receptor de células T (TCR).Usando este método, nós estudamos a diversidade do repertório da cadeia Vβ do TCR dospacientes com diabete melito do tipo 1 ou com esclerose múltipla e a cinética de reconstituição dorepertório de células T após o TACTH. Avaliamos também o repertório da cadeia Vβ do TCR em doisindivíduos-controle saudáveis, um com idade de 29 anos (DN20) e outro com 38 anos (DN12)(Apêndice Y).A Figura C.1 (Apêndice C) mostra um esquema do método de TCRBV CDR3 spectratyping ea Figura C.2 (Apêndice C) mostra uma imagem gerada após a corrida eletroforética dos produtos dePCR obtidos após a reação de elongação (run-off) num gel de seqüenciamento. Essa imagem foianalisada pelo software Gene Mapper, gerando os gráficos de distribuição dos segmentos de CDR3.(Apêndices I-M: pacientes com diabete melito do tipo 1; Apêndices N-U: pacientes com esclerosemúltipla; Apêndices V: indivíduos-controle saudáveis). Os gráficos (ou espectros) representam aintensidade de fluorescência em unidades arbitrárias em função do comprimento da região CDR3 empares de bases.A partir desses gráficos, foi calculada a freqüência de cada pico da região CDR3 das famíliasVβ e a freqüência total de cada família Vβ para uma determinada amostra, a partir do valor da áreados picos de fluorescência, como descrito em Material e Métodos. Devido ao grande volume deresultados, apresentamos nos Apêndices os perfis do repertório Vβ do TCR de cada pacienteindividualmente, bem como uma tabela na qual são mostradas a freqüência total de cada família Vβno repertório e a freqüência de cada segmento de CDR3 dentro de cada família Vβ específica(Apêndices I-M: pacientes com diabete melito do tipo 1; Apêndices N-U: pacientes com esclerosemúltipla; Apêndices V: indivíduos-controle saudáveis). A freqüência total de cada família Vβ norepertório do TCR também está mostrada sob a forma de gráficos no Apêndice W (pacientes com

Resultados 107diabete melito do tipo 1), no Apêndice X (pacientes com esclerose múltipla) e no Apêndice Y(indivíduos-controle saudáveis).Em nossas análises, classificamos as famílias Vβ como: A. famílias policlonais gaussianas,famílias que apresentaram múltiplos picos (ou segmentos) de CDR3 com uma distribuição gaussiana(ou normal) dos picos. B. famílias policlonais não-gaussianas, famílias que apresentaram múltiplospicos de CDR3 com uma distribuição anormal ou não-gaussiana dos picos (distribuição “desviada” ouskewed; às vezes apresentando descontinuidade devido à ausência de alguns picos, formandoburacos no espectro). C. famílias oligoclonais, famílias que apresentaram ≤4 picos de CDR3 comuma distribuição não-gaussiana dos picos. D. famílias monoclonais, famílias que apresentaramsomente um pico de CDR3, representando uma população em expansão clonal.As famílias Vβ policlonais gaussianas foram então classificadas como famílias de padrãogaussiano, e as famílias policlonais não-gaussianas, oligoclonais ou monoclonais foram classificadascomo famílias de padrão não-gaussiano. Algumas famílias Vβ não foram amplificadas emdeterminados períodos em alguns pacientes, e foram denominadas famílias negativas. Em nossoestudo, consideramos um repertório restrito para uma determinada família Vβ quando foramencontrados ≤4 picos de CDR3, independentemente do perfil de distribuição dos picos, se gaussianoou não-gaussiano. Por outro lado, o repertório foi considerado diverso para uma determinada famíliaVβ quando ≥5 picos de CDR3 foram observados. Essas classificações foram baseadas em análisesde repertório descritas na literatura (Wu et al. 2000; Talvensaari et al., 2002; Bomberger et al., 1998;Farge et al., 2005; Muraro et al., 2006).Em nossos experimentos, as análises por TCRBV CDR3 spectratyping identificaram quatropadrões básicos de reconstituição da diversidade dos TCRs, também descritos por Muraro et al.(2005). O padrão I consistiu na recuperação da diversidade a partir de um repertório pré-transplanterestrito. O padrão II consistiu na reconstituição da diversidade a partir de um repertório prétransplantediverso. O padrão III consistiu no reaparecimento total ou parcial de um repertório prétransplanterestrito. E o padrão IV consistiu na reconstituição de um repertório restrito a partir de umrepertório pré-transplante diverso.De modo geral, observamos amplificação de todas as famílias Vβ, com exceção das famíliasVβ19, Vβ20 e Vβ24, que não foram amplificadas em determinados pacientes ou períodos. Em nossasanálises, a expressão da família Vβ24 foi baixa em todos os pacientes e amostras analisadas.

Resultados 108As análises do repertório de linfócitos T dos pacientes com DM ou EM transplantados, porTCRBV CDR3 Spectratyping, mostraram que a maioria das famílias Vβ do TCR, antes e após otransplante, eram policlonais e apresentavam um perfil de distribuição dos picos anormal ou nãogaussiano.No entanto, várias dessas famílias Vβ policlonais, com perfil de distribuição dos picos nãogaussiano,apresentaram expansões dominantes de 1-2 picos de CDR3. Essas expansões foramencontradas nos pacientes principalmente seis meses após o TACTH e estão associadas à faselinfopênica da reconstituição imunológica, caracterizada pela proliferação homeostática de células Tde memória residuais que sobreviveram ao regime de condicionamento. Essa fase também foicaracterizada pela presença de algumas famílias Vβ em expansões oligoclonais ou monoclonais.Além disso, alguns pacientes apresentaram famílias em expansões oligoclonais ou monoclonais noperíodo pré-transplante, que se mantiveram após o transplante em alguns pacientes e em outros não.Em geral, as famílias Vβ analisadas apresentaram segmentos de CDR3 de tamanhos variáveis comoo pico de maior freqüência.A diversidade do repertório da cadeia Vβ do TCR (aumento ou diminuição) foi analisada combase no complexity score calculado para cada amostra (Wu et al., 2000) e no número total de picos(soma dos picos de todas as família Vβ), conforme explicado em Material e Métodos. Em indivíduosnormais, a maioria das famílias Vβ apresenta perfil policlonal gaussiano e possuem em média oitopicos na região CDR3, embora possam ser encontradas famílias Vβ em expansões oligoclonais (Wuet al. 2000; Fallen et al., 2003). Wu et al. (2000) analisaram o repertório da cadeia Vβ do TCR de 10doadores normais e mostraram que a média dos complexity scores dos doadores foi de 183 (nesseestudo o complexity score máximo era de 208). Os autores estabeleceram o score de 142 (intervalode confiança de 95%) como o limite inferior de normalidade. Em nosso trabalho, o complexity scoremáximo foi de 192. Nos indivíduos saudáveis DN20 e DN12 estudados a maioria das famílias Vβapresentaram um perfil policlonal. Os complexity scores foram de 179 e 173 para os indivíduos DN20e DN12, respectivamente.Em seguida, mostramos resultados das análises do repertório de células T pré e póstransplante,separadamente para os pacientes com diabete melito do tipo 1 ou com esclerosemúltipla.

Resultados 1094.4.1 Pacientes com diabete melito do tipo 1A Tabela 7 mostra a análise da diversidade do repertório da cadeia Vβ do TCR dos pacientescom diabete melito do tipo 1, antes e seqüencialmente após o TACTH.Observamos que o complexity score diminuiu em quatro dentre os cinco pacientes com DMtransplantados. Um ano após o transplante (tx), os pacientes DM1, DM2 e DM4, apresentaram umadiminuição do complexity score do repertório Vβ de 6,3%, 12% e 6,3%, respectivamente. O pacienteDM5 teve uma diminuição de apenas 1,6%, mas ainda apresenta um seguimento muito curto pós-tx.Já, o paciente DM3 apresentou um pequeno aumento do complexity score um ano após o TACTH(0,6%). (Tabela 7).O número total de picos de CDR3 das cadeias Vβ dos TCRs, diminuiu em todos os pacientescom DM transplantados. No paciente DM1, 2 famílias Vβ apresentaram maior número de picos norepertório Vβ do TCR um ano pós-tx em relação à diversidade pré-tx. Onze famílias tiveram o númerode picos diminuído e outras 11 famílias mostraram o mesmo número de picos de antes dotransplante. No paciente DM2, sete famílias Vβ apresentaram um aumento no número de picos póstx.Treze famílias tiveram o número de picos diminuído e 4 famílias mostraram a mesma quantidadede picos de antes do transplante (Tabela 7).No paciente DM3. encontramos 6 famílias Vβ com um maior número de picos no repertório Vβdo TCR um após o transplante. Cinco famílias apresentaram diminuição no número de picos e outras13 famílias mostraram o mesmo número de picos de antes do transplante. Já, o paciente DM4 foi oque apresentou o maior número de famílias Vβ com número de picos diminuído (15 famílias). Trêsfamílias Vβ apresentaram um número maior de picos pós-tx e 6 famílias mostraram a mesmaquantidade de picos de antes do transplante.Interessantemente, o paciente DM5, mesmo com um seguimento curto de seis meses pós-tx,apresentou um grande número de famílias Vβ com uma maior número de picos no repertório Vβ (7famílias). Oito famílias apresentaram diminuição no número de picos e 9 famílias Vβ mostraram omesmo número de picos de antes do transplante.É interessante ressaltar que os pacientes com DM têm um seguimento de até um ano póstransplante,desse modo, podemos esperar que um repertório mais diverso seja recuperado após umano e meio a dois anos após o TACTH com a reconstituição de uma população maior de células

Resultados 110naive produzidas pelo timo desses pacientes. Além disso, a diversidade grande de picos pré-tx deveseà idade desses pacientes, pois são pacientes jovens, e portanto apresentam uma diversidademaior de células T. Com isso, a reconstituição de um repertório pós-tx ainda mais diverso do que orepertório pré-tx pode demorar mais tempo.Como podemos observar na Tabela 7, a grande maioria das famílias reconstituídas apresentouum padrão não-gaussiano. Dentre elas as famílias com múltiplos picos (policlonais), mas comdistribuição anormal (não-gaussiana) dos segmentos de CDR3 foram as mais freqüentes. O númerode famílias policlonais de padrão gaussiano diminuiu após o transplante em 4 dentre os 5 pacientesanalisados, e aumentou no paciente DM3 (de 1 para 2 famílias).O paciente DM1 apresentou uma família (Vβ19) oligloclonal, seis meses e um ano após oTACTH. Uma família nesse paciente apresentou-se em expansão clonal (Vβ12), com um único picode CDR3 de 6 resíduos de aminoácidos. Interessantemente, essa família recuperou diversidade umano pós-tx (Tabela 7 e Apêndice I). Expansões oligoclonais ou monoclonais são comumenteencontradas em pacientes com doenças auto-imunes ou doenças hematológicas, como leucemias,por exemplo. Essas expansões podem corresponder a uma população clonal de linfócitos autoreativosou leucêmicos.O paciente DM2, para o qual o repertório foi analisado também nos períodos D+100 e D+270apresentou, quatro famílias oligoclonais 100 dias pós-tx (Vβ4, Vβ7, Vβ8, Vβ12 e Vβ24), 2 famílias noD+180 (Vβ7 e Vβ23) e uma família no D+270 (Vβ19) e D+360 (Vβ7). Esse paciente apresentou umafamília monoclonal, Vβ8, com o segmento de CDR3 de 9aa em expansão clonal, nos D+270 e D+360pós-tx. Vale notar que a família Vβ8, apesar de apresentar múltiplos picos pré-tx, o pico de 9aa eradominante em relação aos outros. Após o transplante, a família tornou-se oligoclonal, e depoismonoclonal com o passar do tempo (Tabela 7 e Apêndice J).Na Tabela 7 podemos observar que o paciente DM3 apresentou uma família oligoclonal (Vβ19)antes do transplante e esse número aumentou para 2 famílias (Vβ13 e Vβ19) no D+100 e para 3famílias (Vβ3, Vβ15 e Vβ19) no D+360 pós-tx. Vale ressaltar que a família Vβ19, que já apresentavaum perfil restrito antes do transplante (2 picos de CDR3, de 10 e 14aa), reapareceu pós-tx com omesmo perfil oligoclonal, mas ainda mais restrito no dia +180 pós-TACTH (Apêndice K).

Resultados 111Tabela 7. Análise da diversidade do repertório Vβ do TCRs dos pacientes com diabete melito do tipo 1 pré e seqüencialmente após o TACTH.PACIENTEPERÍODOFAMÍLIAS DE PADRÃONÃO-GAUSSIANO(Nº DE FAMÍLIAS)Nº DEFAMÍLIASNEGATIVASFAMÍLIAS DEPADRÃOGAUSSIANO(Nº DE FAMÍLIAS)PADRÃO DERECONSTITUIÇÃO(Nº DE FAMÍLIAS)Nº DE PICOS PÓS-TACTH(Nº DE FAMÍLIAS)NºTOTALDEPICOSCSPOLI OLIGO MONO TOTALPOLICLONAL I II III IV > = ), igual (=) ou menor (

Resultados 112No paciente DM4 encontramos 2 famílias Vβ em expansão oligoclonal (Vβ10 e Vβ11) seismeses pós-tx, e nenhuma família monoclonal (Apêndice L). Este paciente, dentre os cinco foi o queapresentou uma maior diminuição do número de picos. Não encontramos nenhuma família com perfiloligoclonal no paciente DM5, o qual em seis meses quase recuperou completamente a diversidade dorepertório pré-tx.Em nossas análises observamos que várias famílias Vβ com perfil de distribuição dos picosnão-gaussiano, classificadas como policlonais por apresentarem ≥5 picos, apresentavam expansõesdominantes de 1-2 picos de CDR3. Sendo os outros segmentos, de outros tamanhos, subdominantesnessa determinada família Vβ. Essas expansões foram encontradas nos pacientes principalmenteseis meses após o TACTH. Como exemplos, temos as famílias Vβ8, Vβ10, Vβ11, Vβ14, Vβ16, Vβ18,Vβ20, Vβ22 e Vβ24 no D+180 pós-tx, e a família Vβ12 um ano após o TACTH, no paciente DM1(Apêndice I).Nós encontramos famílias policlonais não-gaussianas com expansões dominantes de 1-2 picostambém nos outros pacientes. No paciente DM2, encontramos as famílias Vβ8 no período pré-tx(conforme já mencionado anteriormente), e as famílias Vβ4, Vβ12, Vβ14 e Vβ23 pós-tx (Apêndice J).No paciente DM3, a família Vβ15 apresentou expansões dominantes antes do transplante, e asfamílias Vβ3, Vβ10, Vβ16 e Vβ23 nos períodos pós-tx (Apêndice K).O paciente DM4 apresentou várias famílias com esse perfil após o transplante, algumassomente no D+180 (famílias Vβ1, Vβ13, Vβ14, Vβ15 e Vβ19), outras somente no D+360 (famíliasVβ10 e Vβ11), e outros nos dois períodos pós-tx (famílias Vβ3, Vβ7, e Vβ24). A família Vβ3apresentou um pico de 9aa em grande expansão também antes do transplante, que reapareceu emexpansão após o TACTH (Apêndice L). Já, o paciente DM5 apresentou poucas famílias policlonaisnão-gaussianas com expansões dominantes pós-tx (famílias Vβ1, Vβ11, Vβ19 e Vβ20). A família Vβ1também apresentou dois picos em expansão também antes do transplante (Apêndice M).Conforme mencionado anteriormente, observamos quatro diferentes padrões de reconstituiçãodo repertório da cadeia β do TCR após o transplante. Na Tabela 7 podemos observar o número defamílias que apresentaram os diferentes padrões de reconstituição do repertório, nos pacientes comDM. A Figura 23 mostra alguns perfis por TCRBV CDR3 spectratyping que exemplificam os quatrodiferentes padrões de reconstituição encontrados nesses pacientes.

Resultados 113O padrão de reconstituição mais comum em todos os pacientes analisados foi o padrão II, queconsiste na reconstituição da diversidade a partir de um repertório pré-transplante diverso. Noentanto, os outros padrões de reconstituição também foram observados nos pacientes. O pacienteDM1 apresentou uma família Vβ (Vβ19) com padrão de reconstituição IV. O paciente DM2 apresentouduas famílias Vβ (Vβ7 e Vβ8) com padrão de reconstituição IV. Já, o paciente DM3 apresentou umafamília Vβ (Vβ12) com padrão de reconstituição I, uma família Vβ (Vβ19) com padrão dereconstituição III, e duas famílias Vβ (Vβ3 e Vβ15) com padrão de reconstituição IV (Figura 23).O padrão IV (que consiste na reconstituição de um repertório restrito a partir de um repertóriopré-transplante diverso), quando observado, persistiu até o seguimneto máximo pós-tx analisado. Noentanto, podemos esperar que um repertório mais diverso seja recuperado com mais tempo deseguimento pós-tx, e que as famílias que eram policlonais antes do transplante voltem a recuperardiversidade, principalmente por que indivíduos jovens apresentam uma atividade tímica relevante eprodução significativa de células T naive.O método de TCRBV CDR3 spectratyping permite também estimarmos a freqüência de cadafamília Vβ num determinado repertório analisado. No Apêndice W, as Figuras W.1 a W.3, mostram afreqüência total (em %), antes e seqüencialmente após o transplante, das 24 famílias Vβ do TCR paracada paciente com DM individualmente. Nos Apêndices I-M, as tabelas mostram a freqüência totalde cada família Vβ no repertório, bem como a freqüência de cada segmento de CDR3 dentro de cadafamília Vβ específica, para cada paciente individualmente.Observamos mudanças dinâmicas na composição do repertório da cadeia Vβ dos TCRs após oTACTH nos pacientes com DM, evidenciadas por alterações qualitativas e quantitativas dos picos daregião CDR3 das famílias Vβ. Em vários casos, picos de CDR3 em determinada família Vβ que eramdominantes antes do transplante tornaram-se subdominantes após o mesmo, sendo excedidos poroutros segmentos de CDR3 que estavam sub-representados antes do TACTH. Em outros casos,picos de CDR3 em determinada família Vβ que eram dominantes antes do transplante foramexcedidos após o TACTH por outros segmentos de CDR3 que não tinham sido detectados antes dotransplante. A Figura 24 mostra alguns exemplos de mudanças na composição do repertório da dealgumas famílias Vβ do TCR após o TACTH nos pacientes com DM.

Resultados 114PACIENTE - VB Pré-Tx D+180 D+360DM3 - VB12NEGNEGPadrão IDM2 - VB16DM1 - VB18DM1 - VB22Padrão IIDM4 - VB2DM4 - VB5DM2 - VB8Padrão IIIDM3 - VB19DM2 - VB7DM3- VB3Padrão IVDM1 - VB12Figura 23. Padrões de reconstituição do repertório da cadeia Vβ do TCR pós-TACTH nos pacientes comdiabete melito do tipo 1. O RNA total foi extraído das células mononuclerares do sangue periférico, transcrito em cDNA,amplificado usando primers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelométodo de TCRBV CDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao númerode transcritos para a família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares debases (eixo X). Os picos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos deaminoácidos. DM, diabete melito do tipo 1. NEG, negativo ou ausência de expressão da família.

Resultados 115Além disso, várias famílias Vβ apresentaram freqüências diferentes após o transplante,aumentadas ou diminuídas em relação ao período pré-transplante, indicando uma mudançaquantitativa na composição do repertório de células T após o transplante (Apêndice W, Figuras W.1a W.3). Além disso, mesmo quando uma família Vβ manteve freqüência total semelhante após otransplante, em alguns casos foi observada uma mudança qualitativa e quantitativa nos segmentosda região CDR3 dessa família (Figura 24: Paciente DM2-Vβ13, Apêndice J; Paciente DM4-Vβ7,Apêndice L). Esses resultados indicam que o TACTH induz mudanças profundas, qualitativas equantitativas, na composição do repertório de células T dos pacientes com DM transplantados.Durante uma resposta imune adaptativa, a resposta de linfócitos T a um determinado antígenopode envolver expansões de clones ou, de populações policlonais compartilhando o mesmo rearranjoVβ-Jβ, compartilhadas entre diferentes indivíduos (expansões públicas) ou expansões presentesapenas em cada indivíduo (expansões privadas) (Sercarz et al., 2000). Em nosso estudo, nãoestudamos os rearranjos Vβ-Jβ nos linfócitos dos pacientes transplantados, mas podemos discutir aocorrência de expansões relevantes de células T usando a mesma família Vβ, compartilhadas ou nãopor diferentes pacientes. Destacamos as expansões Vβ relevantes com freqüência ≥ 6%,independentemente de seu perfil por TCRBV spectratyping, ter sido policlonal oligoclonal oumonoclonal.A Tabela 8 mostra as famílias Vβ com maiores freqüências nos pacientes com DM (freqüências≥6%). As famílias Vβ6 e Vβ21 mostraram-se em expansão relevante antes do transplante em todosos pacientes em DM analisados nesse estudo. E as famílias Vβ5 e Vβ22 apresentaram-se emexpansão, no período pré-tx em 4/5 pacientes. Enquanto que as famílias Vβ9, Vβ15 e Vβ16apresentaram freqüência ≥6% em 3 entre cinco pacientes transplantados. Interessantemente, o picode CDR3 de maior expressão nas famílias Vβ6 e Vβ22 foi o de 9 resíduos de aa em todos ospacientes. Já, o segmento de CDR3 mais freqüente na família Vβ5 foi o de 10 aa. Em relação àfamília Vβ21, os pacientes apresentaram picos de diferentes tamanhos como pico de maiorfreqüência, variando entre 7, 9, 10 e 12 resíduos de aa (Apêndices I-M).

Resultados 116PACIENTE - VB Pré-Tx D+180 D+360DM2 - VB5DM2 - VB13DM2 - VB15DM2 - VB18DM2 - VB21DM3 - VB2DM3 - VB14DM3 - VB21DM3 - VB22DM4- VB2DM4- VB7Figura 24. Mudanças qualitativas na composição do repertório da cadeia Vβ do TCR após o TACTH nospacientes com diabete melito do tipo 1. O repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBVCDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número de transcritos paraa família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de ases (eixo X). Ospicos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos. DM,pacientes com diabete melito do tipo 1.

Resultados 117Tabela 8. Freqüência das famílias Vβs do TCR com expansões relevantes em linfócitos T do sangueperiférico dos pacientes com diabete melito do tipo 1, pré e seqüencialmente após o TACTH.PACIENTEFAMÍLIA VβPERÍODOPRÉ-TX D+100 D+180 D+270 D+360DM1 VB3 3,78 6,37 1,60VB5 4,76 7,16 2,98VB6 7,30 9,48 4,51VB11 5,47 6,21 4,43VB13 6,22 3,92 7,15VB15 10,93 3,26 7,09VB16 4,31 4,93 7,59VB17 6,30 3,64 7,49VB21 3,71 3,53 6,22VB22 3,67 4,36 7,82DM2 VB2 4,06 5,34 4,41 5,90 6,17VB6 10,21 7,51 10,85 7,39 6,64VB7 6,89 5,72 2,57 4,49 5,52VB9 6,48 3,57 2,06 4,28 3,32VB10 2,77 4,95 1,19 2,32 7,11VB15 5,50 6,82 6,46 4,68 6,72VB16 4,79 5,56 6,46 7,28 7,17VB17 7,58 4,95 5,40 6,49 3,97VB18 5,18 4,00 4,27 6,13 4,65VB21 4,49 4,75 5,71 3,31 6,79VB22 7,29 1,17 6,64 6,58 5,48VB23 5,79 7,13 7,41 4,78 6,52DM3 VB5 7,27 5,74 6,39VB6 9,72 5,63 4,96VB9 6,03 5,18 5,95VB13 1,68 6,79 2,48VB21 4,84 6,14 6,41DM4 VB2 4,64 3,58 7,07VB3 6,25 4,41 8,60VB4 3,96 2,58 7,89VB5 3,21 5,97 6,65VB6 6,46 6,16 9,59VB9 5,11 7,65 3,63VB15 2,96 6,86 4,04VB16 5,53 6,51 4,76VB18 6,41 4,66 3,81VB21 6,32 5,13 4,02VB22 9,00 5,34 4,01DM5 VB5 6,76 5,22VB6 4,94 7,21VB11 7,06 4,03VB20 8,54 1,81VB21 6,13 5,35VB22 6,84 7,47VB23 5,92 6,27As freqüências das famílias Vβ estão expressas em %, em relação às 24 famíliasanalisadas. Os números em negrito correspondem às famílias com expansões defreqüência ≥6%.

ResultadosComo podemos observar, o paciente DM1 apresentou 10 dentre 24 famílias Vβ com expansõesrelevantes pré-tx ou pelo menos em um período pós-tx. Quatro famílias apresentaram expansão ≥6%antes do transplante (famílias Vβ6, Vβ13, Vβ15 e Vβ17), dentre as quais três voltaram a apresentarfreqüência ≥6% um ano pós-tx. Vale ressaltar a família Vβ15 que apresentou freqüência de 10,93%antes do transplante, e reapareceu em expansão após o transplante com freqüência de 7,09%(Tabela 8 e Apêndice W - Figura W.2A). O pico de CDR3 mais expressivo dessa família foi o de 9resíduos de aminoácidos (Apêndice I).Mostramos que o paciente DM2 apresentou 12 famílias com expansões relevantes antes dotransplante ou pelo menos em um período após o TACTH (Tabela 8 e Apêndice W - Figura W.1). Asfamílias Vβ6, Vβ7, Vβ9, Vβ17 e Vβ22 apresentaram-se em expansão relevante antes do transplante.Vale notar a família Vβ6 que apresentou freqüência de 10,21% antes do transplante, e reapareceucom freqüência acima de 6% em todos os períodos pós-tx.Como podemos observar na Tabela 8 e Apêndice W - Figura W.2B, encontramos 5 famíliascom expansões expressivas antes do transplante no paciente DM3 (famílias Vβ5, Vβ6, Vβ9, Vβ13 eVβ21). A família Vβ6 que apresentou freqüência de 9,72% pré-tx, mas teve sua freqüência diminuídapara 5,63% no D+180 e para 4,96% no D+360 pós-tx.O paciente DM4 apresentou 11 dentre as 24 famílias com expansões relevantes pré ou pelomenos em um período pós-tx. Cinco famílias com expansões relevantes (famílias Vβ3, Vβ6, Vβ18,Vβ21 e Vβ22), pré-transplante (Tabela 8 e Apêndice W - Figura W.3A). Podemos ressaltar nopaciente DM4, a família Vβ22 que mostrou freqüência de 9,0% antes do transplante, e as famíliasVβ3 e Vβ6 que apresentaram freqüências de 8,6% e de 9,59% um ano pós-tx. O pico de CDR3 maisexpressivo da família Vβ3 nesse paciente foi o de 9 resíduos de aminoácidos (Apêndice L).Já, o paciente DM5 apresentou, antes do transplante, 5 famílias com expansões ≥6% (famíliasVβ5, Vβ11, Vβ20, Vβ21 e Vβ22), ressaltando a freqüência de 8,54% da família Vβ20. Sete famíliasapresentaram expansões relevantes antes do transplante ou pelo menos em um período pós-tx nessepaciente (Tabela 8 e Apêndice W - Figura W.3B). Os segmentos de CDR3 de maior freqüência nafamília Vβ20 foram os de 9 e 8 resíduos de aminoácidos (Apêndice M).

Resultados 1194.4.2 Pacientes com esclerose múltiplaA Tabela 9 mostra a análise da diversidade do repertório da cadeia Vβ do TCR dos pacientescom esclerose múltipla, antes e seqüencialmente após o TACTH. Observamos que o complexityscore aumentou em quatro dentre os oito pacientes com EM transplantados, e diminuiu em outrosquatro. Dois anos após o transplante, os pacientes EM3 e EM4, apresentaram um aumento docomplexity score do repertório Vβ de 3% e 4,4%, respectivamente. O paciente EM9 tambémapresentou um aumento de 6,3%, um ano pós-tx. Já, os pacientes EM5, EM6, EM8 e EM10apresentaram uma diminuição no complexity score de 16,1% (D+360), 16,0% (D+360), 0,6% (D+180)e de 9,5% (D+270), respectivamente (Tabela 9).Podemos observar na Tabela 9 que o número total de picos de CDR3 das 24 famílias Vβ doTCR analisadas também aumentou em 4 dentre os 8 pacientes transplantados, após um ano ou maisde seguimento. O paciente EM1 teve um aumento de 15,1% no número de picos após 3 anos deseguimento, comparando-se com o número de picos após um ano de seguimento. Este primeiropaciente com esclerose múltipla (GG) foi transplantado antes do início desse estudo, portanto nãoforam coletadas amostras de antes do transplante e dos primeiros meses após o TACTH dessepaciente.No paciente EM1, 13 famílias Vβ apresentaram um maior número de picos no repertório Vβ doTCR um após 3 anos de seguimento, comparando-se com o número de picos após um ano deseguimento. Duas famílias tiveram o número de picos diminuído e outras 9 famílias Vβ mostraram omesmo número de picos de antes do transplante. Também no paciente EM3, 13 famílias Vβapresentaram um maior número de picos pós-transplante. Três famílias tiveram o número de picosdiminuído e 8 famílias Vβ mostraram o mesmo número de picos de antes do transplante.No paciente EM4 encontramos 9 famílias Vβ com um maior número de picos no repertório Vβdo TCR um ano após o transplante. Sete famílias tiveram a o número de picos diminuído e outras 8famílias Vβ mostraram o mesmo número de picos de antes do transplante. Já, o paciente EM5 foi oque apresentou o maior número de famílias com o número de picos diminuído (19 famílias Vβ). Cincofamílias Vβ apresentaram um maior número de picos pós-tx e nenhuma família mostrou a mesmonúmero de picos de antes do transplante.

Resultados 120O paciente EM6 apresentou 2 famílias Vβ com um maior número de picos no repertório Vβ doTCR um ano após o transplante em relação ao número pré-transplante. Dezoito famílias tiveram onúmero de picos diminuído e outras 4 famílias Vβ mostraram o mesmo número de picos de antes dotransplante. No paciente EM8 encontramos 9 famílias Vβ com um maior número de picos norepertório Vβ do TCR seis meses pós-tx. Onze famílias tiveram o número de picos diminuído e outras4 famílias Vβ mostraram o mesmo número de picos de antes do transplante.Já, o paciente EM9, que apresentou um aumento de 6,3% da diversidade do repertório um anopós-tx, foi o que apresentou o maior número de famílias com número de picos aumentado (14 famíliasVβ). Cinco famílias Vβ apresentaram um menor número de picos pós-tx e outras 5 famílias mostrarama mesmo número de picos de antes do transplante. O paciente EM10 apresentou 7 famílias Vβ comum maior número de picos no repertório Vβ do TCR nove meses após o transplante em relação aonúmero de picos pré-tx. Quatorze famílias tiveram o número de picos diminuído e 3 famílias Vβmostraram o mesmo número de picos de antes do transplante.Como podemos observar na Tabela 9, a grande maioria das famílias reconstituídas apresentouum padrão não-gaussiano. Dentre elas as famílias com múltiplos picos (policlonais), mas comdistribuição anormal (não-gaussiana) dos segmentos de CDR3 foram as mais freqüentes. O númerode famílias policlonais de padrão gaussiano aumentou em 2 dentre oito pacientes (EM6 e EM10),diminuiu em 4 pacientes (EM4, EM5, EM8 e EM9) após o TACTH. O paciente EM1 teve o aumento de1 família do D+360 para o D+1080 pós-tx. O paciente EM1 apresentou 4 famílias β oligoclonais (Vβ1,Vβ10, Vβ12 e Vβ19), um ano após o TACTH. O número de famílias oligoclonais nesse pacientediminuiu para 3 (Vβ1, Vβ12 e Vβ19) dois anos pós-tx, e para duas famílias (Vβ1 e Vβ8) três anos póstx(Tabela 9 e Apêndice N). Interessantemente, as famílias Vβ10, Vβ12 e Vβ19 recuperaramdiversidade três anos após o transplante, enquanto que a família Vβ1 permaneceu com um perfilrestrito (oligoclonal) durante todo o período analisado.O paciente EM3, apresentou uma família oligoclonal pré-transplante (Vβ15), quatro famíliasoligoclonais um ano pós-tx (Vβ12, Vβ13, Vβ15 e Vβ19), e uma família dois anos após o TACTH(Vβ19) (Tabela 9 e Apêndice O).

Resultados 121Tabela 9. Análise da diversidade do repertório Vβ dos TCRs dos pacientes com esclerose múltipla pré e seqüencialmente após o TACTH.PACIENTEPERÍODOFAMÍLIAS DE PADRÃONÃO-GAUSSIANO(Nº DE FAMÍLIAS)Nº DEFAMÍLIASNEGATIVASFAMÍLIAS DEPADRÃOGAUSSIANO(Nº DE FAMÍLIAS)PADRÃO DERECONSTITUIÇÃO(Nº DE FAMÍLIAS)Nº DE PICOS PÓS-TACTH(Nº DE FAMÍLIAS)NºTOTALDEPICOSCSPOLI OLIGO MONO TOTALPOLICLONAL I II III IV > = ), igual (=) ou menor (

Resultados 122Já, o paciente EM4 não apresentou nenhuma família oligoclonal nos períodos analisados, masencontramos uma família monoclonal nesse paciente (Vβ19), com o segmento de 10aa em expansãoclonal, antes do transplante. Após o transplante, a família tornou-se negativa no D+360, e depoisrecuperou diversidade D+720 pós-tx. (Tabela 9 e Apêndice P).Na Tabela 9 podemos observar que o paciente EM5 apresentou uma família oligoclonal (Vβ15)antes do transplante e esse número aumentou para 6 famílias Vβ oligoclonais pós-tx (Vβ12, Vβ13,Vβ15, Vβ13 e Vβ19). Esse paciente apresentou uma família monoclonal pré-tx (Vβ10), cujo pico de10aa encontrava-se em expansão clonal, nos D+270 e D+360 pós-tx. Vale notar que a famíliamonoclonal Vβ10 tornou-se policlonal um ano após o TACTH (Apêndice Q).Na paciente EM6 encontramos uma família oligoclonal pré-tx (Vβ19), 3 famílias oligoclonaisseis meses pós-tx (Vβ12, Vβ20, e Vβ23), e 3 famílias Vβ oligoclonais um ano meses pós-tx (Vβ14,Vβ19, e Vβ20). Essa paciente apresentou uma família Vβ negativa antes do transplante (Vβ19). Essafamília foi amplificada nos períodos pós-tx, mas apresentou-se em expansão clonal, com um pico deCDR3 único de 10 resíduos de aa. Após o transplante, foram encontradas mais duas famíliasmonoclonais nessa paciente, a família Vβ19 no D+180 (pico de 10 aa) e a família Vβ1 no D+360 (picode 9aa) (Tabela 9 e Apêndice R).A paciente EM8 apresentou uma família oligoclonal pré-tx (Vβ11) e quatro famílias oligoclonaisseis meses após o transplante (Vβ11, Vβ12, Vβ15 e Vβ24). Encontramos nessa paciente duasfamílias Vβ monoclonais antes do transplante, Vβ14 e Vβ19, com segmentos de 10aa e 9aa emexpansão clonal, respectivamente. Após o TACTH, apenas família monoclonal foi encontrada (Vβ19),com o segmento de CDR3 de 14 resíduos de aa em expansão clonal (Tabela 9 e Apêndice S).No paciente EM9 encontramos 2 famílias Vβ em expansão oligoclonal (Vβ19 e Vβ24) antes dotransplante. Vale ressaltar que a família Vβ19, que já apresentava um perfil restrito antes dotransplante (3 picos de CDR3, de 10, 12 e 13aa), reapareceu pós-tx com o mesmo perfil oligoclonal,mas ainda mais restrito nos D+180 e D+360 pós-TACTH (2 picos de CDR3, segmentos de 10 e 12aa)(Tabela 9 e Apêndice T). Interessantemente, este paciente apresentou uma família Vβ negativa(Vβ20), antes do transplante e em todos os períodos pós-tx. Este paciente, entre os oito estudados foio que apresentou um maior aumento da diversidade do repertório de células T, no período de um anopós-transplante.

Resultados 123A Tabela 9 mostra que o paciente EM10 apresentou 2 famílias oligoclonais (Vβ11 e Vβ24)antes do transplante e 2 famílias oligoclonais (Vβ7 e Vβ20) nove meses pós-tx. Esse pacienteapresentou uma família negativa após o transplante (Vβ24) (Apêndice U).Observamos em nossas análises que várias famílias Vβ com perfil de distribuição dos picosnão-gaussiano, classificadas como policlonais por apresentarem ≥5 picos, apresentavam expansõesdominantes de 1-2 picos de CDR3. Sendo os outros segmentos, de outros tamanhos, subdominantesnessa determinada família Vβ. Essas expansões foram encontradas em todos os pacientes antes eapós o transplante. Como exemplos, temos as famílias Vβ2, Vβ4, Vβ5, Vβ7, Vβ12, Vβ14, Vβ15, Vβ18,Vβ19, Vβ22 e Vβ22 após o transplante no paciente EM1. O Apêndice N mostra que a família Vβ4apresentou uma expansão relevante do pico de 8aa, e a família Vβ7 apresentou dois picos comexpansões relevantes, o pico de 9 e de 11aa.Encontramos famílias policlonais não-gaussianas com expansões dominantes de 1-2 picos deCDR3 também no paciente EM3. As famílias Vβ3, Vβ5 e Vβ19 apresentaram expansões dominantesno período pré-tx, as famílias Vβ10, Vβ12, Vβ23 e Vβ24 apresentaram expansões dominantes nosperíodos pré-tx e pós-tx, e as famílias Vβ11, Vβ13, Vβ18 e Vβ20 apresentaram expansõesdominantes pós-tx. Vale ressaltar as expansões encontradas na família Vβ11 pós-tx, que apresentouos segmentos de CDR3 de 6 e 8 aa em expansão dominante, e a família Vβ23 pós-tx, queapresentou o segmento de 12 aa em expansão dominante antes e após o transplante (Apêndice O).No paciente EM4, a família Vβ3 apresentou expansões dominantes antes do transplante, asfamílias Vβ11 e Vβ15 nos períodos antes e após o transplante, e as famílias Vβ6 e Vβ18 após oTACTH (Apêndice P). Vale ressaltar a família Vβ18 que apresentou o segmento de 10aa em grandeexpansão um ano após o transplante.O paciente EM5 apresentou algumas famílias com esse perfil um ano após o transplante(famílias Vβ14, Vβ17, Vβ18, e Vβ21), outras antes e após o TACTH (famílias Vβ1 e Vβ8), e umafamília com expansão dominante somente antes do transplante (Vβ7). Essa família Vβ7 apresentouum pico de CDR3 de 10aa em expansão dominante, quase clonal. Vale notar também a família Vβ17,que apresentou o segmento de CDR3 de 5aa em expansão dominante, também quase clonal(Apêndice Q).

Resultados 125reconstituição encontrados nos pacientes com EM. A Figura 25 ilustra alguns exemplos dos padrõesde reconstituição encontrados nos pacientes com EM.A Tabela 9 mostra que o paciente EM1 apresentou três famílias Vβ com padrão dereconstituição IV (Vβ10, Vβ12 e Vβ19, uma família (Vβ1) com padrão de reconstituição III, e umafamília (Vβ8) com padrão de reconstituição IV. O paciente EM3 apresentou uma família (Vβ15) compadrão de reconstituição I e uma família (Vβ19) com padrão de reconstituição IV. Já, o paciente EM4apresentou apenas uma família (Vβ19) com padrão de reconstituição I, todas as outras apresentarampadrão de reconstituição II (Tabela 9, Figura 25 e Apêndices N, O e P).O paciente EM5 apresentou duas famílias (Vβ10 e Vβ15) com padrão de reconstituição I, seisfamílias Vβ com padrão de reconstituição IV (Vβ7, Vβ12, Vβ13, Vβ19, Vβ23 e Vβ24). A paciente EM6apresentou duas famílias (Vβ19 e Vβ24) com padrão de reconstituição III, e três famílias Vβ compadrão de reconstituição IV (Vβ1, Vβ14 e Vβ20). Já, a paciente EM8 apresentou uma família (Vβ14)com padrão de reconstituição I, duas famílias Vβ com padrão de reconstituição III (Vβ11 e Vβ24) etrês famílias Vβ com padrão de reconstituição IV (Vβ12, Vβ15 e Vβ19) (Tabela 9, Figura 25 eApêndices Q, R e S).Em nossas análises, o paciente EM9 apresentou uma família (Vβ24) com padrão dereconstituição I e duas famílias (Vβ19 e Vβ20) com padrão de reconstituição III. Já, o paciente EM10apresentou uma família (Vβ11) com padrão de reconstituição I, uma família (Vβ24) com padrão dereconstituição II e duas famílias Vβ com padrão de reconstituição IV (Vβ7 e Vβ20) (Tabela 9, Figura25 e Apêndices T e U).O método de TCRBV CDR3 spectratyping permite também estimarmos a freqüência de cadafamília Vβ num determinado repertório analisado. No Apêndice X, as Figuras X.1 a X.4, mostram afreqüência total (em %), antes e seqüencialmente após o transplante, das 24 famílias Vβ do TCR paracada paciente com EM individualmente. Nos Apêndice N-U, as tabelas mostram a freqüência total decada família Vβ no repertório, bem como a freqüência de cada segmento de CDR3 dentro de cadafamília Vβ específica, para cada paciente com EM individualmente.Nos pacientes com EM, também observamos mudanças dinâmicas na composição dorepertório da cadeia Vβ dos TCRs após o TACTH, evidenciadas por alterações qualitativas equantitativas dos picos de CDR3 das famílias Vβ. Em vários casos, picos de CDR3 em determinada

Resultados 126família Vβ que eram dominantes antes do transplante tornaram-se subdominantes após o mesmo,sendo excedidos por outros picos de CDR3 que estavam sub-representados antes do TACTH. Emoutros casos, segmentos de CDR3 em determinada família Vβ que eram dominantes antes dotransplante foram excedidos após o TACTH por outros segmentos de CDR3 que não tinham sidodetectados antes do transplante. A Figura 26 mostra alguns exemplos de mudanças na composiçãodo repertório da de algumas famílias Vβ do TCR após o TACTH nos pacientes com EM.Diversas famílias Vβ apresentaram freqüências diferentes após o transplante, aumentadas oudiminuídas em relação ao período pré-transplante, indicando uma mudança quantitativa nacomposição do repertório de células T após o transplante (Apêndice X, Figuras X.1 a X.4). Ademais,mesmo quando uma família Vβ manteve freqüência total semelhante após o transplante, em algunscasos foi observada uma mudança qualitativa e quantitativa nos segmentos da região CDR3 dessafamília (Figura 26: Paciente EM3-Vβ7, Apêndice O; Paciente EM9-Vβ17, Apêndice T). Essesresultados indicam que o TACTH induz mudanças profundas, qualitativas e quantitativas, nacomposição do repertório de células T dos pacientes com EM transplantados.A seguir, relatamos a ocorrência de expansões relevantes de células T usando a mesmafamília Vβ, compartilhadas por diferentes pacientes com EM transplantados ou não. Para tal, afreqüência de cada família Vβ do repertório do TCR de cada paciente foi analisada individualmente.Destacamos as expansões Vβ relevantes com freqüência ≥6%, independentemente de seu perfil porTCRBV spectratyping, ter sido policlonal oligoclonal ou monoclonal.A Tabela 10 mostra as famílias Vβ com maiores freqüências nos pacientes com EM(freqüências ≥6%). A família Vβ22 mostrou-se em expansão relevante antes do transplante em todosos pacientes com EM analisados, em pelo menos um período analisado nesse estudo. Enquanto queas famílias Vβ3, Vβ5, e Vβ6 apresentaram-se em expansão, no período pré-transplante, em 7 entreoito pacientes com EM transplantados. E as famílias Vβ13, Vβ17, Vβ21 e Vβ23 apresentaramfreqüência ≥6% em 6/8 pacientes estudados. Já, as famílias Vβ2 e Vβ22 mostraram-se em expansãorelevante antes do transplante em 5/8 pacientes com EM analisados, em pelo menos um períodoanalisado nesse estudo.

Resultados 127PACIENTE- VBEM4 - VB19Pré-Tx D+180 D+360 D+720NEGEM5 - VB15Padrão IEM5 - VB10EM9 - VB24EM3 - VB14EM4 - VB12Padrão IIEM9 - VB5EM6 - VB19Padrão IIIEM9 - VB19EM6 - VB1EM5 - VB13Padrão IVFigura 25. Padrões de reconstituição do repertório da cadeia Vβ do TCR pós-TACTH nos pacientes comesclerose múltipla. O RNA total foi extraído das células mononuclerares do sangue periférico, transcrito em cDNA,amplificado usando primers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelométodo de TCRBV CDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao númerode transcritos para a família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares debases (eixo X). Os picos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos deaminoácidos. EM, esclerose múltipla. NEG, negativo ou ausência de expressão da família. Espaços em branco correspondema períodos pós-transplante em que o repertório não foi analisado no paciente.

Resultados 128Vale ressaltar que, em todas as famílias Vβ com expansões relevantes, os picos de CDR3 demaior freqüência apresentaram diferentes tamanhos variando entre 5 -13 resíduos de aa (ApêndicesN-U). Alguns segmentos de CDR3 de maior freqüência variaram também de acordo com o período dotransplante. O pico de CDR3 de maior freqüência nas famílias Vβ5, Vβ6 e Vβ22 foi o de 10 resíduosde aa.Como podemos verificar na Tabela 10, o paciente EM1 apresentou 10 dentre as 24 famílias Vβcom expansões relevantes pré ou pelo menos em um período pós-tx. Cinco famílias apresentaramexpansão ≥6% um ano pós-tx (famílias Vβ2, Vβ3, Vβ17, Vβ21 e Vβ23), dentre as quais duasmantiveram freqüências ≥6% também nos outros períodos pós-tx analisados. Vale ressaltar a famíliaVβ23 que apresentou freqüência de 8,66% no D+360 pós-tx, e continuou em expansão após otransplante com freqüência de 7,12% no D+720 e 6,29% no D+1080 (Tabela 10 e Apêndice X -Figura X.1A).A Tabela 10 mostra que o paciente EM3 apresentou 10 famílias com expansões relevantes, 6famílias antes do transplante (famílias Vβ6, Vβ9, Vβ16, Vβ17, Vβ21 e Vβ22), 4 um ano após e 7 doisanos após o TACTH. Vale notar a família Vβ6 que apresentou freqüência de 6,09% antes dotransplante, e reapareceu com freqüência de 8% um ano após e de 7,46% dois anos pós-tx(Apêndice X - Figura X.1B).Encontramos 6 famílias com expansões expressivas antes do transplante no paciente EM4(famílias Vβ4, Vβ5, Vβ9, Vβ13, Vβ22 e Vβ23). A família Vβ22 que apresentou freqüência de 6,40%antes do transplante, mas teve sua freqüência aumentada para 7,80% no D+360 e para 8,45% noD+720. Interessantemente, na família Vβ23, que manteve a freqüência >6% após o transplante, ospicos de CDR3 de maior freqüência mudaram de três picos predominantes (6/9/10aa), para um picode CDR3 de 10aa no D+720 pós-tx (Tabela 10 e Apêndice X - Figura X.2A)O paciente EM5 apresentou 6 famílias, com expansões relevantes pré ou pelo menos em umperíodo pós-tx, entre as 24 famílias Vβ estudadas. Três famílias com expansões relevantes (famíliasVβ6, Vβ16 e Vβ22) no período pré-tx e quatro um ano após o transplante (famílias Vβ5, Vβ17, Vβ21 eVβ22) foram observadas (Tabela 8 e Apêndice X - Figura X.2B).

Resultados 129PACIENTE - VB Pré-Tx D+360 D+720EM3- VB5EM3- VB7EM4- VB1EM4- VB14EM4- VB16EM5- VB15Pré-Tx D+180 D+360EM6- VB5EM9- VB5EM9- VB6EM9- VB17EM9- VB21Figura 26. Mudanças na composição do repertório da cadeia Vβ do TCR após TACTH nos pacientes comesclerose múltipla. O repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBV CDR3 spectratyping.Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número de transcritos para a família Vβ, emunidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases (eixo X). Os picos destacadosem azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos. EM, paciente com esclerosemúltipla. Espaço em branco corresponde a um período pós-transplante em que o repertório não foi analisado no paciente.

Resultados 130Já, a paciente EM6 apresentou, antes do transplante, 4 famílias com expansões ≥6% (famíliasVβ3, Vβ5, Vβ6 e Vβ22), ressaltando a freqüência de 8,37% da família Vβ6 (Tabela 10 e Apêndice X -Figura X.3A). Os segmentos de CDR3 de maior freqüência na família Vβ22 foram os de 9 resíduosde aminoácidos no período pré-tx e de 8aa pós-tx (Apêndice R).A paciente EM8 apresentou, antes do transplante, 5 famílias com expansões ≥6% (famíliasVβ2, Vβ5, Vβ6, Vβ21 e Vβ23), vale ressaltar a freqüência de 8,87% da família Vβ21 nesse período.Seis famílias apresentaram expansões relevantes no D+180 pós-tx (Tabela 10 e Apêndice X -Figura X.3B). Embora as famílias Vβ5 e Vβ6 tenham reaparecido em expansão no D+180, ossegmentos de CDR3 de maior freqüência mudaram após o transplante, de 10 para 9aa na famíliaVβ5, e de 10 para 8aa na família Vβ6. O pico de CDR3 mais expressivo da família Vβ21, que tambémreapareceu com freqüência relevante após o transplante nessa paciente, foi o de 11 resíduos deaminoácidos (Apêndice S).A Tabela 10 mostra que o paciente EM9 apresentou 10 famílias com expansões relevantes, 5famílias antes do transplante (famílias Vβ2, Vβ3, Vβ5, Vβ16 e Vβ22), 5 seis meses após e seis umano após o TACTH. Podemos ressaltar no paciente EM9, a família Vβ22 que mostrou freqüência de7,24% pré-tx, e as famílias Vβ22 e Vβ23 que apresentaram freqüências de 11,06% e de 8,63%D+180 após o transplante (Apêndice X - Figura X.4A). Duas famílias, Vβ16 e Vβ22, apresentaramfreqüências relevantes em todos os períodos analisados. O pico de CDR3 mais expressivo da famíliaVβ22 nesse paciente foi o de 7 resíduos de aminoácidos (Apêndice T).A paciente EM10 apresentou, antes do transplante, 6 famílias com expansões ≥6% (famíliasVβ2, Vβ5, Vβ6, Vβ21 e Vβ23), vale ressaltar a freqüência de 9,84% da família Vβ5 e de 10,11% dafamília Vβ6 nesse período. Sete famílias apresentaram expansões relevantes nove meses pós-tx(Tabela 10 e Apêndice X - Figura X.4B). Interessantemente, embora as famílias Vβ5 e Vβ17 tenhamreaparecido em expansão no D+270, os segmentos de CDR3 de maior freqüência mudaram após otransplante, de 10 para 7aa na família Vβ5, e de 13 para 6aa na família Vβ17. Na família Vβ13, quetambém reapareceu com freqüência relevante após o transplante nesse paciente, o pico de CDR3mais expressivo foi o de 10 resíduos de aminoácidos (Apêndice U).

Resultados 131Tabela 10. Freqüência das famílias Vβs do TCR com expansões relevantes em linfócitos T do sangueperiférico dos pacientes com esclerose múltipla, pré e seqüencialmente após o TACTH.PCFAMÍLIAPERÍODOPRÉ D+360 D+720 D+1080PCFAMÍLIAPERÍODOPRÉ D+180 D+270 D+360EM1 VB2 6,47 5,28 3,74 EM6 VB3 6,27 5,05 5,03VB3 6,27 5,20 5,89 VB5 6,36 4,24 5,87VB6 5,99 7,09 7,70 VB6 8,37 5,05 4,26VB13 3,45 4,83 6,35 VB13 5,79 6,02 4,10VB15 4,04 6,31 5,93 VB18 4,26 4,21 6,31VB16 4,08 5,52 7,00 VB22 6,01 7,16 8,04VB17 6,70 6,18 6,70 VB23 5,95 6,49 7,20VB21 6,52 5,12 2,63VB22 5,87 7,18 4,53VB23 8,66 7,12 6,29EM3 VB2 4,45 6,10 4,00 EM8 VB2 7,92 4,39VB3 2,46 7,01 6,05 VB3 3,62 6,94VB5 3,02 6,47 6,26 VB5 6,90 6,61VB6 6,09 8,00 7,46 VB6 7,83 6,90VB9 6,17 4,50 6,28 VB13 4,38 6,91VB16 6,78 4,87 6,02 VB16 4,21 8,34VB17 6,10 5,09 4,76 VB21 8,87 6,07VB21 6,08 5,34 4,93 VB22 5,78 6,05VB22 7,35 5,78 7,15 VB23 6,93 5,78VB23 5,43 4,89 6,58EM4 VB3 5,43 6,93 5,54 EM9 VB2 6,44 3,91 4,83VB4 6,66 4,90 5,42 VB3 6,88 5,19 4,57VB5 6,86 3,91 6,77 VB5 7,24 2,36 5,32VB9 6,12 4,13 5,41 VB6 5,02 5,23 7,43VB13 6,63 4,86 2,83 VB13 3,72 4,87 7,51VB17 5,92 7,83 5,42 VB16 6,03 7,70 7,07VB21 5,48 6,63 4,94 VB17 5,57 6,36 5,77VB22 6,40 7,80 8,45 VB21 4,72 7,37 6,33VB23 6,19 6,39 6,14 VB22 6,14 11,06 8,28VB23 5,53 8,63 6,03EM5 VB5 5,69 6,85 EM10 VB2 6,83 6,87VB6 7,26 4,96 VB3 7,97 5,10VB16 6,26 5,58 VB5 9,84 6,67VB17 4,93 6,76 VB6 10,11 4,59VB21 5,13 6,36 VB12 3,77 6,87VB22 6,62 7,34 VB13 6,54 6,36VB15 4,54 6,34VB17 6,55 6,23VB22 4,02 7,61As freqüências das famílias Vβ estão expressas em %, em relação às 24 famílias analisadas. Os números em negritocorrespondem às famílias com expansões de freqüência ≥6%. Pc, paciente.

Resultados 1324.5 Análise da expressão do gene Foxp3 em células mononuclearesCom o objetivo de investigar os mecanismos imunológicos envolvidos na remissão dasdoenças auto-imunes esclerose múltipla e diabete melito do tipo 1 após a terapia deimunossupressão em altas doses seguida do TACTH e verificar se existe a participação de células Treguladoras nesse processo, nós avaliamos a modulação da expressão do gene Foxp3 após otransplante. Embora não existam marcadores de superfície celular que sejam especificamenteexpressos em células T reguladoras CD4 + CD25 high , a expressão do gene Foxp3 (forkheadtranscription factor 3) pode ser usada como um marcador molecular específico para células Treguladoras, distinguindo-as das células T CD4 + CD25 + recém-ativadas não-reguladoras (Kronenberge Rudensky, 2005).A expressão do RNAm de Foxp3 foi quantificada por real time RT-PCR nas célulasmononucleares dos pacientes antes e em vários períodos após o transplante autólogo. Anormalização e quantificação relativa da expressão gênica foram realizadas pelo método de 2 -ΔΔC T(Livak et al., 2001), conforme descrito em Material e Métodos. Usando o método de 2 -ΔΔC T, os dadossão representados como diferença (em vezes) na expressão gênica, que foi normalizada para umgene endógeno de referência e é relativa a um controle ou calibrador. Em nossos experimentos, nósutilizamos o gene GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) como gene endógeno paraa normalização, e o calibrador usado foi o valor pré-transplante (ou valor basal da doença). Para ocalibrador, o ΔΔC T é igual a zero e 2 0 é igual a um, assim a mudança na expressão gênica relativa aoperíodo pré-transplante é igual a um. Para os períodos pós-transplante, o valor de 2 -ΔΔC T indica adiferença (diminuição ou aumento, em vezes) na expressão gênica, relativa ao período prétransplante.4.5.1 Pacientes com diabete melito do tipo 1Realizamos a quantificação da expressão gênica de Foxp3 em células mononucleares dequatro pacientes com DM (Figura 27). Nós mostramos que, entre os quatro pacientes estudados, trêsapresentaram um aumento na expressão do RNAm de Foxp3 em pelo menos um período póstransplante.No entanto, o paciente DM1 mostrou uma modulação negativa do gene Foxp3 até umano pós-tx. É interessante destacar que o paciente DM1 é o paciente que não respondeu ao TACTHe continua usando altas doses de insulina exógena.

Resultados 133Na Figura 27, podemos observar que o paciente DM2 apresentou uma diminuição dos níveisde RNAm de Foxp3 nos dia +100, +180 e +270 após o transplante, mas um ano pós-tx foi umobservado um aumento de 2x em relação ao pré-tx. O paciente DM3, a expressão de RNAm deFoxp3 nas células mononucleares diminuiu no D+100 após o transplante, mas apresentou umaumento de 0,7X no D+270 e de 0,5X um ano pós-tx.O paciente DM4 apresentou uma modulação positiva da expressão do gene Foxp3 em váriosperíodos analisados após o transplante. Observou-se um aumento de 0,1X na expressão de Foxp3no D+100 pós-tx, porém no D+180 a expressão do gene Foxp3 foi igual à pré-tx. Já, nove meses eum ano após o transplante, houve um aumento nos níveis de RNAm de Foxp3 de 1X e 1,3X,respectivamente (Figura 27).3.53.0Expressão relativaFoxp3/GAPDH2.52.01.51.00.50.0D+100D+180D+270D+360D+100D+180D+270D+360D+100D+270D+360D+100D+180D+270D+360DM1 DM2 DM3 DM4Figura 27. Expressão gênica de Foxp3 em células mononucleares dosangue periférico de pacientes com diabete melito do tipo após o TACTH.RNA foi extraído de células mononucleares isoladas do sangue periférico dospacientes com diabete melito do tipo 1 antes e após o TACTH. Os níveis deFoxp3 foram quantificados usando real time RT-PCR, normalizados para ogene GAPDH, e são relativos à expressão de RNAm do Foxp3 obtida prétransplante.4.5.2 Pacientes com esclerose múltiplaA expressão gênica de Foxp3 em células mononucleares foi avaliada em cinco pacientes comesclerose múltipla (Figura 28). Para o paciente EM3, nos dias +360 e +540 pós-TACTH foi observadauma diminuição da expressão de Foxp3. No entanto, no período de dois anos após o transplantepodemos observar um aumento de 0,7X na expressão de Foxp3.

Resultados 134Expressão relativaFoxp3/GAPDH17161514131211109876543210D+360D+540D+720D+100D+180D+270D+540D+720D+100D+360D+180D+270D+360D+100D+180D+270D+360EM3 EM4 EM5 EM6 EM9Figura 28. Expressão gênica de Foxp3 em células mononucleares do sangueperiférico de pacientes com esclerose múltipla após o TACTH. RNA foi extraído decélulas mononucleares isoladas do sangue periférico dos pacientes com diabete melito dotipo 1 antes e após o TACTH. Os níveis de Foxp3 foram quantificados usando real timeRT-PCR, normalizados para o gene GAPDH, e são relativos à expressão de RNAm doFoxp3 obtida pré-transplante.O paciente EM4 apresentou um aumento da expressão do gene Foxp3 em vários períodosanalisados após o transplante, exceto no dia D+100. O aumento dos níveis de RNAm de Foxp3 foi de1,4X no D+180, 1,7X no D+270 , 0,6X no D+540 e de 2,4X dois anos após o TACTH (Figura 28).O nível de expressão de Foxp3 nas células mononucleares do paciente EM5 mostrou-seaumentado em 0,5X do D+100 e em 0,2 X no D+360 pós-tx. Já a paciente EM6 apresentou umadiminuição dos níveis de RNAm de Foxp3 nos dias +180 e +270 após o TACTH. Um ano após otransplante, essa paciente (EM6) apresentou um nível de expressão gênica similar ao nível pré-tx.Na Figura 28, podemos observar que o paciente EM9 apresentou uma modulação positiva daexpressão do gene Foxp3 em todos os períodos após o transplante avaliados. Esse pacienteapresentou aumento na expressão do gene Foxp3 consideravelmente maior do que os outrospacientes avaliados. Foi observado um aumento de 2X no D+100 e de 9,1X no D+180. No D+270pós-TACTH, o aumento nos níveis de RNAm de Foxp3 em relação ao período pré-transplante foi de5,8X. Um ano após o transplante, o aumento na expressão de Foxp3 foi de 15,8X nesse paciente.Vale destacar que esse paciente (EM9) apresentou uma ótima resposta clínica ao TACTH.

5 Discussão

Discussão 1365.1 Avaliação da reconstituição imunológica após o TACTHA imunossupressão em altas doses associada ao transplante autólogo de células troncohematopoéticas foram propostos nos últimos dez anos como uma terapia experimental para pacientescom formas graves de doenças inflamatórias com etiologia auto-imune, incluindo esclerose múltipla,lúpus eritematoso sistêmico, esclerose sistêmica, artrite reumatóide, artrite idiopática juvenil e doençade Crohn. O racional principal para aplicação do TACTH em DAIs foi a idéia de que a imunodepleçãointensa poderia eliminar o repertório de células T auto-reativas patogênicas, e que a reconstituição deum novo sistema imune a partir dos precursores hematopoéticos poderia restabelecer a tolerânciaimunológica, interrompendo a atividade inflamatória e prevenindo recaídas da doença. No entanto,até recentemente, essa idéia da “reprogramação” do sistema imune pelo TACTH baseou-selargamente em especulação.Vários dos mecanismos potenciais propostos para a restauração da tolerância após o TACTHforam em parte baseados na extrapolação de modelos experimentais (Van Bekkum et al., 2003).Além disso, vale ressaltar os estudos experimentais em fetos apóiam a hipótese de que a exposiçãodo sistema imune a novos antígenos, num período em que o sistema imune está formando seurepertório, possa levar à tolerância imunológica (Touraine et al., 2005). Esses estudos serviram comobase para a idéia da “regeneração” do sistema imune pelo TACTH.Apesar do rápido acúmulo de experiência clínica durante esses dez anos, dados sobre omecanismo de ação do TACTH em doenças auto-imunes humanas eram muito escassos até o anode 2004, quando os primeiros estudos mais elaborados de reconstituição imunológica começaram aaparecer na literatura (Sun et al., 2004; Muraro et al., 2005; Farge et al., 2005; Kleer et al., 2005;Kötter et al., 2005). Esses trabalhos atuais apresentam informações que começam a explicar osmecanismos do TACTH baseando-se em observações da reconstituição imunológica nos pacientes.Nesse contexto, nosso trabalho vem acrescentar dados importantes da reconstituição imunológica empacientes com esclerose múltipla, e é o primeiro trabalho a estudar a reconstituição imunológica emecanismos de ação do TACTH em pacientes com diabete melito do tipo 1 recém-diagnosticados.Em geral, os resultados de reconstituição imunológica após o TACTH em DAIs são similaresaos obtidos em doenças onco-hematológicas (revisado por Guillaume et al., 1998; Toubert e Charron,2001; Porrata e Markovic, 2004; Thiel et al., 2004; Isaacs, 2004; Peggs, 2004; Auletta e Lazarus,2005). No entanto, uma diferença importante é que as DAIs são freqüentemente associadas a

Discussão 137anormalidades pré-transplante, tais como alterações de citocinas e restrição do repertório do TCR.Mesmo com os avanços recentes nessa área, ainda existem várias dúvidas sobre os mecanismos dereconstituição imunológica após o TACTH em pacientes com DAIs. Por exemplo, ainda não foitestado se diferentes regimes de condicionamento resultariam em padrões de reconstituiçãoimunológica similares nos pacientes, e qual seria o melhor tipo de condicionamento para DAIs(mieloablativo ou linfoablativo). Também não está claro se a reconstituição imunológica após oTACTH varia consideravelmente de acordo com alguns fatores, como o tipo de DAI, a purificação ounão das células tronco CD34 + e o uso de imunossupressão após o transplante. Além disso, ainda nãoestá esclarecido se o reaparecimento de células T naive poderia levar a recaída da doença a longoprazo.Conforme sugerido por Muraro e Douek (2006), embora os eventos de reconstituiçãoimunológica possam afetar diferencialmente células que reconhecem antígenos próprios ou nãopróprios,não existe razão para sugerir que o TACTH tenha efeitos seletivos sobre células Tespecíficas para diferentes auto-antígenos, associados a DAIs distintas. Assim, vários conceitossobre o TACTH em DAIs, adquiridos principalmente nos últimos dois anos, podem ser aplicados atodas as DAIs. Entretanto, deve ser considerado que a heterogeneidade clínica e imunopatológicaentre as DAIs e dentro delas, possa introduzir diferenças variáveis entre os efeitos do TACTH nosistema imune, na reconstituição imunológica e nos resultados clínicos.Efeitos da imunodepleção intensa e implicações para a eficácia do TACTHO objetivo da imunossupressão em altas doses é a linfoablação e conseqüente eliminação dascélulas auto-reativas patogênicas. Nesse contexto, as células tronco hematopoéticas autólogas sãoinfundidas como um suporte hematopoético para encurtar a duração do período de citopenia póstransplantee diminuir os risco de infecções. No entanto, a proporção do repertório de células T quedeve ser eliminada para a eficácia clínica do TACTH ainda é desconhecida. Sabe-se, pelaexperiência acumulada no tratamento de DAIs, que doses baixas e moderadas de imunossupressãoconseguem alcançar remissão clínica temporária durante o período do tratamento, na melhor dashipóteses. Em geral, a atividade da doença retorna dentro de semanas a meses após adescontinuidade do tratamento (revisado por Tyndall et al., 2005). Por outro lado, vários trabalhos têmmostrado que a imunodepleção intensa, resultante de condicionamentos mielo e/ou linfoblativos com

Discussão 138altas doses de imunossupressão, e seguida pelo resgate com células tronco hematopoéticas,freqüentemente resulta em remissão da DAI durante o período inteiro de seguimento pós-transplanteobservado. Vale ressaltar que alguns desses trabalhos já apresentam seguimento de vários anos(revisado por Tyndall et al., 2005).No entanto, resultados de TACTH em EM mostraram que, mesmo com um condicionamento dealta intensidade (ciclofosfamida seguida de irradiação corpórea total e ATG), e purificação das célulastronco CD34 + , o repertório de células T não foi completamente substituído por novas especificidades(Muraro et al., 2005). Não obstante, nesse trabalho a persistência de clones pré-existentes antes dotransplante não foi associada com a persistência da atividade inflamatória da doença, sugerindo quea eficácia do TACTH pode não necessitar de uma imunoablação completa nos pacientes e quedevam existir outros mecanismos concomitantes que levam à remissão da DAI após o TACTH.Independentemente da persistência de alguns clones no sistema imune reconstituído após oTACTH, não existe dúvidas de que a imunossupressão em altas doses elimina em grande parte orepertório imune pré-existente no paciente (Muraro et al., 2005). Em nossos pacientes, umaimunoablação intensa foi atingida em todos os pacientes, que pode ser observada pelo número deleucócitos totais no sangue periférico no D+6 pós-transplante. Essa imunoablação maciça resulta,logicamente, numa diminuição marcante também da freqüência de células auto-reativas patogênicas,em proporções bem maiores do que a imunossupressão em baixas doses resultaria. Além disso, aimunossupressão em altas doses leva à uma redução aguda e intensa da população de célulasperiféricas, e isso desencadeia sinais homeostáticos potentes que promovem a reconstituição após otransplante de um sistema imune provavelmente diferente do pré-transplante (Jameson et al., 2002).Nessa mesma vertente, Barthlott et al. (2003) sugeriram que a competição por espaço e fatoresnutricionais pelas células em proliferação homeostática seja responsável pela proteção doscamundongos do desenvolvimento de auto-imunidade. Por outro lado, outros pesquisadoresmostraram que a proliferação homeostática pode levar à auto-imunidade (King et al., 2004; revisadopor Stockinger et al., 2004) e ou bloquear a indução de tolerância a transplante de órgãos (Wu et al.,2004). Entretanto, não está claro até que ponto essas observações feitas em camundongostransgênicos ou geneticamente deficientes aplicam-se a indivíduos imunocompetentes que podemresponder normalmente à linfodepleção aguda.

Discussão 139A imunossupressão em altas doses leva à linfoablação e conseqüentemente a um período delinfopenia que acontece nos pacientes logo após o transplante, que favorece a proliferação de célulasT maduras residuais que sobreviveram ao regime de condicionamento ou foram reinfundidas com ascélulas tronco no momento do transplante, similarmente ao que foi descrito em transplantesalogênicos (Laylor et al., 2005). Uma implicação desse fato é que especificidade e função das célulassobreviventes poderia ser determinante para a eficácia do TACTH. Por exemplo, células Treguladoras, como as células T CD4 + CD25 high , poderiam ser selecionadas e sobreviver ao regime decondicionamento, um mecanismo que foi recentemente mostrado em um modelo murino de GVHDcrônico (Anderson et al., 2004).Por outro lado, a sobrevivência de muitos clones de células T de memória auto-reativas poderialevar à ineficácia do tratamento. Se células T maduras sobrevivem ao regime de condicionamento,evidentemente elas devem ter sido selecionadas, provavelmente com base na quimioresistência, fasedo ciclo celular ou localização no organismo. Num estudo recente, Casorati et al. (2005) mostraramque células T de memória residentes na medula óssea sobreviveram à quimioterapia e contribuírampara a reconstituição imunológica precoce em pacientes com leucemia mielóide aguda. Além daseleção de células pelo regime de condicionamento, a quimioterapia (ciclofosfamida) e o fator decrescimento administrados para a mobilização das células tronco (G-CSF) também podem ter efeitosseletivos importantes sobre as células T que são coletadas e reinfundidas com as células tronco.Reconstituição hematopoética e de células não-T após o TACTHA reconstituição hematopoética (de neutrófilos, plaquetas e monócitos) foi rápida em nossospacientes, como também observada em outros estudos de TACTH em doenças auto-imunes (Burt etal., 1998; Traynor et al., 2000; Verburg et al., 2001; Sun et al., 2004; Farge et al., 2005; Muraro et al.,2005) e em doenças onco-hematológicas (revisado por Guillhaume et al., 1998; Auletta e Lazarus,2005; Peggs, 2004; Thiel, 2004). Uma vez que os regimes de condicionamento usados forammoderadamente intensos (BEAM) ou de baixa intensidade (ciclofosfamida e ATG de coelho), areconstituição hematopoética ocorreria mesmo sem a infusão de células tronco hematopoéticas, noentanto estas células são infundidas como um suporte hematopoético para encurtar o período deneutropenia nos pacientes.

Discussão 140A reconstituição da imunidade inata após transplantes de TCTH é caracteristicamente maisrápida do que a da imunidade adaptativa. A reconstituição numérica de células da imunidade inata,como as células NK e células dendríticas, cuja produção e maturação ocorrem na medula óssea e,portanto são timo-independentes, ocorre rapidamente após TACTH em doenças auto-imunes (Burt etal., 1998; Traynor et al., 2000; Verburg et al., 2001; Sun et al., 2004; Farge et al., 2005; Muraro et al.,2005) e em doenças onco-hematológicas (revisado por Guillhaume et al., 1998; Auletta e Lazarus,2005; Peggs, 2004; Thiel, 2004).As células NK constituem 10% dos linfócitos circulantes e são importantes efetores daimunidade inata devido a sua capacidade de lisar células alvo sem a necessidade de terem sidoestimuladas por antígenos anteriormente. As células NK são constituídas por duas subpopulaçõesprincipais, as células NK CD56 bright CD16 dim , associadas à elevada produção de citocinas, baixacitotoxicidade natural e dependente de anticorpo (ADCC, antibody-dependent cellular cytotoxicity), epela subpopulação CD56 dim CD16 bright , caraterizadas pela baixa produção de citocinas e potentecitotoxicidade natural e ADCC (revisado por Cooper et al., 2001; Auletta e Lazarus, 2005; Peggs,2004). Em geral, de acordo com a literatura, as células NK recuperam concomitantemente número efunção normais dentre 1-2 meses após o TACTH. Assim, nos primeiros meses após o transplanteenquanto a imunidade específica ainda está recuperando, as células NK constituem as principaiscélulas de defesa contra infecções. Especificamente, as células NK CD56 bright CD16 dim constituem asubpopulação predominante nos primeiros meses de reconstituição. A freqüência de células NK entreos linfócitos CD45 + sugere uma expansão dramática de células NK no primeiro mês após o TACTH.No entanto, embora as células NK representem mais de 80% dos linfócitos nesse período, os valoresabsolutos dessas células já são normais um mês após o TACTH (Thiel et al., 2004). Esta observaçãoenfatiza a importância de reportar não somente as porcentagens, mas principalmente os valoresabsolutos em estudos de reconstituição imunológica.Em nossos pacientes, o número absoluto de células NK retornou aos níveis pré-transplante trêsmeses após o TACTH, similarmente aos resultados descritos na literatura para doenças auto-imunes(Burt et al., 1998; Traynor et al., 2000; Verburg et al., 2001; Sun et al., 2004; Farge et al., 2005;Muraro et al., 2005). As células NK aumentaram significantemente no D+60 pós-transplante nospacientes com EM, porém nos pacientes com DM houve um aumento do número de células NK em

Discussão 141relação ao pré-transplante depois dos três primeiros meses pós-TACTH, mas que foi estatisticamentesignificante somente no D+360.Assim como outras células da resposta imune inata, as células dendríticas (DCs) recuperam-seprecocemente após o TCTH, especialmente após transplantes não-mieloablativos (Auffermann-Gretzinger et al., 2002; Mohty et al, 2002). Damiani et al. (2002) mostraram que, após TCTH autólogo,a recuperação das DCs foi três vezes maior quando foram usados medula óssea ou sangue periféricomobilizado não-selecionados, do que quando foram usadas células tronco CD34 +selecionadas.Existem ainda poucos trabalhos na literatura sobre a reconstituição de DCs, principalmente sobre suacapacidade funcional, após o TCTH. Mas, alguns estudos sugerem um papel crucial da reconstituiçãode DCs na sobrevivência do paciente após o transplante (Damiani et al., 2003; Reddy et al., 2004).As DCs representam uma população rara de células apresentadoras de antígenos, importantepara a iniciação e regulação de respostas imunes dependentes de células T, e precursores das DCsconstituem menos de 1% das células mononucleares (Banchereau et al., 1998). Duas subpopulaçõesdistintas de DCs foram descritas em humanos. As DCs mielóides (ou DC1) expressam os antígenosmielóides CD11c, CD13 e CD133, originam-se de precursores da medula mielóides e necessitam dapresença de GM-CFS para sobrevivência. No sangue periférico humano, as DC1 são identificadascomo negativas para marcadores de linhagens linfóide e mielóide (Lin - ) e HLA-DR + /CD11c + . As DC1produzem altos níveis de IL-12 quando estimuladas com TNF-α ou CD40L e direcionam adiferenciação de células T em células T H 1. As DCs linfóides (DC2) foram descritas no sangueperiférico e tecidos linfóides como células plasmocitóides Lin - /HLA-DR + /CD11c - /CD4 + /CD123 + (IL-3Rα). As DC2 não têm marcadores mielóides e dependem de IL-3, e não de GM-CSF, parasobrevivência e diferenciação. Elas foram designadas DC2 porque, após ativação apropriada,induzem a diferenciação de células T em células T H 2 (revisado por Shortman e Liu, 2002).Interessantemente, foi descrito que o G-CSF, usado para a mobilização das células tronco parao sangue periférico e para encurtar o período de neutropenia pós-transplante, mobilizapreferencialmente células dendríticas linfóides DC2 para o sangue periférico (Arpinati et al., 2000;Pulendran et al., 2000; Klangsinsirikul et al., 2002) e promove a diferenciação de células T H 2 queproduzem IL-4 e IL-10 (Sloand et al., 2000). Arpinati et al. (2000) mostraram que o tratamento comG-CSF em humanos induz um aumento de mais de cinco vezes no número de DC2 no sangueperiférico.

Discussão 142Vale ressaltar que em humanos, enxertos de células tronco mobilizadas com G-CSFapresentam uma melhor enxertia e não causam uma maior incidência de GVHD agudo do queenxertos de medula óssea, apesar da quantidade de células T presentes ser pelo menos 10 vezesmaior que no enxerto de medula óssea (Bensinger et al., 1996). Em camundongos, células T do baçoou do sangue periférico de camundongos pré-tratados com G-CSF mostraram capacidade diminuídade induzir GVHD em recipientes alogênicos, provavelmente por causa da polarização em células depadrão T H 2 (Pan et al., 1005). Por outro lado, recentemente foi descrito outro mecanismo pelo qual oG-CSF exerce seu efeito imunossupressor. O G-CFS induz a geração de granulócitos de baixadensidade in vivo que co-purificam com as PBMCs e são capazes de inibir a produção de INF-γ porcélulas T, através da produção de H 2 O 2 (Schmielau e Finn, 2001; Vasconcelos et al., 2003).Recentemente, Vasconcelos et al. (2006) mostraram que esses granulócitos de baixa densidade,induzidos pelo G-CSF, são capazes de inibir GVHD agudo em transplantes alogênicos.Além disso, foi descrito que o G-CSF aumenta a expressão de marcadores de ativação nascélulas mobilizadas (Tayebi et al., 2001a; Tayebi et al., 2001b). Uma vez ativados, monócitospresentes no enxerto são capazes de suprimir a proliferação de células T, via produção de IL-10(Mielcarek et al., 1998). Por outro lado, Franzke et al. (2003) mostraram que o G-CSF atua como umregulador imune em células T que expressam o receptor do G-CSF. Após ligação do G-CSF, oreceptor regula positivamente vários genes imunomoduladores que são provavelmente responsáveispela redução da reatividade e/ou aloreatividade das células T (entre eles o fator de transcrição derespostas imunes T H 2, GATA-3). Embora a maioria dos estudos demonstre o papel do G-CSF naindução de respostas T H 2, outros trabalhos demonstram a inibição da proliferação de células T e daprodução de citocinas pelo G-CSF na ausência de respostas do tipo T H 2 (Schmielau e Finn, 2001;Vasconcelos et al., 2003; Jun et al., 2004, Vasconcelos et al., 2006).Com base nos efeitos do G-CSF descritos na literatura, esperávamos um aumento de DC2 emnossos pacientes pelo menos no período de pré-condicionamento e logo após o transplante. Noentanto, o número de células dendríticas linfóides (Lin - CD11c - HLADR + ) diminuiu, embora nãosignificantemente, nos períodos de pré-condicionamento e após o transplante, nos pacientes com DMe EM. Já, o número de DC1 nos pacientes com DM recuperou valores maiores que o pré-transplantenove meses após o TACTH, porém nos pacientes com EM o número dessas células encontrou-seaumentado (não significantemente) entre dois meses a um ano pós-transplante. Esse aumento de

Discussão 143DC1 pode ser associado ao predomínio de células T H 1 e T c 1 observado pós-transplante, que serádiscutido adiante.No período de pré-condicionamento e logo após o transplante, observamos um aumento deDC2 em alguns poucos pacientes individuais (dados não mostrados), provavelmente devido ao efeitodo G-CFS, porém esse aumento não foi significativo quando o grupo de pacientes foi analisado. Umaexplicação seria a diferença no período de coleta do sangue periférico dos pacientes, que nosestudos descritos na literatura (Arpinati et al., 2000; Pulendran et al., 2000; Klangsinsirikul et al.,2002) foram usadas alíquotas das aféreses realizadas logo após o tratamento com G-CSF por 5 dias.No entanto, em nosso trabalho, a coleta pós-mobilização (ou pré-condicionamento) variou muito edependia de quando os pacientes eram internados para o condicionamento e transplante. Essetempo variou de 2-3 semanas (principalmente nos pacientes com DM) a 2-5 meses (principalmentenos pacientes com EM).Outra subpopulação de células estudadas em nosso trabalho foram as células NKT, umasubpopulação de células T que expressa alguns receptores encontrados nas células NK. Assim comoas células T reguladoras CD4 + CD25 + , as células NKT constituem uma sublinhagem de células T autoreativasgeradas pelo timo, que tem um importante papel fisiológico de imunoregulação. Aespecificidade das células NKT é direcionada a alguns poucos antígenos e, ao contrário das células Treguladoras CD4 + CD25 + , seus papéis na auto-imunidade incluem tanto proteção da patogênese comoexacerbação da doença auto-imune (revisado por Kronenberg e Rudensky, 2005). Em camundongos,a maioria das células NKT são células CD4 +ou duplo-negativas (CD4 - CD8 - ) que reconhecemglicolipídeos no contexto das moléculas MHC de classe I-não clássicas CD1d. Elas apresentam umTCR com uma região CDR3 invariante: rearranjo Vα14-Jα18 pareado com as cadeias Vβ8, Vβ7 ouVβ2 em camundongos, e o rearranjo Vα24-Jα18 pareado com a cadeia Vβ11 em humanos. Ascélulas NKT com TCR invariante são comumente referidas como NKT Vα24 invariantes (NKT Vα24i)ou células iNKT, para distingui-las das outras células T que expressam receptores NK. Grande partedos estudos experimentais que indicam um papel importante das células NKT na auto-imunidadereferem-se às células iNKT (revisado por Godfrey et al., 2005).Em nosso trabalho, definimos como células NTK a população de células que apresentamarcadores de células NK (CD16 e CD56) e de células T (CD3). Existem pouquíssimos trabalhos naliteratura sobre a reconstituição de células NKT após TCTH. Num trabalho recente, Muraro et al.

Discussão 144(2005) mostraram que seis meses após TCTH autólogo, as células NKT (CD3 + CD56 + ) voltaram aosníveis observados pré-terapia. Em nossos pacientes com DM, as células NKT CD3 + CD16 + CD56 +diminuíram após o TACTH, mas mostraram um aumento não estatisticamente significante depois deseis meses, que persistiu até um ano pós-transplante. Por outro lado, nos pacientes com EM, onúmero de células NKT CD3 + CD16 + CD56 + aumentou logo após o TACTH no D+60 (sem significânciaestatística), mas diminuíram em seguida e persistiram em números menores em relação ao prétransplante,durante o resto do seguimento. Haraguchi et al. (2004) avaliaram a reconstituição decélulas NKT Vα24 + Vβ11 + após TCTH alogênico e sua correlação com GVHD. Eles mostraram que ascélulas NKT foram reconstituídas dentro de um mês após o transplante, mas permaneceram emnúmero diminuído por mais de um ano nos pacientes. Além disso, interessantemente, o número decélulas NKT Vα24 + Vβ11 + encontrado nos receptores que desenvolveram GVHD agudo foi menor doque o encontrado nos pacientes sem GVHD após o transplante, indicando a importância dareconstituição dessas células após o TCTH para a regulação de reações alo-imunes.Em geral, após o TACTH, a reconstituição numérica, mas não funcional, de linfócitos B ocorrerapidamente, precede a recuperação de células T e recapitula a ontogenia normal de células B. Oslinfócitos B, assim como os linfócitos T, podem regenerar-se de várias fontes após o TACTH: decélulas B que sobreviveram à quimioterapia, localizadas na medula, linfonodos ou baço; de células Bre-infundidas com o enxerto de células tronco; de células tronco autólogas re-infundidas notransplante; ou de células tronco autólogas residuais. Embora o números de linfócitos B comece anormalizar, em geral, a partir de três meses pós-TACTH, a função das células B pode levar até maisde dois anos para normalizar completamente (revisado por Guillaume et al., 1998; Auletta e Lazarus,2005).Deficiências na resposta humoral de pacientes após o TACTH são atribuídas à falta oudiminuição do estímulo por células T CD4 + helper, uma vez que o número de células T CD4 + diminuidrasticamente no primeiro pós-transplante, como discutiremos a seguir. Os níveis séricos deimunoglobulinas permanecem baixos durante os três primeiros meses após o transplante, durante omesmo período no qual o número de células B circulantes está reduzido. Nesse período, a respostaproliferativa de células B a antígenos independentes de células T é ausente. Enquanto a produção deIgM pela estimulação com mitógenos e a antígenos independentes de células T normaliza três meses

Discussão 145pós-transplante, a produção de IgG é suprimida por 12 a 24 meses na maioria dos pacientes(revisado por Guillaume et al., 1998; Auletta e Lazarus, 2005).Em nosso estudo, o número de linfócitos B CD19 + retornou aos níveis basais três meses póstransplantenos pacientes com DM e seis meses pós-transplante nos pacientes com EM. Nossosresultados corroboram outros descritos na literatura para doenças auto-imunes (Burt et al., 1998;Traynor et al., 2000; Verburg et al., 2001; Sun et al., 2004; Farge et al., 2005; Muraro et al., 2005).Nos pacientes com DM, a porcentagem de células B ativadas que expressam CD38 aumentousignificantemente entre dois a três meses após o transplante. Já, nos pacientes com EM, a freqüênciade linfócitos B CD19 + CD38 +aumentou seis meses após o transplante, porém sem significânciaestatística.É interessante ressaltar que os enxertos de células tronco mobilizadas com G-CSF apresentamuma quantidade muito maior não só de células T, mas também de células B, do que em enxertos demedula óssea (Bensinger et al., 1996). Além disso, foi mostrado que o G-CSF aumenta a expressãode marcadores de ativação nas células B mobilizadas (Tayebi et al., 2001b). Desse modo, podemosesperar que a reconstituição inicial de células B deve-se em grande parte à expansão de células B dememória, com fenótipo ativado, que foram reinfundidas com as células tronco ou que sobreviveramao regime de condicionamento.Em nosso trabalho, a observação de que os níveis de anticorpos anti-GAD65 diminuíram,porém não desapareceram na maioria dos pacientes com DM após o transplante, sugere que oregime de condicionamento não foi capaz de eliminar completamente células B de memória autoreativas,ou que algumas delas foram reinfundidas novamente com as células tronco no transplante.No entanto, em nosso estudo, a resposta imune humoral não foi prognóstica da remissão clínicaobservada nos pacientes, em concordância com outros estudos realizados em pacientes com DM(Palmer et al., 2004).Em estudos que avaliaram pacientes com outras DAIs submetidos ao TACTH também nãohouve correlação entre os níveis de auto-anticorpos e remissão clínica da doença (Traynor et al,2000; Verburg et al., 2001). Verburg et al. (2001) mostraram que após o TACTH em pacientes comartrite reumatóide, os títulos de fator reumatóide IgM e os níveis de anti-CCP (anticorpo contrapeptídeos citrulinados e específico para pacientes com artrite reumatóide) diminuíram nos primeiros

Discussão 146nove e seis meses após o TACTH, respectivamente. No entanto, nenhuma correlação foi encontradaentre a diminuição do fator reumatóide IgM ou do anti-CCP e a resposta clínica ao transplante.Em contraste, Farge et al. (2005) mostraram uma correlação positiva entre os números delinfócitos CD19 + e CD20 + e a presença de altos níveis de auto-anticorpos anti-Scl-70, em pacientescom esclerose sistêmica submetidos ao TACTH. Além disso, os números de células B encontradosforam maiores no grupo de pacientes com esclerose sistêmica que não responderam ao transplanteou tiveram recaída da doença, do que no grupo que apresentou resposta sustentada ao TACTH. Estaobservação sugere que os clones de células B patogênicas possam ter se expandidopreferencialmente nos pacientes que não responderam ao TACTH.Mecanismos de reconstituição de células T timo-independentesA primeira fase da reconstituição imunológica caracteriza-se pela expansão de células Tresiduais que sobreviveram à imunossupressão em altas doses ou que foram reinfundidas notransplante juntamente com as células tronco, em resposta a sinais homeostáticos (Jameson et al.,2002; Guillaume et al., 1998). A proliferação homeostática periférica é responsável pela rápidarestauração da população de células T, particularmente em pacientes mais velhos, devido à produçãotímica limitada de células T naive. Ao contrário do que era esperado, nessa fase a maioria das célulasT apresenta um fenótipo de memória (Koehne et al., 1997; Murali-Krishna e Ahmed, 2000; Goldrath etal., 2000). No entanto, a proliferação homeostática é insuficiente para restabelecer a população delinfócitos T CD4 + , por razões ainda não esclarecidas. Vários trabalhos mostram que a reconstituiçãode células T CD4 + é demorada e muito mais dependente da produção tímica do que as células TCD8 + (Mackall et al., 1997; Hakim et al., 1997). Em contraste, a recuperação do número de células TCD8 + pode ser rapidamente alcançada pela expansão periférica de células T CD8 + maduras (Mackallet al., 1997; Peggs e Mackinnon, 2004).Em nosso trabalho, na reconstituição imunológica observada nos pacientes com DM até umano de seguimento e nos pacientes com EM até dois de seguimento, predominaram mecanismos dereconstituição periférica timo-independentes. Após o transplante, houve uma predominânciasignificante de células T de memória central, memória efetora e também de células T efetorasdiferenciadas, principalmente de linfócitos T CD8 + . Essa predominância de células T de memória eefetoras deve-se provavelmente à expansão homeostática periférica de linfócitos T de memória

Discussão 147residuais que sobreviveram ao regime de condicionamento ou foram re-infundidos com as célulastronco no momento do transplante. A proliferação homeostática não foi suficiente para restabelecer apopulação de linfócitos T CD4 +durante o período pós-transplante analisado. Em contraste, arecuperação do número de linfócitos T CD3 + e T CD8 + foi rapidamente alcançada pela proliferaçãohomeostática de células T CD8 + de memória, e houve um aumento significante dessas células nostrês primeiros meses pós-transplante. Esses dados indicam que a supressão da atividade inflamatóriada doença auto-imune, observada na maioria dos pacientes transplantados durante o períodoavaliado, não dependeu da persistência da linfopenia causada pela imunossupressão em altas doses.O aumento acentuado de linfócitos T CD8 + e diminuição dos linfócitos T CD4 + resultou na inversão darazão CD4 + :CD8 + durante todo o seguimento após o transplante, em todos os pacientes.Nossos resultados corroboram outros estudos de reconstituição imunológica em doenças autoimunes(Burt et al., 1998; Traynor et al., 2000; Verburg et al., 2001; Sun et al., 2004; Farge et al.,2005), nos quais os pacientes foram acompanhados por no máximo um ano após o transplante.Nesses estudos também houve uma predominância de células T de memória, principalmente T CD8 + ,nos primeiros meses após o TACTH.Num outro trabalho recente, Muraro et al. (2005) estudaram os mecanismos de reconstituiçãode células T a longo prazo em sete pacientes com EM que foram acompanhados por 2-3 anos póstransplantee verificaram também uma prevalência de células T com fenótipo de memória central ememória efetora nos seis primeiros meses pós-transplante. Nesse trabalho, houve um aumentosignificante da freqüência das células T CD4 + de memória efetora nos seis primeiros meses após oTACTH, mas que declinou posteriormente em direção aos níveis basais, à medida que houve arecuperação gradual do número de células T CD4 + . A freqüência de células T CD4 + de memóriacentral diminuiu significantemente após o transplante, enquanto que as porcentagens de células TCD8 + de memória central e memória efetora aumentaram no primeiro ano pós-transplante, emboranão significantemente. Nesse estudo, Muraro et al. (2005) mostraram uma normalização gradual, masrelativamente rápida, das células T CD4 +(o que não ocorreu em nossos pacientes). A razãoCD4 + :CD8 + encontrou-se significantemente diminuída aos seis meses após o transplante, no entanto,um ano pós-TACTH a razão CD4 + :CD8 + começou a reverter em direção aos níveis basais e dois anospós-transplante não houve diferença significante em relação à razão CD4 + :CD8 + pré-transplante.

Discussão 148Nesse cenário, pode-se questionar como a expansão homeostática periférica de células Tautólogas maduras conseguiria (mesmo que temporariamente) reconstituir um repertório tolerante emum paciente com uma doença auto-imune pré-existente. Foi mostrado em alguns estudos que aproliferação homeostática de células T CD8 + maduras em indivíduos linfopênicos é decorrente daestimulação do TCR por interações de baixa afinidade com complexos MHC-peptídeo próprio(Goldrath et al., 1999; Ernst et al., 1999). Esses trabalhos sugerem que as condições de linfopeniaaumentam a sensibilidade do TCR para peptídeos próprios associados ao MHC, provavelmente peloaumento da possibilidade de interações das células T com as células apresentadoras de antígenos(Goldrath et al., 1999; Ernst et al., 1999). Assim, durante a fase linfopênica após o TACTH, a mesma“sensibilidade do TCR aumentada” que faz com que células T de baixa afinidade por ligantes própriossejam estimuladas a proliferar homeostaticamente, poderia levar também à deleção de células autoreativasresiduais que têm alta afinidade para ligantes próprios, por AICD (activation-induced celldeath, ou morte induzida celular induzida por ativação).Vale ressaltar que, em nossos pacientes, a freqüência de linfócitos T CD4 + e CD8 + queexpressam Fas aumentou principalmente nos seis primeiros meses pós-transplante nos pacientescom DM e no primeiro ano pós-transplante nos pacientes com EM. E essa freqüência elevada decélulas T CD4 + Fas + e CD8 + Fas + encontrada nos primeiros meses da reconstituição imune, sugereuma suscetibilidade das células aumentada à apoptose (Hakim et al., 1997; Singh et al., 1999; Muraroet al., 2005). Segundo proposto por Muraro e Douek (2006), essa possível forma de deleção decélulas auto-reativas, acima discutida, lembra alguns aspectos do modelo de afinidade diferencialproposto para os mecanismos de seleção tímica (Ashton-Rickardt e Tonegawa, 1994) e poderepresentar um mecanismo de proteção contra auto-imunidade através da geração de um repertóriode células T tolerante enquanto a timopoiese é insuficiente.Nos primeiros meses da reconstituição, houve também um aumento acentuado de linfócitos TCD3 + com fenótipo ativado (CD3 + HLA-DR + ). Nos pacientes com DM, o aumento foi maior entre dois aseis meses pós-TACTH e começou a decrescer nove meses após o TACTH. Nos pacientes com EM,o aumento de células T CD3 + HLA-DR + foi acentuado e estatisticamente significante no período depré-condicionamento e em todos os seguimentos pós-transplante avaliados. O aumento naporcentagem dessas células foi maior entre dois a nove meses pós-TACTH e começou a diminuir um

Discussão 149ano após o TACTH. A expressão elevada de marcadores de ativação, como o HLA-DR, é umacaracterística também observada no sistema imune senescente (Thiel et al., 2004).A predominância e intensa proliferação homeostática de células T CD8 +observada nosprimeiros meses após o TACTH, em nosso e em vários outros estudos, pode estar tambémrelacionada à expansão de células T CD8 + CD57 + CD28 - . Primeiramente, foi mostrado que células TCD8 + CD57 + e CD8 + CD28 - são componentes importantes da reconstituição de células T CD8 + apósquimioterapia intensa (Mackall et al., 1997). Foi sugerido que essas células teriam alcançado umestado de senescência replicativa ou exaustão clonal (Effros et al., 1997), por apresentarem potencialreplicativo in vitro e tamanho do telômero reduzidos (Monteiro et al., 1996). Mais recentemente, foielucidado que é primariamente a expressão de CD57 que define essa subpopulação de células TCD8 +funcionalmente distintas, caracterizadas pela falta de capacidade proliferativa, intensareplicação e propensão à apoptose (Brenchley et al., 2003). Em paralelo, foi identificada tanto emindivíduos-controle saudáveis (Morley et al., 1995) como em receptores de transplantes de medulaóssea alogênicos (Gorochov et al., 1994), a presença de grandes expansões oligoclonais nasubpopulação de células T CD8 + CD57 + .As subpopulações oligoclonais de células T CD8 + CD57 + CD28 - foram associadas a expansõesde células T vírus-específicas em indivíduos assintomáticos HIV + e infectados por citomegalovírus(CMV) (Weekes et al., 1999; Wills et al., 1999). Outros estudos confirmaram, em TCTH autólogos,essa associação entre soropositividade prévia e/ou reativação do CMV e expansão de células TCD8 + CD57 + pós-transplante (Reimer et al., 2003) e redução da diversidade do repertório do TCR(Peggs et al., 2003). Esses autores também mostraram evidências iniciais, através de análisesusando tetrâmeros de MHC, de que essas expansões clonais CMV-específicas contribuem demaneira significativa para a recuperação da população de células T CD8 + após o transplante. Emboraalguns estudos tenham mostrado que as células T CD8 + CD28 - CD57 +podem ter um papelimunoregulador (Autran et al., 1991; Mollet et al., 1998), a participação desse possível efeito natolerância observada após TACTH em DAIs falta ser investigada.Em nosso trabalho, observamos que a freqüência das células T CD8 + CD28 - CD57 + aumentouacentuadamente após o transplante, tanto nos pacientes com DM como nos pacientes com EM. Noentanto, em nosso estudo, freqüência dessas células não foi avaliada em todos os pacientes ouperíodos. Num outro estudo de TACTH em EM (Muraro et al., 2005), expansões oligoclonais de

Discussão 150células T na subpopulação de células T CD8 + foram freqüentemente observadas no primeiro anoapós o TACTH. Nesse estudo, uma dessas expansões clonais representou aproximadamente 50% dototal da população de células T CD8 + . Os autores mostraram que após o TACTH, células T CD8 +clonalmente expandidas têm um fenótipo atípico de células de memória-efetora, apresentandomarcadores e características de células senescentes, terminalmente diferenciadas (CD28 -CD57 + CD95 + ).Em resumo, estes resultados da literatura indicam que expansões oligoclonais de células TCD8 + podem prejudicar fortemente a reconstituição imunológica após o TACTH. Segundo Muraro eDouek (2006), uma implicação desse fato para a doença auto-imune é que a ocupação de umagrande porção do repertório de células T CD8 + por células terminalmente diferenciadas poderia talvezafetar a composição do repertório de células T através de competição por espaço. Conforme foidescrito, a atrição (do inglês, atrittion) de células T CD8 + de memória limita a capacidade do indivíduode armazenar um grande número de células T de diferentes especificidades (Selin e Welsh, 2004). Aatrição é um fenômeno imunológico que consiste na diminuição do tamanho de algumas populaçõesde células T de memória, resultante da competição por “espaço” entre elas. Há possibilidade de queessas grandes expansões de células T CD8 + antígeno-específicas possam limitar drasticamente opotencial de re-expansão de células T auto-reativas residuais após o TACTH.Mecanismos de reconstituição de células T timo-dependentesEstudos em camundongos timectomizados mostraram que na ausência do timo areconstituição imunológica periférica prevalece (Mackall et al., 1993). No entanto, embora a expansãohomeostática periférica consiga restaurar o número de células T após imunodepleção maciça, o timoé a exclusiva fonte de novas especificidades de célula T (revisado por Berzins et al., 2002). Foimostrado que a contribuição tímica para a regeneração de células T CD4 + varia de acordo com idadedo indivíduo (Mackall et al., 1995). Após quimioterapia intensa, uma forte reativação tímica foiobservada em crianças, mas não em adultos. O fenômeno de reativação tímica (do inglês, thymicrebound) significa aumento do tamanho e reativação funcional do timo após depleção intensa decélulas T (Muraro e Douek, 2006). Nos adultos, as células T naive começaram a reaparecer nosadultos somente quinze meses após a quimioterapia intensa. A recuperação lenta de células T naivefoi principalmente observada na subpopulação de células T CD4 + , e a recuperação de células T CD4 +

Discussão 151correlacionou-se inversamente com a idade e diretamente com o aumento do timo (Mackall et al.,1995).Recentemente, Douek et al. (2000) mostraram a persistência de uma significante função tímicae do potencial para recuperação completa e mesmo aumento do número de células T naive(reativação tímica) após TCTH em adultos, através de um método novo de detecção de célulasrecém-emigrantes do timo baseado na amplificação de TRECs (T cell receptor excision circles). Umacorrelação entre o reaparecimento e aumento de células T CD4 + naive e a recuperação e melhorafuncional da timopoiese foi encontrada em vários trabalhos realizados em humanos (revisado porWeinberg et al., 2001; Douek, 2002; Hakim et al., 2005).Malphettes et al. (2003) mostraram que a reconstituição com células CD34 +selecionadasresulta num aumento de células T naive, porém o mesmo não foi verificado quando enxertos decélulas tronco não-manipulados foram usados. Similarmente, os níveis de TREC encontrados forammaiores em receptores de enxertos de células CD34 +selecionadas (Douek et al., 2000). Estaobservação poderia talvez refletir uma competição por espaço entre células T naive e células T dememória durante a reconstituição imunológica. Uma vez que células T de memória são menosfreqüente em enxertos de células CD34 +purificadas, isso poderia favorecer a reconstituição decélulas T naive nos pacientes. Ainda não está esclarecido se o timo consegue aumentar suaprodução em resposta a condições de linfopenia em adultos, embora haja evidências da detecção deníveis supranormais de TRECs após TCTH (Muraro et al. 2005).Se, por um lado, a seleção de células CD34 +parece ser importante para o aumento dareconstituição de células T naive após o TACTH, a seleção células CD34 + pode vir a remover doenxerto, além das células T auto-reativas potencialmente patogênicas, populações celularesimportantes para a manutenção da tolerância periférica, como as células T reguladoras. Num estudode TACTH em artrite reumatóide, Moore et al. (2002) mostraram que os pacientes que receberam oenxerto de células tronco não-manipulado apresentaram uma duração maior da melhora clínica doque os pacientes que receberam as células tronco CD34 +purificadas, embora sem significânciaestatística.Os principais fatores adversos que podem influenciar a reconstituição imunológica após oTACTH em pacientes com DAIs constituem a idade do paciente e o tipo e tempo de tratamentoprévio. O fator idade já foi discutido previamente, mas vale ressaltar que a capacidade tímica de

Discussão 152produzir novas células T naive após o TACTH parece ter valor prognóstico, pois se correlaciona comaumento da diversidade do repertório de células T, diminuição de infecções oportunistas e aumentoda sobrevivência dos pacientes. Desse modo, pacientes mais jovens parecem ter maiores chances deentrar em remissão clínica após o TACTH (Fallen et al., 2003; Isaacs e Thiel, 2004). Em relação aotratamento prévio, já foi mostrado que algumas drogas usadas no tratamento de DAIs podemdanificar o timo (Milicevic et al., 1998; Tonomura et al., 2003) e potencialmente prejudicar as célulastronco da medula óssea e os precursores linfóides que irão reconstituir o sistema imune após otransplante.Em nossos pacientes, os números de linfócitos T CD4 + e CD8 + naive, bem como de células TCD4 + CD45RA + CD31 + recém imigrantes do timo, não recuperaram os níveis basais durante o períodopós-transplante analisado. Vale ressaltar que em nosso estudo os pacientes receberam auto-enxertosde células tronco não-manipulados. Nos pacientes com DM, a partir de nove meses pós-transplante,o número dessas células apresentou uma tendência a aumentar. Nossos resultados foramsemelhantes a de outros trabalhos descritos na literatura para doenças auto-imunes (Burt et al., 1998;Traynor et al., 2000; Verburg et al., 2001; Sun et al., 2004; Farge et al., 2005; Muraro et al., 2005),nos quais o número de células T naive CD4 + CD45RA + também não alcançou níveis pré-transplanteaté um ano pós-transplante.No entanto, um estudo recente (Muraro et al., 2005) mostrou pela primeira vez que a remissãoclínica observada em pacientes com EM após o TACTH, que é acompanhada pela supressão daatividade inflamatória, não é decorrente somente da imunossupressão que esses pacientes recebem,mas de mudanças qualitativas profundas no sistema imunológico que demonstram uma renovação docompartimento de células T nesses pacientes. Nesse trabalho, os paciente com EM receberamenxertos de células CD34 + purificadas. Os autores mostraram que, dois anos após o TACTH, ospacientes apresentaram mais do que o dobro da freqüência de células T CD4 + naive em relação aoperíodo pré-transplante. Já a freqüência de células T CD8 + naive não mudou significantemente doisanos pós-transplante em relação aos níveis basais. Do mesmo modo, a freqüência de células TCD4 + CD45RA + CD31 + recém imigrantes do timo dobrou dois anos pós-TACTH, bem como os níveisde TRECs aumentaram 7,9X um ano pós-transplante e 5,4X dois anos pós-transplante. Em adição,Sun et al. (2004) e Farge et al. (2005), mostraram um aumento dos níveis de TRECs entre 9 a 12meses pós-transplante, após TACTH em pacientes com EM e esclerose sistêmica, respectivamente.

Discussão 153Em nosso trabalho, avaliamos a reconstituição tímica de células T naive pela quantificaçãofenotípica dessas células, e os níveis de TRECs não foram avaliados. Possíveis explicações para nãotermos encontrado uma recuperação e/ou aumento de células T naive nos pacientes com EM aosdois anos pós-TACTH, poderiam ser: amostra não representativa, a idade dos pacientes, respostaclínica pós-transplante. Em nosso trabalho somente quatro pacientes com EM chegaram aoseguimento de dois anos pós-transplante (EM1, EM3, EM4 e EM5). Dentre esses quatro pacientes,três pacientes tem idade >50 anos, dois pacientes apresentaram progressão neurológica e somentedois apresentaram maior diversidade do repertório após o TACTH. Os outros pacientes com EM e ospacientes com DM devem ser acompanhados por mais tempo (pelo menos até dois anos póstransplante)para avaliação da reconstituição tímica de células T naive.Interessantemente, vários estudos mostraram que a produção tímica de células T naive éreduzida em pacientes com EM (Hug et al., 2003), artrite reumatóide (Koetz et al., 2000) e lúpuseritematoso sistêmico (Kayser et al., 2004). Por outro lado, Muraro et al. (2005) mostraram que oTACTH foi capaz de aumentar a timopoiese em pacientes com EM. Desse modo, pode-se sugerir quea reativação tímica após TACTH possa constituir um mecanismo comum de tolerância em diferentesDAIs.Vale destacar outros dois trabalhos que avaliaram a reconstituição tímica de células T autoreativasapós o TACTH. Openshaw et al. (2000) mostraram que a resposta proliferativa de célulasmononucleares à MBP (myelin basic protein) ou a peptídeos imunodominantes da MBP estavasignificantemente suprimida em pacientes com EM, pelo menos até 20 meses pós-TACTH, noentanto respostas novas contra outros peptídeos da MBP desenvolveram-se após o transplante. Sunet al. (2004) demonstraram o reaparecimento de células T auto-reativas anti-mielina por volta de 12meses após o TACTH em pacientes com EM, provavelmente concomitante à reconstituição de novascélulas T naive produzidas pelo timo (avaliada pelos níveis de TREC nesse período).Interessantemente, os pacientes com EM desses estudos continuaram em remissão clínica dadoença mesmo com o reaparecimento de células T auto-reativas anti-mielina, demonstrando que aremissão da doença após o transplante não se deve somente à eliminação das células auto-reativaspatogênicas mas também a outras mudanças determinadas pelo TACTH.

Discussão 1545.2 Perfil de citocinas após o TACTHAs citocinas têm um papel importante na iniciação e direcionamento das respostas imunes, e adesregulação de citocinas é um fator fundamental na patogênese das DAIs. Traynor et al. (2000)mostraram que ocorrem mudanças no padrão de citocinas em pacientes com lúpus eritematososistêmico (LES) após o TACTH. A expressão de interleucina-4 (IL-4), citocina do tipo T H 2, foiencontrada aumentada em linfócitos de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico antes dotransplante e normalizou após o TACTH. Por outro lado, os níveis de interferon-γ (IFN-γ; citocina dotipo T H 1), que estavam abaixo do normal nesses pacientes antes do transplante, aumentaram paraníveis normais após o TACTH. Num estudo mais recente, Sun et al. (2004) mostraram que os níveisde citocinas séricas oscilaram muito após o TACTH e retornaram aos valores basais um ano póstransplante.Houve um aumento significante de INF-γ, TNF-α e IL-10 entre três e seis meses póstransplante,enquanto que os níveis de IL-12 diminuíram persistentemente após o TACTH no soro detodos os pacientes.Em nosso trabalho, investigamos as alterações na produção de citocinas por linfócitos ativadosdos pacientes com DM e EM após o TACTH. Após o transplante, houve um aumento na porcentagemde células T CD4 + (T H 1) e CD8 + (T C 1) produtoras de citocinas do padrão T H 1 ou pró-inflamatórias(INF-γ e TNF-α), que está associado ao aumento de linfócitos T de memória central e efetora, assubpopulações celulares predominantes nesse período da reconstituição imunológica conformediscutido anteriormente. Essas subpopulações de células T de memória e efetoras apresentam umperfil de células ativadas e caracteristicamente respondem rapidamente a estímulos antigênicospoliclonais ou específicos através da produção de citocinas. Eyrich et al. (2004) tambémdemonstraram um aumento de células de memória produtoras de INF-γ após TCTH alogênico,principalmente de células T CD8 + .A diminuição observada na freqüência de células T CD4 + e CD8 + positivas para a citocina IL-2após o transplante está associada ao número diminuído de células T naive encontrado nos pacientesnesse período, uma vez que células T naive, principalmente células T CD4 + , constituem as principaisfontes de IL-2 (Chalmers et al., 1998).Por outro lado, foi observado um pequeno aumento da porcentagem de células T CD4 + (T H 2) eCD8 + (T C 2) produtoras de citocinas do padrão T H 2 ou anti-inflamatórias (IL-4, IL-5 e IL-10) no períodode pré-condicionamento e em vários períodos após o TACTH. Entretanto, esse aumento foi

Discussão 155significante no período de pré-condicionamento e nos D+180 (CD4 + IL-10 + ) e D+270 (CD4 + IL-5 + ,CD4 + IL-10 + ) pós-transplante nos pacientes com DM. Nos pacientes com EM o aumento de célulasT H 2/T C 2 foi também observado em alguns períodos pós-transplante (principalmente nos primeirosseis meses), porém não foi estatisticamente significante. Uma vez que o diabete melito do tipo 1 e aesclerose múltipla são DAIs do tipo T H 1, a presença de um maior número de células com perfil T H 2poderia ter um papel importante na supressão da atividade inflamatória da doença auto-imune nessespacientes e poderia contribuir nos primeiros meses após o transplante para a melhora clínica eremissão da doença auto-imune nesses pacientes.O achado de células T C 2 nos pacientes, principalmente após o transplante, foi interessante eintrigante ao mesmo tempo, pois classicamente o padrão de citocinas expresso pelas células T CD8 +efetoras é similar ao das células T CD4 + T H 1 (revisado por Mosmann et al., 1997; Woodland e Dutton,2003). A produção de INF-γ, TNF-α e linfotoxina por células T CD8 + é consistente com sua funçãocitotóxica, pois essas três citocinas ativam e aumentam a capacidade citotóxica em macrófagos eneutrófilos. Entretanto, nem todas as células T CD8 +secretam citocinas do padrão T H 1. Váriostrabalhos descritos na literatura mostram que as células T CD8 + podem secretar citocinas do padrãoT H 2 in vivo e in vitro. Clones de células T CD8 + descritos em alguns trabalhos secretam ambos tiposde citocinas, T H 1 e T H 2. Também foi mostrado que alguns clones de células T CD8 + isolados depacientes com hanseníase secretam IL-4 e baixos níveis de INF-γ. Desse modo, está claro naliteratura que as células T CD8 + podem diferenciar-se em dois fenótipos de células efetoras, T C 1 ouT C 2. Ambas subpopulações são citotóxicas através das vias de sinalização por Fas eperforina/granzima, e ambas são capazes de lisar células B em repouso (ou resting) ou ativadas,embora as células T C 2 sejam capazes de prover estímulo (bystander help) para células B através daprodução de citocinas T H 2 (revisado por Mosmann et al., 1997; Woodland e Dutton, 2003).Sugerimos que o G-CSF, usado para a mobilização das células tronco para o sangue periféricoe para encurtar o período de neutropenia, possa ter induzido esse aumento de células com perfil T H 2/T C 2 nos pacientes transplantados em nosso estudo. Conforme discutido anteriormente, o G-CSFpolariza as células T para um padrão T H 2, pela regulação positiva de vários genesimunomoduladores, dentre eles o fator de transcrição GATA-3 (Arpinati et al., 2000; Sloand et al.,2000; Franzke et al., 2003). Atualmente, existem várias evidências que demostram um papel criticodo G-CSF como um novo mediador de tolerância de células T (revisado por Rutella et al., 2005).

Discussão 156Desse modo, o G-CFS poderia contribuir para os efeitos terapêuticos benéficos do TACTH notratamento de DAIs do tipo T H 1 através da modulação do “ambiente imunológico” imediatamente apóso transplante, induzindo mudanças no perfil da resposta imune para um perfil T H 2 menos inflamatório.Por outro lado, recentemente foi descrito outro mecanismo pelo qual o G-CSF exerce seu efeitoimunossupressor (Schmielau e Finn, 2001; Vasconcelos et al., 2003; Vasconcelos et al., 2006). O G-CFS induz a geração de granulócitos de baixa densidade in vivo que co-purificam com as PBMCs esão capazes de inibir a produção de INF-γ e IL-4 por células T humanas, através da produção deH 2 O 2 . Em contraste, em nosso estudo, além do número de células produtoras de citocinas T H 2 teremaumentado, a freqüência de células produtoras de citocinas T H 1 aumentou também.Apesar de termos observado um pequeno aumento na freqüência de células T H 2/T C 2 nospacientes após o transplante, esperávamos que esse aumento fosse maior e na maioria dospacientes, pelo menos no período de pré-condicionamento, devido ao efeito do G-CSF na indução derespostas T H 2 descrito na literatura (Arpinati et al., 2000; Pulendran et al., 2000; Klangsinsirikul et al.,2002). Uma explicação para esse resultado seria a diferença no período de coleta do sangueperiférico dos pacientes após o condicionamento, que variou muito em nossos pacientes conformediscutido anteriormente, em contraste com outros estudos descritos na literatura que avaliaram oefeito do G-CSF na indução de respostas T H 2. (Arpinati et al., 2000; Pulendran et al., 2000;Klangsinsirikul et al., 2002). Não obstante, resultados semelhantes aos nossos foram encontrados emoutros estudos que avaliaram a produção de citocinas após TACTH alogênico em pacientes comdoenças onco-hematológicas ou oncológicas (Schlenke et al., 2001; Eyrich et al., 2004).Outra explicação seria a presença de granulócitos de baixa densidade induzidos pelo G-CSFna cultura in vitro, principalmente nas amostras colhidas no pré-condicionamento, que poderiam estarinibindo a produção de IL-4 pelas células T dos pacientes, através da produção de H 2 O 2 (Schmielau eFinn, 2001; Vasconcelos et al., 2004; Vasconcelos et al., 2006). Entretanto, em nosso trabalhousamos células mononucleares congeladas em nossos experimentos de citocinas intracelulares eSchmielau e Finn (2001) mostraram que os granulócitos de baixa densidade induzidos pelo G-CSFperdem sua função inibitória após o congelamento.Intrigantemente, em algumas amostras de pré-condicionamento e nos primeiros seis mesespós-transplante, foram freqüentemente encontradas células positivas para citocinas T H 2 quando ascélulas foram incubadas sem o estímulo, o que reflete a produção in vivo dessas citocinas. Mas,

Discussão 157quando essas mesmas amostras eram estimuladas com PMA e IONO, as células T H 2/T C 2 não eramencontradas (dados não mostrados). Uma explicação talvez seria de que essas células T H 2/T C 2teriam uma maior suscetibilidade à morte por AICD (activation-induced cell death, morte induzida porativação). De qualquer modo, nós faremos na continuação desse projeto, a dosagem de citocinasT H 1 e T H 2 no soro que foi armazenado desses pacientes, pela técnica de CBA (BD TM Cytometric BeadArray) por citometria de fluxo, e compararemos os resultados com esses obtidos por marcaçãointracelular das citocinas.Vale destacar dois trabalhos recentes que avaliaram o perfil de citocinas produzidas ouexpressas em células auto-reativas, antes e após o TACTH. Como citado anteriormente, Openshawet al. (2000) mostraram que a resposta proliferativa de células mononucleares à MBP (myelin basicprotein) ou peptídeos imunodominantes da MBP estavam suprimidas em pacientes com EM, pelomenos até 20 meses pós-TACTH, no entanto novas respostas contra alguns peptídeos da MBPdesenvolveram-se após o transplante. No entanto, interessantemente, apesar de reaparecerem apóso transplante, porém em freqüência muito menor, as células auto-reativas anti-mielina apresentaramum perfil de citocinas predominantemente T H 2 nove meses após o TACTH. Essa aparente mudançano padrão de citocinas das células anti-mielina pode ser um dos motivos pelos quais os pacientescom EM continuaram em remissão clínica da doença mesmo com a reconstituição de células T autoreativasapós o transplante. Num estudo mais recente, de Kleer et al. (2005) mostraram evidênciasque sugerem uma “reprogramação” de células auto-reativas em crianças com artrite juvenil idiopática(AJI) após o TACTH. Usando APCs artificiais para isolar células auto-reativas contra um peptídeo daHsp60 (heat shock protein 60; auto-antígeno importante na AJI), eles demonstraram que o TACTHinduz a mudança do fenótipo pró-inflamatório (caracterizado por elevados níveis de RNAm de IFN-γ eT-bet) das células auto-reativas pré-transplante para um fenótipo tolerante pós-transplante(caracterizado por elevados níveis de RNAm de IL-4 e GATA-3).5.3 Diversidade do repertório de células T após o TACTHA análise do repertório da cadeia Vβ do TCR nos permitiu ter uma visão global do repertório decélulas T do sangue periférico dos pacientes com diabete melito do tipo 1 ou esclerose múltipla antesdo transplante, e das mudanças que ocorrem no mesmo após o transplante. No entanto, paraobtermos informações mais específicas e detalhadas sobre o repertório do TCR, seria necessário

Discussão 158estudarmos o rearranjo Vβ-Jβ. Para tal, poderíamos amplificar o produto do PCR de cada família Vβcom primers específicos para cada uma das 12 famílias Jβ (onde todas as possíveis combinaçõesVβ-Jβ seriam: 24 Vβ x 12 Jβ= 288), ou poderíamos estudar, na continuação desse projeto, o rearranjoVβ-Jβ somente para as famílias Vβ encontradas em expansões relevantes nesses pacientesestudados. Além disso, seria interessante realizar análises clonotípicas baseadas no seqüenciamentoda região CDR3, para estudar a renovação das especificidades de células T após o transplante.Em resumo, as análises do repertório de linfócitos T dos pacientes com DM ou EMtransplantados, por TCRBV CDR3 Spectratyping, mostraram que a maioria das famílias Vβ do TCR,antes e após o transplante, eram policlonais e apresentavam um perfil de distribuição dos picosanormal ou não-gaussiano e tamanhos de segmentos de CDR3 variáveis para o pico de maiorfreqüência. No entanto, várias dessas famílias Vβ policlonais, com perfil de distribuição dos picos nãogaussiano,apresentaram expansões dominantes de 1-2 picos de CDR3. Essas expansões foramencontradas nos pacientes principalmente seis meses após o TACTH, e estão associadas à faselinfopênica da reconstituição imunológica caracterizada pela proliferação homeostática de células Tde memória residuais, que sobreviveram ao regime de condicionamento. Essa fase também foicaracterizada pela presença de algumas famílias Vβ em expansões oligoclonais ou monoclonais.Além disso, alguns pacientes apresentaram famílias em expansões oligoclonais ou monoclonais noperíodo pré-transplante, que se mantiveram após o transplante em alguns pacientes e em outros não.Foram identificados quatro padrões básicos de reconstituição do repertório da cadeia Vβ dosTCRs pelas análises por TCRBV CDR3 Spectratyping, também descritos por Muraro et al. (2005). Opadrão II, que consistiu na reconstituição da diversidade a partir de um repertório pré-transplantediverso, foi o mais dominante em todos os pacientes analisados. Em algumas famílias Vβ foiobservado padrão I, que consistiu na recuperação da diversidade a partir de um repertório prétransplanterestrito, o que sugere um aumento da diversidade do repertório após o transplante. Opadrão III (reaparecimento total ou parcial de um repertório pré-transplante restrito) e o padrão IV(reconstituição de um repertório restrito a partir de um repertório pré-transplante diverso) tambémforam observados para algumas poucas famílias Vβ.Observamos mudanças dinâmicas na composição do repertório da cadeia Vβ dos TCRs após oTACTH nos pacientes com DM e EM, evidenciadas por alterações qualitativas e quantitativas dospicos de CDR3 das famílias Vβ. Em vários casos, picos de CDR3 em determinada família Vβ que

Discussão 159eram dominantes antes do transplante tornaram-se subdominantes após o mesmo, sendo excedidospor outros picos de CDR3 que estavam sub-representados antes do TACTH. Em outros casos,segmentos de CDR3 em determinada família Vβ que eram dominantes antes do transplante foramexcedidos após o TACTH por outros segmentos de CDR3 que não tinham sido detectados antes dotransplante. Vale ressaltar que no paciente DM1, o único paciente com DM que não apresentouresposta ao TACTH e ainda necessita de altas doses de insulina, as mudanças qualitativas nacomposição do repertório de células T não foram tão evidentes quanto nos outros pacientes com DM,ou seja, o perfil e composição qualitativa da região CDR3 de várias famílias Vβ do TCR reconstituídasnesse paciente após o TACTH foi muito similar ao pré-transplante.Diversas famílias Vβ apresentaram freqüências diferentes após o transplante, aumentadas oudiminuídas em relação ao período pré-transplante, indicando uma mudança quantitativa nacomposição do repertório de células T após o transplante. Ademais, mesmo quando uma família Vβmanteve freqüência total semelhante após o transplante, em alguns casos foi observada umamudança qualitativa e quantitativa nos segmentos de CDR3 dessa família. Esses resultados indicamque o TACTH induz mudanças profundas, qualitativas e quantitativas, na composição do repertório decélulas T dos pacientes após o TACTH, que poderia explicar a indução da remissão da doença autoimunenos pacientes.Por outro lado, a diversidade do repertório da cadeia Vβ do TCR, avaliada pelo complexityscore, diminuiu em quatro dentre os cinco pacientes com DM transplantados, que foramacompanhados por um ano pós-transplante. Já, dentre os pacientes com EM, que tiveram umseguimento de dois anos após o transplante, quatro apresentaram um aumento da diversidade dorepertório de células T após o transplante, e nos outros quatro a diversidade diminuiu.Vale ressaltar que dentre os quatro pacientes com EM que apresentaram uma diminuição dadiversidade do repertório de células T após o transplante, três (EM5, EM6 e EM8) tiveram infecçõesapós o transplante e conseqüente progressão neurológica. Pode ser sugerido então que as infecçõespós-transplante tenham causado expansões de algumas subpopulações de células T específicas,levando à restrição do repertório nesses pacientes. Embora os pacientes com DM tenhamapresentado uma diminuição da diversidade do repertório, é interessante ressaltar que essespacientes tiveram um seguimento de um ano pós-transplante somente, desse modo, podemosesperar que um repertório Vβ mais diverso seja recuperado com um seguimento mais longo (um ano

Discussão 160e meio a 2 anos) pós-transplante com a reconstituição de uma população maior de células T naiveproduzidas pelo timo. O mesmo aplica-se para o outro paciente com EM que apresentou diminuiçãoda diversidade do repertório (EM10). Além disso, a diversidade grande de picos pré-transplante deveseà idade dos pacientes com DM, pois são pacientes jovens. Com isso, a reconstituição de umrepertório de células T ainda mais diverso do que o repertório pré-transplante pode demorar maistempo.Nossos resultados corroboram outros trabalhos descritos na literatura, os quais mostraramque nos primeiros doze meses ocorre uma expansão seletiva de células T pré-existentes ou residuaisatravés de mecanismos timo-independentes, que leva à restrição do repertório do TCR nessa fase.Sun et al. (2004) mostraram a restrição do repertório Vβ do TCR por vários meses após o transplante,com expansões relevantes de populações de células T expressando a família Vβ20 em todos osquatro pacientes com EM estudados, e das famílias Vβ1 e Vβ14 em alguns, mas não em todos ospacientes. Análises por Immunoscope (método idêntico ao TCRBV CDR3 Spectratyping, em que osresultados são analisados pelo software Immunoscope), revelaram que essas famílias expandidasapresentavam um perfil de distribuição policlonal. Nesse estudo, o repertório do TCR gradualmentemudou para um padrão de distribuição mais heterogêneo (relativamente similar ao padrão basal), àmedida que novas células T naive foram reconstituídas pela produção tímica. Conforme citadoanteriormente, nesse trabalho a quantificação de TRECs revelou a recuperação da produção decélulas T timo-dependente nos pacientes, no período entre 9-12 meses pós-TACTH.Em outro estudo recente, Farge et al (2005) mostrou uma perturbação do repertório empacientes com esclerose sistêmica antes do TACTH, com poucas famílias Vβ policlonais e umafreqüência aumentada de famílias Vβ oligoclonais (ou skewed) e de famílias Vβ negativas,comparando-se com controles normais pareados de acordo com a idade. Nesse trabalho, ospacientes foram também acompanhados por um ano após o TACTH. O repertório permaneceuperturbado até um ano pós-transplante em ambos os grupos de pacientes (grupo A, pacientes nãoresponderam ao transplante ou tiveram recaída da doença; grupo B, pacientes que apresentaramresposta sustentada ao TACTH). Apesar de não-estatisticamente significante devido ao númeroreduzido de pacientes, houve uma tendência em direção a um aumento da diversidade do repertóriode células T no grupo A, um ano pós-TACTH. Apesar da extensa depleção de células T no enxerto de

Discussão 161células tronco, observou-se nesse estudo a persistência de 1-4 expansões oligloclonais de células T,presentes antes do TCATH e que foram conservadas após o mesmo.Como discutido anteriormente, o racional do TACTH em DAIs baseia-se na idéia de que aimunodepleção intensa possa eliminar as células auto-reativas e que o novo sistema imunereconstituído dos precursores hematopoéticos possa restabelecer tolerância. No entanto, nenhum dosestudos de reconstituição imunológica discutidos acima conseguiu demonstrar a hipótese do“regeneração” do sistema imune após o TACTH, através da detecção da renovação fenotípica oufuncional do repertório imune durante a remissão clínica observada nos pacientes.No entanto, num trabalho recente, Muraro et al. (2005) mostraram em 7 pacientes EM, doisanos após o TACTH, a reconstituição de uma diversidade clonal mais ampla do repertório do TCR euma extensa renovação das especificidades clonais comparadas com o pré-transplante, que é devidaà produção de novas células T naive pelo timo desses pacientes. Nesse estudo, o repertório do TCRfoi analisado separadamente em populações purificadas de células T CD4 + ou CD8 + . Em relação àscélulas T CD4 + , em todos os casos foi verificada a restauração, dois anos após o TACTH, de umaampla diversidade de segmentos de CDR3 em todas as famílias Vβ, tanto quando o perfil dedistribuição dos segmentos de CDR3 era restrito antes do transplante, como quando o perfil eranormalmente diverso. Na subpopulação de células T CD8 + , as expansões observadas em algumasfamílias 6 meses a um ano pós-transplante foram geralmente associadas à um perfil de distribuiçãooligoclonal ou monoclonal.Em 6 dentre os 7 pacientes avaliados nesse trabalho (Muraro et a., 2005), em ambas assubpopulações celulares CD4 +ou CD8 + , foram observados quase exclusivamente os padrões dereconstituição A (recuperação da diversidade a partir de um repertório pré-transplante restrito) e B(reconstituição da diversidade a partir de um repertório pré-transplante diverso). O paciente 5, queteve infecções recorrentes após o TACTH, o padrão C (reaparecimento total ou parcial de umrepertório pré-transplante restrito) foi mais comum. De maneira geral, um perfil de distribuiçãopoliclonal foi reconstituído na maioria das famílias Vβ, sugerindo segundo os autores, umadiversidade clonal aumentada a partir dos rearranjos de novo dos TCRs.Nesse mesmo trabalho, Muraro et al. (2005) avaliaram também o repertório Vβ do TCR a nívelclonal, para isso clonaram e sequenciaram transcritos de TCRBV de células T CD4 + ou CD8 +purificadas antes ou dois anos após o TACTH. Nos casos em que a diversidade do repertório

Discussão 162aumentou ou manteve-se após o transplante (padrões A e B), os pesquisadores observaram umarenovação substancial ou completa das especificidades clonais. Novas seqüências representaram de90-100% da porção do repertório examinada. Nas famílias Vβ que apresentaram padrão dereconstituição A, a maioria das novas seqüências observadas após o transplante, eram clones únicos(aparecendo uma única vez), o que foi consistente com a observação do aumento da diversidade dorepertório. A proporção de seqüências únicas também aumentou em famílias Vβ que apresentarampadrão de reconstituição B, demonstrando a diversidade aumentada de clones individuais dentro decada segmento de CDR3. Nas famílias Vβ que apresentaram padrão de reconstituição C, a proporçãode seqüências únicas diminuiu, conforme esperado. Apesar da extensa renovação dasespecificidades clonais do repertório de células T, Muraro et al. (2005) mostraram que a renovação dorepertório não foi completa, e alguns clones individuais pré-existentes, mais freqüentemente nasubpopulação de células T CD8 + , foram encontrados novamente no sangue periférico dos pacientesapós o TACTH.Nossos resultados apóiam a hipótese proposta por Muraro et al. (2005), de que a mudança nacomposição do repertório de células T após o TACTH, seguida pela renovação das especificidadesdo repertório de células T devida à produção de novas células T naive pelo timo, possa levar àregeneração de um sistema imune “novo” (ou “diferente”) e tolerante nos pacientes com DAIs. A“renovação” do sistema imune pode ser um dos principais fatores que explicam os benefíciosterapêuticos do TACTH em pacientes com DAIs. Os trabalhos recentes descritos acima e os nossosresultados, substanciam a idéia da “reprogramação” do sistema imune como o racional do TACTH emDAIs, e provêem a base racional para os ensaios clínicos, futuros ou em andamento, dessa estratégiaterapêutica em DAIs.5.4 Análise da reconstituição de células T reguladoras e da expressão deFopx3 após o TACTHO sistema imune desenvolveu vários mecanismos para estabelecer e sustentar a autotolerânciaimunológica (estado de não-responsividade a antígenos próprios), incluindo eliminaçãofísica (deleção clonal) ou inativação funcional (anergia) de células auto-reativas. Existem váriasevidências de que a supressão ativa de células T auto-reativas, mediada por células T reguladoras,constitui um outro mecanismo essencial de auto-tolerância (revisado por Shevach, 2000; Maloy e

Discussão 163Powrie, 2001; Coutinho et al., 2001; Sakaguchi, 2004). A maioria das células Tregs são CD4 + eexpressam constitutivamente a molécula (Sakaguchi et al., 1995), podendo ser geradas no timo ou naperiferia (Sakaguchi, 2004; Apostolou e Boehmer, 2004). Foi recentemente demonstrado que ascélulas Tregs CD4 + CD25 + expressam exclusivamente o gene regulador Foxp3, que codifica um fatorde transcrição que controla seu desenvolvimento e função (Hori et al., 2003; Fontenot et al., 2003;Khattri et al., 2003). Portanto, a expressão de Foxp3 pode ser usada como um marcador molecularespecífico para células Tregs CD4 + CD25 + .Dois trabalhos recentes avaliaram a reconstituição de Tregs CD4 + CD25 high , após o TACTH.Verda et al. (2005) mostraram uma restauração de células Tregs CD4 + CD25 high em pacientes comdoença de Crohn após TCTH não-mieloablativo. Foi mostrado um aumento significante do númeroabsoluto de células T CD4 + CD25 high após o transplante. Em outro estudo recente, de Kleer et al.(2005) mostraram também a restauração da freqüência de células Tregs CD4 + CD25 high em criançascom artrite juvenil idiopática (AJI) após o TACTH, de números significantemente reduzidos antes doTACTH (comparados aos de indivíduos saudáveis) para níveis normais após o transplante. Elessugerem que esta recuperação deve-se à proliferação homeostática das células CD4 + CD25 highdurante os primeiros meses da reconstituição imunológica, e à produção tímica de novas célulasTregs CD4 + CD25 high que expressam Foxp3 numa etapa posterior da reconstituição. Estes trabalhossugerem que a restauração das células Tregs CD4 + CD25 high possa contribuir para o restabelecimentoda homeostasia imune, indução da tolerância imune e remissão da DAI após o TACTH.Em nosso estudo, embora não tenha havido um aumento do número de células TregsCD4 + CD25 high durante o período pós-transplante analisado, em relação ao pré-transplante, a cinéticade reconstituição das células Tregs CD4 + CD25 high após o transplante foi mais rápida do que a dascélulas T CD4 + totais. Isto sugere que após o TACTH ocorre uma expansão homeostática preferencialdessas células, dentro da população de células T CD4 +totais, durante a fase linfopênica dareconstituição imunológica. Além disso, foi observado um aumento na expressão do RNAm de Foxp3,marcador molecular específico para células Tregs CD4+CD25 high , em três dentre quatro pacientescom DM avaliados. Já, entre os cinco pacientes com EM estudados, quatro mostraram um aumentoda expressão do gene Foxp3 após o transplante. Esses resultados sugerem uma melhora demecanismos reguladores que podem contribuir para a manutenção da tolerância nos pacientes queentraram em remissão clínica.

Discussão 164Vale ressaltar em nosso trabalho que os pacientes com EM que apresentaram um aumento dadiversidade do repertório do TCR (pacientes EM1, EM3, EM4 e EM9) também tiveram um aumentoda expressão do gene Foxp3. Em contraste, o único paciente com diabete melito do tipo 1 que nãoapresentou resposta ao TACTH (paciente DM1) e ainda necessita de altas doses de insulina, nãoapresentou um aumento de RNAm de Foxp3 após o transplante.É concebível que a proliferação preferencial das células CD4+CD25 highdurante a faselinfopênica da reconstituição imunológica seja explicada por diferenças, entre células T CD4 +convencionais e células Tregs CD4+CD25 high , em resposta à estimulação pelo TCR (Cozzo et al.,2003). Além da proliferação homeostática preferencial de células Treg CD4 + CD25 high após otransplante, estas células podem ter sido selecionadas e sobrevivido ao regime de condicionamento,um mecanismo que foi recentemente mostrado em um modelo murino de GVHD crônico (Anderson etal., 2004). Vale ressaltar também que, além da geração tímica de células Tregs CD4 + CD25 high , célulasT periféricas não-Treg podem adquirir a expressão de Foxp3 e converter a células Tregs in vivo apósestimulação antigênica crônica ou em condições de linfopenia (Apostolou e Boehmer, 2004; Curottode Lafaille et al., 2004; Walker et al., 2003). Podemos sugerir que esses mecanismos podem ter sidoresponsáveis pela expansão homeostática preferencial das células Tregs CD4+CD25 high dentro dapopulação de células T CD4 + totais e pelo aumento expressão de Foxp3, mesmo na ausência deatividade tímica expressiva nesse período, avaliada pela fenotipagem de células T naive em nossospacientes.Em nossos experimentos a expressão de Foxp3 foi avaliada na população total de célulasmononucleares do sangue periférico, e isso poderia explicar o fato de que o aumento da expressãode Foxp3 encontrado não tenha sido tão expressivo quanto ao observado por de Kleer et al. (2005),que avaliaram a expressão do gene Foxp3 em células Tregs CD4 + CD25 + purificadas por colunasimunomagnéticas. De qualquer forma, na continuação deste trabalho nós pretendemos isolar célulasTregs CD4 + CD25 high de novos pacientes que serão transplantados e estudar a expressão gênica deFoxp3, bem como a capacidade funcional dessas células antes e após o TACTH.Além disso, de Kleer et al. (2005) avaliaram a reconstituição de células Tregs CD4 + CD25 high emcrianças, e como foi discutido anteriormente, a reativação tímica e produção de novas células T naive(o que inclui logicamente células Tregs CD4 + CD25 high ) em crianças é muito mais rápida do que emadultos (Mackall et al., 1995; Douek et al., 2000). Desse modo, baseando-se nas evidências atuais,

Discussão 165uma remissão clínica duradoura da DAI após o TACTH parece depender amplamente da reativaçãoda atividade tímica após o transplante, através da produção de novas células T naive e novas célulasTregs CD4 + CD25 high .Recentemente, Hermman et al. (2005) mostraram também, num modelo animal de esclerosemúltipla (EAE induzida por MOG, myelin-oligodendrocyte-glycoprotein), um aumento do número decélulas Tregs CD4 + CD25 high , um aumento da expressão de Foxp3, uma mudança de reconhecimentode epítopos antigênicos, e uma acentuada redução de auto-anticorpo anti-MOG nos camundongosapós o transplante de medula óssea autólogo. Baseando-se neste trabalho e no de Kleer et al.(2005), pode ser proposto que a melhora da produção de células Treg pelo timo após o transplantedeve constituir um mecanismo de tolerância após o TACTH e necessita de mais investigação emhumanos e em outras DAIs.Interessantemente, um outro trabalho recente (Kared et al., 2005) mostrou que o tratamentocom G-CSF foi capaz de prevenir o desenvolvimento de diabete em camundongos NOD através dorecrutamento de células dendríticas plasmocitóides (DC2) com propriedades tolerogênicas, e decélulas Tregs CD4 + CD25 high funcionais. À medida que aprendermos mais sobre células T reguladorase células dendríticas tolerogênicas, deverá ser possível no futuro “enriquecer” o enxerto de célulastronco com essas subpopulações celulares, com o intuito de apressar a recuperação da tolerânciaapós o TACTH. Nesse cenário, essas populações celulares reguladoras e tolerogênicas teriam umpapel na “re-educação” de qualquer célula auto-reativa residual no paciente ou no enxerto e no “redirecionamento”da resposta auto-imune em favor da auto-tolerância.

6 Conclusões

Conclusões 167• Na reconstituição imunológica observada nos pacientes com DM até um ano de seguimento póstransplantee nos pacientes com EM até dois de seguimento pós-transplante, predominarammecanismos timo-independentes. Após o transplante, houve uma predominância de células T dememória central, memória efetora e também de células T efetoras diferenciadas, principalmentede linfócitos T CD8 + . Esse fato é provavelmente devido à expansão homeostática periférica delinfócitos T de memória residuais que sobreviveram ao regime de condicionamento ou foram reinfundidoscom as células tronco no momento do transplante. A proliferação homeostática não foisuficiente para restabelecer a população de linfócitos T CD4 + durante o período pós-transplanteanalisado. Em contraste, a recuperação do número de linfócitos T CD3 + e T CD8 + foi rapidamentealcançada pela proliferação homeostática de células T CD8 + de memória. Esses dados indicamque a supressão da atividade inflamatória da doença auto-imune, observada na maioria dospacientes transplantados durante o período pós-transplante avaliado, não dependeu dapersistência da linfopenia causada pela imunossupressão em altas doses. O aumento acentuadode linfócitos T CD8 + e diminuição dos linfócitos T CD4 + resultou na inversão da razão CD4 + :CD8 +durante todo o seguimento pós-transplante. O número de linfócitos T CD4 + e CD8 + naive,incluindo o de células T CD4 + CD45RA + CD31 + recém imigrantes do timo, não recuperou os níveisbasais durante o período pós-transplante analisado. Nos pacientes com DM, a partir de novemeses pós-transplante, o número dessas células apresentou uma tendência a aumentar.• O número de linfócitos B CD19 + voltou aos níveis basais três meses pós-transplante nospacientes com DM e seis meses pós-transplante nos pacientes com EM. As células NKretornaram aos níveis pré-transplante três meses após o TACTH. A freqüência de linfócitos TCD4 + e CD8 + que expressam Fas aumentou principalmente nos seis primeiros meses póstransplantenos pacientes com DM e no primeiro ano pós-transplante nos pacientes com EM,sugerindo uma suscetibilidade aumentada à apoptose. Nesses períodos, houve também umaumento acentuado de linfócitos com fenótipo ativado, linfócitos T CD3 + HLA - DR + e linfócitos BCD19 + CD38 + .• Após o transplante, houve um aumento na porcentagem de células T CD4 + e CD8 + produtoras decitocinas do padrão T H 1 (INF-γ e TNF-α), que está associado ao aumento de linfócitos T dememória central e efetora, as subpopulações celulares predominantes nesse período dareconstituição imunológica. Ocorreu uma diminuição na freqüência de células T CD4 + e CD8 +

Conclusões 168positivas para a citocina IL-2 após o transplante, que está associada ao número diminuído decélulas T naive nos pacientes. Em geral, foi observado um aumento da porcentagem de células TCD4 + e CD8 + produtoras de citocinas do padrão T H 2 (IL-4, IL-5 e IL-10), no período de précondicionamentoe em vários períodos após o TACTH, embora esse aumento tenha sidoestatisticamente significante somente no pré-condicionamento, D+180 e D+270 nos pacientescom DM. A presença de um maior número de células com perfil T H 2 pode ter um papel nasupressão da atividade inflamatória da doença nesses pacientes.• As análises do repertório de linfócitos T dos pacientes com DM ou EM transplantados, porTCRBV CDR3 Spectratyping, mostraram que a maioria das famílias Vβ do TCR, antes e após otransplante, eram policlonais e apresentavam um perfil de distribuição dos picos anormal ou nãogaussiano.No entanto, várias dessas famílias Vβ policlonais, com perfil de distribuição dos picosnão-gaussiano, apresentaram expansões dominantes de 1-2 picos de CDR3. Essas expansõesforam encontradas nos pacientes principalmente seis meses após o TACTH e estão associadas àfase linfopênica da reconstituição imunológica, caracterizada pela proliferação homeostática decélulas T de memória residuais que sobreviveram ao regime de condicionamento. Essa fasetambém foi caracterizada pela presença de algumas famílias Vβ em expansões oligoclonais oumonoclonais. Além disso, alguns pacientes apresentaram famílias em expansões oligoclonais oumonoclonais no período pré-transplante, que se mantiveram após o transplante em algunspacientes e em outros não. Em geral, as famílias Vβ analisadas apresentaram segmentos deCDR3 variáveis como o pico de maior freqüência.• Foram identificados quatro padrões básicos de reconstituição do repertório da cadeia Vβ dosTCRs pelas análises por TCRBV CDR3 Spectratyping. O padrão II, que consistiu nareconstituição da diversidade a partir de um repertório pré-transplante diverso, foi o maisdominante em todos os pacientes analisados. Em algumas famílias Vβ foi observado padrão I,que consistiu na recuperação da diversidade a partir de um repertório pré-transplante restrito, oque sugere um aumento da diversidade do repertório após o transplante. Os padrões dereconstituição III (reaparecimento total ou parcial de um repertório pré-transplante restrito) e IV(reconstituição de um repertório restrito a partir de um repertório pré-transplante diverso) tambémforam observados para algumas poucas famílias Vβ.

Conclusões 169• Foram observadas mudanças na composição do repertório de células T após o TACTH,evidenciadas por alterações qualitativas e quantitativas dos picos de CDR3 das famílias Vβ. Adiversidade do repertório da cadeia Vβ do TCR diminuiu em quatro dentre os cinco pacientes comDM analisados, que foram acompanhados por um até ano pós-transplante. Já, dentre oitopacientes com EM analisados, com seguimentos de até dois anos pós-transplante, quatroapresentaram um aumento da diversidade do repertório de células T após o transplante, e nosoutros quatro a diversidade diminuiu. Em geral, os resultados das análises do repertório dacadeia Vβ do TCR, sugerem uma mudança profunda na composição do repertório de células Tapós o TACTH, que poderia explicar a indução da remissão da doença auto-imune nos pacientes.• Foi observada uma rápida reconstituição de células T CD4 + CD25 high após o transplante, quesugere uma expansão homeostática preferencial dessas células dentro da população de células TCD4 + , durante a fase linfopênica da reconstituição imunológica. Além disso, foi observado umaumento na expressão do RNAm de Foxp3, marcador molecular específico para células TregsCD4+CD25 high , em três dentre quatro pacientes com DM avaliados. Dentre os cinco pacientescom EM analisados, quatro mostraram um aumento da expressão do gene Foxp3 após otransplante. Esses resultados sugerem uma melhora de mecanismos reguladores que podemcontribuir para o restabelecimento da auto-tolerância nos pacientes com DM e EM submetidos aoTACTH.

Referências

Referências 171Referências *American Diabetes Association. Diagnosis and Classification of Diabetes. Diabetes Care 2004; 27(Suppl I): S5-S10.Anderson BE, McNiff JM, Matte C, Athanasiadis I, Shlomchik WD, Shlomchik MJ. Recipient CD4+ Tcells that survive irradiation regulate chronic graft-versus-host disease. Blood 2004, 104(5):1565-1573.Anderson MS, Bluestone JA.The NOD mouse: a model of immune dysregulation. Annu Rev Immunol.2005, 23:447-85.Apostolou I, von Boehmer H. In vivo instruction of suppressor commitment in naive T cells. J Exp Med.2004, 199(10):1401-1408.Apostolou I, von Boehmer H.In vivo instruction of suppressor commitment in naive T cells. J Exp Med.2004, 199(10):1401-8.Arpinati M, Green CL, Heimfeld S, Heuser JE, Anasetti C. Granulocyte-colony stimulating factormobilizes T helper 2-inducing dendritic cells. Blood 2000, 95(8):2484-2490.Ashton-Rickardt PG, Tonegawa S. A differential-avidity model for T-cell selection. Immunol Today1994, 15(8):362-366.Atkinson MA, Kaufman DL, Campbell L, Gibbs KA, Shah SC, Bu DF, Erlander MG, Tobin AJ,Maclaren NK. Response of peripheral-blood mononuclear cells to glutamate decarboxylase in insulindependentdiabetes. Lancet 1992, 339(8791):458-459.Autran B, Leblond V, Sadat-Sowti B, Lefranc E, Got P, Sutton L, Binet JL, Debre P. A soluble factorreleased by CD8+CD57+ lymphocytes from bone marrow transplanted patients inhibits cell-mediatedcytolysis. Blood 1991, 77(10):2237-2241.Baars PA, Ribeiro Do Couto LM, Leusen JH, Hooibrink B, Kuijpers TW, Lens SM, van Lier RA.Cytolytic mechanisms and expression of activation-regulating receptors on effector-typeCD8+CD45RA+CD27- human T cells. J Immunol 2000, 165(4):1910-1917.Bach JF. Regulatory T cells under scrutiny. Nat Rev Immunol. 2003, 3(3):189-198.Bargetzi MJ, Schonenberger A, Tichelli A, Fried R, Cathomas G, Signer E, Speck B, Gratwohl A.Celiac disease transmitted by allogeneic non-T cell-depleted bone marrow transplantation. BoneMarrow Transplant. 1997, 20(7):607-609.Barthlott T, Kassiotis G, Stockinger B. T cell regulation as a side effect of homeostasis andcompetition. J Exp Med. 2003, 197(4):451-60.Bendelac A, Carnaud C, Boitard C, Bach JF. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabeticNOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J Exp Med. 1987,166(4):823-832.Bendelac A, Rivera MN, Park SH, Roark JH. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development,specificity, and function. Annu Rev Immunol. 1997, 15:535-562.* De acordo com:International Committee of Medical Journal Editors (Vancouver Style) – Grupo de Vancouver.

Referências 172Bennett CL, Christie J, Ramsdell F, Brunkow ME, Ferguson PJ, Whitesell L, Kelly TE, Saulsbury FT,Chance PF, Ochs HD. The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linkedsyndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nat Genet. 2001, 27(1):20-21.Ben-Nun A, Cohen IR. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mediated by T cell lines:process of selection of lines and characterization of the cells. J Immunol. 1982, 129(1):303-308.Berzins SP, Godfrey DI, Miller JF, Boyd RL. A central role for thymic emigrants in peripheral T cellhomeostasis. Proc Natl Acad Sci USA. 1999, 96(17):9787-9791.Berzins SP, Uldrich AP, Sutherland JS, Gill J, Miller JF, Godfrey DI, Boyd RL. Thymic regeneration:teaching an old immune system new tricks. Trends Mol. Med. 2002, 8(10):469-476.Bingley PJ, Bonifacio E, Williams AJ, Genovese S, Bottazzo GF, Gale EA. Prediction of IDDM in thegeneral population: strategies based on combinations of autoantibody markers. Diabetes 1997,46(11):1701-1710.Bluestone JA and Abbas AK. Natural versus adaptive regulatory T cells. Nature Rev Immunol 2003,3(3):253-257.Bougnères F, Landais P, Boisson C, Carel JC, Frament N, Boitard C, Chaussain JL, Bach JF. Limitedduration of remission of insulin dependency in children with recent overt type I diabetes treated withlow-dose cyclosporin. Diabetes 1990, 39(1):1264-1272.Boyum, A. Separation of blood leukocytes, granulocytes and lymphocytes. Tissue Antigens 1974,4(4):269-274.Brenchley JM, Karandikar NJ, Betts MR, Ambrozak DR, Hill BJ, Crotty LE, Casazza JP, Kuruppu J,Migueles SA, Connors M, Roederer M, Douek DC, Koup RA. Expression of CD57 defines replicativesenescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood 2003, 101(7):2711-2720.Brunkow ME, Jeffery EW, Hjerrild KA, Paeper B, Clark LB, Yasayko SA, Wilkinson JE, Galas D,Ziegler SF, Ramsdell F. Disruption of a new forkhead/winged-helix protein, scurfin, results in the fatallymphoproliferative disorder of the scurfy mouse. Nat Genet. 2001, 27(1):68-73.Burt RK, Cohen B, Rose J, Petersen F, Oyama Y, Stefoski D, Katsamakis G, Carrier E, Kozak T,Muraro PM, Martin R, Hintzen R, Slavin S, Karussis D, Haggiag S, Voltarelli JC, Ellison GW,Jovanovic B, Popat U, McGuirk J, Statkute L, Verda L, Haas J, Arnold R. Hematopoietic stem celltransplantation for multiple sclerosis. Arch Neurol 2005, 62(6): 860-864.Burt RK, Kenyon N, Voltarelli JC, Kaufman DB. Hematopoietic stem cell transplantation as treatmentfor type 1 diabetes. In: Burt RK and Marmont A (eds). Stem cell therapy for autoimmune diseases.Landes Biociences, Georgetown, Texas, USA, 2004.Burt RK, Oyama Y, Traynor A, Kenyon NS. Hematopoietic stem cell therapy for type 1 diabetes:induction of tolerance and islet cell neogenesis. Autoimmun Rev. 2002a, 1(3):133-138.Burt RK, Padilla J, Begolka WS, Canto MC, Miller SD. Effect of disease stage on clinical outcome aftersyngeneic bone marrow transplantation for relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis.Blood 1998a, 91(7):2609-2616.Burt RK, Slavin S, Burns WH, Marmont AM. Induction of tolerance in autoimmune diseases byhematopoeitic stem cell transplantation: getting closer to a cure? Blood 2002b, 99(3):768-784.Burt RK, Traynor AE, Craig R, Marmont AM. The promise of hematopoietic stem cell transplantationfor autoimmune diseases. Bone Marrow Transplantation 2003, 31(7):521-524.Burt RK, Traynor AE, Pope R, Schroeder J, Cohen B, Karlin KH, Lobeck L, Goolsby C, Rowlings P,Davis FA, Stefoski D, Terry C, Keever-Taylor C, Rosen S, Vesole D, Fishman M, Brush M, Mujias S,

Referências 173Villa M, Burns WH. Treatment of autoimmune disease by intense immunosuppressive conditioningand autologous hematopoietic stem cell transplantation. Blood 1998b, 92(10): 3505-3514.Burt RK, Traynor AE. Hematopoietic stem cell transplantation: a new therapy for autoimmune disease.Oncologist 1999; 4(1):77-83.Bustin, SA. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chainreaction assays. J Mol Endocrinol. 2000, 25: 169-193.Casrouge A, Beaudoing E, Dalle S, Pannetier C, Kanellopoulos J, Kourilsky P. Size estimate of thealpha beta TCR repertoire of naive mouse splenocytes. J Immunol. 2000, 164(11):5782-5787.Chen TC, Cobbold SP, Fairchild PJ, Waldmann H. Generation of anergic and regulatory T cellsfollowing prolonged exposure to a harmless antigen. J Immunol. 2004, 172(10):5900-5907.Chklovskaia E, Nowbakht P, Nissen C, Gratwohl A, Bargetzi M, Wodnar-Filipowicz A. Reconstitutionof dendritic and natural killer-cell subsets after allogeneic stem cell transplantation: effects ofendogenous flt3 ligand. Blood 2004, 103(10):3860-3868.Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatephenol-chloroformextraction. Anal.Biochem 1987, 162(1):156-159.Christianson SW, Shultz LD, Leiter EH. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NODscid/scidmice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabeticNOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes 1993, 42(1):44-55.Compston A, Coles A. Multiple sclerosis. Lancet 2002, 359(9313):1221-1231.Coo H, Aronson KJ. A systematic review of several potential non-genetic risk factors for multiplesclerosis. Neuroepidemiology 2004, 23(1-2):1-12.Cook JJ, Hudson I, Harrison LC, Dean B, Colman PG, Werther GA, Warne GL, Court JM. Doubleblindcontrolled trial of azathioprine in children with newly diagnosed type I diabetes. Diabetes 1989,38(6): 779-783.Cozzo C, Larkin J 3rd, Caton AJ. Cutting edge: self-peptides drive the peripheral expansion ofCD4+CD25+ regulatory T cells. J Immunol. 2003, 171(11):5678-5682.Curotto de Lafaille MA, Lino AC, Kutchukhidze N, Lafaille JJ. CD25- T cells generate CD25+Foxp3+regulatory T cells by peripheral expansion. J Immunol. 2004, 173(12):7259-7268.Davidson A, Diamond B. Autoimmune diseases. N Engl J Med 2001; 345(5):340-350.Davis MM, Bjorkman PJ. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature 1988,334(6181):395-402.de Kleer I, Vastert B, Klein M, Teklenburg G, Arkesteijn G, Yung GP, Albani S, Kuis W, Wulffraat N,Prakken B. Autologous stem cell transplantation for autoimmunity induces immunologic self-toleranceby reprogramming autoreactive T cells and restoring the CD4+CD25+ immune regulatory network.Blood 2006, 107(4):1696-1702.de Kleer I, Wedderburn LR, Taams LS, Patel A, Varsani H, Klein M, de Jager W, Pugayung G,Giannoni F, Rijkers G, Albani S, Kuis W, Prakken B. CD4+CD25bright regulatory T cells activelyregulate inflammation in the joints of patients with the remitting form of juvenile idiopathic arthritis. JImmunol. 2004, 172(10):6435-6443.Dighiero G, Rose NR. Critical self-epitopes are key to the understanding of self-tolerance andautoimmunity. Immunol Today. 1999, 20(9):423-428.

Referências 174Douek DC, McFarland RD, Keiser PH, Gage EA, Massey JM, Haynes BF, Polis MA, Haase AT,Feinberg MB, Sullivan JL, Jamieson BD, Zack JA, Picker LJ, Koup RA. Changes in thymic functionwith age and during the treatment of HIV infection. Nature 1998, 396(6712):690-695.Douek DC, Vescio RA, Betts MR, Brenchley JM, Hill BJ, Zhang L, Berenson JR, Collins RH, Koup RA.Assessment of thymic output in adults after haematopoietic stem-cell transplantation and prediction ofT-cell reconstitution. Lancet. 2000, 355(9218):1875-1881.Douek DC. The contribution of the thymus to immune reconstitution after hematopoietic stem-celltransplantation. Cytotherapy 2002, 4(5):425-426.Dyment DA, Ebers GC, Sadovnick AD. Genetics of multiple sclerosis. Lancet Neurol. 2004, 3(2):104–110Effros RB, Pawelec G. Replicative senescence of T cells: does the Hayflick Limit lead to immuneexhaustion? Immunol. Today 1997, 18(9):450–454.Elliott RB, Crossley JR, Berryman CC, James AG. Partial preservation of pancreatic β-cell function inchildren with diabetes. Lancet 1981, 2(8247): 631-632.Encinas JA, Kuchroo VK. Mapping and identification of autoimmunity genes. Curr Opin Immunol 2000;12(6):691-697.Ernst B, Lee DS, Chang JM, Sprent J, Surh CD. The peptide ligands mediating positive selection inthe thymus control T cell survival and homeostatic proliferation in the periphery. Immunity 1999,11(2):173-181.Euler HH, Marmont AM, Bacigalupo A, Fastenrath S, Dreger P, Hoffknecht M, Zander AR, Schalke B,Hahn U, Haas R, Schmitz N. Early recurrence or persistence of autoimmune diseases afterunmanipulated autologous stem cell transplantation. Blood 1996;88(9):3621-3625.Eyrich M, Leiler C, Croner T, Lang P, Schumm M, Mascher B, Schilbach K, Klingebiel T,Handgretinger R, Niethammer D, Schlegel PG. Impaired T-cell activation and cytokine productivityafter transplantation of positively selected CD34+ allogeneic hematopoietic stem cells. Hematol J.2004, 5(4):329-340.Fallen PR, Duarte RF, McGreavey L, Potter M, Ethell M, Prentice HG, Madrigal JA, Travers PJ.Identification of non-naïve CD4+CD45RA+ T cell subsets in adult allogeneic haematopoietic celltransplant recipients. Bone Marrow Transplant 2003; 32(6):609-616.Fallen PR, McGreavey L, Madrigal JA, Potter M, Ethell M, Prentice HG, Guimarães A, Travers PJ.Factors affecting reconstitution of the T cell compartment in allogeneic haematopoietic cell transplantrecipients. Bone Marrow Transplant 2003; 32(10):1001-1014.Farge D, Henegar C, Carmagnat M, Daneshpouy M, Marjanovic Z, Rabian C, Ilie D, Douay C, MounierN, Clave E, Bengoufa D, Cabane J, Marolleau JP, Gluckman E, Charron D, Toubert A. Analysis ofimmune reconstitution after autologous bone marrow transplantation in systemic sclerosis. ArthritisRheum. 2005, 52(5):1555-1563.Fassas A, Kimiskidis VK. Stem cell transplantation for multiple sclerosis: what is the evidence? BloodRev. 2003, 17(4):233–240.Fontenot JD, Rasmussen JP, Williams LM, Dooley JL, Farr AG, Rudensky AY. Regulatory T celllineage specification by the forkhead transcription factor foxp3. Immunity 2005, 22(3):329-341.Fontenot JD, Rudensky AY. A well adapted regulatory contrivance: regulatory T cell development andthe forkhead family transcription factor Foxp3. Nat Immunol. 2005, 6(4):331-337.

Referências 175Franzke A, Piao W, Lauber J, Gatzlaff P, Konecke C, Hansen W, Schmitt-Thomsen A, Hertenstein B,Buer J, Ganser A. G-CSF as immune regulator in T cells expressing the G-CSF receptor: implicationsfor transplantation and autoimmune diseases. Blood 2003, 102(2):734-739.Garcia KC, Degano M, Stanfield RL, Brunmark A, Jackson MR, Peterson PA, Teyton L, Wilson IA. Analphabeta T cell receptor structure at 2.5 A and its orientation in the TCR-MHC complex. Science1996, 274(5285):209-219.Garcia KC, Teyton L, Wilson IA. Structural basis of T cell recognition. Annu Rev Immunol. 1999,17:369-397.Gavin MA, Clarke SR, Negrou E, Gallegos A, Rudensky A. Homeostasis and anergy ofCD4(+)CD25(+) suppressor T cells in vivo. Nat Immunol. 2002, 3(1):33-41.Gbadamosi J, Buhmann C, Tessmer W, Moench A, Haag F, Heesen C. Effects of mitoxantrone onmultiple sclerosis patients’ lymphocyte subpopulations and production of immunoglobulin, TNF-alphaand IL-10. Eur. Neurol. 2003, 49(3):137-141.Ge Q, Hu H, Eisen HN, Chen J. Different contributions of thymopoiesis and homeostasis-drivenproliferation to the reconstitution of naive and memory T cell compartments. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 2002, 99(5):2989-2994.Genain CP, Cannella B, Hauser SL, Raine CS. Identification of autoantibodies associated with myelindamage in multiple sclerosis. Nat. Med. 1999, 5(2):170-175Gestri D, Baldacci L, Taiuti R, Galli E, Maggi E, Piccinni MP, Vergelli M, Massacesi L. Oligoclonal Tcell repertoire in cerebrospinal fluid of patients with inflammatory diseases of the nervous system. JNeurol Neurosurg Psychiatry. 2001, 70(6):767-772.Goebels N, Hofstetter H, Schmidt S, Brunner C, Wekerle H, Hohlfeld R. Repertoire dynamics ofautoreactive T cells in multiple sclerosis patients and healthy subjects: epitope spreading versus clonalpersistence. Brain 2000, 123(Pt 3):508-518.Goldrath AW, Bevan MJ. Low-affinity ligands for the TCR drive proliferation of mature CD8+ T cells inlymphopenic hosts. Immunity 1999, 11(2):183-190.Goldrath AW, Bevan MJ. Selecting and maintaining a diverse T-cell repertoire. Nature 1999,402(6759):255-262.Goldrath AW, Bogatzki LY, Bevan MJ. Naive T cells transiently acquire a memory-like phenotypeduring homeostasis driven proliferation. J. Exp. Med. 2000, 192(4):557–564.Good R, Ikehara S. Preclinical investigations that subserve efforts to employ bone marrowtransplantation for rheumatoid or autoimmune diseases. J Rheumatol Suppl. 1997, 48:5-12.Goodnow CC, Sprent J, Fazekas de St Groth B, Vinuesa CG. Cellular and genetic mechanisms of selftolerance and autoimmunity. Nature 2005, 435(7042):590-597.Gorochov G, Debre P, Leblond V, Sadat-Sowti B, Sigaux F, Autran B. 1994. Oligoclonal expansion ofCD8+CD57+ T cells with restricted T-cell receptor beta chain variability after bone marrowtransplantation. Blood 1994, 83(2):587-595.Gorski J, Yassai M, Zhu X, Kissela B, Keever C, Flomenberg N. Circulating T cell repertoirecomplexity in normal individuals and bone marrow recipients analyzed by CDR3 spectratyping:correlation with the immune status. J. Immunol.1994, 152(10):5109-5119.Gran B, Gestri D, Sottini A, Quiros Roldan E, Bettinardi A, Signorini S, Primi D, Ballerini C, Taiuti R,Amaducci L, Massacesi L. Detection of skewed T-cell receptor V-beta gene usage in the peripheralblood of patients with multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 1998, 85(1):22-32.

Referências 176Gratwohl A, Tyndall A. From autoimmunity to stem cell transplantation. Clinical Reviews inHematology/Oncology 1999; 30(2): 159-172.Grossman WJ, Verbsky JW, Barchet W, Colonna M, Atkinson JP, Ley TJ. Human T regulatory cellscan use the perforin pathway to cause autologous target cell death. Immunity 2004, 21(4):589-601.Guillaume T, Rubinstein DB, Symann M. Immune reconstitution and immunotherapy after autologoushematopoietic stem cell transplantation. Blood 1998; 92(5):1471-1490.Hafler DA. Multiple sclerosis. J. Clin. Invest. 2004, 113(6):788–794.Hahn BH. The potential role of stem cell transplantation in patients with systemic lupus erythematosus.J Rheumatol 1997; 24 (Suppl 48): 89-93.Haines JL, Terwedow HA, Burgess K, Pericak-Vance MA, Rimmler JB, Martin ER, Oksenberg JR,Lincoln R, Zhang DY, Banatao DR, Gatto N, Goodkin DE, Hauser SL. Linkage of the MHC to familialmultiple sclerosis suggests genetic heterogeneity. The Multiple Sclerosis Genetics Group. Hum MolGenet. 1998, 7(8):1229-1234.Hakim FT, Cepeda R, Kaimei S, Mackall CL, McAtee N, Zujewski J, Cowan K, Gress RE. Constraintson CD4 recovery postchemotherapy in adults: thymic insufficiency and apoptotic decline of expandedperipheral CD4 cells. Blood 1997, 90(9):3789-3798.Hakim FT, Memon SA, Cepeda R, Jones EC, Chow CK, Kasten-Sportes C, Odom J, Vance BA,Christensen BL, Mackall CL, Gress RE. Age-dependent incidence, time course, and consequences ofthymic renewal in adults. J Clin Invest. 2005, 115(4):930-939.Hamann D, Baars PA, Hooibrink B, van Lier RW. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population:two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms.Blood 1996; 88(9):3513-3521.Hamann D, Baars PA, Rep MH, Hooibrink B, Kerkhof-Garde SR, Klein MR, van Lier RA. Phenotypicand functional separation of memory and effector human CD8+ Tcells. J Exp Med 1997, 186(9):1407–1418.Haraguchi K, Takahashi T, Hiruma K, Kanda Y, Tanaka Y, Ogawa S, Chiba S, Miura O, Sakamaki H,Hirai H. Recovery of Valpha24+ NKT cells after hematopoietic stem cell transplantation. Bone MarrowTransplant. 2004, 34(7):595-602.Harrison LC, Colman PG, Dean B, Baxter R, Martin FI. Increase in remission rate in newly diagnosedtype l diabetic subjects treated with azathioprine. Diabetes 1985, 34(12):1306-1308.Hawkes CJ, Schloot NC, Marks J, Willemen SJ, Drijfhout JW, Mayer EK, Christie MR, Roep BO. T-celllines reactive to an immunodominant epitope of the tyrosine phosphatase-like autoantigen IA-2 in type1 diabetes. Diabetes 2000, 49(3):356-366.Hemmer B, Archelos JJ, Hartung HP. New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis.Nat Rev Neurosci. 2002, 3(4):291-301.Herold KC, Hagopian W, Auger JA, Poumian-Ruiz E, Taylor L, Donaldson D, Gitelman SE, HarlanDM, Xu D, Zivin RA, Bluestone JA. Anti-CD3 monoclonal antibody in new-onset type 1 diabetesmellitus. N Eng J Med 2002, 346(22):1692-1698.Herrmann MM, Gaertner S, Stadelmann C, van den Brandt J, Boscke R, Budach W, Reichardt HM,Weissert R. Tolerance induction by bone marrow transplantation in a multiple sclerosis model. Blood2005, 106(5):1875-1883.Hess D, Li L, Martin M, Sakano S, Hill D, Strutt B, Thyssen S, Gray DA, Bhatia M. Bone marrowderivedstem cells initiate pancreatic regeneration. Nature Biotech 2003, 21(7):763-770.

Referências 177Hogquist KA, Baldwin TA, Jameson SC. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat RevImmunol. 2005, 5(10):772-82.Holbrook MR, Tighe PJ, Powell RJ. Restrictions of T cell receptor β chain repertoire in the peripheralblood of patients with systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis 1996; 55(9): 627-631.Hough RE, Snowden JA., Wulffraat NM. Haematopoietic stem cell transplantation in autoimmunediseases: a European perspective. Br. J. Haematol 2005, 128(4):432-459.Hug A, Korporal M, Schroder I, Haas J, Glatz K, Storch-Hagenlocher B, Wildemann B. Thymic exportfunction and T cell homeostasis in patients with relapsing remitting multiple sclerosis. J. Immunol.2003, 171(1):432–437.Ikehara S, Good RA, Nakamura T, Sekita K, Inoue S, Oo MM, Muso E, Ogawa K, Hamashima Y.Rationale for bone marrow transplantation in the treatment of autoimmune diseases. Proc. Natl Acad.Sci. USA 1985, 82(8), 2483-2487, 1985.Ikehara S, Kawamura M, Takao F, Inaba M, Yasumizu R, Than S, Hisha H, Sugiura K, Koide Y,Yoshida TO, Ida T, Imura H, Good RA. Organ-specific and systemic autoimmune diseases originatefrom defects in haematopoietic stem cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1990, 87(21):8341-8344.Ikehara S, Yasumizu R, Inaba M, Izui S, Hayakawa K, Sekita K, Toki J, Sugiura K, Iwai H, NakamuraT, Muso E, Hamashima Y, Good RA. Long-term observations of autoimmune-prone mice treated forautoimmune disease by allogeneic bone marrow transplantation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1989,86(9):3306-3310.Ikehara S. Bone marrow transplantation for autoimmune diseases. Acta Haematol. 1998, 99(3):116-132.Itoh N, Hanafusa T, Miyazaki A, Miyagawa J, Yamagata K, Yamamoto K, Waguri M, Imagawa A,Tamura S, Inada M, Kawata S, Tarui S,Kono N, Matsuzawa Y. Mononuclear cell infiltration and itsrelation to the expression of major histocompatibility complex antigens and adhesion molecules inpancreas biopsy specimens from newly diagnosed insulin-dependent diabetes mellitus patients. J ClinInvest. 1993, 92(5):2313-2322.Itoh N, Imagawa A, Hanafusa T, Waguri M, Yamamoto K, Iwahashi H, Moriwaki M, Nakajima H,Miyagawa J, Namba M, Makino S, Nagata S, Kono N, Matsuzawa Y. Requirement of Fas for thedevelopment of autoimmune diabetes in nonobese diabetic mice. J Exp Med. 1997, 186(4):613-618.Jacobsen M, Cepok S, Quak E, Happel M, Gaber R, Ziegler A, Schock S, Oertel WH, Sommer N,Hemmer B. Oligoclonal expansion of memory CD8+ T cells in cerebrospinal fluid from multiplesclerosis patients. Brain 2002, 125(Pt 3):538-550.Jaeckel E, Kretschmer K, Apostolou I, von Boehmer H. Instruction of Treg commitment in peripheral Tcells is suited to reverse autoimmunity. Semin Immunol. 2006, 18(2):89-92.Jameson SC. Maintaining the norm: T-cell homeostasis. Nat Rev Immunol. 2002, 2(8):547-556.Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, Schwartz RE, Keene CD, Ortiz-Gonzalez XR, Reyes M, LenvikT, Lund T, Blackstad M, Du J, Aldrich S, Lisberg A, Low WC, Largaespada DA, Verfaillie CM.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 2002, 418(6893):41-49.Jun HS, Khil LY, Yoon JW. Role of glutamic acid decarboxylase in the pathogenesis of type 1diabetes. Cell Mol Life Sci. 2002, 59(11):1892-1901.Jun HX, Jun CY, Yu ZX. In vivo induction of T-cell hyporesponsiveness and alteration ofimmunological cells of bone marrow grafts using granulocyte colony-stimulating factor. Haematologica2004, 89(12):1517-24.

Referências 178Kagi D, Odermatt B, Seiler P, Zinkernagel RM, Mak TW, Hengartner H. Reduced incidence anddelayed onset of diabetes in perforin-deficient nonobese diabetic mice. J Exp Med. 1997, 186(7):989-997.Kared H, Masson A, Adle-Biassette H, Bach JF, Chatenoud L, Zavala F. Treatment with granulocytecolony-stimulating factor prevents diabetes in NOD mice by recruiting plasmacytoid dendritic cells andfunctional CD4(+)CD25(+) regulatory T-cells. Diabetes. 2005, 54(1):78-84.Kayser C, Alberto FL, da Silva NP, Andrade LE. Decreased number of T cells bearing TCRrearrangement excision circles (TREC) in active recent onset systemic lupus erythematosus. Lupus2004, 13(12):906-911.Kelly MA, Rayner ML, Mijovic CH, Barnett AH. Molecular aspects of type 1 diabetes. Mol Pathol. 2003,56(1):1-10.Keymeulen B, Vandemeulebroucke E, Ziegler AG, Mathieu C, Kaufman L, Hale G, Gorus F, GoldmanM, Walter M, Candon S, Schandene L, Crenier L, De Block C, Seigneurin JM, De Pauw P, Pierard D,Weets I, Rebello P, Bird P, Berrie E, Frewin M, Waldmann H, Bach JF, Pipeleers D, Chatenoud L.Insulin needs after CD3-antibody therapy in new-onset type 1 diabetes. N Engl J Med 2005,352(25):2598-2608.Kimmig S, Przybylski GK, Schmidt CA, Laurisch K, Mowes B, Radbruch A, Thiel A. Two subsets ofnaïve T helper cells with distinct T cell receptor excision circle content in human adult peripheral blood.J Exp Med 2002; 195(6):789-794.King C, Ilic A, Koelsch K, Sarvetnick N. Homeostatic expansion of T cells during immune insufficiencygenerates autoimmunity. Cell. 2004, 117(2):265-77.Klangsinsirikul P, Russell NH. Peripheral blood stem cell harvests from G-CSF-stimulated donorscontain a skewed Th2 CD4 phenotype and a predominance of type 2 dendritic cells. Exp Hematol.2002, 30(5):495-501.Knip M, Akerblom HK. Environmental factors in the pathogenesis of type 1 diabetes mellitus. Exp ClinEndocrinol Diabetes. 1999, 107(Suppl 3):S93-100.Koehne G, Zeller W, Stockschlaeder M, Zander AR. Phenotype of lymphocyte subsets afterautologous peripheral blood stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant. 1997, 19(2):149-156.Koetz K, Bryl E, Spickschen K, O'Fallon WM, Goronzy JJ, Weyand CM. T cell homeostasis in patientswith rheumatoid arthritis. Proc Natl Acad Sci USA. 2000, 97(16):9203-9208.Kondo M, Wagers AJ, Manz MG, Prohaska SS, Scherer DC, Beilhack GF, Shizuru JA, Weissman IL.Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu RevImmunol. 2003, 21:759-806.Kotter I, Daikeler T, Einsele H, Koch S, Lochmann L, Kanz L, Loffler J. Relapse of autoimmunediseases after autologous T cell depleted stem cell transplantation may be triggered by T cells recentlyemigrated from the thymus. Ann Rheum Dis. 2005, 64(12):1787-9.Kronenberg M, Rudensky A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature 2005,435(7042):598-604.Kurtzke JF. Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an expanded disability status scale.Neurology 1983, 33:1444-1452.Lampeter EF, McCann SR, Kolb H. Transfer of diabetes type 1 by bone marrow transplantation.Lancet 1998, 351(9102):568-569.

Referências 179Laplaud DA, Ruiz C, Wiertlewski S, Brouard S, Berthelot L, Guillet M, Melchior B, Degauque N, EdanG, Brachet P, Damier P, Soulillou JP. Blood T-cell receptor beta chain transcriptome in multiplesclerosis. Characterization of the T cells with altered CDR3 length distribution. Brain 2004, 127(Pt5):981-995.Laylor R, Dewchand H, Simpson E, Dazzi F. Engraftment of allogeneic hematopoietic stem cellsrequires both inhibition of host-versus-graft responses and 'space' for homeostatic expansion.Transplantation 2005, 79(11):1484-91.Livak KJ and Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitativePCR and the 2 -ΔΔC T method. Methods 2001, 25:402-408.Luppi P, Zanone MM, Hyoty H, Rudert WA, Haluszczak C, Alexander AM, Bertera S, Becker D,Trucco M. Restricted TCR V beta gene expression and enterovirus infection in type I diabetes: a pilotstudy. Diabetologia 2000, 43(12):1484-1497.Mackall CL, Fleisher TA, Brown MR, Andrich MP, Chen CC, Feuerstein IM, Magrath IT, Wexler LH,Dimitrov DS, Gress RE. Distinctions between CD8+ and CD4+ T-cell regenerative pathways result inprolonged T-cell subset imbalance after intensive chemotherapy. Blood 1997, 89(10):3700–3707.Mackall CL, Fleisher TA, Brown MR, Andrich MP, Chen CC, Feuerstein IM, Horowitz ME, Magrath IT,Shad AT, Steinberg SM, Wexler LH, Gress RE. Age, thymopoiesis, and CD4+ T-lymphocyteregeneration after intensive chemotherapy. N Engl J Med. 1995, 332(3):143-149.Mackall CL, Granger L, Sheard MA, Cepeda R, Gress RE. T-cell regeneration after bone marrowtransplantation: differential CD45 isoform expression on thymic-derived versus thymic-independentprogeny. Blood 1993, 82(8):2585-2594.Malphettes M, Carcelain G, Saint-Mezard P, Leblond V, Altes HK, Marolleau JP, Debre P, Brouet JC,Fermand JP, Autran B. Evidence for naive T-cell repopulation despite thymus irradiation afterautologous transplantation in adults with multiple myeloma: role of ex vivo CD34+ selection and age.Blood 2003, 101(5):1891-1897.Marrack P, Kappler J, Kotzin BL. Autoimmune disease: why and where it occurs. Nature medicine2001; 7(8):899-905.Mathews V, Hanson PT, Ford E, Fujita J, Polonsky KS, Graubert TA. Recruitment of bone marrowderivedendothelial cells to sites of pancreatic beta-cell injury. Diabetes 2004, 53(1):91-98.Mathis D, Vence L, Benoist C. Beta-Cell death during progression to diabetes. Nature 2001,414(6865):792-798.Matsumoto Y, Yoon WK, Jee Y, Fujihara K, Misu T, Sato S, Nakashima I, Itoyama Y.Complementarity-determining region 3 spectratyping analysis of the TCR repertoire in multiplesclerosis. J Immunol. 2003, 170(9):4846-4853.Mellor AL, Munn DH. IDO expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan catabolism. Nat RevImmunol. 2004, 4(10):762-774.Mollet L, Sadat-Sowti B, Duntze J, Leblond V, Bergeron F, Calvez V, Katlama C, Debre P, Autran B.CD8hi+CD57+ T lymphocytes are enriched in antigen-specific T cells capable of down-modulatingcytotoxic activity. Int Immunol 1998, 10(3):311-323.Monteiro J, Batliwalla F, Ostrer H, Gregersen PK. Shortened telomeres in clonally expanded CD28-CD8+ T cells imply a replicative history that is distinct from their CD28+CD8+ counterparts. J.Immunol. 1996, 156(10):3587-3590.Morley JK, Batliwalla FM, Hingorani R, Gregersen PK. Oligoclonal CD8+ T cells are preferentiallyexpanded in the CD57+ subset. J. Immunol. 1995, 154(11):6182-6190.

Referências 180Morton JI, Siegel BV. Transplantation of autoimmune potential. Development of antinuclear antibodiesin H-2 histocompatible recipients of bone marrow from New Zealand Black mice. Proc. Natl Acad. Sci.USA 1974, 71(6): 2162-2165..Mosmann TR, Li L, Sad S. Functions of CD8 T-cell subsets secreting different cytokine patterns.Semin Immunol. 1997, 9(2):87-92.Murali-Krishna K, Ahmed R. Cutting edge: naive T cells masquerading as memory cells. J. Immunol.2000, 165(4):1733-1737.Muraro PA and Martin R. Immunological questions on hematopoietic stem cell transplantation formultiple sclerosis. Bone Marrow Transplant 2003, 32:S41–S44.Muraro PA, Bonanni L, Mazzanti B, Pantalone A, Traggiai E, Massacesi L, Vergelli M, Gambi D. Shorttermdynamics of circulating T cell receptor V beta repertoire in relapsing-remitting MS. JNeuroimmunol. 2002, 127(1-2):149-159.Muraro PA, Cassiani Ingoni R, Martin R. Hematopoietic stem cell transplantation for multiple sclerosis:current status and future challenges. Curr. Opin. Neurol. 2003, 16(3):299–305.Muraro PA, Douek DC, Packer A, Chung K, Guenaga FJ, Cassiani-Ingoni R, Campbell C, Memon S,Nagle JW, Hakim FT, Gress RE, McFarland HF, Burt RK, Martin R. Thymic output generates a newand diverse TCR repertoire after autologous stem cell transplantation in multiple sclerosis patients. J.Exp. Med. 2005, 201(5):805-816.Muraro PA, Douek DC. Renewing the T cell repertoire to arrest autoimmune aggression. TrendsImmunol. 2006, 27(2):61-67.Naquet P, Ellis J, Tibensky D, Kenshole A, Singh B, Hodges R, Delovitch TL. T cell autoreactivity toinsulin in diabetic and related non-diabetic individuals. J Immunol. 1988, 140(8):2569-2578.Nelson JL, Torrez R, Louie FM, Choe OS, Storb R, Sullivan KM. Pre-existing autoimmune disease inpatients with long-term survival after allogeneic marrow transplantation. J. Rheumatol. 1997; 24 (Suppl48): 23-29.Nikolic B, Takeuchi Y, Leykin I, Fudaba Y, Smith RN, Sykes M. Mixed hematopoietic chimerism allowscure of autoimmune diabetes through allogeneic tolerance and reversal of autoimmunity. Diabetes2004, 53(2):376-383.Nikolich-Zugich J, Slifka MK, Messaoudi I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. NatRev Immunol. 2004, 4(2):123-132.Notkins AL, Lernmark A. Autoimmune type 1 diabetes: resolved and unresolved issues. J Clin Invest2001, 108(9): 1247-1252.Notkins AL. Immunologic and genetic factors in type 1 diabetes. J Biol Chem. 2002, 277(46):43545-43548.Ogawa M, Maruyama T, Hasegawa T, Kanaya T, Kobayashi F, Tochino Y, . et al. The inhibitory effectof neonatal thymectomy on the incidence of insulitis in non-obese diabetes (NOD) mice. Biomed. Res.1985, 6:103–106.Openshaw H, Nash RA, McSweeney PA. High dose immunosuppression and hematopoeitic stem celltransplantation in autoimmune disease: clinical review. Biol Blood Marrow Transplant 2002; 8:233-248.Palmer JP, Fleming GA, Greenbaum CJ, Herold KC, Jansa LD, Kolb H, Lachin JM, Polonsky KS,Pozzilli P, Skyler JS, Steffes MW. C-peptide is the appropriate outcome measure for type 1 diabetesclinical trials to preserve β-cell function. Diabetes 2004; 53(1): 250-264.

Referências 181Pan L, Delmonte J Jr, Jalonen CK, Ferrara JL. Pretreatment of donor mice with granulocyte colonystimulatingfactor polarizes donor T lymphocytes toward type-2 cytokine production and reducesseveity of experimental graft-versus-host disease. Blood 1995, 86(12):4422-9.Pannetier C, Cochet M, Darche S, Casrouge A, Zoller M, Kourilsky P. The sizes of the CDR3hypervariable regions of the murine T-cell receptor beta chains vary as a function of the recombinedgerm-line segments. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993, 90(9):4319-4323.Pannetier C, Even J, Kourilsky P. T-cell repertoire diversity and clonal expansions in normal andclinical samples. Immunol.Today 1995, 16(4):176-181.Peggs KS, Mackinnon S. Immune reconstitution following haematopoietic stem cell transplantation. BrJ Haematol. 2004, 124(4):407-420.Peggs KS, Verfuerth S, Pizzey A, Khan N, Moss P, Goldstone AH, Yong K, Mackinnon S.Reconstitution of T-cell repertoire after autologous stem cell transplantation: influence of CD34selection and cytomegalovirus infection. Biol. Blood Marrow Transplant. 2003, 9(3):198-205.Pettinelli CB, McFarlin DE. Adoptive transfer of experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J miceafter in vitro activation of lymph node cells by myelin basic protein: requirement for Lyt 1+ 2- Tlymphocytes. J Immunol. 1981, 127(4):1420-1423.Pfaffl, MW. A new mathematical model for relative quantification for real time RT-PCR. Nucleic AcidsRes. 2001, 29: 2002-2007.Popat U, Krance R. Haematopoietic stem cell transplantation for autoimmune disorders: the Americanperspective. Br. J. Haematol 2004, 126(5):637-649.Posnett DN, Schmelkin I, Burton DA, August A, McGrath H, Mayer LF. T cell antigen receptor V geneusage. Increases in V beta 8+ T cells in Crohn's disease. J Clin Invest. 1990, 85(6):1770-1776.Pulendran B, Banchereau J, Burkeholder S, Kraus E, Guinet E, Chalouni C, Caron D, Maliszewski C,Davoust J, Fay J, Palucka K. Flt3-ligand and granulocyte colony-stimulating factor mobilize distincthuman dendritic cell subsets in vivo. J Immunol. 2000, 165(1):566-572.Qin Y, Duquette P, Zhang Y, Talbot P, Poole R, Antel J. Clonal expansion and somatic hypermutationof V(H) genes of B cells from cerebrospinal fluid in multiple sclerosis. J Clin Invest. 1998, 102(5):1045-1050.Raz I, Elias D, Avron A, Tamir M, Metzger M, Cohen IR. β-cell function in newly-onset type 1 diabetesand immunomodulation with a heatshock protein peptide (DiaPep277): a randomised, double-blind,phase II trial. Lancet 2001, 358(9295):1749-1753.Reimer P, Kunzmann V, Wilhelm M, Weissbrich B, Kraemer D, Berghammer H, Weissinger F. Cellularand humoral immune reconstitution after autologous peripheral blood stem cell transplantation(PBSCT). Ann. Hematol. 2003, 82(5):263–270.Rioux JD, Abbas AK. Paths to understanding the genetic basis of autoimmune disease. Nature 2005,435(7042):584-589.Rivers TM, Sprunt DH, Berry GP. Observations on attempts to produce acute disseminatedencephalomyelitis in monkeys. J. Exp. Med. 1933, 58:39–53.Roep BO, Atkinson M. Animal models have little to teach us about type 1 diabetes: 1. In support of thisproposal. Diabetologia 2004, 47(10):1650-1656.Roep BO. The role of T-cells in the pathogenesis of Type 1 diabetes: from cause to cure. Diabetologia2003, 46(3):305-321.

Referências 182Rose NR, Bona C. Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited).Immunol Today. 1993, 14(9):426-430.Ruprecht CR, Gattorno M, Ferlito F, Gregorio A, Martini A, Lanzavecchia A, Sallusto F. Coexpressionof CD25 and CD27 identifies FoxP3+ regulatory T cells in inflamed synovia. J Exp Med. 2005.201(11):1793-803.Rutella S, Zavala F, Danese S, Kared H, Leone G. Granulocyte colony-stimulating factor: a novelmediator of T cell tolerance. J Immunol. 2005, 175(11):7085-91.Sadat-Sowti B, Debre P, Mollet L, Quint L, Hadida F, Leblond V, Bismuth G, Autran B. An inhibitor ofcytotoxic functions produced by CD8+CD57+ T lymphocytes from patients suffering from AIDS andimmunosuppressed bone marrow recipients. Eur J Immunol. 1994, 24(11):2882-2888.Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, Itoh M, Toda M. Immunologic self-tolerance maintained byactivated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism ofself-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 1995, 155(3):1151-1164.Sakaguchi S. Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negativecontrol of immune responses. Annu Rev Immunol. 2004, 22:531-562.Sakaguchi S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in immunologicaltolerance to self and non-self. Nat Immunol. 2005, 6(4):345-352.Sallusto F, Geginat J, Lanzavecchia A. Central memory and effector memory T cell subsets: function,generation, and maintenance. Annu Rev Immunol. 2004, 22:745-63.Sallusto F, Lenig D, Forster R, Lipp M, Lanzavecchia A. Two subsets of memory T lymphocytes withdistinct homing potentials and effector functions. Nature 1999, 401(6754):708-712.Schall R. Estimation in generalized linear models with random effects. Biometrika 1991, 78(4):719-727.Schlenke P, Sheikhzadeh S, Weber K, Wagner T, Kirchner H. Immune reconstitution and productionof intracellular cytokines in T lymphocyte populations following autologous peripheral blood stem celltransplantation. Bone Marrow Transplant 2001; 28(3):251-257.Schmielau J, Finn OJ. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are theunderlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Res.2001, 61(12):4756-60.Selin LK, Lin MY, Kraemer KA, Pardoll DM, Schneck JP, Varga SM, Santolucito PA, Pinto AK, WelshRM. Attrition of T cell memory: selective loss of LCMV epitope-specific memory CD8 T cells followinginfections with heterologous viruses. Immunity 1999, 11(6):733–742.Selin LK, Welsh RM. Plasticity of T cell memory responses to viruses. Immunity. 2004, 20(1):5-16.Shevach EM. CD4+ CD25+ suppressor T cells: more questions than answers. Nature Rev Immunol2002, 2(6):389-400.Silverstein J, Maclaren N, Riley W, Spillar R, Radjenovic D, Jonhson. Immunosuppression withazathioprine and prednisone in recent-onset insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med 1988,319(10): 599-604.Singh RK, Varney ML, Buyukberber S, Ino K, Ageitos AG, Reed E, Tarantolo S, Talmadge JE. Fas-FasL-mediated CD4+ T-cell apoptosis following stem cell transplantation. Cancer Res. 1999,59(13):3107–3111.

Referências 183Sloand EM, Kim S, Maciejewski JP, Van Rhee F, Chaudhuri A, Barrett J, Young NS. Pharmacologicdoses of granulocyte colony-stimulating factor affect cytokine production by lymphocytes in vitro and invivo. Blood 2000,95(7):2269-2274.Sospedra M, Martin R. Immunology of multiple sclerosis. Annu Rev Immunol. 2005, 23:683-747.Sun W, Popat U, Hutton G, Zang YCQ, Krance R, Carrum G, Land GA, Heslop H, Brenner M, ZhangJZ. Characteristics of T-cell receptor repertoire and myelin-reactive T cells reconstituted fromautologous haematopoietic stem-cell grafts in multiple sclerosis. Brain 2004, 127(5):996-1008.Sykes M, Nikolic B. Treatment of severe autoimmune disease by stem cell transplantation. Nature2005, 435(7042):620-627.Tanchot C, Le Campion A, Martin B, Leaument S, Dautigny N, Lucas B. Conversion of naive T cells toa memory-like phenotype in lymphopenic hosts is not related to a homeostatic mechanism that fills theperipheral naive T cell pool. J. Immunol. 2002, 168(10):5042–5046.Terada N, Hamazaki T, Oka M, Hoki M, Mastalerz DM, Nakano Y, Meyer EM, Morel L, Petersen BE,Scott EW. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. Nature2002, 416(6880):542-545.Theofilopoulos AN, Kono DH. The genes of systemic autoimmunity. Proc Assoc Am Physicians 1999;111(3):228-240.Thiel A, Alexander T, Schmidt CA, Hiepe F, Arnold R, Radbruch A, Verda L, Burt RK. Immunereconstitution after hematopoietic stem cell transplantation. In: Burt RK Marmont A (eds). Stem celltherapy for autoimmune diseases. Landes Biociences, Georgetown, Texas, USA, 2004, 206-222.Thornton AM, Donovan EE, Piccirillo CA, Shevach EM. Cutting edge: IL-2 is critically required for thein vitro activation of CD4+CD25+ T cell suppressor function. J Immunol. 2004, 172(11):6519-6523.Touraine JL, Roncarolo MG, Raudrant D, Bacchetta R, Golfier F, Sembeil R, Gebuhrer L. Induction oftransplantation tolerance in humans using fetal cell transplants. Transplant Proc. 2005, 37(1):65-66.Traynor AE, Schroeder J, Rosa RM, Cheng D, Stefka J, Mujais S, Baker S, Burt RK. Treatment ofsevere systemic lupus erythematosus with high-dose chemotherapy and hematopoietic stem celltransplantation: a phase I study. Lancet 2000; 356(9231): 701-707.Tyndall A, Gratwohl A. Immune ablation and stem cell therapy in autoimmune disease: clinicalexperience. Arthritis Res 2000, 2(4):276-280.Tyndall A, Koike T. High-dose immunoablative therapy with hematopoietic stem cell support in thetreatment of severe autoimmune: current status and future direction. Inter Med 2002; 41(8):608-612.Tyndall A, Saccardi R. Hematopoietic stem cell transplantation in the treatment of severe autoimmunedisease - results from phase I/II studies, prospective randomized trials and future directions. Clin. Exp.Immunol 2005, 141(1):1-9.van Bekkum DW. Autologous stem cell transplantation for treatment of autoimmune diseases. StemCells 1999; 17(3): 172-178.van Bekkum DW. Experimental basis for the treatment of autoimmune diseases with autologoushematopoietic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant 2003, 32(Suppl 1):S37-S39.van Bekkum DW. Immune ablation and stem cell therapy in autoimmune disease: experimental basisfor autologous stem cell transplantation. Arthritis Res 2000, 2(4):281-284.van Bekkum DW. Stem cell transplantation in experimental models of autoimmune disease. J ClinImmunol 2000; 20(1):10-16.

Referências 184van Bekkum, DW. Experimental basis of hematopoietic stem cell transplantation for treatment ofautoimmune diseases. J Leuk Biol 2002, 72(4):609-620.van Gelder M, Kinwel-Bohre EP, van Bekkum DW. Treatment of experimental allergicencephalomyelitis in rats with total body irradiation and syngeneic BMT. Bone Marrow Transplant.1993, 11(3):233-241.van Gelder M, van Bekkum DW. Treatment of relapsing experimental autoimmune encephalomyelitisin rats with allogeneic bone marrow transplantation from a resistant strain. Bone Marrow Transplant.1995, 16(3):343-351.van Laar JM. Immune ablation and stem-cell therapy in autoimmune disease: immunologicalreconstitution after high-dose immunosuppression and haematopoietic stem-cell transplantation.Arthritis Res. 2000, 2(4):270–275.Vasconcelos ZF, Dos Santos BM, Farache J, Palmeira TS, Areal RB, Cunha JM, Barcinski MA,Bonomo A. G-CSF-treated granulocytes inhibit acute graft-versus-host disease. Blood. 2006,107(5):2192-9.Vasconcelos ZF, Santos BM, Costa ES, Lima M, Tabak DG, Bouzas LF, Azevedo WM, Barcinski MA,Bonomo A. T-lymphocyte function from peripheral blood stem-cell donors is inhibited by activatedgranulocytes. Cytotherapy 2003;5(4):336-45.Verda L, Oyama Y, Craig R, Statkute L, Krosnjar N, Quigley K, Burt RK. Restoration of the CD4+CD25bright regulatory cell subset in patients with Crohn’s disease following autologous non-myeloablativestem cell transplantation (NST). Blood 2005, 106(11):2193.Voltarelli JC, Couri CE, Stracieri ABPL, Moraes DA, Oliveira MCB, Pieroni F, Coutinho MA,Malmegrim KCR, Simões BP, Foss MC, Burt RK. High dose immunosuppression and autologoushematopoietic stem cell transplantation in early onset type 1 diabetes mellitus. Submitted 2006b.Voltarelli JC, Couri CEB, Oliveira MCB, Stracieri ABPL, Moraes DA, Godoi DF, Coutinho MA,Malmegrim KCR, Foss-Freitas MC, Foss MC, Simões BP, Squiers EC, Burt RK. Autologoushematopoietic stem cell transplantation for type 1 diabetes mellitus. Blood 2004a, 104(11):5224.Voltarelli JC, Couri CEB, Oliveira MCB, Stracieri ABPL, Moraes DA, Coutinho MA, Malmegrim KCR,Foss-Freitas MC, Simões BP, Foss MC, Burt RK. Autologous hematopoietic stem cell transplantationfor type 1 diabetes mellitus. Bone Marrow Transplant. 2006a, 37(S1):26.Voltarelli JC, Oliveira MC, Stracieri AB, Godoi DF, Moraes DA, Coutinho MA, Malmegrim KCR, SantosAC. Hematopoietic stem cell transplantation for refractory Takayasu’s arteritis. Rheumatology 2004b,43(10):1308-1309.Voltarelli JC, Ouyang J. Hematopoietic stem cell transplantation for autoimmune diseases indeveloping countries: current status and future prospectives. Bone Marrow Transplant. 2003, 32 (S1):S69-S71.Voltarelli JC, Stracieri ABPL, Oliveira MCB, Godoi DF, Moraes DA, Pieroni F, Malmegrim KCR,Coutinho MA, Simoes BP. Transplante de células tronco hematopoéticas em doenças reumáticas.Parte 1: Experiência internacional. Rev Bras Reumatol. 2005a, 45: 229-241.Voltarelli JC, Stracieri ABPL, Oliveira MCB, Godoi DF, Moraes DA, Pieroni F, Malmegrim KCR,Coutinho MA, Simões BP, Massumoto C, Hamerschlak N, Scheinberg M, Ferreira E, Coutinho M,Ostronoff M, Sturaro D, Dulley F. Transplante de células tronco hematopoéticas em doençasreumáticas - parte 2: experiência brasileira perspectivas futuras. Revista Brasileira de Reumatologia2005b, 45: 301-312.

Referências 185Voltarelli JC. Transplante de células tronco hematopoéticas no diabete melito do tipo 1. Rev BrasHematol Hemoter. 2004c, 26(1):43-45.Walker LS, Abbas AK.The enemy within: keeping self-reactive T cells at bay in the periphery. Nat RevImmunol. 2002, 2(1):11-9.Walker MR, Kasprowicz DJ, Gersuk VH, Benard A, Van Landeghen M, Buckner JH, Ziegler SF.Induction of FoxP3 and acquisition of T regulatory activity by stimulated human CD4+CD25- T cells. JClin Invest. 2003, 112(9):1437-1443.Weekes MP, Carmichael AJ, Wills MR, Mynard K, Sissons JG. Human CD28-CD8+ T cells containgreatly expanded functional virus-specific memory CTL clones. J Immunol. 1999, 162(12):7569-7577.Weinberg K, Blazar BR, Wagner JE, Agura E, Hill BJ, Smogorzewska M, Koup RA, Betts MR, CollinsRH, Douek DC. Factors affecting thymic function after allogeneic hematopoietic stem celltransplantation. Blood 2001, 97(5):1458-1466.Weiner HL, Cohen JA. Treatment of multiple sclerosis with cyclophosphamide: critical review of clinicaland immunologic effects. Mult Scler. 2002, 8(2):142-154.Wicker LS, Miller BJ, Mullen Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes fromnonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes 1986, 35(8):855–60.Wills MR, Carmichael AJ, Weekes MP, Mynard K, Okecha G, Hicks R, Sissons JG. Human virusspecificCD8+ CTL clones revert from CD45ROhigh to CD45RAhigh in vivo: CD45RAhighCD8+ T cellscomprise both naive and memory cells. J Immunol. 1999, 162(12):7080-7087.Woodland DL, Dutton RW. Heterogeneity of CD4(+) and CD8(+) T cells. Curr Opin Immunol. 2003,15(3):336-342.Wu CJ, Chillemi A, Alyea EP, Orsini E, Neuberg D, Soiffer RJ, Ritz J.Reconstitution of T-cell receptorrepertoire diversity following T-cell depleted allogeneic bone marrow transplantation is related tohematopoietic chimerism. Blood. 2000, 95(1):352-9.Wu Z, Bensinger SJ, Zhang J, Chen C, Yuan X, Huang X, Markmann JF, Kassaee A, Rosengard BR,Hancock WW, Sayegh MH, Turka LA. Homeostatic proliferation is a barrier to transplantationtolerance. Nat Med. 2004, 10(1):87-92.Yasumizu R, Sugiura K, Iwai H, Inaba M, Makino S, Ida T, Imura H, Hamashima Y, Good RA, IkeharaS. Treatment of type 1 diabetes mellitus in non-obese diabetic mice by transplantation of allogeneicbone marrow and pancreatic tissue. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1987, 84(18):6555-6557.Zorina TD, Subbotin VM, Bertera S, Alexander AM, Haluszczak C, Gambrell B, Bottino R, Styche AJ,Trucco M. Recovery of the endogenous beta cell function in the NOD model of autoimmune diabetes.Stem Cells 2003, 21(4):377-388.Zulewski H, Abraham EJ, Gerlach MJ, Daniel PB, Moritz W, Muller B, Vallejo M, Thomas MK, HabenerJF. Multipotential nestin-positive stem cells isolated from adult pancreatic islets differentiate ex vivointo pancreatic endocrine, exocrine, and hepatic phenotypes. Diabetes 2001, 50(3):521-33.

Apêndices e Anexo

Apêndice A 187Apêndice A - Exemplos de análises de imunofenotipagem por citometria de fluxo desubpopulações celulares do sangue periférico.ABGated em R1CGate em linfócitos0,250,1200,00 3,23DE99,55 0,07F0,5096,271,1034,714,5625,543,3912,57G38,70 25,50H23,73 46,16I36,01 48,036,112,614,7365,9367,84 4,72J25,73 65,55K29,21 0,13L27,35 0,0958,51 4,5114,73 19,1421,59 13,1234,49 2,8623,65 42,4862,78 2,51Figura A.1. Análise de subpopulações linfócitárias do sangue periférico. Durante a aquisição das células,foi desenhada uma gate na população de linfócitos (R1), estabelecida com base nos parâmetros de tamanho(FSC) por granularidade (SSC) (A). A figura mostra as porcentagens (%) de marcação inespecífica dos isotiposcontroles (B), de linfócitos T CD3 + (C), linfócitos T auxiliares CD3 + CD4 + (D) e linfócitos T citotóxicos CD3 + CD8 +(E), de linfócitos B CD19 + CD38 + ou CD19 + CD38 - (F), de células NK CD3 - CD16 + CD56 + e de células NKT-likeCD3 + CD16 + CD56 + (G), linfócitos T CD3 + TCRαβ + (H), linfócitos T CD3 + TCRγδ + (I), linfócitos CD3 + CD69 + (J),linfócitos CD3 + HLADR + (K), linfócitos CD4 + CD25 + (L).

Apêndice A 188ABGated em R1CGated em R2Gate em linfócitosD0,0599,70,08F0,18E99,75 0,25Gated em R229,33 44,3057,40 42,90G25,23 1,13HGated em R247,09 26,8761,71 38,5421,10 4,94Figura A.2. Análise de subpopulações de células T do sangue periférico. Durante a aquisição das células,foi desenhada uma gate na população de linfócitos (R1), estabelecida com base nos parâmetros de tamanho(FSC) por granularidade (SSC) (A). Foram feitos dot plots de FL1 versus FL2, em seguida foi desenhada umagate R2 na população duplo-positiva. A marcação de fluorescência 3 (FL3, PercP) nessa gate R2 foirepresentada por um histograma de FL3. A figura mostra as porcentagens (%) de marcação inespecífica dosisotipos controles (B,C), de linfócitos T CD3 + CD4 + (D) e linfócitos T CD3 + CD4 + CD95 + (E), de linfócitos TCD3 + CD8 + (G) e linfócitos T CD3 + CD8 + CD95 + (H).

Apêndice A 189ABGated em R1CGated em R2Gate em linfócitos0,050,0899,75 0,25D99,70,18EGated em R229,72 44,7499,30 0,70G24,84 0,69HGated em R245,36 24,2197,45 2,65I26,41 4,02JGated em R215,99 28,4728,20 71,811,67 43,88Figura A.3. Análise de subpopulações de células T do sangue periférico. Durante a aquisição das células,foi desenhada uma gate na população de linfócitos (R1), estabelecida com base nos parâmetros de tamanho(FSC) por granularidade (SSC) (A). Foram feitos dot plots de FL1 versus FL2, em seguida foi desenhada umagate R2 na população duplo-positiva. A marcação de fluorescência 3 (FL3, PercP) nessa gate R2 foirepresentada por um histograma de FL3. A figura mostra as porcentagens (%) de marcação inespecífica dosisotipos controles (B,C), de linfócitos T CD3 + CD4 + (D) e linfócitos T CD3 + CD4 + CD95L + (E), de linfócitos TCD3 + CD8 + (G) e linfócitos T CD3 + CD8 + CD95L + (H), de linfócitos T CD4 + CD45RA + (I) e linfócitos TCD4 + CD45RA + CD31 + (J).

Apêndice A 190Gate em linfócitos0,250,13CGated em R1D99,44 0,18Gated em R2R2 = 42,6446,58 49,14EGated em R1F0,943,34Gated em R2R2 = 22,7922,29 64,689,053,98G R2 = 2,22H IGated em R161,11 38,89Figura A.4. Análise de células T naive, efetoras e de memória, e de células dendríticas do sangueperiférico. Durante a aquisição das células, foi desenhada uma gate na população de linfócitos (R1),estabelecida com base nos parâmetros de tamanho (FSC) por granularidade (SSC) (A). As subpopulações decélulas T CD4 + (C) ou CD8 + (E) foram selecionadas por uma gate R2 (FL3), e foram feitos dot plots de FL1versus FL2 para análise dos eventos da gate R2. A figura mostra as porcentagens (%) de células T naiveCD4 + CD27 + CD45RO - , células T de memória central CD4 + CD27 + CD45RO + , células T de memória efetoraCD4 + CD27 - CD45RO + e células T efetoras diferenciadas CD4 + CD27 - CD45RO - (D), e das mesmas subpopulaçõesde células T CD8 + em (F). Para análise das subpopulações de células dendríticas, foi feito um dot plot de FL3versus FL2 (HLADR-Percp versus LIN-FITC) (G), em seguida uma gate R1 foi desenhada na população decélulas HLADR high LIN - . A marcação de fluorescência na gate R1 foi analisada por um dot plot de FL3 versus FL2(HLADR-Percp versus IgG2a-PE, isotipo controle) (H) ou (HLADR-Percp versus CD11c-PE) (I). Células LIN -CD11c - HLADR + são células dendríticas linfóides (gate R3) e as LIN - CD11c + HLADR + são células dendríticasmielóides (gate R2).

Apêndice A 191ABGated em R1Gate em linfócitos0,030,0399,79 0,15CGated em R1DGated em R2R2 = 1,9080,77 19,23EGated em R1FGated em R2R2 = 1,99 84,44 15,56Figura A.5. Análise de populações de células T reguladoras CD4 + CD25 + do sangue periférico. Durante aaquisição das células, foi desenhada uma gate na população de linfócitos (R1), estabelecida com base nosparâmetros de tamanho (FSC) por granularidade (SSC) (A). Foram feitos dot plots de FL3 versus FL1, emseguida foi desenhada uma gate R2 na população duplo-positiva CD4 + CD25 +high (C,E). A marcação defluorescência 2 (FL2, PE) nessa gate R2 foi representada por um histograma de FL2. A figura mostra asporcentagens (%) de marcação inespecífica dos isotipos controles (B), células T reguladorasCD4 + CD25 high CTLA-4 + (D), e de células T reguladoras CD4 + CD25 high GITR + (F).

Apêndice A 192ABGated em R1Gate em linfócitosR2 = 15,81CGated em R2DGated em R299,77 0,2389,02 10,98EFGated em R1Gate em linfócitosR2 = 22,90GGated em R2HGated em R20,230,1076,88 2,2899,52 0,1520,24 0,60Figura A.6. Análise de subpopulações linfócitárias do sangue periférico. Durante a aquisição das células,foi desenhada uma gate na população de linfócitos (R1), estabelecida com base nos parâmetros de tamanho(FSC) por granularidade (SSC) (A). A subpopulação de células B CD19 + (B) foi selecionada por uma gate R2(FL2), e a marcação de fluorescência 1 (FL1, FITC) nessa gate R2 foi representada por um histograma de FL1. Afigura mostra as porcentagens (%) de marcação inespecífica do isotipo controle (C) e linfócitos B CD19 + CD95 +(D). Os linfócitos foram selecionados por uma gate R (E), e a subpopulação de células T CD8 + (F) foi selecionadapor uma gate R2 (FL3), e foram feitos dot plots de FL1 versus FL2 para análise dos eventos da gate R2. Amarcação inespecífica do isotipo controle pode ser vista em (G) e linfócitos T CD8 + CD28 - CD57 + (H).

Apêndice B 193Apêndice B - Exemplos de análises da marcação de citocinas intracelulares em linfócitosativados por citometria de fluxo.ABGated em R1CGated em R2Gate em linfócitos42,35 14,3799,96 0,04DEF99,96 0,0499,87 0,13100,0 0,00G H I99,96 0,0499,74 0,2699,63 0,00Figura B.1. Produção de citocinas intracelulares do padrão T H1 e T H2 por subpolulações linfócitárias.Durante a aquisição das células, foi desenhada uma gate na população de linfócitos (R1), estabelecida com basenos parâmetros de tamanho (FSC) por granularidade (SSC) (A). Os eventos da gate de linfócitos (R1) foramanalisados por dot plots de fluorescência 1 (FL1, anti-CD3-FITC) versus fluorescência 3 (FL3, anti-CD8-PercP)(B). Em seguida, foram desenhadas uma gate R2 na população duplo-positiva (CD3 + CD8 + , de linfócitos T CD8 + )e uma gate R3 na população CD3 + CD8 - (que contém linfócitos T CD4 + em sua grande maioria). A marcação defluorescência 2 (FL2, anti-citocinas-PE) na gate R2 foi representada por um histograma de FL2. Esta figuramostra a análise das células T CD3 + CD8 + (gate R2) incubadas na presença de brefeldina A, mas nãoestimuladasin vitro com PMA e ionomicina. As porcentagens (%) de marcação inespecífica dos isotiposcontroles (C), de células T CD3 + CD8+ - IL-2 + (D), de células T CD3 + CD8 + INF-γ + (E), células T CD3 + CD8 + TNF-α +(F), de células T CD3 + CD8+ - IL-4 + (G), de células T CD3 + CD8 + IL-5 + (H), células T CD3 + CD8 + IL-10 + (I), estãomostradas na figura.

Apêndice B 194ABGated em R1CGated em R2Gate em linfócitos39,87 13,7899,93 0,07DE00,00 00,00F71,34 28,7046,43 53,5730,68 69,45G H I99,29 0,7199,32 0,6899,60 0,40Figura B.2. Produção de citocinas intracelulares do padrão T H1 e T H2 por subpolulações linfócitárias.Durante a aquisição das células, foi desenhada uma gate na população de linfócitos (R1), estabelecida com basenos parâmetros de tamanho (FSC) por granularidade (SSC) (A). Os eventos da gate de linfócitos (R1) foramanalisados por dot plots de fluorescência 1 (FL1, anti-CD3-FITC) versus fluorescência 3 (FL3, anti-CD8-PercP)(B). Em seguida, foram desenhadas uma gate R2 na população duplo-positiva (CD3 + CD8 + , de linfócitos T CD8 + )e uma gate R3 na população CD3 + CD8 - (que contém linfócitos T CD4 + em sua grande maioria). A marcação defluorescência 2 (FL2, anti-citocinas-PE) na gate R2 foi representada por um histograma de FL2. Esta figuramostra a análise das células T CD3 + CD8 + (gate R2) incubadas na presença de brefeldina A, estimuladas invitro com PMA e ionomicina. As porcentagens (%) de marcação inespecífica dos isotipos controles (C), decélulas T CD3 + CD8+ - IL-2 + (D), de células T CD3 + CD8 + INF-γ + (E), células T CD3 + CD8 + TNF-α + (F), de células TCD3 + CD8+ - IL-4 + (G), de células T CD3 + CD8 + IL-5 + (H), células T CD3 + CD8 + IL-10 + (I), estão mostradas na figura.

Apêndice B 195ABGated em R1CGated em R1Gate em linfócitosR2 = 0,08R2 = 24,03DGated em R2EGated em R299,53 0,4725,69 74,37Figura B.3. Análise da expressão de CD69 por células T CD3+ estimuladas com PMA e Inonomicina.Durante a aquisição das células, foi desenhada uma gate na população de linfócitos (R1), estabelecida com basenos parâmetros de tamanho (FSC) por granularidade (SSC) (A). Os eventos da gate de linfócitos (R1) foramanalisados por um dot plot de fluorescência 2 (FL2, anti-CD3-PE) versus SSS (C). Em seguida, a subpopulaçãode células B CD3 + (C) foi selecionada por uma gate R2 (FL2), e a marcação de fluorescência 1 (FL1, FITC)nessa gate R2 foi representada por um histograma de FL1. A figura mostra as porcentagens (%) de marcaçãoinespecífica do isotipo controle (D) e linfócitos T CD3 + CD69 + (D).

Apêndice C 196Apêndice C - Método de TCRBV CDR3 Spectratyping e imagem de um gel deseqüenciamento dos produtos da reação de elongação Vβ-Cβ.Distribuiçãonormal,gaussianaAnálise da distribuiçãodos segmentos daregião CDR3TCRBV CDR3 SpectratypingPoliclonal, gaussinaPoliclonal, não-gaussinaDistribuiçãoanormal, nãogaussiana(CDR3 skewing)OligoclonalMonoclonalFigura C.1. Método de TCRBV CDR3 Spectratyping. Este método permite analisar a diversidade do repertóriode linfócitos T e detectar populações celulares em expansão clonais (Pannetier et al., 1993; Pannetier et al.,1995). Esta técnica é iniciada por uma amplificação por PCR dos segmentos Vβ-Cβ do TCR utilizando primersespecíficos para cada uma das famílias Vβ. O produto desta reação é submetido à outra amplificação por PCRque inclui um primer adicional marcado com fluorocromo. Nesta reação amplifica-se o segmento gênico quecontém a região CDR3 (do inglês Complementarity-Determining Region) do TCR, uma vez que esta se localizaentre os segmentos V-D-J. Em seguida estes segmentos amplificados por PCR são separados em gel deseqüenciamento e, com o auxílio de um seqüenciador automático e do software Gene Mapper (AppliedBiosystem), é possível calcular o tamanho (em pares de bases) dos diferentes segmentos (picos) de CDR3, onúmero de picos na região CDR3, estimar a freqüência de cada família Vβ no repertório do TCR, e analisar aclonalidade e a distribuição dos picos na região CDR3 (gaussiana ou não-gaussiana). Os gráficos (ou espectros)representam a intensidade de fluorescência em unidades arbitrárias em função do comprimento da região CDR3em pares de bases. Nos espectros, os picos destacados em azul correspondem ao segmento de CDR3 com 10resíduos de aminoácidos.

Apêndice C 197Figura C.2. Imagem de um gel de seqüenciamento. Exemplo de uma imagem obtida pelo software “GeneMapper” (Applied Biosystems) de um gel de seqüenciamento após corrida eletroforética dos produtos dePCR Vβ-Cβ marcados com fluorescência azul, carregados concomitantemente com o marcador de pesomolecular (Gene Scan - 500 Rox standard, Applied Biosystems) marcado com fluorescência vermelha.

Apêndice D 198Apêndice D - Valores de média, desvio padrão, mediana e p valor do número absoluto e/ourelativo das populações celulares analisadas nos pacientes com diabete melito dotipo 1, pré e pós-TACTH.Tabela D.1. Valores de média, desvio padrão e mediana das subpopulações celulares analisadas noscontroles saudáveis e pacientes com diabete melito do tipo 1, pré- e pós-transplante.SUBPOPULAÇÃO CELULARIS PRÉ-MOB PRÉ-COND D+60 D+100 D+180 D+270 D+360(N=10) (N=11) (N=10) (N=10) (N=7) (N=7) (N=5) (N=4)5822,00 5427,00 4040,00 4800,00 4957,00 4314,00 5460,00 4225,00Leucócitos totais/μl 1678,00 964,00 1107,00 1571,00 1118,00 1481,00 2402,00 822,005550,00 5500,00 3950,00 4350,00 4700,00 4000,00 4200,00 4000,001856,00 2273,00 1200,00 1520,00 1571,00 1471,00 1640,00 1925,00Linfócitos/μl460,00 718,00 471,00 454,00 502,00 468,00 378,00 613,001800,00 2300,00 1100,00 1600,00 1400,00 1400,00 1700,00 1850,00431,30 454,50 370,00 540,00 371,40 443,00 420,00 300,00Monócitos/μI262,60 269,70 125,20 395,00 236,00 282,00 83,70 81,60450,00 400,00 400,00 450,00 300,00 400,00 400,00 300,003394,00 2709,00 2480,00 2720,00 3000,00 2400,00 3400,00 1925,00Granulócitos/μI1295,00 813,00 1008,00 1144,00 995,00 1366,00 2345,00 768,003450,00 2500,00 2500,00 2450,00 3400,00 2000,00 2100,00 1850,001327,20 1652,00 892,00 1033,00 1072,00 888,00 1033,00 1259,00Linfócitos T CD3 + /μl 372,80 563,00 392,00 410,00 520,00 400,00 274,00 472,001204,80 1553,00 800,00 1108,00 896,00 813,00 977,00 1067,00876,00 1021,00 519,30 190,40 227,90 230,10 323,00 460,00Linfócitos T CD4 + /μl 336,00 427,00 285,80 72,20 101,30 70,10 96,70 254,00757,00 961,00 416,10 186,10 230,90 216,90 304,40 393,00444,50 585,80 337,30 842,00 871,00 661,00 707,00 832,00Linfócitos T CD8 + /μl 150,00 197,80 145,10 405,00 485,00 330,00 267,00 364,00461,80 587,90 284,50 896,00 616,00 601,00 580,00 782,002,07 1,79 1,55 0,27 0,30 0,40 0,50 0,60Razão CD4 + :CD8 + 0,71 0,68 0,58 0,13 0,12 0,17 0,19 0,301,75 1,57 1,44 0,24 0,25 0,30 0,47 0,58Linfócitos TCD3 + TCRαβ + /μlLinfócitos TCD3 + TCRγδ + /μlLinfócitos B CD19 + /μlCélulas NKCD3 - CD16 + CD56 + /μlCélulas NKTCD3 + CD16 + CD56 + /μl1293,00 1580,00 825,00 974,00 1005,00 834,00 940,00 1164,00449,00 525,00 366,00 410,00 491,00 349,00 258,00 385,001180,00 1462,00 748,00 1075,00 810,00 699,00 823,00 1018,0084,10 89,40 72,25 68,00 67,50 73,60 93,50 91,0065,10 31,43 29,54 35,70 49,00 54,30 48,90 72,3067,00 84,76 71,53 64,50 64,80 58,50 70,40 68,60241,70 342,30 85,20 261,10 321,80 317,40 314,20 368,00122,20 192,00 41,90 121,90 121,50 157,20 97,70 188,10223,00 303,20 99,10 257,30 303,80 306,50 309,10 349,10250,30 179,00 97,60 135,20 237,00 179,30 233,80 289,10137,10 117,70 72,20 93,40 269,00 118,00 67,10 110,80237,60 127,90 68,20 103,80 168,00 161,30 250,90 281,2099,30 58,70 48,67 38,60 31,50 81,60 72,70 62,70113,50 43,60 29,71 32,60 30,30 73,40 40,60 29,5046,80 49,60 34,74 31,70 24,70 65,50 69,10 68,20IS, indivíduos saudáveis; Pré-mob, pré-mobilização (pré-transplante); Pré-cond, pré-condicionamento; D+60, D+100, D+180,D+270, D+360, dias pós-transplante. São mostrados os valores absolutos (célula/μl) e/ou valores relativos (%) para asdiferentes subpopulações celulares analisadas. Os valores estão mostrados na seguinte ordem: média, desvio padrão emediana dos valores.

Apêndice D 199Tabela D.2. Valores de média, desvio padrão e mediana das subpopulações celularesanalisadas nos controles saudáveis e pacientes com diabete melito do tipo 1, pré- e póstransplante.SUBPOPULAÇÃOIS PRÉ-MOB PRÉ-COND D+60 D+100 D+180 D+270 D+360CELULAR(N=10) (N=11) (N=10) (N=10) (N=7) (N=7) (N=5) (N=4)315,30 473,00 87,30 4,93 4,00 28,56 111,90 98,20Linfócitos T naive163,00 205,00 93,10 5,46 1,35 23,23 116,20 95,20CD4 + CD27 + CD45RO - /μl286,30 431,50 60,70 2,49 3,36 27,12 84,00 82,10206,30 298,20 162,20 110,30 94,00 119,70 126,60 170,60Linfócitos T naive105,30 147,30 108,80 78,90 57,70 74,80 89,60 75,60CD8 + CD27 + CD45RO - /μl188,40 309,80 132,80 72,60 57,90 131,50 115,90 154,00446,30 486,20 352,00 105,40 112,60 115,50 184,50 211,30Linfócitos T MC145,00 146,30 232,00 34,50 33,20 33,10 88,50 77,00CD4 + CD27 + CD45RO + /μl421,10 500,60 282,00 88,60 110,40 104,00 139,80 213,80156,10 203,00 123,60 391,70 392,30 287,90 281,50 261,50Linfócitos T MC57,20 121,50 62,30 191,70 165,30 105,20 66,80 83,80CD8 + CD27 + CD45RO + /μl157,20 173,00 120,30 387,90 395,10 291,10 289,80 280,4080,60 36,78 43,58 57,80 45,10 50,08 57,90 70,10Linfócitos T ME68,10 23,16 10,18 64,40 40,50 22,99 32,70 21,00CD4 + CD27 - CD45RO + /μl61,40 31,77 43,90 21,10 35,00 50,67 51,30 70,0040,77 17,22 12,39 108,20 195,00 156,00 157,70 114,70Linfócitos T ME22,87 11,55 7,03 161,40 255,00 124,40 190,10 74,50CD8 + CD27 - CD45RO + /μl36,10 17,23 11,00 39,80 82,80 146,90 95,60 134,1017,87 7,97 11,91 5,11 13,80 14,82 72,80 23,80Linfócitos T ED21,49 4,23 6,91 3,51 24,40 18,81 134,10 32,60CD4 + CD27 - CD45RO - /μl11,09 7,61 8,00 6,45 3,80 9,40 9,84 11,10103,20 52,60 25,37 82,60 153,10 158,60 161,80 297,00Linfócitos T ED60,00 27,80 11,19 57,60 147,90 180,70 176,40 283,00CD8 + CD27 - CD45RO - /μl98,60 44,10 24,52 64,90 68,90 88,30 74,70 270,00193,10 197,80 179,60 38,29 44,70 51,70 80,21 107,10Linfócitos T106,90 145,30 138,10 23,70 27,80 29,50 21,95 57,90CD4 + CD25 + /μl211,90 191,40 157,70 40,74 44,50 49,00 81,62 91,0010,25 9,61 13,95 2,70 3,33 3,54 5,20 5,58% Linfócitos T3,99 3,66 5,72 1,25 1,02 1,90 2,20 2,37CD4 + CD25 + 10,83 7,92 12,40 2,71 3,12 3,24 3,71 4,7810,30 24,58 14,89 8,86 8,18 10,47 8,85 16,13Linfócitos T6,94 15,26 11,54 6,26 6,96 9,14 6,59 9,71CD4 + CD25 high /μl8,76 22,40 10,26 8,38 6,50 8,12 9,44 15,030,56 1,10 1,14 0,62 0,63 0,66 0,81 0,79% Linfócitos T0,39 0,56 0,63 0,39 0,37 0,47 0,38 0,27CD4 + CD25 high 0,43 0,94 1,03 0,62 0,64 0,58 0,77 0,85Linfócitos T1,72 4,12 2,36 2,01 1,18 1,87 4,54 1,63CD4 + CD25 high CTLA- 1,21 6,17 2,94 1,81 0,99 1,65 5,48 2,454 + /μl 1,46 0,46 1,68 1,82 1,12 1,39 3,13 0,6220,79 20,44 24,69 22,64 24,30 36,40 39,50 27,40% Linfócitos T13,33 32,24 30,82 22,31 35,10 36,40 47,20 48,50CD4 + CD25 high CTLA-4 + 17,14 7,69 11,81 13,49 10,00 15,00 11,10 4,70IS, indivíduos saudáveis; Pré-mob, pré-mobilização (pré-transplante); Pré-cond, pré-condicionamento; D+60, D+100,D+180, D+270, D+360, dias pós-transplante; MC, memória central; ME, memória efetora; ED, efetores diferenciados.São mostrados os valores absolutos (célula/μl) e/ou valores relativos (%) para as diferentes subpopulações celularesanalisadas. Os valores estão mostrados na seguinte ordem: média, desvio padrão e mediana dos valores.

Apêndice D 200Tabela D.3. Valores de média, desvio padrão e mediana das subpopulações celularesanalisadas nos controles saudáveis e pacientes com diabete melito do tipo 1, pré- e póstransplante.IS PRÉ-MOB PRÉ-COND D+60 D+100 D+180 D+270 D+360SUBPOPULAÇÃO CELULAR(N=10) (N=11) (N=10) (N=10) (N=7) (N=7) (N=5) (N=4)3,77 1,86 1,80 1,11 1,15 2,66 2,87 3,09Linfócitos T2,67 2,25 2,02 1,33 1,49 3,26 2,50 3,01CD4 + CD25 high+ GITR + /μl2,95 1,17 1,02 0,54 0,31 1,32 1,81 2,2140,88 12,30 19,90 18,26 20,30 70,30 47,70 32,40% Linfócitos T25,33 7,16 21,49 18,08 18,60 35,60 34,70 45,40CD4 + CD25 high+ GITR + 36,04 15,48 14,07 10,99 10,00 80,00 66,70 13,00303,80 451,80 87,10 27,16 29,89 62,70 119,90 187,20Linfócitos T153,10 236,30 81,50 21,16 26,41 31,40 63,50 161,80CD4 + CD45RA + CD31 + /μl267,90 419,10 59,80 21,10 18,31 77,90 116,80 188,3071,45 73,95 61,22 58,17 55,18 62,49 59,29 61,00% Linfócitos T12,02 13,17 18,52 22,03 22,60 21,35 16,62 25,30CD4 + CD45RA + CD31 + 71,09 75,61 66,89 63,16 56,10 64,68 59,66 70,503,65 2,32 2,18 2,10 0,97 1,81 1,74 2,12% Linfócitos T1,53 1,21 0,98 2,06 0,58 1,06 1,23 0,97CD3 + CD69 + 3,64 2,29 1,94 1,23 0,72 1,86 1,17 2,1611,47 7,09 12,09 33,29 27,29 24,48 15,58 18,94% Linfócitos T3,38 4,75 5,91 17,99 15,80 13,05 6,28 9,24CD3 + HLA-DR + 13,26 5,25 10,43 26,55 32,44 21,08 16,26 16,1410,04 13,32 5,62 15,11 18,01 21,84 17,70 18,11% Linfócitos B2,65 7,13 3,25 6,46 7,30 12,59 4,12 7,72CD19 + CD38 + 10,71 9,99 5,70 15,16 18,71 20,73 15,01 16,5077,87 59,26 78,93 93,54 90,32 84,49 66,40 76,07% Linfócitos T19,41 27,71 17,13 9,44 14,52 17,80 32,90 7,49CD3 + CD4 + Fas + 81,95 45,04 80,86 94,46 99,48 95,78 86,70 76,8067,87 47,30 62,40 73,60 70,90 73,20 68,20 47,30% Linfócitos T11,56 31,80 31,40 31,00 39,20 33,40 36,00 35,10CD3 + CD8 + Fas + 70,59 38,50 64,40 85,20 99,80 99,00 81,50 43,2027,72 14,39 30,98 30,80 22,40 32,20 14,94 9,94% Linfócitos B14,08 8,64 13,16 38,20 27,30 32,20 13,50 6,87CD19 + Fas + 28,22 12,32 31,62 6,80 5,34 30,80 8,76 7,610,63 1,79 5,40 1,07 0,60 3,22 1,13 5,85% Linfócitos T0,66 2,86 14,49 1,61 0,74 3,27 0,54 9,64CD3 + CD4 + FasL + 0,47 0,61 0,27 0,58 0,31 1,88 1,05 1,512,41 4,88 10,49 0,80 1,56 5,60 3,28 3,17% Linfócitos T2,31 8,23 22,51 0,66 2,81 7,27 2,43 5,24CD3 + CD8 + FasL + 1,25 2,11 1,35 0,52 0,46 3,34 3,66 0,7013,89 9,14 5,66 4,91 4,84 5,90 4,33 6,95Células dendríticas9,50 5,47 4,24 2,62 2,01 2,65 2,78 7,53LIN - CD11c - HLADR + /μl11,28 9,35 5,54 3,98 4,89 6,50 3,93 4,79153,50 15,17 10,67 14,28 10,02 33,50 15,82 23,40Células dendríticas144,90 10,37 9,39 13,36 4,72 53,20 11,54 22,60LIN - CD11c + HLADR + /μl120,40 16,47 11,76 9,45 10,25 7,65 18,52 19,90IS, indivíduos saudáveis; Pré-mob, pré-mobilização (pré-transplante); Pré-cond, pré-condicionamento; D+60, D+100,D+180, D+270, D+360, dias pós-transplante. São mostrados os valores absolutos (célula/μl) e/ou valores relativos (%)para as diferentes subpopulações celulares analisadas. Os valores estão mostrados na seguinte ordem: média, desviopadrão e mediana dos valores.

Apêndice D 201Tabela D. 4. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controlessaudáveis e pacientes com diabete melito do tipo 1 pré- e pós-transplante, para cadasubpopulação celular analisada.SUBPOPULAÇÃO CELULARIS XPRÉ-MOBPRÉ- MOBX PRÉ-CONDPRÉ- MOBX D+60PRÉ- MOBX D+100PRÉ- MOBX D+180PRÉ- MOBX D+270PRÉ- MOBX D+360Leucócitos totais/μl 0,4748 0,0019 0,1558 0,2349 0,0319 0,7792 0,0138Linfócitos/μl 0,0369

Apêndice D 202Tabela D.5. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controlessaudáveis e pacientes com diabete melito do tipo 1 pré- e pós-transplante, para cadasubpopulação celular analisada.SUBPOPULAÇÃO CELULARLinfócitos TCD4 + CD25 high /μlIS XPRÉ-MOBPRÉ- MOBX PRÉ-CONDPRÉ- MOBX D+60PRÉ- MOBX D+100PRÉ- MOBX D+180PRÉ- MOBX D+270PRÉ- MOBX D+3600,0004 0,0129 0,0001 0,0002 0,0013 0,0038 0,0511% Linfócitos TCD4 + high 0,0034 0,8207 0,0044 0,0056 0,0108 0,1624 0,0356CD25Linfócitos TCD4 + CD25 high CTLA-4 + /μl0,5027 0,9939 0,7714 0,6770 0,5861 0,8328 0,5131% Linfócitos TCD4 + CD25 high +CTLA-40,9687 0,1308 0,8746 0,3463 0,0392 0,0942 0,4189Linfócitos TCD4 + CD25 high+ GITR + /μl0,1780 0,9559 0,4557 0,6112 0,7442 0,9220 0,5853% Linfócitos TCD4 + CD25 high+ + 0,0510 0,5178 0,8090 0,7569 0,0063 0,1742 0,2230GITRLinfócitos TCD4 + CD45RA + CD31 + /μl0,0152

Apêndice E 203Apêndice E - Valores de média, desvio padrão, mediana e p valor do número absoluto e/ourelativo das populações celulares analisadas nos pacientes com esclerose múltipla,pré e pós-TACTH.Tabela E.1. Valores de média, desvio padrão e mediana das subpopulações celulares analisadas noscontroles saudáveis e pacientes com esclerose múltipla, pré- e pós-transplante.SUBPOPULAÇÃO CELULARIS(N=10)PRÉ-MOB(N=13)PRÉ-COND(N=15)D+60(N=10)D+100(N=12)D+180(N=8)D+270(N=5)D+360(N=7)D+540(N=4)D+720(N=4)5544,00 6973,00 6293,00 6155,00 4550,00 5744,00 6100,00 5975,00 6250,00 6125,00Leucócitos totais/μl 859,00 1534,00 2098,00 2113,00 963,00 1071,00 1336,00 984,00 1489,00 1330,005500,00 7200,00 6900,00 5800,00 4450,00 5700,00 6350,00 6050,00 6400,00 5750,001869,00 1892,00 1353,00 2091,00 1508,30 2089,00 2233,00 1925,00 2225,00 1833,00Linfócitos/μl529,00 700,00 621,00 783,00 326,00 544,00 706,00 495,00 580,00 404,001700,00 1800,00 1200,00 1900,00 1450,00 1900,00 1950,00 1950,00 2150,00 1900,00387,50 581,80 450,00 540,00 408,30 388,90 466,70 387,50 625,00 375,00Monócitos/μI182,10 244,20 247,30 183,80 131,10 183,30 103,30 145,80 170,80 206,00300,00 600,00 400,00 500,00 400,00 400,00 500,00 300,00 650,00 350,003288,00 4445,00 4600,00 3640,00 2667,00 3220,00 3517,00 3650,00 3275,00 3825,00Granulócitos/μI826,00 1426,00 2129,00 1198,00 806,00 827,00 840,00 689,00 1345,00 854,003200,00 4100,00 4850,00 3700,00 2850,00 3400,00 3500,00 3700,00 2800,00 3450,001405,10 1430,00 891,10 1599,00 1088,10 1494,00 1860,00 1490,00 1347,00 1220,00Linfócitos T CD3 + /μl 409,20 525,00 332,40 554,00 276,60 423,00 733,00 454,00 478,00 470,001267,40 1600,00 805,20 1451,00 1030,70 1497,00 1588,00 1433,00 1263,00 1253,00834,00 887,00 484,50 272,20 253,10 367,10 359,10 303,50 397,80 369,00Linfócitos T CD4 + /μl 342,00 403,00 223,10 166,10 121,00 153,00 94,90 158,70 106,00 164,80744,00 891,00 455,50 211,40 241,30 331,70 393,60 225,10 405,10 300,70500,80 498,70 406,40 1306,00 843,00 1117,00 1493,00 1198,00 984,00 875,00Linfócitos T CD8 + /μl 180,80 254,90 183,90 482,00 196,40 332,00 740,00 474,00 453,00 446,00475,90 445,20 344,80 1239,00 847,10 1086,00 1125,00 1063,00 821,00 816,001,86 1,91 1,30 0,23 0,30 0,35 0,30 0,30 0,45 0,50Razão CD4 + :CD8 + 0,99 0,94 0,63 0,13 0,13 0,15 0,18 0,20 0,17 0,251,62 2,07 1,13 0,19 0,26 0,31 0,20 0,27 0,47 0,53Linfócitos TCD3 + TCRαβ + /μlLinfócitos TCD3 + TCRγδ + /μlLinfócitos B CD19 + /μlCélulas NKCD3 - CD16 + CD56 + /μlCélulas NKTCD3 + CD16 + CD56 + /μl1328,00 1316,00 833,20 1516,00 1043,90 1459,00 1799,00 1451,00 1297,00 1139,00416,00 500,00 332,90 524,00 261,50 424,00 741,00 450,00 477,00 441,001245,00 1514,00 789,00 1353,00 1020,70 1472,00 1528,00 1413,00 1149,00 1118,0071,20 62,50 40,20 35,80 24,42 33,82 35,60 37,44 24,50 31,7047,40 69,10 39,70 35,70 14,41 14,31 27,20 18,74 9,48 22,1064,20 43,50 24,80 23,50 20,96 36,31 32,90 39,82 21,08 30,10235,10 275,70 69,80 103,30 130,90 285,80 223,30 257,50 455,00 298,6098,00 198,90 48,70 123,40 109,20 172,70 101,90 74,70 207,00 128,50221,60 228,20 50,90 51,20 122,60 265,80 272,30 290,50 472,00 347,40183,40 171,00 129,50 304,30 171,60 205,40 195,80 192,20 254,70 276,9095,40 60,00 109,30 171,00 95,70 95,50 119,20 91,50 87,10 102,10174,70 180,40 94,40 287,50 157,20 225,30 157,10 196,90 254,30 279,10117,90 95,10 65,70 139,50 59,30 66,90 75,41 118,10 52,60 61,6053,90 95,90 53,80 103,40 54,90 33,70 18,62 139,80 40,60 34,50109,60 54,40 54,80 108,80 53,10 64,40 75,72 68,70 52,70 75,90IS, indivíduos saudáveis; Pré-mob, pré-mobilização (pré-transplante); Pré-cond, pré-condicionamento; D+60, D+100, D+180,D+270, D+360, dias pós-transplante. São mostrados os valores absolutos (célula/μl) e/ou valores relativos (%) para asdiferentes subpopulações celulares analisadas. Os valores estão mostrados na seguinte ordem: média, desvio padrão emediana dos valores.

Apêndice E 204Tabela E.2. Valores de média, desvio padrão e mediana das subpopulações celulares analisadas noscontroles saudáveis e pacientes com esclerose múltipla, pré- e pós-transplante.SUBPOPULAÇÃO CELULARLinfócitos T naiveCD4 + CD27 + CD45RO - /μlLinfócitos T naiveCD8 + CD27 + CD45RO - /μlLinfócitos T MCCD4 + CD27 + CD45RO + /μlLinfócitos T MCCD8 + CD27 + CD45RO + /μlLinfócitos T MECD4 + CD27 - CD45RO + /μlLinfócitos T MECD8 + CD27 - CD45RO + /μlLinfócitos T EDCD4 + CD27 - CD45RO - /μlLinfócitos T EDCD8 + CD27 - CD45RO - /μlLinfócitos TCD4 + CD25 + /μlIS(N=10)PRÉ-MOB(N=13)PRÉ-COND(N=15)D+60(N=10)D+100(N=12)D+180(N=8)D+270(N=5)D+360(N=7)D+540(N=4)D+720(N=4)320,60 272,20 73,70 8,48 7,14 25,60 22,54 20,70 33,10 15,98197,80 152,80 59,80 16,38 7,32 42,50 13,30 22,70 27,80 15,70308,00 290,40 60,70 0,86 4,85 11,30 20,45 10,20 26,80 12,97153,60 188,50 109,50 95,90 130,20 155,80 179,80 119,90 116,50 105,0087,40 121,20 86,90 76,00 94,20 114,90 97,70 83,90 45,20 75,30122,40 193,10 74,70 79,40 93,80 121,60 151,80 114,40 103,60 117,00497,50 446,00 354,90 147,90 178,80 181,90 234,20 164,20 246,50 236,70206,50 371,00 270,40 63,50 50,90 77,30 42,60 84,60 76,60 195,70447,60 393,00 314,60 149,50 180,40 163,40 248,90 166,10 249,00 174,10172,40 145,40 163,80 777,00 509,00 505,60 450,90 263,30 334,30 365,0088,90 108,20 152,90 342,00 171,50 168,00 163,40 168,30 136,00 280,00144,90 127,70 89,30 807,00 508,00 423,80 495,40 217,70 287,30 331,0082,30 169,40 53,20 99,00 74,40 101,10 101,20 78,00 62,89 70,4052,30 204,30 43,50 61,60 39,40 51,50 40,90 40,50 6,89 34,9068,70 97,20 33,60 85,50 73,30 86,60 108,90 81,00 63,11 82,7091,20 66,90 34,15 188,90 153,00 315,00 613,00 774,00 492,00 159,1099,20 76,50 24,07 119,70 150,40 246,00 420,00 643,00 434,00 159,7049,70 44,50 28,19 184,10 109,40 267,00 625,00 728,00 346,00 127,208,86 14,52 15,21 7,35 8,21 12,43 9,46 9,79 3,09 7,816,06 21,33 22,73 7,36 6,04 8,72 10,98 10,63 1,30 6,348,42 7,31 5,44 4,32 7,03 12,11 5,83 3,57 3,46 8,69120,40 109,70 62,90 116,10 80,00 143,60 157,10 214,80 132,60 94,4073,60 100,00 47,90 74,70 40,70 55,00 64,40 129,50 72,50 95,10109,60 76,30 44,00 97,60 77,70 151,60 151,40 173,60 122,20 69,50229,80 160,20 196,30 53,40 53,60 73,00 162,20 80,20 91,80 110,50147,60 123,70 167,10 44,30 52,50 41,20 124,70 84,00 77,20 53,20213,40 157,60 119,50 42,80 34,50 66,10 140,80 42,20 89,30 115,7011,44 8,61 15,18 1,87 3,97 3,74 8,12 5,17 5,41 6,314,91 6,27 8,77 1,43 3,05 2,28 7,72 4,37 2,65 4,03% Linfócitos TCD4 + CD25 + 11,07 8,18 13,49 1,20 2,81 3,20 7,04 3,74 5,72 5,7315,64 25,50 19,60 8,20 12,25 12,95 17,14 10,43 18,60 16,14Linfócitos T11,09 50,70 29,35 9,07 8,48 8,36 15,06 8,24 24,30 14,60CD4 + CD25 high /μl13,80 9,16 11,62 4,86 9,68 10,60 14,10 7,40 7,20 10,560,75 0,57 1,34 0,29 0,80 0,72 0,94 0,64 0,87 1,00% Linfócitos T0,44 0,46 1,45 0,34 0,44 0,43 1,08 0,48 1,10 1,13CD4 + CD25 high 0,72 0,56 0,98 0,20 0,74 0,78 0,47 0,44 0,40 0,51Linfócitos TCD4 + CD25 high CTLA-4 + /μl1,64 1,61 4,30 1,22 3,77 1,00 8,75 4,46 0,80 1,581,67 3,07 13,35 2,67 8,69 1,16 18,67 8,59 0,72 1,751,09 0,37 0,69 0,30 0,78 0,74 0,44 0,77 1,02 0,9619,31 17,90 16,23 8,45 22,77 8,99 23,80 30,90 27,20 13,9725,04 29,20 15,41 12,76 30,69 7,21 42,80 42,00 44,20 12,69% Linfócitos TCD4 + CD25 high CTLA-4 + 12,64 4,56 8,82 4,26 12,85 10,26 5,41 11,30 7,93 13,50IS, indivíduos saudáveis; Pré-mob, pré-mobilização (pré-transplante); Pré-cond, pré-condicionamento; D+60, D+100, D+180,D+270, D+360, dias pós-transplante. MC, memória central; ME, memória efetora; ED, efetores diferenciados. São mostradosos valores absolutos (célula/μl) e/ou valores relativos (%) para as diferentes subpopulações celulares analisadas. Os valoresestão mostrados na seguinte ordem: média, desvio padrão e mediana dos valores.

Apêndice E 205Tabela E.3. Valores de média, desvio padrão e mediana das subpopulações celulares analisadas noscontroles saudáveis e pacientes com esclerose múltipla, pré- e pós-transplante.SUBPOPULAÇÃO CELULARLinfócitos TCD4 + CD25 high+ GITR + /μlIS(N=10)PRÉ-MOB(N=13)PRÉ-COND(N=15)D+60(N=10)D+100(N=12)D+180(N=8)D+270(N=5)D+360(N=7)D+540(N=4)D+720(N=4)2,37 4,01 2,97 2,49 2,09 1,43 3,04 0,97 1,13 2,171,57 4,58 4,10 3,48 2,00 1,23 0,12 1,41 * 1,662,23 1,64 1,16 1,30 1,06 0,78 3,04 0,32 1,13 2,6434,33 19,83 17,10 12,48 18,60 15,05 56,90 5,90 22,22 28,5028,82 18,56 27,80 14,65 13,86 13,04 45,20 7,25 * 25,40% Linfócitos TCD4 + CD25 high+ GITR + 23,08 25,00 6,78 8,29 14,81 9,09 56,90 3,70 22,22 27,30Linfócitos TCD4 + CD45RA + CD31 + /μl192,90 249,60 68,22 24,90 13,86 34,20 87,70 28,60 35,40 106,50104,60 148,70 32,33 54,00 10,53 60,60 76,00 20,73 42,50 161,00144,00 194,50 54,57 7,21 7,77 9,95 42,70 19,52 15,80 29,5061,24 64,99 58,40 54,55 58,78 60,33 57,20 58,56 68,87 54,509,75 12,80 12,47 14,01 19,01 18,18 28,80 19,58 11,60 24,40% Linfócitos TCD4 + CD45RA + CD31 + 63,48 69,63 58,18 53,96 51,22 61,54 51,10 60,96 68,63 51,002,98 2,05 3,08 2,40 1,89 3,67 2,93 1,49 0,68 1,33% Linfócitos T1,67 3,36 1,86 3,06 1,69 6,41 2,99 1,44 0,27 1,34CD3 + CD69 + 2,54 0,76 2,94 1,75 1,24 1,77 1,96 0,96 0,76 1,1112,68 7,02 17,16 38,42 40,12 29,78 37,75 21,32 18,66 23,95% Linfócitos T5,30 5,58 9,38 17,56 20,36 13,21 14,75 10,08 5,47 8,78CD3 + HLA-DR + 11,67 4,67 13,86 45,44 41,55 29,90 34,68 18,97 17,34 25,488,75 10,10 4,47 4,83 8,68 13,39 10,35 14,07 19,19 15,06% Linfócitos T3,17 5,09 3,67 5,77 7,48 8,46 5,51 7,34 6,98 9,18CD19 + CD38 + 9,08 10,22 3,12 1,92 6,85 11,76 12,64 13,68 20,88 14,7683,56 59,21 79,53 89,94 89,73 92,84 96,58 91,44 91,08 89,02% Linfócitos T14,23 24,91 20,48 12,70 13,46 11,73 4,45 13,38 12,29 10,94CD3 + CD4 + Fas + 85,72 65,79 88,44 95,21 96,76 99,35 98,06 98,24 95,32 90,7177,30 44,60 69,54 74,51 72,90 79,76 92,61 86,25 86,30 83,67% Linfócitos T16,24 27,37 28,62 27,94 30,50 25,90 14,08 21,76 18,34 18,65CD3 + CD8 + Fas + 74,83 44,12 79,57 81,33 81,80 99,18 99,48 99,61 92,42 84,3028,90 18,73 41,27 41,30 34,00 40,80 39,40 24,67 18,09 12,69% Linfócitos B12,40 17,69 20,47 46,90 39,50 36,50 40,60 24,58 9,26 5,38CD19 + Fas + 27,21 13,04 42,71 17,90 7,41 33,70 22,60 16,53 19,91 12,400,66 0,31 1,84 0,74 0,76 4,42 0,21 5,66 8,55 1,58% Linfócitos T0,58 0,30 4,51 0,69 0,69 8,45 0,20 13,02 15,58 1,39CD3 + CD4 + FasL + 0,58 0,21 0,49 0,68 0,46 0,74 0,11 0,44 1,08 1,652,32 1,56 7,77 1,10 1,02 3,47 0,78 5,62 18,60 8,86% Linfócitos T3,78 2,38 10,95 1,24 1,63 5,21 0,60 13,14 35,40 15,00CD3 + CD8 + FasL + 1,12 1,03 3,39 0,59 0,37 0,78 0,87 0,49 1,28 1,86Células dendríticasLIN - CD11c - HLADR + /μlCélulas dendríticasLIN - CD11c + HLADR + /μl17,62 7,08 5,64 3,01 6,59 5,09 5,52 7,48 4,08 9,139,73 4,32 5,55 1,40 4,01 2,80 2,50 6,29 1,52 4,6117,28 6,93 5,68 3,14 4,91 5,00 5,90 4,14 4,41 9,30261,30 18,84 11,17 21,89 25,94 17,89 24,56 58,70 10,04 17,90251,20 15,82 9,54 24,93 18,02 20,72 10,09 83,70 2,50 12,74171,80 20,57 8,28 11,97 23,30 12,77 26,32 25,10 10,55 18,38IS, indivíduos saudáveis; Pré-mob, pré-mobilização (pré-transplante); Pré-cond, pré-condicionamento; D+60, D+100,D+180, D+270, D+360, dias pós-transplante. São mostrados os valores absolutos (célula/μl) e/ou valores relativos (%)para as diferentes subpopulações celulares analisadas. Os valores estão mostrados na seguinte ordem: média, desviopadrão e mediana dos valores.

Apêndice E 206Tabela E.4. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controlessaudáveis e de pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-transplante, para cada subpopulaçãocelular analisada.SUBPOPULAÇÃOCELULARIS XPRÉ-MOBPRÉ-MOB XPRÉ-CONDPRÉ-MOB XD+60PRÉ-MOB XD+100PRÉ-MOB XD+180PRÉ-MOB XD+270PRÉ-MOB XD+360PRÉ-MOB XD+540PRÉ-MOB XD+720Leucócitos totais/μl 0,0096 0,7802 0,9180 0,0220 0,4284 0,6203 0,6537 0,8595 0,2158Linfócitos/μl 0,9823 0,0167 0,3824 0,0954 0,5072 0,3048 0,8935 0,2199 0,9165Monócitos/μI 0,0104 0,0700 0,5226 0,0179 0,0120 0,1392 0,0166 0,8308 0,0389Granulócitos/μI 0,0249 0,6842 0,0284 0,0002 0,0073 0,0295 0,0554 0,0530 0,3084Linfócitos T CD3 + /μl 0,9701 0,0017 0,3965 0,0425 0,8127 0,1470 0,8898 0,9934 0,4257Linfócitos T CD4 + /μl 0,5505

Apêndice E 207Tabela E.5. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controlessaudáveis e de pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-transplante, para cada subpopulaçãocelular analisada.SUBPOPULAÇÃO CELULARIS XPRÉ-MOBPRÉ-MOB XPRÉ-CONDPRÉ-MOB XD+60PRÉ-MOB XD+100PRÉ-MOB XD+180PRÉ-MOB XD+270PRÉ-MOB XD+360PRÉ-MOB XD+540PRÉ-MOB XD+720Linfócitos TCD4 + CD25 + /μl0,2198 0,6311

Apêndice F 208Apêndice F - Valores de média, desvio padrão, mediana e p valor da freqüência de populações decélulas T CD4 + ou T CD8 + produtoras de citocinas em indivíduos saudáveis (grupo1) e pacientes com diabete melito do tipo 1 pré e pós-TACTH.Tabela F.1. Valores da média, desvio padrão e mediana da porcentagem das populações decélulas T CD4 + (CD3 + CD8 - ) ou CD8 + (CD3 + CD8 + ) produtoras de citocinas nos controlessaudáveis e pacientes com diabete melito do tipo 1, pré- e pós-transplante.SUBPOPULAÇÃO IS PRÉ-MOB PRÉ-COND D+60 D+100 D+180 D+270 D+360CELULAR (N=10) (N=11) (N=10) (N=9) (N=7) (N=7) (N=5) (N=4)24,84 23,09 33,25 61,60 58,85 58,29 47,86 51,28% células T6,24 6,27 6,69 17,03 15,96 12,98 11,73 19,22CD3 + CD8 - INF-γ + 25,92 23,33 32,08 64,51 62,81 60,50 47,93 54,9751,48 40,89 48,50 76,55 66,20 75,26 82,16 88,65% células T7,11 13,14 16,70 17,39 29,50 20,18 9,65 7,05CD3 + CD8 + INF-γ + 53,67 44,30 50,40 83,33 79,30 80,95 85,17 87,2843,90 28,17 36,55 26,81 34,30 25,11 27,29 31,27% células T13,49 13,59 14,85 10,20 18,51 12,30 7,03 7,56CD3 + CD8 - IL-2 + 39,73 25,89 34,88 24,72 34,01 25,94 28,86 33,4819,19 9,53 11,33 3,95 5,54 6,92 5,26 4,92% células T5,34 6,37 7,41 3,37 5,78 6,13 4,21 5,30CD3 + CD8 + IL-2 + 18,49 9,21 10,66 2,71 4,51 5,29 2,67 3,3834,59 35,56 48,35 55,68 68,74 60,53 50,48 52,20% células T14,44 13,30 15,35 24,72 16,53 19,29 16,85 27,20CD3 + CD8 - TNF-α + 32,12 38,40 55,56 57,17 74,00 54,40 58,71 58,5030,98 26,28 26,67 48,41 67,29 67,42 59,12 57,80% células T10,54 12,32 15,81 25,81 17,48 22,15 19,51 29,60CD3 + CD8 + TNF-α + 29,96 30,70 24,47 57,16 68,86 58,46 59,86 70,200,00 0,10 0,32 0,54 0,22 0,43 0,93 0,76% células T0,00 0,19 0,34 1,02 0,43 0,74 0,82 1,43CD3 + CD8 - IL-4 + 0,00 0,00 0,23 0,10 0,00 0,11 0,60 0,080,71 0,29 0,68 0,48 0,03 0,26 0,15 0,00% células T0,80 0,37 0,58 0,45 0,09 0,29 0,19 0,00CD3 + CD8 + IL-4 + 0,44 0,07 0,67 0,45 0,00 0,25 0,11 0,000,00 0,00 1,41 0,15 0,09 0,04 1,02 1,24% células T0,00 0,00 4,21 0,24 0,16 0,09 1,26 2,47CD3 + CD8 - IL-5 + 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,58 0,000,22 0,37 1,37 0,74 0,13 0,30 0,02 0,03% células T0,35 0,70 1,61 1,13 0,25 0,44 0,03 0,07CD3 + CD8 + L-5 + 0,00 0,00 0,85 0,07 0,00 0,04 0,00 0,000,11 0,04 0,20 1,51 0,28 0,20 0,33 0,07% células T0,27 0,13 0,55 4,46 0,48 0,18 0,27 0,15CD3 + CD8 - IL-10 + 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,31 0,38 0,000,72 0,25 0,89 1,14 0,32 0,36 0,10 0,00% células T0,96 0,38 0,84 2,05 0,58 0,49 0,14 0,00CD3 + CD8 + IL-10 + 0,40 0,00 0,74 0,32 0,00 0,14 0,00 0,00IS, indivíduos saudáveis; Pré-mob, pré-mobilização (pré-transplante); Pré-cond, pré-condicionamento; D+60, D+100,D+180, D+270, D+360, dias pós-transplante. São mostrados os valores relativos (%) para as diferentes subpopulaçõescelulares analisadas. Os valores estão mostrados na seguinte ordem: média, desvio padrão e mediana dos valores.

Apêndice F 209Tabela F.2. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controlessaudáveis e de pacientes com diabete melito do tipo 1 pré- e pós-transplante, para aspopulações de células T CD4 + (CD3 + CD8 - ) ou CD8 + (CD3 + CD8 + ) produtoras de citocinas.SUBPOPULAÇÃOCELULARIS XPRÉ-MOBPRÉ-MOB XPRÉ-CONDPRÉ- MOBX D+60PRÉ- MOBX D+100PRÉ- MOBX D+180PRÉ- MOBX D+270PRÉ- MOBX D+360% células TCD3 + CD8 - INF-γ + 0,7780 0,0542

Apêndice G 210Apêndice G - Valores de média, desvio padrão, mediana e p valor da freqüência de populaçõesde células T CD4 + ou T CD8 + produtoras de citocinas em indivíduos saudáveis(grupo 2) e pacientes com esclerose múltipla, pré e pós-TACTH.Tabela G.1. Valores da média, desvio padrão e mediana da porcentagem das populações de célulasT CD4 + (CD3 + CD8 - ) ou CD8 + (CD3 + CD8 + ) produtoras de citocinas nos controles saudáveis epacientes com esclerose múltipla, pré- e pós-transplante.SUBPOPULAÇÃOCELULARIS(N=10)PRÉ-MOB(N=14)PRÉ-COND(N=14)D+60(N=11)D+100(N=12)D+180(N=8)D+270(N=6)D+360(N=7)D+540(N=4)D+720(N=4)35,51 27,55 30,04 67,48 68,19 63,64 58,74 64,42 56,80 60,34% células T8,94 9,01 11,14 12,49 11,27 8,56 11,64 18,92 21,60 13,69CD3 + CD8 - INF-γ + 35,11 27,27 31,14 67,42 67,43 63,13 57,10 62,64 50,90 62,1168,55 52,10 51,57 81,75 83,47 82,73 73,76 75,18 89,72 73,60% células T11,37 15,86 24,04 12,79 7,71 9,53 11,13 17,24 4,44 20,50CD3 + CD8 + INF-γ + 71,25 54,34 49,51 85,03 84,75 86,33 72,12 81,15 91,56 81,2053,96 35,05 35,62 37,37 36,71 40,30 41,22 34,24 46,08 38,73% células T20,82 13,03 11,83 14,43 13,63 14,25 15,79 14,55 13,18 9,43CD3 + CD8 - IL-2 + 56,61 33,53 35,04 39,04 33,20 42,35 44,76 30,88 48,97 35,7632,21 13,83 19,36 9,64 8,70 8,87 17,86 13,24 18,90 25,60% células T19,77 10,14 13,72 9,43 7,35 6,79 17,30 20,94 15,13 22,50CD3 + CD8 + IL-2 + 28,08 12,60 14,55 7,42 4,91 6,42 11,41 5,40 15,71 23,0057,35 39,81 53,06 68,18 68,34 58,16 52,10 67,80 76,97 74,58% células T19,22 23,60 18,34 10,85 14,92 13,52 24,60 14,17 16,00 8,75CD3 + CD8 - TNF-α + 67,35 42,69 59,61 66,47 67,41 52,31 58,70 68,63 76,11 72,1054,63 35,84 47,03 50,80 62,20 55,43 42,60 60,76 78,58 76,03% células T22,24 20,28 21,53 13,28 12,99 26,72 26,20 20,96 12,99 10,80CD3 + CD8 + TNF-α + 62,31 37,02 48,23 50,30 58,81 65,10 45,90 58,59 75,16 75,110,04 0,79 0,40 0,60 1,83 0,91 0,27 0,16 0,31 0,43% células T0,09 1,52 1,34 1,20 2,69 2,33 0,67 0,28 0,22 0,62CD3 + CD8 - IL-4 + 0,00 0,00 0,00 0,23 0,75 0,00 0,00 0,00 0,36 0,200,29 1,26 0,68 0,18 1,04 1,30 0,46 0,16 0,00 0,39% células T0,57 1,93 0,82 0,25 1,82 2,81 0,72 0,36 0,00 0,33CD3 + CD8 + IL-4 + 0,00 0,56 0,23 0,00 0,13 0,00 0,00 0,00 0,00 0,380,08 0,02 0,43 0,15 0,34 0,24 0,00 0,00 0,00 0,03% células T0,16 0,06 1,43 0,26 1,16 0,67 0,00 0,00 0,00 0,07CD3 + CD8 - IL-5 + 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,000,38 0,29 1,64 0,46 0,55 0,91 0,13 0,25 0,00 0,18% células T0,51 0,51 2,50 0,82 0,87 1,67 0,19 0,32 0,00 0,23CD3 + CD8 + L-5 + 0,07 0,00 0,91 0,15 0,00 0,10 0,04 0,00 0,00 0,121,17 0,09 0,08 1,48 2,40 0,35 0,30 0,30 0,45 0,13% células T2,69 0,16 0,26 2,77 6,87 0,95 0,46 0,54 0,54 0,25CD3 + CD8 - IL-10 + 0,23 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,35 0,001,26 0,34 0,73 0,48 0,85 0,48 0,27 0,09 0,06 0,05% células T2,14 0,66 1,46 0,72 2,11 0,87 0,42 0,15 0,11 0,06CD3 + CD8 + IL-10 + 0,46 0,00 0,21 0,06 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,05IS, indivíduos saudáveis; Pré-mob, pré-mobilização (pré-transplante); Pré-cond, pré-condicionamento; D+60, D+100, D+180,D+270, D+360, dias pós-transplante. São mostrados os valores relativos (%) para as diferentes subpopulações celularesanalisadas. Os valores estão mostrados na seguinte ordem: média, desvio padrão e mediana dos valores.

Apêndice G 211Tabela G.2. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controlessaudáveis e de pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-transplante, para as populações decélulas T CD4 + (CD3 + CD8 - ) ou CD8 + (CD3 + CD8 + ) produtoras de citocinas.SUBPOPULAÇÃOCELULARIS XPRÉ-MOBPRÉ-MOB XPRÉ-CONDPRÉ-MOB XD+60PRÉ-MOB XD+100PRÉ-MOB XD+180PRÉ-MOB XD+270PRÉ-MOB XD+360PRÉ-MOB XD+540PRÉ-MOB XD+720% células TCD3 + CD8 - INF-γ + 0,1370 0,6228

Apêndice H 212Apêndice H - Curvas de amplificação, curvas de dissociação e a eficiência deamplificação dos genes GAPDH e Foxp3.A. Gene de referência: GAPDH B. Gene alvo: Foxp3A.1B.1A.2B.2A.3 B.32 3 4 5 1 2 3 4 5C.média Ct353025201510500 0,5 1 1,5 2 2,5log ng RNAMédia Ct FOXP3Média Ct GAPDHLi near (Médi a Ct FOXP3)Li near (Médi a Ct GAPDH)y = -3.1903x + 33.75R 2 = 0.9985y = -3,1554x + 25,48R 2 = 0,9921Figura H.1. Reação de Real time PCR para genes GAPDH (A) e Foxp3 (B). Curvas de amplificação (A.1 eB.1), de curvas de dissociação (A.2 e B.2), curvas de amplificação com o threshold (linha de corte verde; A.3 eB.3) e gráfico com a eficiência de amplificação dos primers (C). Os números 1, 2, 3, 4, 5 indicam a diluição docDNA, respectivamente: puro, 1/5, 1/25, 1/125, 1/625. Para a quantificação relativa, foi estabelecido um valor deΔRn, que é uma linha de corte (threshold) para cada curva de amplificação de um dado par de primers. Onúmero do ciclo em que o ΔRn da amostra cruza o threshold corresponde ao Ct (cycle threshold) da amostra.

Apêndice I 213Apêndice I -Repertório da cadeia Vβ do TCR de linfócitos T do sangue periférico dopaciente com diabete melito do tipo 1 LSM (DM1), pré- e pós-TACTH.Pré-Tx D+180 D+360VB1VB2VB3VB4VB5VB6VB7VB8VB9VB10VB11VB12

Apêndice I 214Pré-Tx D+180 D+360VB13VB14VB15VB16VB17VB18VB19VB20VB21VB22VB23VB24Figura I.1. Repertório da cadeia Vβ do TCR no paciente com diabete melito do tipo 1 LSM (DM1), pré epós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificadousando primers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método deTCRBV CDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número de

Apêndice I 215transcritos para a família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases(eixo X). Os picos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos.Tabela I.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do TCR efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente com diabetemelito do tipo 1 LSM (DM1), pré- e pós-TACTH.Família VBPré-TxD+180 D+360 Família VB Pré-Tx D+180 D+360VB1 6aa VB13 6aa 0,116 0,154VB1 7aa 0,046 0,027 VB13 7aa 0,428 0,605 0,623VB1 8aa 0,242 0,089 0,081 VB13 8aa 1,217 0,978 1,412VB1 9aa 0,402 0,480 0,166 VB13 9aa 1,972 0,514 1,735VB1 10aa 0,339 0,397 0,187 VB13 10aa 1,536 1,454 2,208VB1 11aa 0,765 1,616 0,401 VB13 11aa 0,726 0,367 0,736VB1 12aa 0,034 0,147 0,025 VB13 12aa 0,158 0,204VB1 13aa 0,030 0,192 0,025 VB13 13aa 0,065 0,074VB1 Total 1,858 2,921 0,913 VB13 Total 6,219 3,918 7,146VB2 5aa 0,047 VB14 5aa 0,044VB2 6aa 0,067 0,329 0,050 VB14 6aa 0,057 0,040VB2 7aa 0,296 0,448 0,147 VB14 7aa 0,245 0,186VB2 8aa 0,629 0,893 0,316 VB14 8aa 0,607 1,445 1,857VB2 9aa 1,062 1,588 0,358 VB14 9aa 0,805 0,054 0,666VB2 10aa 0,495 1,522 0,244 VB14 10aa 0,586 0,090 0,870VB2 11aa 0,184 0,308 0,086 VB14 11aa 0,737 0,373 1,063VB2 12aa 0,056 0,680 0,052 VB14 12aa 0,150 0,020 0,139VB2 13aa 0,043 0,033 VB14 13aa 0,223 0,077VB2 14aa 0,038 VB14 14aaVB2 15aa 0,055 VB14 15aaVB2 Total 2,831 5,941 1,254 VB14 Total 3,453 1,983 4,897VB3 6aa 0,105 0,863 0,091 VB15 6aa 0,156 0,121 0,404VB3 7aa 0,568 0,995 0,185 VB15 7aa 0,408 0,161 0,740VB3 8aa 0,203 0,070 0,093 VB15 8aa 1,145 0,366 0,989VB3 9aa 1,968 3,618 0,794 VB15 9aa 1,913 0,529 1,668VB3 10aa 0,409 0,589 0,275 VB15 10aa 1,242 0,435 1,723VB3 11aa 0,252 0,079 0,120 VB15 11aa 1,604 1,534 1,080VB3 12aa 0,071 0,152 0,042 VB15 12aa 1,159 0,000 0,172VB3 13aa 0,201 VB15 13aa 1,733 0,000 0,124VB3 14aa VB15 14aa 0,744 0,114 0,185VB3 15aa VB15 15aa 0,666VB3 16aa VB15 16aa 0,157VB3 Total 3,778 6,366 1,600 VB15 Total 10,926 3,260 7,085VB4 4aa 0,029 VB16 4aaVB4 5aa 0,091 0,086 0,023 VB16 5aaVB4 6aa 0,357 0,263 0,096 VB16 6aa 0,036 0,133VB4 7aa 1,194 1,199 0,339 VB16 7aa 0,347 0,122 0,383VB4 8aa 0,975 0,766 0,275 VB16 8aa 0,725 0,300 1,089VB4 9aa 0,971 1,839 0,386 VB16 9aa 1,057 0,183 1,179VB4 10aa 0,275 0,246 0,075 VB16 10aa 0,775 1,126 1,540VB4 11aa 0,108 0,171 0,042 VB16 11aa 0,450 2,518 2,156VB4 12aa 0,053 0,023 VB16 12aa 0,513 0,267 0,577

Apêndice I 216VB4 13aa VB16 13aa 0,298 0,376 0,401VB4 14aa VB16 14aa 0,078 0,037 0,091VB4 15aa VB16 15aa 0,035 0,041VB4 Total 4,053 4,570 1,260 VB16 Total 4,313 4,930 7,589VB5 5aa 0,028 VB17 5aaVB5 6aa 0,080 0,114 0,042 VB17 6aa 0,158 0,157VB5 7aa 0,419 1,591 0,186 VB17 7aa 0,578 0,292 0,604VB5 8aa 0,725 0,740 0,479 VB17 8aa 1,114 1,015 1,463VB5 9aa 1,421 1,998 0,782 VB17 9aa 1,925 0,719 1,950VB5 10aa 1,280 2,088 0,853 VB17 10aa 1,450 0,863 2,072VB5 11aa 0,560 0,309 0,502 VB17 11aa 0,619 0,164 0,561VB5 12aa 0,216 0,226 0,099 VB17 12aa 0,358 0,583 0,620VB5 13aa 0,062 0,068 0,035 VB17 13aa 0,099 0,057VB5 Total 4,763 7,161 2,978 VB17 Total 6,302 3,637 7,485VB6 6aa 0,085 0,066 0,070 VB18 6aa 0,053 0,046VB6 7aa 0,507 0,721 0,302 VB18 7aa 0,152 0,047 0,151VB6 8aa 1,228 1,553 0,765 VB18 8aa 0,920 0,000 0,704VB6 9aa 2,076 3,798 1,635 VB18 9aa 1,613 3,243 1,966VB6 10aa 1,635 1,498 0,910 VB18 10aa 1,241 0,154 0,913VB6 11aa 1,082 1,002 0,547 VB18 11aa 0,752 0,068 0,521VB6 12aa 0,530 0,629 0,174 VB18 12aa 0,232 0,037 0,168VB6 13aa 0,113 0,054 VB18 13aa 0,037 0,057VB6 14aa 0,040 0,048 VB18 14aa 0,044 0,052VB6 15aa 0,217 VB18 15aaVB6 Total 7,295 9,484 4,506 VB18 Total 5,044 3,548 4,578VB7 6aa 0,041 VB19 6aaVB7 7aa 0,089 0,206 0,130 VB19 7aa 0,055VB7 8aa 0,582 0,281 0,558 VB19 8aa 0,075 0,097 0,040VB7 9aa 0,901 0,652 0,991 VB19 9aa 0,058 0,134 0,060VB7 10aa 1,926 2,144 2,152 VB19 10aa 0,138 0,272 0,357VB7 11aa 0,822 0,215 0,861 VB19 11aa 0,069 0,160VB7 12aa 0,749 0,769 0,852 VB19 12aa 0,035VB7 13aa 0,167 0,044 0,165 VB19 13aa 0,040VB7 14aa 0,068 0,043 VB19 14aa 0,024VB7 15aa 0,176 VB19 15aaVB7 Total 5,522 4,311 5,752 VB19 Total 0,494 0,664 0,456VB8 6aa 0,083 VB20 6aa 0,077 0,090 0,139VB8 7aa 0,334 0,074 0,219 VB20 7aa 0,328 0,089 0,362VB8 8aa 1,953 0,531 0,694 VB20 8aa 0,517 0,097 0,716VB8 9aa 0,898 3,941 1,983 VB20 9aa 0,339 0,047 0,524VB8 10aa 0,831 0,197 0,386 VB20 10aa 0,307 1,705 1,238VB8 11aa 0,354 0,199 0,354 VB20 11aa 0,106 0,043VB8 12aa 0,041 0,042 0,115 VB20 12aa 0,043 0,079VB8 13aa 0,028 0,030 0,036 VB20 13aaVB8 Total 4,521 5,015 3,786 VB20 Total 1,718 2,029 3,101VB9 6aa 0,059 0,040 VB21 6aa 0,073 0,090VB9 7aa 0,279 0,147 0,205 VB21 7aa 0,185 0,164 0,287VB9 8aa 0,789 1,082 1,055 VB21 8aa 0,516 0,766 1,213

Apêndice I 217VB9 9aa 1,047 1,105 1,138 VB21 9aa 0,658 0,720 1,380VB9 10aa 1,233 0,487 0,838 VB21 10aa 1,413 1,228 1,958VB9 11aa 0,432 0,290 0,489 VB21 11aa 0,386 0,165 0,629VB9 12aa 0,204 0,161 0,464 VB21 12aa 0,153 0,080 0,268VB9 13aa 0,163 0,041 VB21 13aa 0,107 0,257 0,165VB9 14aa 0,085 0,294 VB21 14aa 0,221 0,145 0,230VB9 15aa 0,131 VB21 15aaVB9 Total 4,293 3,568 4,401 VB21 Total 3,713 3,525 6,221VB10 5aa 0,159 0,142 VB22 5aa 0,042VB10 6aa 0,178 0,056 VB22 6aa 0,223 0,229VB10 7aa 0,303 0,169 0,238 VB22 7aa 0,449 0,099 0,679VB10 8aa 0,147 0,130 0,182 VB22 8aa 0,943 0,189 1,551VB10 9aa 0,255 0,241 0,488 VB22 9aa 0,908 0,884 3,738VB10 10aa 0,343 2,826 1,198 VB22 10aa 0,695 2,718 0,980VB10 11aa 0,415 1,119 0,644 VB22 11aa 0,287 0,274 0,379VB10 12aa 0,329 0,044 VB22 12aa 0,070 0,137 0,121VB10 13aa 0,032 0,063 VB22 13aa 0,039 0,063 0,061VB10 14aa 0,028 0,052 VB22 14aa 0,056 0,039VB10 15aa 0,058 VB22 15aaVB10 Total 1,853 4,822 3,163 VB22 Total 3,669 4,364 7,819VB11 6aa 0,084 VB23 6aa 0,112VB11 7aa 0,235 0,149 1,010 VB23 7aa 0,278 0,065 0,078VB11 8aa 0,980 1,032 1,028 VB23 8aa 0,491 0,400 1,998VB11 9aa 1,964 3,876 1,296 VB23 9aa 0,981 1,208 0,703VB11 10aa 0,776 0,494 0,479 VB23 10aa 0,901 0,668 0,719VB11 11aa 0,654 0,424 0,404 VB23 11aa 0,800 0,868 0,583VB11 12aa 0,616 0,231 0,212 VB23 12aa 0,165 0,075 0,087VB11 13aa VB23 13aa 0,091 0,329 0,087VB11 14aa 0,063 VB23 14aa 0,066VB11 15aa 0,095 VB23 15aaVB11 Total 5,468 6,206 4,429 VB23 Total 3,886 3,614 4,256VB12 5aa 0,067 VB24 5aaVB12 6aa 1,574 4,122 4,133 VB24 6aaVB12 7aa 0,333 0,046 VB24 7aa 0,027 0,018 0,040VB12 8aa 0,370 0,215 VB24 8aa 0,028 0,001 0,033VB12 9aa 0,751 0,267 VB24 9aa 0,044 0,002 0,060VB12 10aa 0,575 0,255 VB24 10aa 0,053 0,019 0,098VB12 11aa 0,142 0,060 VB24 11aa 0,033 0,002 0,030VB12 12aa 0,055 VB24 12aa 0,009 0,015VB12 13aa 0,029 VB24 13aa 0,007 0,005VB12 Total 3,830 4,122 5,043 VB24 Total 0,200 0,043 0,282

Apêndice J 218Apêndice J -Repertório da cadeia Vβ do TCR de linfócitos T do sangue periférico dopaciente com diabete melito do tipo 1 ALSR (DM2), pré- e pós-TACTH.Pré-Tx D+100 D+180 D+270 D+360VB1VB2VB3VB4VB5VB6VB7VB8VB9VB10VB11VB12

Apêndice J 219Pré-Tx D+100 D+180 D+270 D+360VB13VB14VB15VB16VB17VB18VB19VB20VB21VB22VB23VB24Figura J.1. Repertório da cadeia Vβ do TCR no paciente com diabete melito do tipo 1 ALSR (DM2), pré epós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificadousando primers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método deTCRBV CDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número detranscritos para a família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases(eixo X). Os picos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos.

Apêndice J 220Tabela J.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do TCR efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente com diabetemelito do tipo 1 ALSR (DM2), pré- e pós-TACTH.FamíliaVBPré-TxD+100 D+180 D+270 D+360FamíliaVBPré-TxD+100 D+180 D+270 D+360VB1 6aa 0,058 VB13 6aa 0,120VB1 7aa 0,193 0,183 0,191 0,083 VB13 7aa 0,257 0,510 0,279 0,417 0,183VB1 8aa 0,207 0,116 0,167 0,262 0,143 VB13 8aa 0,841 0,946 0,892 1,286 0,711VB1 9aa 0,312 1,252 2,239 1,304 0,959 VB13 9aa 0,981 0,552 0,413 0,944 0,301VB1 10aa 0,349 0,215 0,237 0,346 0,160 VB13 10aa 1,266 0,678 0,349 0,770 0,345VB1 11aa 0,197 0,296 0,706 0,493 0,391 VB13 11aa 0,626 2,987 2,106 1,846 2,090VB1 12aa 0,052 0,109 0,173 0,187 0,126 VB13 12aa 0,099VB1 13aa VB13 13aa 0,049VB1 Total 1,118 2,180 3,705 2,841 1,863 VB13 Total 4,240 5,673 4,038 5,262 3,630VB2 6aa 0,136 0,438 0,376 0,371 0,384 VB14 6aa 0,143 0,076 0,195 0,112VB2 7aa 0,400 0,145 0,198 0,408 0,405 VB14 7aa 0,112 0,111 0,033 0,175VB2 8aa 1,128 2,575 2,068 1,819 2,022 VB14 8aa 0,893 1,523 0,855 2,050 0,886VB2 9aa 1,124 0,695 0,667 1,521 1,512 VB14 9aa 0,973 1,768 0,897 2,208 0,995VB2 10aa 0,781 0,485 0,401 0,846 0,886 VB14 10aa 0,840 0,104 0,022 0,304VB2 11aa 0,276 0,395 0,244 0,545 0,474 VB14 11aa 0,382 0,115 0,064 0,237 0,138VB2 12aa 0,161 0,416 0,294 0,249 0,317 VB14 12aa 0,090 0,077 0,047VB2 13aa 0,055 0,142 0,074 0,095 0,118 VB14 13aa 0,058 0,060VB2 14aa 0,052 0,085 0,046 0,057 VB14 14aaVB2 Total 4,059 5,342 4,407 5,901 6,174 VB14 Total 3,348 3,764 1,946 5,305 2,177VB3 6aa 0,060 VB15 6aa 0,148 0,107 0,117 0,091 0,068VB3 7aa 0,235 0,110 0,296 0,252 0,195 VB15 7aa 0,399 1,059 0,908 0,422 0,534VB3 8aa 0,238 0,139 0,161 0,219 0,188 VB15 8aa 0,870 0,325 0,676 0,849 0,750VB3 9aa 0,547 0,145 0,119 0,382 0,219 VB15 9aa 1,060 0,143 0,143 0,370 0,335VB3 10aa 0,619 0,283 0,280 0,550 0,337 VB15 10aa 1,658 2,510 1,816 1,072 1,909VB3 11aa 1,370 1,829 1,859 1,685 1,320 VB15 11aa 0,655 0,193 0,236 0,304 0,171VB3 12aa 0,206 2,192 2,673 2,816 3,038 VB15 12aa 0,553 2,487 2,524 1,501 2,898VB3 13aa VB15 13aa 0,154 0,042 0,067 0,051VB3 Total 3,273 4,698 5,388 5,904 5,296 VB15 Total 5,497 6,824 6,462 4,676 6,716VB4 5aa 0,070 0,044 VB16 5aaVB4 6aa 0,223 0,089 0,081 0,154 0,069 VB16 6aa 0,070 0,172 0,295 0,183 0,132VB4 7aa 0,544 0,438 0,638 0,478 0,282 VB16 7aa 0,356 0,155 0,119 0,310 0,173VB4 8aa 1,001 2,187 4,508 2,979 2,096 VB16 8aa 1,320 0,680 1,507 1,092 1,402VB4 9aa 0,556 0,058 0,059 0,200 0,093 VB16 9aa 0,978 2,081 2,302 1,836 1,680VB4 10aa 0,235 0,097 0,191 0,107 VB16 10aa 1,450 1,447 1,748 1,987 1,705VB4 11aa 0,086 0,212 0,078 0,063 VB16 11aa 0,371 0,852 0,263 1,214 1,383VB4 12aa VB16 12aa 0,183 0,083 0,226 0,291 0,394VB4 13aa VB16 13aa 0,064 0,087 0,216 0,231VB4 14aa VB16 14aa 0,054 0,071VB4 15aa VB16 15aa 0,093VB4 Total 2,714 2,772 5,595 4,123 2,710 VB16 Total 4,791 5,556 6,460 7,276 7,172VB5 6aa 0,041 VB17 6aa 0,164 0,093 0,124 0,178 0,062VB5 7aa 0,082 0,210 0,173 0,108 0,189 VB17 7aa 0,466 0,430 0,315 0,345 0,201VB5 8aa 0,306 2,449 2,389 0,959 2,042 VB17 8aa 1,444 0,365 0,408 0,641 0,355

Apêndice J 221VB5 9aa 0,408 1,914 1,770 0,641 1,207 VB17 9aa 2,270 1,359 1,441 1,531 0,875VB5 10aa 0,455 0,523 0,783 0,363 0,697 VB17 10aa 2,222 2,176 2,456 2,894 1,983VB5 11aa 0,225 0,158 0,204 0,179 0,295 VB17 11aa 0,571 0,186 0,249 0,524 0,255VB5 12aa 0,060 0,052 0,051 0,071 VB17 12aa 0,321 0,233 0,311 0,261 0,140VB5 13aa 0,043 VB17 13aa 0,125 0,108 0,095 0,112 0,098VB5 Total 1,536 5,307 5,318 2,301 4,586 VB17 Total 7,584 4,951 5,399 6,486 3,969VB6 5aa VB18 5aa 0,041VB6 6aa 0,233 0,066 0,071 0,060 VB18 6aa 0,040 0,062 0,192VB6 7aa 0,735 0,483 0,646 0,505 0,372 VB18 7aa 0,116 0,246 0,296 0,470 0,546VB6 8aa 1,322 1,844 3,054 2,051 2,186 VB18 8aa 0,527 0,099 0,158 0,690 1,011VB6 9aa 4,015 3,002 3,792 3,141 2,497 VB18 9aa 2,338 0,690 0,949 1,522 1,328VB6 10aa 1,797 0,311 0,343 0,380 0,208 VB18 10aa 1,119 1,002 0,946 1,528 0,607VB6 11aa 1,665 1,728 2,789 1,133 1,245 VB18 11aa 0,746 0,555 0,564 0,790 0,874VB6 12aa 0,199 0,075 VB18 12aa 0,271 1,405 1,318 1,068 0,051VB6 13aa 0,172 0,156 0,111 VB18 13aa 0,058VB6 14aa 0,068 0,139 VB18 14aaVB6 Total 10,205 7,507 10,846 7,393 6,643 VB18 Total 5,175 3,996 4,271 6,129 4,650VB7 6aa VB19 6aa 0,708VB7 7aa 0,223 2,857 0,052 VB19 7aa 0,050 0,120VB7 8aa 0,326 1,036 0,073 VB19 8aa 0,052 0,438 0,516 0,256 0,603VB7 9aa 1,988 1,825 1,362 1,969 2,621 VB19 9aa 0,046 0,037 0,044 0,049 0,273VB7 10aa 1,902 0,290 1,006 1,026 VB19 10aa 0,088 0,667 0,529 0,266 0,099VB7 11aa 1,780 0,922 1,307 1,871 VB19 11aa 0,050 0,271 0,250 0,094VB7 12aa 0,391 0,045 VB19 12aa 0,045 0,062 0,055 0,116VB7 13aa 0,224 0,039 VB19 13aaVB7 14aa 0,053 VB19 14aaVB7 Total 6,886 5,718 2,573 4,491 5,518 VB19 Total 0,330 1,475 1,393 0,665 1,920VB8 6aa 0,085 VB20 6aa 0,066 0,536 0,553 0,183 0,245VB8 7aa 0,178 VB20 7aa 0,254 0,071 0,081 0,066 0,112VB8 8aa 0,353 0,084 VB20 8aa 0,712 0,855 0,639 0,370 0,443VB8 9aa 3,849 4,908 3,115 2,924 2,723 VB20 9aa 0,207 0,113 0,198 0,136 0,210VB8 10aa 0,101 VB20 10aa 0,159 0,070 0,073 0,065 0,092VB8 11aa 0,230 VB20 11aa 0,079 0,103 0,131VB8 12aaVB20 12aaVB8 13aa 0,116 0,233 VB20 13aaVB8 14aa VB20 14aa 0,065VB8 15aaVB20 15aaVB8 16aa VB20 16aa 0,102VB8 Total 4,912 5,225 3,115 2,924 2,723 VB20 Total 1,398 1,813 1,623 0,924 1,234VB9 6aa VB21 6aa 0,061 0,083VB9 7aa 0,422 0,821 0,432 0,791 0,626 VB21 7aa 0,236 0,137 0,138 0,090 0,120VB9 8aa 0,622 0,190 0,078 0,347 0,214 VB21 8aa 0,628 0,134 0,064 0,153 0,189VB9 9aa 2,024 0,602 0,269 0,692 0,394 VB21 9aa 0,732 0,706 0,807 0,533 1,016VB9 10aa 2,269 1,606 1,146 1,973 1,730 VB21 10aa 1,819 1,703 2,027 0,875 1,768VB9 11aa 0,562 0,095 0,132 0,112 VB21 11aa 0,368 0,253 0,310 0,204 0,270VB9 12aa 0,315 0,252 0,133 0,274 0,197 VB21 12aa 0,585 1,820 2,363 1,456 3,346VB9 13aa 0,148 0,074 0,044 VB21 13aa 0,061VB9 14aa 0,121 VB21 14aaVB9 Total 6,483 3,565 2,058 4,282 3,317 VB21 Total 4,490 4,752 5,709 3,312 6,792

Apêndice J 222VB10 5aa VB22 5aa 0,056 0,050 0,065 0,050VB10 6aa 0,097 0,079 VB22 6aa 0,405 0,057 0,321 0,364 0,268VB10 7aa 0,233 0,123 0,412 VB22 7aa 0,797 0,140 0,756 0,840 0,535VB10 8aa 0,324 0,331 0,154 0,694 VB22 8aa 1,390 0,151 1,276 1,354 1,278VB10 9aa 0,419 0,432 0,187 0,939 VB22 9aa 2,088 0,362 2,030 1,688 1,446VB10 10aa 0,687 1,527 0,597 0,715 1,696 VB22 10aa 1,890 0,318 1,516 1,425 1,279VB10 11aa 0,402 0,498 0,082 0,382 0,536 VB22 11aa 0,335 0,080 0,455 0,548 0,434VB10 12aa 0,430 0,496 0,123 0,545 1,695 VB22 12aa 0,278 0,035 0,161 0,225 0,126VB10 13aa 0,105 0,135 0,130 VB22 13aa 0,047 0,023 0,076 0,075 0,062VB10 14aa 1,020 0,392 0,203 1,138 VB22 14aaVB10 15aa 0,074 VB22 15aaVB10 Total 2,770 4,948 1,194 2,317 7,109 VB22 Total 7,286 1,166 6,643 6,583 5,479VB11 6aa 0,094 VB23 6aa 0,050VB11 7aa 1,332 0,884 1,475 1,320 0,537 VB23 7aa 0,342 0,117 0,167 0,163VB11 8aa 0,900 0,385 0,058 0,234 0,097 VB23 8aa 1,081 0,790 0,676 0,734 1,214VB11 9aa 0,321 1,285 0,627 0,786 0,320 VB23 9aa 1,348 5,498 5,918 3,126 4,138VB11 10aa 0,538 0,271 0,153 0,489 0,204 VB23 10aa 1,300 0,050 0,327 0,443VB11 11aa 0,390 1,069 0,304 0,385 0,251 VB23 11aa 1,196 0,676 0,812 0,421 0,512VB11 12aa 0,127 0,170 0,054 VB23 12aa 0,250VB11 13aa 0,120 0,113 VB23 13aa 0,180VB11 14aa VB23 14aa 0,089VB11 Total 3,728 3,988 2,616 3,498 1,463 VB23 Total 5,787 7,131 7,407 4,775 6,520VB12 6aa 0,049 0,037 VB24 6aa 0,002VB12 7aa 0,150 0,079 0,205 0,195 VB24 7aa 0,008 0,004 0,005VB12 8aa 0,522 0,097 0,157 0,388 0,267 VB24 8aa 0,013 0,015 0,013 0,008VB12 9aa 0,840 1,408 1,212 1,101 0,860 VB24 9aa 0,026 0,048 0,038 0,035VB12 10aa 0,486 0,063 0,395 0,421 VB24 10aa 0,039 0,025 0,122 0,070 0,057VB12 11aa 0,152 0,048 0,188 0,221 VB24 11aa 0,013 0,107 0,005 0,031 0,008VB12 12aa 0,065 0,053 0,091 VB24 12aa 0,009 0,005 0,005VB12 13aa 0,059 0,084 0,087 0,132 VB24 13aa 0,002 0,011 0,006 0,004VB12 Total 2,274 1,506 1,642 2,464 2,222 VB24 Total 0,113 0,143 0,193 0,168 0,118

Apêndice K 223Apêndice K - Repertório da cadeia Vβ do TCR de linfócitos T do sangue periférico dopaciente com diabete melito do tipo 1 WSL (DM3), pré- e pós-TACTH.Pré-Tx D+100 D+360VB1VB2VB3VB4VB5VB6VB7VB8VB9VB10VB11VB12- -

Apêndice K 224Pré-Tx D+100 D+360VB13VB14VB15VB16VB17VB18VB19VB20VB21VB22VB23VB24Figura K.1. Repertório da cadeia Vβ do TCR no paciente com diabete melito do tipo 1 WSL (DM3), pré epós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificadousando primers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método deTCRBV CDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número detranscritos para a família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases(eixo X). Os picos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos.

Apêndice K 225Tabela K.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do TCR efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente com diabetemelito WSL (DM3), pré- e pós-TACTH.FamíliaVBPré-TxD+100 D+360FamíliaVBPré-TxD+100 D+360VB1 7aa 0,099 0,246 0,031 VB13 7aa 0,765 3,334 1,248VB1 8aa 0,325 0,160 0,356 VB13 8aa 0,079 0,095 0,063VB1 9aa 0,986 0,490 0,131 VB13 9aa 0,204 0,663 0,300VB1 10aa 0,826 0,462 1,182 VB13 10aa 0,479 2,698 0,819VB1 11aa 0,413 0,175 0,109 VB13 11aa 0,095 0,054VB1 12aa 2,597 2,914 1,491 VB13 12aa 0,056VB1 Total 5,245 4,446 3,300 VB13 Total 1,678 6,789 2,485VB2 5aa 0,018 0,025 VB14 5aaVB2 6aa 0,103 0,064 0,158 VB14 6aa 0,036 0,013VB2 7aa 0,568 0,433 0,571 VB14 7aa 0,074 0,025VB2 8aa 0,584 0,558 0,958 VB14 8aa 0,291 1,357 0,448VB2 9aa 0,990 1,037 1,250 VB14 9aa 0,375 1,419 0,498VB2 10aa 0,588 1,166 1,234 VB14 10aa 0,141 1,216 0,756VB2 11aa 0,500 1,701 0,716 VB14 11aa 0,073 0,374 0,938VB2 12aa 0,066 0,032 0,121 VB14 12aa 0,028 0,050 0,014VB2 13aa 0,222 0,033 0,066 VB14 13aa 0,052 0,021VB2 14aa VB14 14aa 0,044VB2 Total 3,638 5,025 5,100 VB14 Total 0,908 4,621 2,713VB3 6aa 0,078 0,239 0,073 VB15 6aa 0,041 0,019VB3 7aa 0,050 0,613 0,107 VB15 7aa 0,068 0,076VB3 8aa 2,580 3,675 4,966 VB15 8aa 0,796 1,720 0,093VB3 9aa 0,162 0,022 VB15 9aa 0,361 0,823 0,044VB3 10aa 0,323 0,361 0,169 VB15 10aa 0,290 0,388 0,057VB3 11aa 0,183 0,095 VB15 11aa 3,791 2,244 0,101VB3 12aa 0,040 VB15 12aaVB3 13aa 0,033 VB15 13aaVB3 Total 3,450 5,005 5,315 VB15 Total 5,347 5,270 0,296VB4 5aa 0,044 0,031 0,040 VB16 5aaVB4 6aa 0,700 0,701 0,441 VB16 6aa 0,045 0,120VB4 7aa 0,367 1,280 0,724 VB16 7aa 3,031 3,244 3,917VB4 8aa 0,792 0,237 0,973 VB16 8aa 0,526 0,114 0,225VB4 9aa 0,594 0,911 0,637 VB16 9aa 0,272 0,065VB4 10aa 0,288 0,096 0,217 VB16 10aa 0,251 0,031 0,170VB4 11aa 0,627 0,431 0,293 VB16 11aa 0,266 0,150 0,181VB4 12aa 0,023 0,027 VB16 12aa 0,072 0,032 0,030VB4 13aa 0,017 VB16 13aa 0,161 0,060VB4 14aa 0,016 VB16 14aaVB4 Total 3,468 3,687 3,353 VB16 Total 4,651 3,617 4,767VB5 5aa VB17 5aa 0,029VB5 6aa 0,080 0,040 0,072 VB17 6aa 0,056 0,125 0,096VB5 7aa 0,315 0,308 0,318 VB17 7aa 0,321 0,703 0,700VB5 8aa 0,892 1,993 1,673 VB17 8aa 1,340 1,545 1,374VB5 9aa 1,635 0,751 1,262 VB17 9aa 0,958 0,853 1,341VB5 10aa 2,305 1,711 1,961 VB17 10aa 0,858 0,792 1,361

Apêndice K 226VB5 11aa 0,929 0,436 0,521 VB17 11aa 0,464 0,345 0,452VB5 12aa 0,795 0,175 0,287 VB17 12aa 0,107 0,083 0,179VB5 13aa 0,080 0,060 0,103 VB17 13aa 0,040 0,021 0,084VB5 14aa 0,239 0,265 0,196 VB17 14aa 0,016VB5 15aa VB17 15aa 0,011VB5 Total 7,271 5,739 6,392 VB17 Total 4,146 4,466 5,642VB6 5aa 0,092 0,026 VB18 5aa 1,507 0,748 0,388VB6 6aa 0,159 0,146 0,084 VB18 6aa 0,022VB6 7aa 0,540 0,304 0,224 VB18 7aa 0,160 0,081VB6 8aa 1,450 1,075 0,906 VB18 8aa 0,614 1,000 0,916VB6 9aa 2,261 1,547 1,718 VB18 9aa 0,598 0,275 0,728VB6 10aa 2,253 1,354 1,174 VB18 10aa 1,531 2,457 1,841VB6 11aa 1,034 0,771 0,689 VB18 11aa 0,558 0,116 0,536VB6 12aa 1,888 0,262 0,142 VB18 12aa 0,172 0,333 0,206VB6 13aa 0,031 0,043 VB18 13aa 0,168 0,037 0,157VB6 14aa 0,101 0,036 VB18 14aaVB6 Total 9,716 5,630 4,963 VB18 Total 5,308 4,965 4,873VB7 6aa 0,022 VB19 6aaVB7 7aa 0,026 0,042 VB19 7aaVB7 8aa 0,324 0,206 0,280 VB19 8aaVB7 9aa 0,596 1,275 1,190 VB19 9aa 0,174VB7 10aa 1,095 0,471 1,104 VB19 10aa 3,338 3,874 4,962VB7 11aa 1,490 1,559 1,222 VB19 11aaVB7 12aa 0,420 0,082 0,246 VB19 12aaVB7 13aa 0,190 0,165 0,235 VB19 13aaVB7 14aa 0,227 0,067 0,150 VB19 14aa 1,363 0,200 0,302VB7 15aa 0,045 VB19 15aaVB7 Total 4,435 3,824 4,469 VB19 Total 4,702 4,074 5,438VB8 5aa 0,024 VB20 5aa 0,115VB8 6aa 0,098 0,039 0,041 VB20 6aa 0,066 0,071VB8 7aa 0,296 0,149 0,132 VB20 7aa 1,520 1,155 1,357VB8 8aa 0,662 0,927 0,501 VB20 8aa 0,109 0,139 0,173VB8 9aa 0,834 1,348 0,918 VB20 9aa 1,914 2,534 2,765VB8 10aa 0,608 0,115 0,285 VB20 10aaVB8 11aa 0,244 0,144 0,145 VB20 11aaVB8 12aa 0,135 0,141 0,061 VB20 12aaVB8 13aa 0,117 0,033 0,059 VB20 13aa 0,069 0,060VB8 14aa 0,095 0,641 VB20 14aa 0,044VB8 15aa 0,160 VB20 15aa 0,249 0,117 0,092VB8 Total 3,113 3,537 2,301 VB20 Total 3,973 4,059 4,518VB9 6aa 0,037 0,041 VB21 6aa 0,047 0,071 0,036VB9 7aa 0,157 0,134 0,270 VB21 7aa 0,529 1,888 1,491VB9 8aa 1,477 0,679 1,112 VB21 8aa 0,453 1,339 1,106VB9 9aa 1,155 1,339 1,265 VB21 9aa 1,751 1,017 1,386VB9 10aa 1,554 1,307 1,846 VB21 10aa 1,063 1,240 1,384VB9 11aa 0,840 0,350 0,523 VB21 11aa 0,465 0,342 0,582VB9 12aa 0,622 0,552 0,448 VB21 12aa 0,261 0,209 0,219VB9 13aa 0,115 0,071 0,089 VB21 13aa 0,087 0,031 0,106VB9 14aa 0,042 0,742 0,359 VB21 14aa 0,068 0,097VB9 15aa 0,034 VB21 15aa 0,112

Apêndice K 227VB9 Total 6,032 5,175 5,954 VB21 Total 4,836 6,138 6,408VB10 5aa VB22 5aa 0,042VB10 6aa 0,026 VB22 6aa 0,240 0,139VB10 7aa 0,041 VB22 7aa 0,472 0,095 0,194VB10 8aa 0,116 0,107 0,088 VB22 8aa 1,463 3,102 3,158VB10 9aa 0,164 0,231 0,175 VB22 9aa 1,181 0,086 0,366VB10 10aa 1,334 2,682 2,264 VB22 10aa 1,324 0,304 0,637VB10 11aa 0,159 0,110 0,240 VB22 11aa 0,910 0,593 0,579VB10 12aa 0,130 0,312 0,121 VB22 12aa 0,257 0,042VB10 13aa 0,116 0,568 0,219 VB22 13aa 0,047 0,024VB10 14aa 0,887 0,203 VB22 14aaVB10 Total 2,973 4,212 3,108 VB22 Total 5,936 4,180 5,140VB11 6aa 0,255 0,318 0,548 VB23 6aa 0,023VB11 7aa 0,365 0,178 VB23 7aa 0,116 0,416 0,184VB11 8aa 0,743 0,077 0,384 VB23 8aa 0,391 0,043 0,163VB11 9aa 1,244 0,114 0,873 VB23 9aa 0,927 0,304 0,126VB11 10aa 0,728 0,143 1,009 VB23 10aa 2,567 3,507 5,230VB11 11aa 0,431 0,022 0,408 VB23 11aa 0,205 0,428VB11 12aa 0,337 0,010 0,195 VB23 12aa 0,370 0,241VB11 13aa 0,172 0,018 0,029 VB23 13aa 0,029VB11 14aa 0,069 0,012 0,253 VB23 14aa 0,048VB11 15aa 0,026 VB23 15aaVB11 Total 4,369 0,714 3,879 VB23 Total 4,677 4,698 5,945VB12 6aa 0,075 VB24 6aa 0,005 0,019VB12 7aa 0,373 VB24 7aa 0,005 0,004 0,007VB12 8aa 0,628 VB24 8aa 0,063 0,045 0,423VB12 9aa 0,901 VB24 9aa 0,011 0,005 0,018VB12 10aa 0,682 VB24 10aa 0,023 0,028 0,066VB12 11aa 0,194 VB24 11aa 0,011 0,015 0,032VB12 12aa 0,099 VB24 12aa 0,006 0,008 0,023VB12 13aa 0,091 VB24 13aa 0,003 0,002 0,004VB12 14aa VB24 14aa 0,003 0,020 0,008VB12 Total 0,000 0,000 3,042 VB24 Total 0,130 0,127 0,599

Apêndice L 228Apêndice L - Repertório da cadeia Vβ do TCR de linfócitos T do sangue periférico dopaciente com diabete melito do tipo 1 MGB (DM4), pré- e pós-TACTH.Pré-Tx D+180 D+360VB1VB2VB3VB4VB5VB6VB7VB8VB9VB10VB11VB12

Apêndice L 229Pré-Tx D+180 D+360VB13VB14VB15VB16VB17VB18VB19VB20VB21VB22VB23VB24Figura L.1. Repertório da cadeia Vβ do TCR no paciente com diabete melito do tipo 1 MGB (DM4), pré epós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificadousando primers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método deTCRBV CDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número detranscritos para a família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases(eixo X). Os picos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos.

Apêndice L 230Tabela L.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do TCR efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente com diabetemelito do tipo 1 MGB (DM4), pré- e pós-TACTH.FamíliaVBPré-TxD+180 D+360FamíliaVBPré-TxD+180 D+360VB1 6aa 0,031 VB13 6aa 0,054 0,050 0,047VB1 7aa 0,101 0,227 VB13 7aa 0,220 0,049 0,105VB1 8aa 0,881 0,311 1,304 VB13 8aa 0,867 0,632 0,732VB1 9aa 0,937 0,053 0,694 VB13 9aa 1,082 0,465 0,756VB1 10aa 1,376 1,101 2,711 VB13 10aa 1,913 3,063 3,174VB1 11aa 0,856 0,067 0,649 VB13 11aa 0,837 0,045 0,295VB1 12aa 0,292 0,030 0,099 VB13 12aa 0,056VB1 13aa 0,055 VB13 13aaVB1 14aa 0,024 VB13 14aaVB1 15aa 0,023 VB13 15aaVB1 Total 4,576 1,562 5,683 VB13 Total 5,028 4,303 5,110VB2 5aa 0,034 0,028 VB14 5aaVB2 6aa 0,149 0,073 0,159 VB14 6aa 0,247 0,082VB2 7aa 0,318 0,169 0,430 VB14 7aa 0,019 0,022 0,106VB2 8aa 0,659 0,523 0,843 VB14 8aa 0,334 2,170 1,334VB2 9aa 1,304 0,866 1,592 VB14 9aa 0,132 0,505 0,526VB2 10aa 1,131 1,110 2,964 VB14 10aa 0,145 0,514 0,598VB2 11aa 0,825 0,661 0,857 VB14 11aa 0,069 0,234 0,491VB2 12aa 0,144 0,080 0,132 VB14 12aa 0,037 0,058 0,116VB2 13aa 0,050 0,030 0,068 VB14 13aa 0,013 0,048 0,036VB2 14aa 0,025 0,047 VB14 14aa 0,031VB2 15aa 0,024 VB14 15aaVB2 Total 4,639 3,584 7,072 VB14 Total 0,749 3,798 3,319VB3 6aa 0,458 0,602 0,839 VB15 6aa 0,040 0,163 0,071VB3 7aa 0,218 0,046 0,151 VB15 7aa 0,180 0,064 0,087VB3 8aa 0,238 0,112 0,594 VB15 8aa 0,408 0,195 0,202VB3 9aa 3,519 2,852 5,337 VB15 9aa 0,327 0,826 0,616VB3 10aa 1,188 0,618 1,090 VB15 10aa 0,636 1,966 0,850VB3 11aa 0,346 0,060 0,240 VB15 11aa 0,787 0,408 1,137VB3 12aa 0,157 0,125 0,237 VB15 12aa 0,444 3,241 1,044VB3 13aa 0,097 0,056 VB15 13aa 0,057 0,029VB3 14aa 0,029 0,059 VB15 14aa 0,031VB3 15aa VB15 15aa 0,044VB3 Total 6,250 4,414 8,602 VB15 Total 2,956 6,863 4,037VB4 5aa 0,163 0,056 0,145 VB16 5aaVB4 6aa 0,351 0,209 0,464 VB16 6aa 0,082VB4 7aa 0,623 0,447 0,756 VB16 7aa 0,485 0,804 0,394VB4 8aa 1,178 0,617 2,034 VB16 8aa 0,924 2,117 1,016VB4 9aa 1,047 0,574 3,470 VB16 9aa 0,842 1,048 0,760VB4 10aa 0,374 0,219 0,517 VB16 10aa 2,355 1,930 1,842VB4 11aa 0,100 0,077 0,171 VB16 11aa 0,439 0,287 0,443VB4 12aa 0,079 0,032 0,083 VB16 12aa 0,257 0,151 0,124VB4 13aa 0,045 0,347 0,247 VB16 13aa 0,061 0,055 0,081VB4 14aa VB16 14aa 0,039 0,122 0,036

Apêndice L 231VB4 15aa VB16 15aa 0,043 0,070VB4 Total 3,961 2,577 7,886 VB16 Total 5,528 6,513 4,765VB5 6aa 0,054 0,043 0,209 VB17 6aa 0,197 0,132VB5 7aa 0,857 1,801 1,379 VB17 7aa 0,378 0,329 0,279VB5 8aa 0,316 0,430 0,607 VB17 8aa 0,823 0,654 0,538VB5 9aa 0,695 0,859 1,308 VB17 9aa 1,302 1,829 1,274VB5 10aa 0,761 1,881 2,056 VB17 10aa 1,363 2,214 1,301VB5 11aa 0,330 0,690 0,674 VB17 11aa 0,625 0,266 0,356VB5 12aa 0,128 0,119 0,272 VB17 12aa 0,233 0,559 0,297VB5 13aa 0,045 0,094 0,089 VB17 13aa 0,086 0,048VB5 14aa 0,023 0,054 0,052 VB17 14aa 0,116 0,327VB5 Total 3,210 5,972 6,646 VB17 Total 5,123 5,852 4,551VB6 5aa 0,101 VB18 5aaVB6 6aa 0,340 0,303 0,207 VB18 6aa 0,116 0,133 0,051VB6 7aa 0,302 0,751 0,615 VB18 7aa 0,304 0,127 0,197VB6 8aa 0,806 0,423 1,358 VB18 8aa 0,840 0,438 0,688VB6 9aa 1,791 0,497 2,439 VB18 9aa 1,778 0,870 0,684VB6 10aa 1,766 1,982 2,059 VB18 10aa 1,786 2,253 1,060VB6 11aa 0,705 0,336 1,079 VB18 11aa 0,861 0,270 0,967VB6 12aa 0,468 1,614 1,397 VB18 12aa 0,478 0,286 0,101VB6 13aa 0,050 0,055 VB18 13aa 0,179 0,264 0,043VB6 14aa 0,227 0,152 0,383 VB18 14aa 0,064 0,022 0,024VB6 Total 6,456 6,158 9,593 VB18 Total 6,408 4,663 3,814VB7 5aa VB19 5aa 0,080 0,095VB7 6aa VB19 6aa 0,053 0,056VB7 7aa 0,085 0,027 VB19 7aa 0,025 0,307 0,189VB7 8aa 0,299 0,041 0,071 VB19 8aa 0,026 0,045VB7 9aa 0,404 0,030 0,085 VB19 9aa 0,054 0,034 0,067VB7 10aa 0,972 1,638 1,880 VB19 10aa 0,144 0,474 0,130VB7 11aa 0,430 0,032 0,121 VB19 11aa 0,171 0,029 0,072VB7 12aa 0,790 0,474 1,089 VB19 12aa 0,074 0,082 0,143VB7 13aa 0,121 VB19 13aa 0,038 0,084VB7 14aa 0,067 VB19 14aa 0,067 0,127 0,031VB7 15aa VB19 15aa 0,050VB7 Total 3,167 2,215 3,274 VB19 Total 0,599 1,268 0,878VB8 5aa 0,028 VB20 5aaVB8 6aa 0,778 0,163 0,469 VB20 6aa 0,085 0,064 0,031VB8 7aa 0,132 0,318 0,109 VB20 7aa 0,151 0,243 0,152VB8 8aa 0,504 0,832 0,837 VB20 8aa 0,463 0,383 0,281VB8 9aa 0,844 1,182 0,965 VB20 9aa 0,375 0,275 0,390VB8 10aa 0,490 0,776 0,324 VB20 10aa 0,258 0,695 0,303VB8 11aa 0,277 0,211 0,264 VB20 11aa 0,115 0,034VB8 12aa 0,364 0,089 0,097 VB20 12aa 0,032 0,070VB8 13aa 0,020 VB20 13aa 0,031 0,026VB8 14aa 0,132 VB20 14aa 0,027VB8 15aa VB20 15aa 0,035VB8 16aa VB20 16aa 0,092VB8 Total 3,435 3,703 3,065 VB20 Total 1,662 1,792 1,157VB9 6aa 0,056 0,041 VB21 6aa 0,100 0,169 0,072

Apêndice L 232VB9 7aa 0,234 0,363 0,122 VB21 7aa 0,367 0,087 0,145VB9 8aa 0,362 1,031 0,469 VB21 8aa 0,764 0,342 0,409VB9 9aa 2,121 2,504 1,100 VB21 9aa 0,854 0,490 0,435VB9 10aa 1,041 1,779 1,000 VB21 10aa 2,328 2,094 1,272VB9 11aa 0,779 0,620 0,526 VB21 11aa 1,113 1,569 1,479VB9 12aa 0,310 0,350 0,123 VB21 12aa 0,423 0,131 0,106VB9 13aa 0,052 0,076 VB21 13aa 0,173 0,070 0,035VB9 14aa 0,154 0,931 0,249 VB21 14aa 0,168 0,175 0,067VB9 15aa VB21 15aa 0,034VB9 Total 5,110 7,654 3,629 VB21 Total 6,324 5,126 4,020VB10 5aa VB22 5aa 0,060 0,028 0,215VB10 6aa 0,081 0,299 VB22 6aa 0,254 0,142 0,117VB10 7aa 0,166 0,059 VB22 7aa 0,687 0,188 0,389VB10 8aa 0,216 0,158 VB22 8aa 1,820 0,757 0,347VB10 9aa 0,483 3,721 1,489 VB22 9aa 2,297 0,815 1,463VB10 10aa 0,835 0,100 VB22 10aa 1,421 1,859 0,503VB10 11aa 0,336 0,336 VB22 11aa 2,161 1,392 0,975VB10 12aa 0,182 VB22 12aa 0,115 0,107VB10 13aa 0,119 VB22 13aa 0,094 0,017VB10 14aa 0,027 VB22 14aa 0,046 0,035VB10 15aa 0,163 VB22 15aa 0,042VB10 Total 2,606 3,721 2,440 VB22 Total 8,998 5,338 4,010VB11 6aa 0,122 VB23 6aa 0,165 0,170VB11 7aa 0,261 0,065 VB23 7aa 0,274 0,059 0,066VB11 8aa 0,681 0,107 VB23 8aa 0,855 0,420 0,196VB11 9aa 1,290 4,538 1,321 VB23 9aa 1,660 1,566 0,545VB11 10aa 0,941 0,065 VB23 10aa 1,575 2,037 0,867VB11 11aa 0,333 0,086 VB23 11aa 0,560 1,154 0,380VB11 12aa 0,316 0,030 VB23 12aa 0,325 0,083 0,014VB11 13aa 0,105 0,057 VB23 13aa 0,174 0,064 0,039VB11 14aa 0,032 VB23 14aa 0,041VB11 15aa 0,026 VB23 15aaVB11 Total 4,108 4,538 1,731 VB23 Total 5,627 5,382 2,277VB12 5aa 0,096 VB24 5aaVB12 6aa 0,066 0,108 0,073 VB24 6aa 0,007 0,016VB12 7aa 0,494 0,134 0,037 VB24 7aa 0,003 0,031 0,018VB12 8aa 0,270 0,645 0,389 VB24 8aa 0,007 0,011 0,016VB12 9aa 1,156 0,998 0,907 VB24 9aa 0,014 0,022 0,034VB12 10aa 0,922 0,730 0,512 VB24 10aa 0,026 0,041 0,054VB12 11aa 0,100 0,068 0,085 VB24 11aa 0,018 0,125 0,238VB12 12aa 0,178 0,023 VB24 12aa 0,007 0,017 0,007VB12 13aa 0,084 0,041 0,021 VB24 13aa 0,005 0,009 0,003VB12 14aa 0,027 VB24 14aa 0,004 0,018 0,005VB12 Total 3,394 2,724 2,047 VB24 Total 0,085 0,281 0,392

Apêndice M 233Apêndice M - Repertório da cadeia Vβ do TCR de linfócitos T do sangue periférico dopaciente com diabete melito do tipo 1 RLFS (DM5), pré- e pós-TACTH.Pré-Tx D+180 Pré-Tx D+180VB1VB13VB2VB14VB3VB15VB4VB16VB5VB17VB6VB18VB7VB19VB8VB20VB9VB21VB10VB22VB11VB23VB12VB24Figura M.1. Repertório da cadeia Vβ do TCR no paciente com diabete melito do tipo 1 RFLS (DM5), pré epós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificadousando primers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de

Apêndice M 234TCRBV CDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número detranscritos para a família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases(eixo X). Os picos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos.Tabela M.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do TCR efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente com diabetemelito do tipo 1 RLFS (DM5), pré- e pós-TACTH.FamíliaVBPré-TxD+360FamíliaVBPré-TxD+360VB1 5aa VB13 5aa 0,020VB1 6aa 0,038 0,021 VB13 6aa 0,078 0,049VB1 7aa 0,214 0,288 VB13 7aa 0,319 0,258VB1 8aa 0,276 0,058 VB13 8aa 1,212 0,710VB1 9aa 1,701 2,054 VB13 9aa 1,400 0,584VB1 10aa 1,191 0,680 VB13 10aa 1,674 1,891VB1 11aa 0,150 0,071 VB13 11aa 0,652 0,276VB1 12aa 0,127 0,016 VB13 12aa 0,173 0,143VB1 13aa 0,134 0,521 VB13 13aa 0,092 0,060VB1 14aa VB13 14aa 0,024VB1 Total 3,831 3,709 VB13 Total 5,624 3,992VB2 4aa 0,107 0,046 VB14 4aaVB2 5aa 0,057 0,037 VB14 5aaVB2 6aa 0,169 0,274 VB14 6aa 0,072 0,053VB2 7aa 0,570 0,534 VB14 7aa 0,127 0,614VB2 8aa 1,112 1,365 VB14 8aa 0,571 0,816VB2 9aa 1,328 1,084 VB14 9aa 0,823 0,860VB2 10aa 0,979 0,966 VB14 10aa 0,471 0,936VB2 11aa 0,495 0,548 VB14 11aa 0,207 0,186VB2 12aa 0,168 0,300 VB14 12aa 0,111 0,157VB2 13aa 0,072 0,055 VB14 13aa 0,041 0,059VB2 14aa 0,025 0,028 VB14 14aa 0,021VB2 Total 5,082 5,235 VB14 Total 2,423 3,703VB3 6aa 0,135 0,070 VB15 6aa 0,033VB3 7aa 0,413 0,435 VB15 7aa 0,098 1,764VB3 8aa 0,900 0,617 VB15 8aa 0,600 0,553VB3 9aa 1,261 1,404 VB15 9aa 0,373 0,611VB3 10aa 1,009 1,335 VB15 10aa 0,780 0,739VB3 11aa 0,596 0,561 VB15 11aa 0,184 0,269VB3 12aa 0,155 0,245 VB15 12aa 0,053 0,134VB3 13aa 0,038 0,042 VB15 13aa 0,073 0,246VB3 14aa 0,026 VB15 14aa 0,050VB3 Total 4,534 4,709 VB15 Total 2,193 4,365VB4 4aa 0,024 VB16 4aaVB4 5aa 0,081 0,061 VB16 5aaVB4 6aa 0,361 0,296 VB16 6aa 0,098 1,244VB4 7aa 0,688 0,711 VB16 7aa 0,237 0,187VB4 8aa 1,011 0,726 VB16 8aa 0,890 0,802VB4 9aa 0,907 0,894 VB16 9aa 0,936 0,887VB4 10aa 0,329 0,326 VB16 10aa 1,051 0,860VB4 11aa 0,140 0,101 VB16 11aa 0,588 1,420VB4 12aa 0,091 0,093 VB16 12aa 0,271 0,183

Apêndice M 235VB4 13aa 0,020 VB16 13aa 0,142 0,068VB4 14aa VB16 14aa 0,051 0,032VB4 15aa VB16 15aa 0,108VB4 Total 3,631 3,228 VB16 Total 4,264 5,790VB5 4aa 0,049 0,037 VB17 4aaVB5 5aa 0,019 0,016 VB17 5aa 0,047 0,027VB5 6aa 0,138 0,114 VB17 6aa 0,173 0,327VB5 7aa 0,362 0,201 VB17 7aa 0,470 0,384VB5 8aa 1,107 0,688 VB17 8aa 1,114 1,567VB5 9aa 1,631 0,991 VB17 9aa 1,165 1,305VB5 10aa 1,911 0,861 VB17 10aa 1,095 1,147VB5 11aa 0,834 1,370 VB17 11aa 0,502 0,655VB5 12aa 0,436 0,102 VB17 12aa 0,211 0,208VB5 13aa 0,191 0,836 VB17 13aa 0,056 0,090VB5 14aa 0,045 VB17 14aa 0,046 0,112VB5 15aa 0,033 VB17 15aaVB5 Total 6,756 5,215 VB17 Total 4,877 5,823VB6 6aa 0,100 0,107 VB18 6aa 0,118 0,427VB6 7aa 0,312 0,386 VB18 7aa 0,136 0,174VB6 8aa 1,022 0,917 VB18 8aa 0,749 0,493VB6 9aa 1,290 2,544 VB18 9aa 0,592 0,495VB6 10aa 1,259 1,712 VB18 10aa 1,873 1,361VB6 11aa 0,641 1,213 VB18 11aa 0,494 0,361VB6 12aa 0,207 0,167 VB18 12aa 0,138 0,249VB6 13aa 0,082 0,145 VB18 13aa 0,112 0,109VB6 14aa 0,031 0,020 VB18 14aa 0,025VB6 Total 4,944 7,212 VB18 Total 4,210 3,693VB7 6aa 0,028 0,206 VB19 6aa 0,035VB7 7aa 0,087 0,045 VB19 7aa 0,016 0,062VB7 8aa 0,201 0,256 VB19 8aa 0,161 0,143VB7 9aa 0,594 0,287 VB19 9aa 0,518 0,682VB7 10aa 0,973 0,836 VB19 10aa 0,337 0,101VB7 11aa 0,650 0,670 VB19 11aa 0,075 0,113VB7 12aa 0,425 0,139 VB19 12aa 0,472 0,022VB7 13aa 0,103 0,240 VB19 13aa 0,107VB7 14aa 0,048 0,019 VB19 14aa 0,035VB7 15aa 0,031 VB19 15aa 0,133VB7 Total 3,108 2,729 VB19 Total 1,889 1,123VB8 5aa 0,017 0,073 VB20 5aa 0,117VB8 6aa 0,103 0,191 VB20 6aa 0,481 0,116VB8 7aa 0,241 0,450 VB20 7aa 0,819 0,134VB8 8aa 0,850 1,040 VB20 8aa 2,044 0,258VB8 9aa 0,671 1,137 VB20 9aa 2,076 1,050VB8 10aa 0,629 1,027 VB20 10aa 1,248 0,162VB8 11aa 0,199 0,428 VB20 11aa 0,487 0,047VB8 12aa 0,091 0,119 VB20 12aa 0,185 0,013VB8 13aa 0,040 0,107 VB20 13aa 0,235 0,030VB8 14aa 0,030 VB20 14aa 0,124VB8 15aa 0,029 VB20 15aa 0,179VB8 16aa VB20 16aa 0,540

Apêndice M 236VB8 Total 2,841 4,632 VB20 Total 8,536 1,810VB9 5aa 0,034 VB21 5aa 0,024VB9 6aa 0,335 VB21 6aa 0,214 0,075VB9 7aa 0,056 0,245 VB21 7aa 0,433 0,172VB9 8aa 0,139 0,712 VB21 8aa 0,956 1,044VB9 9aa 0,262 1,188 VB21 9aa 1,530 1,069VB9 10aa 0,233 1,390 VB21 10aa 1,505 1,608VB9 11aa 0,138 0,759 VB21 11aa 0,850 0,598VB9 12aa 0,058 0,590 VB21 12aa 0,314 0,400VB9 13aa 0,032 0,111 VB21 13aa 0,217 0,387VB9 14aa 0,040 VB21 14aa 0,064VB9 15aa VB21 15aa 0,026VB9 Total 0,919 5,406 VB21 Total 6,134 5,352VB10 5aa VB22 5aa 0,054 0,055VB10 6aa 0,085 VB22 6aa 0,231 0,112VB10 7aa 0,116 0,188 VB22 7aa 0,445 0,452VB10 8aa 0,254 0,464 VB22 8aa 1,529 2,016VB10 9aa 0,331 0,460 VB22 9aa 1,664 1,039VB10 10aa 0,381 0,666 VB22 10aa 1,142 0,828VB10 11aa 0,441 0,253 VB22 11aa 0,356 0,345VB10 12aa 0,228 0,124 VB22 12aa 0,173 0,080VB10 13aa 0,117 0,455 VB22 13aa 1,251 2,543VB10 14aa 0,108 0,389 VB22 14aaVB10 Total 2,061 3,000 VB22 Total 6,844 7,470VB11 5aa 0,044 VB23 5aaVB11 6aa 0,491 0,054 VB23 6aa 0,071 0,180VB11 7aa 0,435 0,125 VB23 7aa 0,323 0,254VB11 8aa 0,838 0,330 VB23 8aa 0,872 0,788VB11 9aa 1,420 0,241 VB23 9aa 1,608 1,921VB11 10aa 1,559 3,120 VB23 10aa 1,073 1,556VB11 11aa 1,132 0,027 VB23 11aa 1,529 0,752VB11 12aa 0,355 0,132 VB23 12aa 0,229 0,241VB11 13aa 0,368 VB23 13aa 0,058 0,577VB11 14aa 0,268 VB23 14aa 0,159VB11 15aa 0,085 VB23 15aaVB11 16aa 0,068 VB23 16aaVB11 Total 7,064 4,028 VB23 Total 5,922 6,268VB12 6aa 0,042 0,016 VB24 6aa 0,003VB12 7aa 0,129 0,168 VB24 7aa 0,002 0,009VB12 8aa 0,438 0,194 VB24 8aa 0,007 0,025VB12 9aa 0,753 0,537 VB24 9aa 0,010 0,043VB12 10aa 0,464 0,207 VB24 10aa 0,015 0,062VB12 11aa 0,315 VB24 11aa 0,008 0,043VB12 12aa 0,050 0,058 VB24 12aa 0,004 0,010VB12 13aa 0,072 0,123 VB24 13aa 0,003 0,008VB12 14aa VB24 14aa 0,002VB12 15aa VB24 15aa 0,001VB12 Total 2,264 1,304 VB24 Total 0,050 0,204

Apêndice N 237Apêndice N - Repertório da cadeia Vβ do TCR de linfócitos T do sangue periférico dopaciente com esclerose múltipla GG (EM1), pré- e pós-TACTH.D+480 D+720 D+1020VB1VB2VB3VB4VB5VB6VB7VB8VB9VB10VB11VB12

Apêndice N 238D+480 D+720 D+1020VB13VB14VB15VB16VB17VB18VB19VB20VB21VB22VB23VB24Figura N.1. Repertório da cadeia Vβ do TCR no paciente com esclerose múltipla GG (EM1), pré e pós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usandoprimers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBVCDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número de transcritos paraa família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases (eixo X). Ospicos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos.

Apêndice N 239Tabela N.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do TCR efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla GG (EM1), pré- e pós-TACTH.FamíliaVBD+480 D+720 D+1020FamíliaVBD+480 D+720 D+1020VB1 6aa VB13 6aa 0,209 0,262 0,297VB1 7aa VB13 7aa 0,089 0,126 0,236VB1 8aa VB13 8aa 0,213 0,561 0,679VB1 9aa 3,167 3,514 VB13 9aa 1,075 1,485 1,251VB1 10aa 0,089 0,102 1,587 VB13 10aa 1,466 1,821 3,444VB1 11aa 0,135 0,056 VB13 11aa 0,114 0,106VB1 12aa 0,058 VB13 12aa 0,402 0,084VB1 13aa VB13 13aa 0,465 0,254VB1 Total 3,391 3,616 1,700 VB13 Total 3,454 4,835 6,352VB2 5aa 0,475 1,348 1,934 VB14 5aaVB2 6aa 0,074 0,030 VB14 6aa 0,073VB2 7aa 0,115 0,053 0,049 VB14 7aa 0,390 0,364 0,270VB2 8aa 2,978 2,139 0,665 VB14 8aa 0,618 0,766 1,247VB2 9aa 1,125 0,578 0,493 VB14 9aa 0,339 0,521 1,083VB2 10aa 0,929 0,597 0,299 VB14 10aa 1,697 1,931 2,252VB2 11aa 0,601 0,569 0,236 VB14 11aa 0,035 0,287 0,517VB2 12aa 0,177 0,036 VB14 12aa 0,094 0,041VB2 13aa VB14 13aa 0,026 0,044VB2 Total 6,474 5,284 3,742 VB14 Total 3,199 3,868 5,525VB3 6aa 0,239 0,222 0,258 VB15 6aaVB3 7aa 1,786 1,399 1,109 VB15 7aa 0,055 0,065 0,157VB3 8aa 0,241 0,320 0,728 VB15 8aa 2,536 2,383 1,474VB3 9aa 1,026 0,866 1,408 VB15 9aa 0,182 1,254 1,466VB3 10aa 1,132 1,051 1,543 VB15 10aa 0,954 1,994 1,925VB3 11aa 0,168 0,151 0,255 VB15 11aa 0,105 0,589 0,701VB3 12aa 0,160 0,103 0,085 VB15 12aa 0,047 0,024 0,130VB3 13aa 0,051 0,021 0,028 VB15 13aa 0,048 0,079VB3 14aa 1,463 1,064 0,475 VB15 14aa 0,118VB3 15aa 0,239 0,222 0,258 VB15 15aaVB3 Total 6,267 5,197 5,888 VB15 Total 4,045 6,310 5,931VB4 5aa 0,322 0,202 VB16 5aaVB4 6aa 0,070 0,069 0,168 VB16 6aa 0,098VB4 7aa 0,142 0,203 0,306 VB16 7aa 0,031 0,154VB4 8aa 1,809 1,868 1,323 VB16 8aa 0,649 0,658 1,046VB4 9aa 0,233 0,167 0,357 VB16 9aa 1,942 2,256 2,523VB4 10aa 0,069 0,063 0,131 VB16 10aa 0,086 1,005 1,291VB4 11aa 0,041 0,022 0,176 VB16 11aa 0,898 1,012 1,315VB4 12aa VB16 12aa 0,098 0,126 0,230VB4 13aa VB16 13aa 0,061 0,085 0,076VB4 14aa VB16 14aa 0,312 0,375 0,267VB4 Total 2,364 2,715 2,663 VB16 Total 4,077 5,516 7,000VB5 5aaVB17 5aaVB5 6aa 0,146 0,160 0,213 VB17 6aa 0,069

Apêndice N 240VB5 7aa 0,116 0,126 0,217 VB17 7aa 0,712 0,455 0,409VB5 8aa 0,591 0,734 1,119 VB17 8aa 0,855 1,264 0,915VB5 9aa 0,292 0,454 1,044 VB17 9aa 1,728 1,582 1,223VB5 10aa 3,700 3,905 2,922 VB17 10aa 2,866 2,346 1,939VB5 11aa 0,138 0,111 0,314 VB17 11aa 0,542 0,532 0,491VB5 12aa 0,087 0,265 0,153 VB17 12aa 1,659VB5 Total 5,070 5,756 5,982 VB17 Total 6,704 6,179 6,704VB6 5aa 0,084 VB18 5aaVB6 6aa 0,225 0,107 1,067 VB18 6aaVB6 7aa 1,642 0,271 0,884 VB18 7aa 0,043 0,100VB6 8aa 1,511 1,484 1,251 VB18 8aa 0,108 0,176 0,401VB6 9aa 1,573 1,397 1,508 VB18 9aa 0,523 2,175 0,620VB6 10aa 0,310 2,666 2,101 VB18 10aa 3,101 0,371 0,457VB6 11aa 0,358 0,354 0,373 VB18 11aa 0,599 0,116 0,179VB6 12aa 0,287 0,363 0,305 VB18 12aa 0,299 0,183 0,113VB6 13aa 0,445 0,213 VB18 13aa 0,274VB6 Total 5,991 7,086 7,703 VB18 Total 4,954 3,064 1,870VB7 6aaVB19 6aaVB7 7aa 0,069 VB19 7aa 0,388 0,063VB7 8aa 0,103 0,279 VB19 8aa 0,711 0,585VB7 9aa 2,814 2,263 2,464 VB19 9aa 0,036VB7 10aa 0,055 0,062 0,529 VB19 10aa 0,087 0,162 0,253VB7 11aa 1,079 0,822 1,337 VB19 11aa 0,711 0,066VB7 12aa 0,221 VB19 12aaVB7 13aa 0,235 0,120 0,607 VB19 13aaVB7 14aa 0,055 0,078 VB19 14aaVB7 Total 4,286 3,321 5,585 VB19 Total 0,476 1,584 1,003VB8 6aa 0,027 0,081 VB20 6aa 0,040 0,058VB8 7aa 0,270 0,440 1,656 VB20 7aa 0,090 0,561 0,198VB8 8aa 0,457 0,732 0,287 VB20 8aa 0,232 0,424 0,471VB8 9aa 1,394 1,630 0,802 VB20 9aa 0,905 0,109 0,079VB8 10aa 0,678 1,293 0,825 VB20 10aa 0,166 0,124 0,056VB8 11aa 0,022 0,028 VB20 11aa 0,116 0,053VB8 12aa 0,449 0,033 VB20 12aa 0,293 0,165 0,036VB8 13aa 0,101 VB20 13aaVB8 14aa 0,074 0,318 VB20 14aaVB8 15aa VB20 15aa 0,099VB8 16aa VB20 16aa 0,070VB8 Total 3,471 4,557 3,569 VB20 Total 1,803 1,645 0,897VB9 6aa 0,069 0,115 VB21 6aaVB9 7aa 1,018 1,135 0,912 VB21 7aa 0,116 0,398 0,223VB9 8aa 0,342 0,519 0,725 VB21 8aa 1,865 0,668 0,363VB9 9aa 0,825 0,939 1,447 VB21 9aa 3,015 2,629 1,046VB9 10aa 1,594 1,468 1,311 VB21 10aa 0,903 0,591 0,457VB9 11aa 0,673 1,198 0,985 VB21 11aa 0,327 0,374 0,284VB9 12aa 0,390 0,221 0,229 VB21 12aa 0,193 0,227 0,161VB9 13aa 0,054 0,083 0,117 VB21 13aa 0,044 0,232 0,042VB9 14aa VB21 14aa 0,054 0,052VB9 Total 4,966 5,562 5,841 VB21 Total 6,517 5,119 2,628

Apêndice N 241VB10 4aa VB22 4aa 0,600 0,091VB10 5aa VB22 5aa 0,215 0,042 0,098VB10 6aa 0,021 VB22 6aa 0,181 0,425 0,304VB10 7aa 0,094 0,047 VB22 7aa 2,163 0,352 0,233VB10 8aa 1,311 0,385 0,844 VB22 8aa 1,556 1,905 1,194VB10 9aa 0,356 0,145 VB22 9aa 1,111 0,937 0,968VB10 10aa 0,062 0,086 0,270 VB22 10aa 0,280 2,510 1,290VB10 11aa 0,293 0,129 0,140 VB22 11aa 0,063 0,346 0,322VB10 12aa 0,265 0,325 0,567 VB22 12aa 0,301 0,063 0,033VB10 13aaVB22 13aaVB10 14aa 0,070 VB22 14aaVB10 15aa 0,161 VB22 15aaVB10 Total 1,931 1,376 2,266 VB22 Total 5,870 7,181 4,534VB11 6aa 0,134 0,097 0,212 VB23 6aa 0,656 0,569 0,362VB11 7aa 0,100 0,119 VB23 7aa 0,990 1,117 0,488VB11 8aa 0,192 0,267 0,483 VB23 8aa 0,073 0,106 0,376VB11 9aa 1,083 0,507 1,656 VB23 9aa 4,392 3,486 2,603VB11 10aa 0,702 0,373 1,012 VB23 10aa 0,980 0,521 1,114VB11 11aa 0,055 0,101 VB23 11aa 1,126 1,177 1,014VB11 12aa VB23 12aa 0,442 0,144 0,210VB11 13aa VB23 13aa 0,126VB11 Total 2,211 1,299 3,584 VB23 Total 8,659 7,120 6,293VB12 6aa 0,041 VB24 6aaVB12 7aa 0,162 VB24 7aa 0,005 0,007 0,023VB12 8aa 0,249 VB24 8aa 0,026 0,018 0,039VB12 9aa 3,098 1,422 1,387 VB24 9aa 0,008 0,017 0,044VB12 10aa 0,040 0,046 0,283 VB24 10aa 0,252 0,171 0,249VB12 11aa 0,386 0,100 VB24 11aa 0,004 0,006 0,011VB12 12aa 0,123 0,138 VB24 12aa 0,006VB12 13aa 0,041 VB24 13aa 0,005VB12 Total 3,525 1,591 2,361 VB24 Total 0,296 0,219 0,377

Apêndice O 242Apêndice O - Repertório da cadeia Vβ do TCR de linfócitos T do sangue periférico dopaciente com esclerose múltipla SSS (EM3), pré- e pós-TACTH.Pré-Tx D+375 D+765VB1VB2VB3VB4VB5VB6VB7VB8VB9VB10VB11VB12

Apêndice O 243Pré-Tx D+375 D+765VB13VB14VB15VB16VB17VB18VB19VB20VB21VB22VB23VB24Figura O.1. Repertório da cadeia Vβ do TCR no paciente com esclerose múltipla SSS (EM3), pré e pós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usandoprimers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBVCDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número de transcritos paraa família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases (eixo X). Ospicos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos.

Apêndice O 244Tabela O.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do TCR efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla SSS (EM3), pré- e pós-TACTH.FamíliaVBPré-TxD+360 D+720FamíliaVBPré-TxD+360 D+720VB1 6aa 0,059 0,015 VB13 6aaVB1 7aa 0,117 0,155 0,036 VB13 7aa 0,659 0,116VB1 8aa 0,415 0,171 0,274 VB13 8aa 0,473 0,373 0,297VB1 9aa 0,754 1,011 0,585 VB13 9aa 2,577 2,991 2,332VB1 10aa 0,867 1,102 0,691 VB13 10aa 0,446 0,616 0,105VB1 11aa 0,344 1,190 0,481 VB13 11aa 0,494 0,338VB1 12aa 0,081 0,067 0,620 VB13 12aa 0,175 0,067VB1 13aa 0,087 0,314 0,114 VB13 13aaVB1 Total 2,723 4,011 2,816 VB13 Total 4,823 3,980 3,254VB2 5aa 0,381 0,595 0,251 VB14 5aaVB2 6aa 0,138 0,969 1,223 VB14 6aa 1,210 1,203 0,906VB2 7aa 0,218 0,039 0,203 VB14 7aa 0,078 0,076VB2 8aa 1,301 2,267 0,804 VB14 8aa 0,713 0,151 0,568VB2 9aa 1,785 0,695 0,617 VB14 9aa 0,914 0,810 1,243VB2 10aa 0,321 0,415 0,630 VB14 10aa 0,347 0,331 0,575VB2 11aa 0,308 1,119 0,213 VB14 11aa 0,206 0,291 0,528VB2 12aa 0,056 VB14 12aa 0,121 0,035VB2 13aa VB14 13aa 0,051 0,025VB2 Total 4,454 6,097 3,996 VB14 Total 3,640 2,786 3,957VB3 5aaVB15 5aaVB3 6aaVB15 6aaVB3 7aa 0,354 1,788 1,287 VB15 7aaVB3 8aa 0,093 0,082 0,173 VB15 8aa 0,091VB3 9aa 1,728 2,888 2,557 VB15 9aa 1,763 2,307 2,213VB3 10aa 0,064 0,055 0,413 VB15 10aa 2,525 1,935 0,960VB3 11aa 0,222 2,195 1,619 VB15 11aa 0,229 0,336 0,390VB3 12aa VB15 12aa 0,854 1,069 0,738VB3 Total 2,460 7,009 6,049 VB15 Total 5,370 5,647 4,392VB4 5aa 0,041 VB16 5aaVB4 6aa 0,201 0,079 0,155 VB16 6aa 0,066VB4 7aa 0,307 0,302 0,385 VB16 7aa 0,273 0,252 0,382VB4 8aa 0,466 0,505 0,875 VB16 8aa 1,155 1,380 1,008VB4 9aa 0,362 0,721 0,735 VB16 9aa 1,426 0,256 1,343VB4 10aa 0,118 0,094 0,212 VB16 10aa 2,060 0,318 1,539VB4 11aa 0,148 0,554 0,204 VB16 11aa 1,081 0,364 0,674VB4 12aa 0,057 0,036 VB16 12aa 0,280 0,061 0,159VB4 13aa 0,717 VB16 13aa 0,415 1,841 0,535VB4 14aa VB16 14aa 0,084 0,055 0,099VB4 15aa VB16 15aa 0,162 0,214VB4 16aa VB16 16aa 0,182VB4 Total 1,602 3,029 2,644 VB16 Total 6,775 4,870 6,020VB5 6aa 0,055 VB17 6aa 0,103 0,119VB5 7aa 0,079 0,303 0,259 VB17 7aa 0,407 1,093 0,854

Apêndice O 245VB5 8aa 0,333 1,077 0,995 VB17 8aa 1,278 0,806 0,769VB5 9aa 0,413 0,916 1,142 VB17 9aa 1,179 0,407 0,899VB5 10aa 1,731 1,786 1,848 VB17 10aa 1,094 1,146 1,066VB5 11aa 0,214 0,822 0,647 VB17 11aa 0,602 0,347 0,454VB5 12aa 0,209 0,219 0,232 VB17 12aa 1,388 1,288 0,567VB5 13aa 0,038 1,344 1,081 VB17 13aa 0,050 0,035VB5 Total 3,016 6,468 6,259 VB17 Total 6,100 5,086 4,764VB6 5aa 0,077 VB18 5aaVB6 6aa 0,056 0,104 VB18 6aa 0,110 0,022VB6 7aa 0,420 0,821 0,536 VB18 7aa 0,069 0,071 0,091VB6 8aa 0,977 1,260 1,028 VB18 8aa 0,812 0,162 0,417VB6 9aa 1,051 1,133 1,281 VB18 9aa 1,329 0,136 0,573VB6 10aa 1,666 2,404 2,288 VB18 10aa 1,565 1,790 0,976VB6 11aa 0,321 0,180 0,453 VB18 11aa 0,357 0,030 0,204VB6 12aa 1,178 0,635 0,589 VB18 12aa 0,476 0,315 0,115VB6 13aa 0,425 1,567 1,105 VB18 13aa 0,039 0,023VB6 Total 6,093 7,999 7,463 VB18 Total 4,648 2,614 2,422VB7 8aa 0,384 0,281 0,430 VB19 8aa 0,037VB7 9aa 0,557 1,047 1,030 VB19 9aa 0,136VB7 10aa 1,343 1,736 2,222 VB19 10aa 0,034 0,115 0,276VB7 11aa 2,133 0,544 0,756 VB19 11aa 0,622 1,757 1,479VB7 12aa 0,680 0,198 0,242 VB19 12aa 0,041VB7 13aa 0,067 VB19 13aa 0,017 0,202VB7 14aa 0,126 VB19 14aaVB7 15aaVB19 15aaVB7 16aaVB19 16aaVB7 Total 5,098 3,805 4,873 VB19 Total 0,886 2,074 1,755VB8 6aa VB20 6aa 0,128 0,026 0,086VB8 7aa 0,725 1,560 1,005 VB20 7aa 0,346 0,229 0,329VB8 8aa 1,150 1,176 0,650 VB20 8aa 0,455 0,025 0,193VB8 9aa 0,874 0,590 0,815 VB20 9aa 0,318 0,052 0,339VB8 10aa 0,455 0,048 0,463 VB20 10aa 0,428 0,151 0,301VB8 11aa 0,187 0,115 0,754 VB20 11aa 0,086 0,039 0,058VB8 12aa 0,076 0,070 VB20 12aa 0,044 0,037VB8 Total 3,467 3,559 3,685 VB20 Total 1,805 0,523 1,342VB9 5aa VB21 5aa 0,600 1,498 0,710VB9 6aa 0,095 0,317 VB21 6aa 0,115 0,108VB9 7aa 0,425 0,606 0,489 VB21 7aa 0,804 1,278 0,717VB9 8aa 0,951 0,789 1,126 VB21 8aa 0,654 0,350 0,575VB9 9aa 1,601 0,810 1,135 VB21 9aa 0,904 0,663 0,964VB9 10aa 1,458 1,189 1,884 VB21 10aa 2,111 0,663 1,024VB9 11aa 0,754 0,365 0,609 VB21 11aa 0,518 0,545 0,477VB9 12aa 0,804 0,747 0,502 VB21 12aa 0,370 0,342 0,290VB9 13aa 0,085 0,220 VB21 13aa 0,070VB9 Total 6,172 4,505 6,282 VB21 Total 6,077 5,340 4,934VB10 5aa VB22 5aa 2,906 2,945 2,277VB10 6aa VB22 6aa 0,099 0,107VB10 7aa 0,103 0,200 VB22 7aa 0,411 0,418 0,658VB10 8aa 0,224 0,016 VB22 8aa 0,785 0,192 0,573

Apêndice O 246VB10 9aa 1,366 1,334 1,225 VB22 9aa 1,408 0,539 1,143VB10 10aa 0,062 0,033 VB22 10aa 1,104 1,498 1,890VB10 11aa 0,310 1,016 0,502 VB22 11aa 0,497 0,030 0,232VB10 12aa VB22 12aa 0,142 0,162 0,224VB10 13aa 0,174 0,561 0,045 VB22 13aa 0,043VB10 14aa 1,432 0,142 VB22 14aaVB10 15aa 0,141 VB22 15aaVB10 Total 3,610 3,114 2,163 VB22 Total 7,353 5,784 7,149VB11 6aa 0,596 2,789 1,970 VB23 6aaVB11 7aa 0,610 0,072 0,081 VB23 7aa 0,094VB11 8aa 0,959 0,343 1,339 VB23 8aa 0,184 0,236 0,533VB11 9aa 0,790 0,277 0,227 VB23 9aa 0,265 0,189 0,639VB11 10aa 0,342 0,033 0,292 VB23 10aa 0,380 0,211 0,940VB11 11aa 0,230 0,073 VB23 11aa 0,193 0,031 0,351VB11 12aa 0,701 0,125 VB23 12aa 4,406 4,228 4,024VB11 13aa 0,044 VB23 13aaVB11 Total 4,271 3,515 4,107 VB23 Total 5,428 4,895 6,582VB12 6aa 0,024 VB24 6aa 0,037 0,012 0,015VB12 7aa 0,136 0,058 VB24 7aa 0,004 0,004 0,005VB12 8aa 1,838 0,893 0,581 VB24 8aa 0,273 0,259 0,218VB12 9aa 0,491 1,843 1,566 VB24 9aa 0,048 0,034 0,048VB12 10aa 0,624 0,094 0,247 VB24 10aa 0,002 0,002 0,009VB12 11aa 0,207 0,149 0,183 VB24 11aa 0,004 0,004VB12 12aa 0,330 0,042 VB24 12aa 0,006 0,009VB12 13aa 0,127 0,080 VB24 13aaVB12 Total 3,753 2,978 2,782 VB24 Total 0,374 0,310 0,308

Apêndice P 247Apêndice P - Repertório da cadeia Vβ do TCR de linfócitos T do sangue periférico dopaciente com esclerose múltipla DFG (EM4), pré- e pós-TACTH..Pré-Tx D+330 D+720VB1VB2VB3VB4VB5VB6VB7VB8VB9VB10VB11VB12

Apêndice P 248Pré-Tx D+330 D+720VB13VB14VB15VB16VB17VB18VB19-VB20VB21VB22VB23VB24Figura P.1. Repertório da cadeia Vβ do TCR no paciente com esclerose múltipla DFG (EM4), pré e pós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usandoprimers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBVCDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número de transcritos paraa família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases (eixo X). Ospicos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos.

Apêndice P 249Tabela P.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do TCR efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla DFG (EM4), pré- e pós-TACTH.FamíliaVBPré-TxD+360 D+720FamíliaVBPré-TxD+360 D+720VB1 6aa 0,045 0,063 VB13 6aa 0,189 0,068 0,058VB1 7aa 0,263 0,301 0,190 VB13 7aa 0,418 0,321 0,179VB1 8aa 0,329 0,106 0,356 VB13 8aa 1,188 0,771 0,503VB1 9aa 1,318 1,075 0,577 VB13 9aa 1,491 1,272 0,701VB1 10aa 0,677 0,366 0,804 VB13 10aa 2,232 1,073 0,945VB1 11aa 0,628 0,320 0,444 VB13 11aa 0,909 0,947 0,293VB1 12aa 0,545 1,962 0,668 VB13 12aa 0,199 0,406 0,088VB1 13aa 0,014 VB13 13aa 0,024VB1 14aa 0,016 VB13 14aa 0,035VB1 Total 3,791 4,175 3,102 VB13 Total 6,627 4,859 2,827VB2 6aa 0,141 0,677 0,022 VB14 6aa 0,132 0,148 0,049VB2 7aa 0,266 0,312 0,295 VB14 7aa 0,159 1,092 0,162VB2 8aa 0,769 1,455 0,913 VB14 8aa 1,781 0,369 0,787VB2 9aa 0,889 0,790 1,342 VB14 9aa 0,780 0,859 1,034VB2 10aa 0,829 0,607 1,092 VB14 10aa 0,932 0,154 0,860VB2 11aa 0,354 0,483 0,413 VB14 11aa 0,510 0,308VB2 12aa 0,117 0,084 0,199 VB14 12aa 0,078 0,105VB2 13aa 0,240 0,064 0,136 VB14 13aa 0,061 0,051VB2 14aa 0,037 0,019 0,019 VB14 14aa 0,077VB2 Total 3,694 4,491 4,433 VB14 Total 4,433 2,620 3,434VB3 5aa 2,538 3,234 1,303 VB15 5aa 0,155 0,031VB3 6aa 0,033 0,016 0,133 VB15 6aa 0,244 0,641 0,291VB3 7aa 0,201 0,233 0,402 VB15 7aa 0,127 0,025 0,120VB3 8aa 0,376 1,074 0,723 VB15 8aa 0,224 0,051 0,289VB3 9aa 1,004 0,809 1,229 VB15 9aa 0,797 0,388 0,329VB3 10aa 0,711 0,838 1,017 VB15 10aa 0,458 0,356 0,593VB3 11aa 0,355 0,526 0,483 VB15 11aa 2,533 2,828 1,636VB3 12aa 0,141 0,059 0,139 VB15 12aa 0,060 1,128 0,475VB3 13aa 0,072 0,142 0,073 VB15 13aa 0,249 0,080 0,143VB3 14aa 0,037 VB15 14aaVB3 Total 5,430 6,931 5,540 VB15 Total 4,847 5,527 3,875VB4 5aa 0,067 0,016 0,038 VB16 5aaVB4 6aa 0,220 0,287 0,235 VB16 6aaVB4 7aa 0,816 0,884 0,516 VB16 7aa 0,049 0,045 0,174VB4 8aa 1,031 0,600 0,717 VB16 8aa 0,193 1,347 1,179VB4 9aa 0,605 0,655 0,642 VB16 9aa 1,712 1,900 1,728VB4 10aa 0,361 0,215 0,191 VB16 10aa 0,443 1,009 1,423VB4 11aa 0,176 0,079 0,126 VB16 11aa 0,219 0,267 0,825VB4 12aa 0,048 0,042 0,054 VB16 12aa 0,135 0,897 0,339VB4 13aa 0,033 0,018 VB16 13aa 0,047 0,094 0,039VB4 14aa VB16 14aa 0,032 0,107VB4 Total 3,356 2,796 2,519 VB16 Total 2,830 5,559 5,814VB5 4aa 0,018 VB17 4aaVB5 5aa 0,018 VB17 5aa 0,071

Apêndice P 250VB5 6aa 0,121 0,086 0,127 VB17 6aa 0,146 0,204 0,160VB5 7aa 0,474 0,073 0,203 VB17 7aa 0,582 0,711 0,566VB5 8aa 1,108 1,039 0,747 VB17 8aa 1,469 1,458 1,205VB5 9aa 1,524 0,597 0,873 VB17 9aa 1,533 1,273 1,174VB5 10aa 2,153 2,491 2,482 VB17 10aa 1,512 2,167 1,435VB5 11aa 0,742 0,583 0,597 VB17 11aa 0,376 0,767 0,488VB5 12aa 0,297 0,209 VB17 12aa 0,147 0,443 0,230VB5 13aa 0,100 0,033 0,064 VB17 13aa 0,114 0,069 0,099VB5 14aa 0,141 0,036 VB17 14aa 0,043 0,665 0,057VB5 Total 6,659 4,901 5,417 VB17 Total 5,923 7,828 5,416VB6 5aa 0,046 0,076 VB18 5aaVB6 6aa 0,104 0,042 0,300 VB18 6aa 0,031 0,019VB6 7aa 0,566 0,330 0,889 VB18 7aa 0,084 0,129VB6 8aa 1,371 0,263 2,922 VB18 8aa 0,548 0,864 0,958VB6 9aa 1,494 2,285 1,382 VB18 9aa 1,021 0,082 0,756VB6 10aa 1,834 0,525 0,711 VB18 10aa 1,699 3,279 1,973VB6 11aa 0,743 0,270 0,291 VB18 11aa 0,515 0,082 0,544VB6 12aa 0,399 0,151 0,154 VB18 12aa 0,290 0,230 0,124VB6 13aa 0,121 0,049 0,047 VB18 13aa 0,113 0,040 0,085VB6 14aa 0,177 VB18 14aa 0,035 0,018VB6 Total 6,857 3,915 6,772 VB18 Total 4,336 4,578 4,606VB7 7aa 0,115 0,058 0,142 VB19 7aaVB7 8aa 0,386 0,562 0,466 VB19 8aa 0,056VB7 9aa 0,538 0,350 0,803 VB19 9aa 0,101VB7 10aa 1,254 0,594 1,805 VB19 10aa 0,936 0,373VB7 11aa 1,390 1,367 0,956 VB19 11aa 0,026VB7 12aa 0,253 0,063 0,548 VB19 12aa 0,159VB7 13aa 0,145 1,020 0,622 VB19 13aa 0,084VB7 14aa 0,032 0,058 0,067 VB19 14aa 0,056VB7 15aa 0,068 0,706 0,339 VB19 15aaVB7 Total 4,182 4,779 5,748 VB19 Total 0,936 0,000 0,799VB8 5aa 0,143 0,431 VB20 5aaVB8 6aa 0,108 0,057 0,437 VB20 6aa 0,037 0,020 0,041VB8 7aa 0,322 0,828 0,575 VB20 7aa 0,082 0,079 0,109VB8 8aa 0,540 0,890 1,005 VB20 8aa 0,309 0,118 0,370VB8 9aa 0,748 0,550 1,164 VB20 9aa 0,245 0,256 0,367VB8 10aa 0,647 0,709 1,008 VB20 10aa 0,143 0,066 0,323VB8 11aa 0,227 0,124 0,287 VB20 11aa 0,099 0,561 0,227VB8 12aa 0,137 0,050 0,144 VB20 12aa 0,044 0,070VB8 13aa 0,027 0,038 VB20 13aaVB8 Total 2,899 3,639 4,659 VB20 Total 0,915 1,144 1,506VB9 6aa 0,126 0,051 0,156 VB21 6aa 0,142 0,106VB9 7aa 0,309 0,148 0,227 VB21 7aa 0,402 0,784 0,374VB9 8aa 0,901 0,390 0,843 VB21 8aa 0,679 0,471 1,023VB9 9aa 1,243 0,643 0,863 VB21 9aa 1,110 0,830 0,905VB9 10aa 1,416 1,191 1,504 VB21 10aa 1,683 1,024 1,266VB9 11aa 0,679 0,295 0,625 VB21 11aa 0,864 0,732 0,464VB9 12aa 0,499 0,219 0,263 VB21 12aa 0,333 0,347 0,148VB9 13aa 0,807 0,610 0,777 VB21 13aa 0,038 0,066 0,066VB9 14aa 0,077 0,589 0,151 VB21 14aa 0,228 2,371 0,591VB9 15aa 0,065 VB21 15aa

Apêndice P 251VB9 Total 6,121 4,135 5,408 VB21 Total 5,478 6,625 4,943VB10 5aa VB22 5aa 0,063 0,090VB10 6aa 0,056 0,045 VB22 6aa 0,087 0,464VB10 7aa 0,196 0,050 0,098 VB22 7aa 1,369 1,564 0,862VB10 8aa 0,128 0,602 0,144 VB22 8aa 1,471 1,533 1,660VB10 9aa 0,056 0,268 0,466 VB22 9aa 1,177 0,977 1,601VB10 10aa 0,421 0,389 0,319 VB22 10aa 1,226 0,922 1,997VB10 11aa 0,094 0,673 1,086 VB22 11aa 0,481 2,111 1,260VB10 12aa 0,120 0,333 0,193 VB22 12aa 0,467 0,640 0,423VB10 13aa 0,032 0,020 0,042 VB22 13aa 0,058 0,060 0,087VB10 14aa 0,033 0,109 VB22 14aaVB10 Total 1,103 2,367 2,503 VB22 Total 6,399 7,805 8,446VB11 5aa 0,042 VB23 5aaVB11 6aa 0,085 0,057 VB23 6aa 1,562 1,786 0,720VB11 7aa 0,258 0,119 0,370 VB23 7aa 0,342 0,219 0,383VB11 8aa 0,151 0,203 0,286 VB23 8aa 0,436 0,417 0,518VB11 9aa 1,696 1,564 1,550 VB23 9aa 1,445 1,626 1,518VB11 10aa 0,392 0,156 0,723 VB23 10aa 1,411 1,077 1,827VB11 11aa 0,114 0,073 0,147 VB23 11aa 0,667 0,363 0,651VB11 12aa 0,495 0,191 VB23 12aa 0,207 0,784 0,294VB11 13aa 0,096 VB23 13aa 0,120 0,066 0,183VB11 14aa VB23 14aa 0,050 0,048VB11 15aa 0,084 VB23 15aaVB11 Total 3,192 2,115 3,546 VB23 Total 6,190 6,387 6,143VB12 6aa 0,075 0,066 VB24 6aaVB12 7aa 0,557 0,293 0,188 VB24 7aa 0,003 0,002VB12 8aa 0,652 0,472 0,456 VB24 8aa 0,023 0,015 0,006VB12 9aa 0,884 0,448 0,755 VB24 9aa 0,025 0,012 0,008VB12 10aa 1,093 0,869 0,678 VB24 10aa 0,039 0,014 0,011VB12 11aa 0,200 0,034 0,196 VB24 11aa 0,024 0,007 0,006VB12 12aa 0,083 0,100 0,069 VB24 12aa 0,007 0,028 0,003VB12 13aa 0,134 0,534 0,104 VB24 13aa 0,001VB12 14aa VB24 14aa 0,003VB12 Total 3,679 2,749 2,513 VB24 Total 0,125 0,077 0,033

Apêndice Q 252Apêndice Q - Repertório da cadeia Vβ do TCR de linfócitos T do sangue periférico dopaciente com esclerose múltipla ARJTA (EM5), pré- e pós-TACTH.Pré-Tx D+360 Pré-Tx D+360VB1VB13VB2VB14VB3VB15VB4VB16VB5VB17VB6VB18VB7VB19VB8VB20VB9VB21VB10VB22VB11VB23VB12VB24Figura Q.1. Repertório da cadeia Vβ do TCR no paciente com esclerose múltipla ARJTA (EM5), pré e pós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usandoprimers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBV

Apêndice Q 253CDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número de transcritos paraa família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases (eixo X). Ospicos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos.Tabela Q.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do TCR efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente com comesclerose múltipla ARJTA (EM5), pré- e pós-TACTH.FamíliaVBPré-TxD+360FamíliaVBPré-TxD+360VB1 5aa VB13 5aa 0,020VB1 6aa 0,135 VB13 6aa 0,114VB1 7aa 0,131 0,149 VB13 7aa 0,202VB1 8aa 0,197 0,150 VB13 8aa 0,707 0,623VB1 9aa 0,320 0,281 VB13 9aa 1,196VB1 10aa 0,966 2,596 VB13 10aa 1,378 0,250VB1 11aa 0,061 VB13 11aa 0,544VB1 12aa 0,041 VB13 12aa 0,037 0,084VB1 13aa VB13 13aa 0,028VB1 Total 1,748 3,278 VB13 Total 4,225 0,958VB2 6aa VB14 6aa 0,032 0,030VB2 7aa 0,206 0,231 VB14 7aa 0,193 0,055VB2 8aa 0,594 0,952 VB14 8aa 0,661 0,223VB2 9aa 1,593 1,032 VB14 9aa 1,102 0,392VB2 10aa 1,378 3,019 VB14 10aa 0,927 0,981VB2 11aa 0,518 0,180 VB14 11aa 0,766 2,380VB2 12aa 1,115 0,155 VB14 12aa 0,143VB2 13aa 0,055 VB14 13aa 0,047VB2 14aa 0,068 VB14 14aa 0,249VB2 Total 5,405 5,694 VB14 Total 4,120 4,060VB3 6aa 0,121 0,048 VB15 6aa 0,036VB3 7aa 0,191 0,077 VB15 7aa 0,252VB3 8aa 1,445 2,510 VB15 8aa 0,064 0,797VB3 9aa 1,519 1,117 VB15 9aa 3,894 0,993VB3 10aa 1,107 0,319 VB15 10aa 0,348VB3 11aa 0,579 0,424 VB15 11aa 0,104 0,319VB3 12aa 0,203 0,142 VB15 12aa 0,357 0,287VB3 13aa 0,039 VB15 13aa 0,136VB3 14aa VB15 14aa 0,409VB3 15aaVB15 15aaVB3 16aa VB15 16aa 0,333VB3 Total 5,203 4,636 VB15 Total 4,420 3,910VB4 5aa 0,066 0,047 VB16 5aaVB4 6aa 0,224 0,214 VB16 6aa 0,229 0,330VB4 7aa 0,399 0,594 VB16 7aa 0,158 0,160VB4 8aa 0,914 0,638 VB16 8aa 1,479 1,359VB4 9aa 0,821 0,717 VB16 9aa 1,276 0,609VB4 10aa 0,398 1,054 VB16 10aa 1,345 0,906VB4 11aa 0,184 0,133 VB16 11aa 0,976 1,305VB4 12aa 0,073 0,573 VB16 12aa 0,378 0,132

Apêndice Q 254VB4 13aa 0,028 VB16 13aa 0,288 0,651VB4 14aa 0,024 VB16 14aa 0,132 0,045VB4 15aa VB16 15aa 0,083VB4 Total 3,131 3,971 VB16 Total 6,261 5,581VB5 5aa VB17 5aa 0,227 6,063VB5 6aa 0,098 0,028 VB17 6aa 1,123VB5 7aa 0,325 0,133 VB17 7aa 0,248VB5 8aa 0,610 0,195 VB17 8aa 0,783 0,047VB5 9aa 1,522 2,206 VB17 9aa 1,098 0,268VB5 10aa 2,178 1,382 VB17 10aa 0,880 0,265VB5 11aa 0,440 2,788 VB17 11aa 0,373 0,122VB5 12aa 0,206 0,120 VB17 12aa 0,066VB5 13aa 0,237 VB17 13aa 0,043VB5 14aa 0,008 VB17 14aa 0,089VB5 15aa 0,071 VB17 15aaVB5 Total 5,694 6,852 VB17 Total 4,931 6,765VB6 5aa 0,098 VB18 5aaVB6 6aa 0,113 0,149 VB18 6aaVB6 7aa 0,905 0,503 VB18 7aa 0,176 0,028VB6 8aa 1,004 0,760 VB18 8aa 0,943 0,172VB6 9aa 1,695 0,306 VB18 9aa 0,603 2,685VB6 10aa 2,904 1,104 VB18 10aa 2,717 0,801VB6 11aa 0,268 1,528 VB18 11aa 0,289 0,061VB6 12aa 0,196 0,606 VB18 12aa 0,248 0,065VB6 13aa 0,081 VB18 13aa 0,068VB6 14aa VB18 14aa 0,055VB6 Total 7,263 4,955 VB18 Total 5,099 3,812VB7 5aa VB19 5aa 2,528VB7 6aaVB19 6aaVB7 7aa 0,022 VB19 7aaVB7 8aa 0,053 VB19 8aa 0,046VB7 9aa 0,168 0,056 VB19 9aa 0,125 0,296VB7 10aa 3,107 3,573 VB19 10aa 0,580VB7 11aa 0,204 0,056 VB19 11aa 0,199VB7 12aa 0,090 0,036 VB19 12aa 0,072VB7 13aa 0,036 VB19 13aa 0,032VB7 14aa 0,043 VB19 14aa 0,047 0,474VB7 15aa VB19 15aa 0,043VB7 16aa VB19 16aa 0,100VB7 Total 3,722 3,721 VB19 Total 1,245 3,297VB8 6aa 0,224 1,486 VB20 6aaVB8 7aa 1,439 0,090 VB20 7aa 0,008 0,035VB8 8aa 0,203 0,372 VB20 8aa 0,006 0,028VB8 9aa 1,516 0,693 VB20 9aa 0,064 0,010VB8 10aa 0,125 0,182 VB20 10aa 0,006VB8 11aa 0,069 0,291 VB20 11aa 0,009 0,057VB8 12aa 0,027 VB20 12aa 0,020VB8 13aa VB20 13aa 0,056VB8 14aa VB20 14aa 0,026VB8 15aa VB20 15aa 0,003

Apêndice Q 255VB8 Total 3,603 3,114 VB20 Total 0,139 0,189VB9 6aa VB21 6aa 0,034VB9 7aa 0,179 0,056 VB21 7aa 0,649 0,192VB9 8aa 0,510 0,316 VB21 8aa 0,735 0,146VB9 9aa 2,481 0,944 VB21 9aa 0,830 0,778VB9 10aa 0,610 0,720 VB21 10aa 0,743 0,338VB9 11aa 0,648 0,985 VB21 11aa 0,311 2,204VB9 12aa 0,141 2,572 VB21 12aa 1,826 2,706VB9 13aa 0,189 VB21 13aaVB9 Total 4,759 5,595 VB21 Total 5,127 6,364VB10 5aa 0,408 VB22 5aa 0,075 0,708VB10 6aa VB22 6aa 0,135 0,100VB10 7aa 0,177 VB22 7aa 0,598 0,406VB10 8aa 0,050 VB22 8aa 0,995 0,966VB10 9aa 0,204 VB22 9aa 1,566 1,540VB10 10aa 3,840 0,214 VB22 10aa 2,337 2,187VB10 11aa 1,788 VB22 11aa 0,371 1,432VB10 12aa 1,238 VB22 12aa 0,480VB10 13aa VB22 13aa 0,065VB10 14aa 0,250 VB22 14aaVB10 Total 3,840 4,330 VB22 Total 6,621 7,340VB11 5aa 0,062 0,378 VB23 5aaVB11 6aa 0,042 0,142 VB23 6aaVB11 7aa 0,101 0,236 VB23 7aa 0,284VB11 8aa 0,798 0,558 VB23 8aa 0,607 0,729VB11 9aa 1,393 1,057 VB23 9aa 1,204 4,093VB11 10aa 0,627 0,652 VB23 10aa 1,027 0,229VB11 11aa 0,642 0,174 VB23 11aa 1,281VB11 12aa 0,191 0,054 VB23 12aa 0,984VB11 13aa 0,101 VB23 13aa 0,332VB11 14aaVB23 14aaVB11 15aa 0,087 VB23 15aaVB11 Total 4,045 3,252 VB23 Total 5,719 5,051VB12 7aa 0,318 VB24 7aaVB12 8aa 1,262 1,152 VB24 8aa 0,007VB12 9aa 0,817 0,055 VB24 9aa 0,007VB12 10aa 0,995 2,004 VB24 10aa 0,007VB12 11aa 0,111 0,059 VB24 11aa 0,009 0,004VB12 12aa 0,079 VB24 12aa 0,002VB12 13aa 0,063 VB24 13aa 0,003VB12 Total 3,645 3,270 VB24 Total 0,034 0,004

Apêndice R 256Apêndice R - Repertório da cadeia Vβ do TCR de linfócitos T do sangue periférico dopaciente com esclerose múltipla SHGE (EM6), pré- e pós-TACTH.Pré-Tx D+180 D+360VB1VB2VB3VB4VB5VB6VB7VB8VB9VB10VB11VB12

Apêndice R 257Pré-Tx D+180 D+360VB13VB14VB15VB16VB17VB18VB19VB20VB21VB22VB23VB24-Figura R.1. Repertório da cadeia Vβ do TCR no paciente com esclerose múltipla SHGE (EM6), pré e pós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usandoprimers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBVCDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número de transcritos paraa família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases (eixo X). Ospicos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos.

Apêndice R 258Tabela R.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do TCR efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla SHGE (EM6), pré- e pós-TACTH.FamíliaVBPré-TxD+180 D+360FamíliaVBPré-TxD+180 D+360VB1 6aa 0,023 VB13 6aa 0,132 0,399 0,223VB1 7aa 0,091 VB13 7aa 0,357 0,424 0,256VB1 8aa 0,428 0,194 VB13 8aa 1,059 0,551 0,408VB1 9aa 0,942 3,106 4,186 VB13 9aa 1,302 1,150 0,666VB1 10aa 1,152 0,348 VB13 10aa 1,935 2,579 2,121VB1 11aa 0,445 0,093 VB13 11aa 0,878 0,652 0,310VB1 12aa 0,233 0,055 VB13 12aa 0,126 0,148 0,113VB1 13aa 0,025 VB13 13aaVB1 14aa 0,052 VB13 14aa 0,087VB1 15aa VB13 15aa 0,033VB1 Total 3,391 3,796 4,186 VB13 Total 5,790 6,024 4,096VB2 5aa 0,032 VB14 5aaVB2 6aa 0,175 0,210 0,258 VB14 6aa 0,024VB2 7aa 0,281 0,180 0,346 VB14 7aa 0,171VB2 8aa 0,555 0,638 0,969 VB14 8aa 0,561 0,501 0,051VB2 9aa 0,821 2,089 1,829 VB14 9aa 0,967 1,704 0,267VB2 10aa 0,674 0,842 0,989 VB14 10aa 1,110 0,398 0,070VB2 11aa 0,277 1,125 1,181 VB14 11aa 0,349 1,418 0,084VB2 12aa 0,147 0,331 VB14 12aa 0,386 0,024VB2 13aa 0,169 0,139 0,295 VB14 13aa 0,053VB2 14aa 0,036 0,122 VB14 14aa 0,046VB2 15aa 0,098 VB14 15aaVB2 Total 3,130 5,686 5,989 VB14 Total 3,666 4,045 0,472VB3 5aa VB15 5aa 0,048VB3 6aa 0,434 VB15 6aa 0,059 0,033 0,052VB3 7aa 0,108 0,067 0,061 VB15 7aa 0,249 0,193 0,108VB3 8aa 0,976 1,355 1,590 VB15 8aa 0,693 0,455 0,213VB3 9aa 0,433 0,296 0,216 VB15 9aa 0,634 1,611 2,816VB3 10aa 0,195 0,317 0,142 VB15 10aa 1,068 1,156 0,379VB3 11aa 4,558 2,550 2,284 VB15 11aa 0,753 0,794 0,650VB3 12aa 0,463 0,306 VB15 12aa 0,180 1,060 0,724VB3 13aa VB15 13aa 0,127 0,021VB3 Total 6,270 5,049 5,034 VB15 Total 3,761 5,350 4,963VB4 5aa 0,033 0,022 VB16 5aaVB4 6aa 0,170 0,051 0,023 VB16 6aa 0,134VB4 7aa 0,530 0,185 0,081 VB16 7aa 0,298 0,187 0,044VB4 8aa 0,700 0,467 0,291 VB16 8aa 1,132 0,144 0,420VB4 9aa 0,445 1,716 0,481 VB16 9aa 1,547 0,107 0,406VB4 10aa 0,243 0,023 0,025 VB16 10aa 1,170 0,875 1,663VB4 11aa 0,089 2,319 3,339 VB16 11aa 0,728 2,701 3,200VB4 12aa 0,060 VB16 12aa 0,441 0,030 0,061VB4 13aa VB16 13aa 0,088VB4 14aa VB16 14aa 0,149VB4 15aa VB16 15aa 0,039

Apêndice R 259VB4 Total 2,271 4,782 4,240 VB16 Total 5,726 4,044 5,794VB5 5aa 0,088 VB17 5aaVB5 6aa 0,174 0,057 VB17 6aa 0,117 0,241VB5 7aa 0,211 0,087 0,089 VB17 7aa 0,391 0,632 0,100VB5 8aa 1,323 1,161 2,101 VB17 8aa 0,890 0,743 0,734VB5 9aa 1,751 0,539 0,280 VB17 9aa 1,351 0,438 0,466VB5 10aa 1,483 0,541 0,696 VB17 10aa 1,197 2,784 1,635VB5 11aa 0,863 1,599 2,594 VB17 11aa 0,431 0,496VB5 12aa 0,304 0,170 0,114 VB17 12aa 0,218 0,618 0,478VB5 13aa 0,193 VB17 13aa 0,083VB5 14aa 0,059 VB17 14aa 0,049VB5 Total 6,362 4,240 5,874 VB17 Total 4,727 5,953 3,414VB6 5aa VB18 5aa 0,042VB6 6aa 0,150 0,035 0,032 VB18 6aa 0,028 0,042 0,057VB6 7aa 0,550 0,442 0,270 VB18 7aa 0,225 0,072VB6 8aa 1,779 0,707 0,772 VB18 8aa 0,611 1,054 1,049VB6 9aa 2,101 2,049 1,462 VB18 9aa 1,267 0,899 0,835VB6 10aa 2,197 0,874 0,995 VB18 10aa 1,221 0,849 3,365VB6 11aa 0,981 0,158 0,026 VB18 11aa 0,556 0,711 0,659VB6 12aa 0,290 0,520 0,450 VB18 12aa 0,258 0,065 0,143VB6 13aa 0,218 0,121 VB18 13aa 0,095 0,079 0,129VB6 14aa 0,047 0,140 0,256 VB18 14aaVB6 15aa 0,057 VB18 15aaVB6 16aa VB18 16aa 0,471VB6 Total 8,370 5,047 4,264 VB18 Total 4,261 4,213 6,308VB7 6aa 0,032 VB19 6aaVB7 7aa 0,037 VB19 7aaVB7 8aa 0,405 0,310 0,208 VB19 8aa 0,063VB7 9aa 0,681 0,399 0,475 VB19 9aa 0,007 0,119VB7 10aa 1,390 0,997 0,394 VB19 10aa 0,181 3,089 3,798VB7 11aa 1,133 0,500 0,235 VB19 11aaVB7 12aa 0,503 1,745 1,465 VB19 12aa 0,006VB7 13aa 0,154 0,227 0,240 VB19 13aa 0,010VB7 14aa 0,028 VB19 14aaVB7 15aa 0,050 VB19 15aaVB7 16aa 0,048 VB19 16aaVB7 Total 4,460 4,177 3,017 VB19 Total 0,204 3,089 3,979VB8 6aa 0,063 0,021 VB20 6aa 0,496 1,416 1,925VB8 7aa 0,313 0,066 VB20 7aa 0,127VB8 8aa 0,575 1,083 1,250 VB20 8aa 0,605VB8 9aa 0,759 0,384 0,605 VB20 9aa 0,639 0,209 0,260VB8 10aa 0,609 0,235 0,399 VB20 10aa 0,382 0,063VB8 11aa 0,195 0,257 0,320 VB20 11aa 0,115VB8 12aa 0,079 0,825 2,109 VB20 12aa 0,122VB8 13aaVB20 13aaVB8 14aa VB20 14aa 0,152 0,178VB8 Total 2,592 2,871 4,682 VB20 Total 2,486 1,777 2,426VB9 6aa 0,117 0,305 0,124 VB21 6aa 0,075VB9 7aa 0,371 0,660 0,240 VB21 7aa 0,178 0,067 0,042

Apêndice R 260VB9 8aa 0,889 0,922 0,712 VB21 8aa 0,668 0,529 0,215VB9 9aa 1,401 0,641 0,821 VB21 9aa 1,115 0,254 0,605VB9 10aa 1,938 1,740 2,019 VB21 10aa 1,755 1,822 1,639VB9 11aa 0,490 0,775 0,176 VB21 11aa 0,591 0,608 0,411VB9 12aa 0,309 0,353 0,360 VB21 12aa 0,187 0,000 0,021VB9 13aa 0,060 0,127 0,154 VB21 13aa 0,114 0,174 0,046VB9 14aa 0,066 0,036 VB21 14aa 0,052VB9 15aa 0,136 VB21 15aaVB9 Total 5,641 5,694 4,606 VB21 Total 4,681 3,454 3,030VB10 5aa VB22 5aa 0,026 0,042VB10 6aa 0,152 0,250 0,112 VB22 6aa 0,245 0,195 0,254VB10 7aa 0,319 1,548 1,991 VB22 7aa 0,480 0,472 0,458VB10 8aa 0,075 0,232 0,232 VB22 8aa 1,337 3,052 2,918VB10 9aa 0,465 0,151 VB22 9aa 1,679 1,017 1,384VB10 10aa 0,908 1,110 2,073 VB22 10aa 1,451 1,136 1,432VB10 11aa 0,385 0,216 VB22 11aa 0,508 0,987 0,870VB10 12aa 0,458 0,102 0,267 VB22 12aa 0,149 0,154VB10 13aa VB22 13aa 0,107 0,302 0,527VB10 14aa 0,169 VB22 14aa 0,024VB10 Total 2,932 3,457 4,829 VB22 Total 6,005 7,161 8,038VB11 6aa 0,164 0,033 0,065 VB23 6aa 0,096VB11 7aa 0,565 0,073 0,161 VB23 7aa 0,146 0,045VB11 8aa 0,713 0,331 0,381 VB23 8aa 1,653 3,767 3,706VB11 9aa 1,017 0,867 0,742 VB23 9aa 1,728 0,751VB11 10aa 0,694 0,148 0,385 VB23 10aa 1,186 1,482 1,449VB11 11aa 0,955 0,200 0,298 VB23 11aa 0,709 0,125 0,147VB11 12aa 0,301 0,079 0,021 VB23 12aa 0,313 0,121VB11 13aa 0,035 0,200 VB23 13aa 0,119 1,118 0,981VB11 14aa 0,053 0,384 VB23 14aaVB11 15aa 0,105 VB23 15aaVB11 Total 4,600 2,117 2,252 VB23 Total 5,950 6,492 7,200VB12 6aa 0,046 0,076 VB24 6aaVB12 7aa 0,197 0,122 VB24 7aaVB12 8aa 0,349 0,167 0,077 VB24 8aaVB12 9aa 1,058 0,904 0,631 VB24 9aaVB12 10aa 0,518 0,315 0,279 VB24 10aa 0,097 0,043VB12 11aa 0,248 VB24 11aaVB12 12aa 0,157 0,022 VB24 12aaVB12 13aa 0,151 0,058 VB24 13aaVB12 Total 2,722 1,386 1,267 VB24 Total 0,000 0,097 0,043

Apêndice S 261Apêndice S - Repertório da cadeia Vβ do TCR de linfócitos T do sangue periférico dopaciente com esclerose múltipla MFM (EM8), pré- e pós-TACTH.Pré-Tx D+180 Pré-Tx D+180VB1VB13VB2VB14VB3VB15VB4VB16VB5VB17VB6VB18VB7VB19VB8VB20VB9VB21VB10VB22VB11VB23VB12VB24Figura S.1. Repertório da cadeia Vβ do TCR no paciente com esclerose múltipla MFM (EM8), pré e pós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usandoprimers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBV

Apêndice S 262CDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número de transcritos paraa família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases (eixo X). Ospicos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos.Tabela S.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do TCR efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla MFM (EM8), pré- e pós-TACTH.FamíliaVBPré-TxD+180FamíliaVBPré-TxD+180VB1 4aa 0,011 VB13 4aaVB1 5aa 0,014 VB13 5aaVB1 6aa 0,036 VB13 6aa 0,089 1,869VB1 7aa 0,118 0,078 VB13 7aa 0,191 0,273VB1 8aa 0,336 0,055 VB13 8aa 0,929 1,234VB1 9aa 0,685 0,189 VB13 9aa 0,925 1,989VB1 10aa 1,107 0,543 VB13 10aa 0,438 1,265VB1 11aa 0,562 0,235 VB13 11aa 1,811 0,224VB1 12aa 1,633 0,011 VB13 12aa 0,058VB1 13aa 0,110 0,054 VB13 13aaVB1 14aa 0,010 VB13 14aaVB1 Total 4,552 1,237 VB13 Total 4,384 6,913VB2 5aa 0,099 VB14 5aa 0,018VB2 6aa 0,060 0,053 VB14 6aa 0,007VB2 7aa 0,489 0,252 VB14 7aa 0,039VB2 8aa 0,804 1,357 VB14 8aa 0,090VB2 9aa 0,744 0,315 VB14 9aa 0,233VB2 10aa 5,290 1,741 VB14 10aa 1,756 0,463VB2 11aa 0,116 0,509 VB14 11aa 0,031VB2 12aa 0,315 0,168 VB14 12aaVB2 13aa VB14 13aa 0,008VB2 Total 7,917 4,395 VB14 Total 1,756 0,888VB3 6aa 0,070 0,113 VB15 6aa 0,056VB3 7aa 0,774 0,641 VB15 7aa 0,116VB3 8aa 0,329 2,359 VB15 8aa 0,940 0,925VB3 9aa 1,211 0,978 VB15 9aa 0,383 0,393VB3 10aa 0,485 0,530 VB15 10aa 1,370 0,581VB3 11aa 0,748 2,020 VB15 11aa 0,218 0,416VB3 12aa 0,092 VB15 12aa 0,176VB3 13aaVB15 13aaVB3 14aa 0,211 VB15 14aa 0,042VB3 Total 3,616 6,945 VB15 Total 3,300 2,316VB4 4aa 0,004 VB16 4aaVB4 5aa 0,021 VB16 5aaVB4 6aa 0,270 0,034 VB16 6aaVB4 7aa 0,236 0,137 VB16 7aa 0,899 1,515VB4 8aa 0,108 0,589 VB16 8aa 1,000 0,556VB4 9aa 0,109 0,067 VB16 9aa 0,641 4,769VB4 10aa 0,075 0,107 VB16 10aa 0,620 0,195VB4 11aa VB16 11aa 0,560 0,429

Apêndice S 263VB4 12aa 0,055 VB16 12aa 0,315 0,873VB4 13aa 0,004 VB16 13aa 0,128VB4 14aa 0,196 0,201 VB16 14aaVB4 15aa 0,031 VB16 15aa 0,049VB4 Total 0,994 1,249 VB16 Total 4,212 8,337VB5 6aa 0,074 VB17 6aa 0,320 0,112VB5 7aa 0,805 1,044 VB17 7aa 0,082 1,201VB5 8aa 0,949 0,608 VB17 8aa 0,359 1,255VB5 9aa 1,066 1,987 VB17 9aa 0,482 0,507VB5 10aa 2,168 1,265 VB17 10aa 0,598 0,331VB5 11aa 0,777 1,300 VB17 11aa 1,802 0,608VB5 12aa 0,970 0,194 VB17 12aaVB5 13aa 0,000 0,087 VB17 13aaVB5 14aa 0,163 0,046 VB17 14aaVB5 Total 6,899 6,607 VB17 Total 3,643 4,445VB6 6aa 0,088 1,401 VB18 6aa 1,041 0,112VB6 7aa 0,479 0,180 VB18 7aa 0,135 1,192VB6 8aa 0,933 1,865 VB18 8aa 0,194 0,522VB6 9aa 1,196 0,591 VB18 9aa 1,346 1,216VB6 10aa 2,319 1,525 VB18 10aa 0,382 0,781VB6 11aa 0,697 0,637 VB18 11aa 0,339 0,812VB6 12aa 1,755 0,501 VB18 12aa 0,050VB6 13aa 0,053 0,195 VB18 13aa 0,121 0,383VB6 14aa 0,307 VB18 14aaVB6 Total 7,826 6,895 VB18 Total 3,609 5,017VB7 7aa 0,654 0,096 VB19 7aaVB7 8aa 0,797 0,399 VB19 8aa 0,178VB7 9aa 0,617 0,669 VB19 9aa 0,296VB7 10aa 2,377 0,855 VB19 10aa 0,426VB7 11aa 0,322 0,290 VB19 11aa 0,371VB7 12aa 0,198 0,648 VB19 12aa 0,190VB7 13aa 0,200 1,487 VB19 13aa 0,101VB7 14aa VB19 14aa 2,983 5,067VB7 Total 5,166 4,443 VB19 Total 4,546 5,067VB8 4aa VB20 4aa 0,015VB8 5aa 0,114 VB20 5aa 0,015VB8 6aa 0,191 VB20 6aa 0,016 0,125VB8 7aa 0,190 0,160 VB20 7aa 0,113 0,287VB8 8aa 0,504 0,367 VB20 8aa 0,278 0,621VB8 9aa 1,507 1,086 VB20 9aa 0,253 0,332VB8 10aa 0,595 0,803 VB20 10aa 0,149 0,161VB8 11aa 0,261 0,273 VB20 11aa 0,093 0,058VB8 12aa 0,289 VB20 12aa 0,062VB8 13aa 0,047 VB20 13aa 0,019VB8 14aa VB20 14aa 0,031VB8 15aa VB20 15aa 0,012VB8 16aa VB20 16aa 0,022VB8 Total 3,537 2,850 VB20 Total 1,080 1,583VB9 6aa 0,070 VB21 6aa 0,127 0,111

Apêndice S 264VB9 7aa 0,163 VB21 7aa 0,264 0,303VB9 8aa 0,759 0,568 VB21 8aa 1,121 0,755VB9 9aa 0,979 1,071 VB21 9aa 0,740 0,888VB9 10aa 0,517 0,582 VB21 10aa 2,445 1,605VB9 11aa 0,195 1,252 VB21 11aa 3,652 1,841VB9 12aa 0,313 0,284 VB21 12aa 0,226 0,139VB9 13aa 0,334 VB21 13aa 0,116 0,309VB9 14aa VB21 14aa 0,183 0,120VB9 15aa 0,060 VB21 15aaVB9 Total 2,823 4,325 VB21 Total 8,874 6,070VB10 5aa VB22 5aa 0,350 0,066VB10 6aa VB22 6aa 0,675 0,412VB10 7aa 0,276 0,154 VB22 7aa 0,253 0,326VB10 8aa 0,186 0,749 VB22 8aa 0,634 0,365VB10 9aa 0,267 0,245 VB22 9aa 0,765 0,413VB10 10aa 0,295 0,549 VB22 10aa 1,445 4,257VB10 11aa 0,309 0,356 VB22 11aa 0,552 0,104VB10 12aa 0,085 VB22 12aa 1,020 0,106VB10 13aa 0,043 VB22 13aaVB10 14aa 1,480 0,180 VB22 14aa 0,080VB10 15aaVB22 15aaVB10 16aa 0,087 VB22 16aaVB10 Total 2,898 2,364 VB22 Total 5,775 6,049VB11 6aa 1,924 2,111 VB23 6aaVB11 7aa 0,189 VB23 7aa 1,038VB11 8aa 0,114 VB23 8aa 0,695 0,401VB11 9aa 0,199 2,108 VB23 9aa 1,452 0,785VB11 10aa VB23 10aa 0,791 0,422VB11 11aa 1,139 VB23 11aa 0,760 1,236VB11 12aa VB23 12aa 2,192 2,938VB11 Total 3,376 4,407 VB23 Total 6,928 5,783VB12 5aa VB24 5aa 0,016VB12 6aa VB24 6aa 0,078VB12 7aa 0,078 0,078 VB24 7aaVB12 8aa 0,230 0,134 VB24 8aa 0,017VB12 9aa 0,813 0,950 VB24 9aa 0,010 0,026VB12 10aa 0,428 0,517 VB24 10aaVB12 11aa 0,278 VB24 11aaVB12 12aa 0,450 VB24 12aaVB12 Total 2,277 1,679 VB24 Total 0,010 0,137

Apêndice T 265Apêndice T - Repertório da cadeia Vβ do TCR de linfócitos T do sangue periférico dopaciente com esclerose múltipla WRS (EM9), pré- e pós-TACTH.Pré-Tx D+180 D+360VB1VB2VB3VB4VB5VB6VB7VB8VB9VB10VB11VB12

Apêndice T 266Pré-Tx D+180 D+360VB13VB14VB15VB16VB17VB18VB19VB20- - -VB21VB22VB23VB24Figura T.1. Repertório da cadeia Vβ do TCR no paciente com esclerose múltipla GG (EM1), pré e pós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usandoprimers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBVCDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número de transcritos paraa família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases (eixo X). Ospicos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos.

Apêndice T 267Tabela T.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do TCR efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla WRS (EM9), pré- e pós-TACTH.FamíliaVBPré-TxD+180 D+360FamíliaVBPré-TxD+180 D+360VB1 5aa VB13 5aa 0,052VB1 6aa VB13 6aa 0,029 0,115VB1 7aa 0,572 0,747 0,783 VB13 7aa 0,144 0,189 0,340VB1 8aa 0,531 0,623 0,816 VB13 8aa 0,310 0,826 1,407VB1 9aa 1,235 0,280 0,401 VB13 9aa 1,371 1,365 2,153VB1 10aa 1,367 0,319 0,419 VB13 10aa 0,545 0,811 1,884VB1 11aa 0,181 0,094 0,159 VB13 11aa 1,326 1,591 1,538VB1 12aa 0,730 0,037 0,080 VB13 12aa 0,039 0,025VB1 13aa 0,239 VB13 13aa 0,024 0,024VB1 Total 4,856 2,100 2,657 VB13 Total 3,720 4,874 7,514VB2 5aa 0,057 0,042 VB14 5aaVB2 6aa 0,124 0,088 0,092 VB14 6aa 0,067VB2 7aa 0,346 0,156 0,242 VB14 7aa 0,044 0,067 0,120VB2 8aa 0,671 1,453 0,549 VB14 8aa 0,539 0,723 0,626VB2 9aa 0,653 1,106 1,418 VB14 9aa 0,298 0,839 0,642VB2 10aa 2,375 0,444 1,296 VB14 10aa 0,480 1,241 1,601VB2 11aa 0,334 0,058 0,568 VB14 11aa 0,213 0,422 0,758VB2 12aa 0,112 0,103 VB14 12aa 0,164 0,189 0,124VB2 13aa 0,598 0,561 0,056 VB14 13aa 0,168 0,146VB2 14aa 1,167 0,042 0,502 VB14 14aaVB2 Total 6,437 3,907 4,826 VB14 Total 1,737 3,649 4,084VB3 5aa 0,035 VB15 5aaVB3 6aa 0,087 0,059 VB15 6aaVB3 7aa 2,246 1,947 1,513 VB15 7aa 0,080 0,036VB3 8aa 0,539 0,127 0,180 VB15 8aa 1,134 0,810 0,511VB3 9aa 0,629 0,307 0,465 VB15 9aa 0,216 1,609 0,939VB3 10aa 0,839 1,444 1,244 VB15 10aa 0,475 0,461 0,640VB3 11aa 1,800 1,360 1,024 VB15 11aa 1,297 1,153 0,803VB3 12aa 0,386 0,017 VB15 12aa 0,126 0,147 0,236VB3 13aa 0,035 VB15 13aa 0,410 0,184VB3 14aa 0,358 VB15 14aa 0,039VB3 15aa VB15 15aa 0,118VB3 Total 6,883 5,186 4,573 VB15 Total 3,365 4,709 3,350VB4 5aa 0,038 0,022 VB16 5aa 0,029VB4 6aa 0,634 0,047 0,072 VB16 6aa 0,340 0,048 0,103VB4 7aa 0,348 0,157 0,291 VB16 7aa 0,634 0,632 0,582VB4 8aa 1,887 2,043 1,468 VB16 8aa 0,864 0,360 0,753VB4 9aa 0,797 0,923 0,506 VB16 9aa 0,313 0,906 1,256VB4 10aa 0,419 0,052 0,098 VB16 10aa 1,987 1,851 1,599VB4 11aa 0,230 0,164 0,154 VB16 11aa 1,010 2,267 1,344VB4 12aa 0,039 0,023 VB16 12aa 0,449 1,592 1,267VB4 13aa 0,139 VB16 13aa 0,399 0,042 0,122VB4 14aa VB16 14aa 0,031VB4 15aa VB16 15aa 0,016

Apêndice T 268VB4 Total 4,531 3,386 2,633 VB16 Total 6,026 7,699 7,074VB5 5aa VB17 5aa 0,072VB5 6aa 0,050 VB17 6aa 0,085 0,225 0,153VB5 7aa 0,155 0,082 VB17 7aa 0,063 0,571 0,525VB5 8aa 1,682 0,369 1,016 VB17 8aa 1,453 1,269 1,056VB5 9aa 0,726 0,751 1,446 VB17 9aa 0,958 1,437 1,686VB5 10aa 4,163 0,696 1,576 VB17 10aa 1,968 1,265 1,355VB5 11aa 0,263 0,345 0,798 VB17 11aa 0,505 0,622 0,551VB5 12aa 0,256 0,133 0,230 VB17 12aa 0,483 0,577 0,321VB5 13aa 0,018 0,044 VB17 13aa 0,027 0,211 0,053VB5 14aa 0,053 0,082 VB17 14aa 0,031 0,108 0,067VB5 Total 7,245 2,365 5,324 VB17 Total 5,573 6,358 5,767VB6 5aaVB18 5aaVB6 6aa 0,051 0,076 VB18 6aa 0,073 0,234 0,158VB6 7aa 0,152 0,233 0,438 VB18 7aa 0,133 0,027 0,101VB6 8aa 0,416 0,574 1,197 VB18 8aa 0,171 0,113 0,467VB6 9aa 0,583 1,663 2,029 VB18 9aa 0,875 1,287 1,262VB6 10aa 1,911 0,866 1,678 VB18 10aa 1,868 1,396 1,806VB6 11aa 0,984 1,412 1,452 VB18 11aa 2,101 0,351 0,682VB6 12aa 0,261 0,110 0,189 VB18 12aa 0,077 0,106VB6 13aa 0,189 0,322 0,311 VB18 13aa 0,057 0,026 0,080VB6 14aa 0,522 0,059 VB18 14aaVB6 15aa VB18 15aa 0,069 0,293 0,405VB6 Total 5,017 5,231 7,428 VB18 Total 5,424 3,726 5,066VB7 8aa 0,160 0,261 0,355 VB19 8aaVB7 9aa 0,437 0,210 0,265 VB19 9aaVB7 10aa 1,206 0,747 0,644 VB19 10aa 1,806 3,458 2,404VB7 11aa 0,524 0,382 0,406 VB19 11aaVB7 12aa 0,282 0,302 0,239 VB19 12aa 0,505 0,847 0,583VB7 13aa 0,540 0,046 VB19 13aa 0,051VB7 Total 3,149 1,901 1,955 VB19 Total 2,363 4,304 2,988VB8 6aa 0,057 0,395 0,297 VB20 6aaVB8 7aa 0,127 0,207 0,293 VB20 7aaVB8 8aa 0,413 0,410 0,517 VB20 8aaVB8 9aa 0,649 0,806 0,993 VB20 9aaVB8 10aa 0,372 0,455 0,514 VB20 10aaVB8 11aa 0,067 0,104 0,160 VB20 11aaVB8 12aa 0,145 0,035 0,046 VB20 12aaVB8 13aa 0,440 0,023 VB20 13aaVB8 14aa 0,020 VB20 14aaVB8 Total 2,273 2,413 2,863 VB20 Total 0,000 0,000 0,000VB9 5aa 0,089 0,131 0,124 VB21 5aaVB9 6aa 0,193 0,059 0,090 VB21 6aa 0,118 0,118VB9 7aa 0,199 0,529 0,496 VB21 7aa 0,114 1,068 0,593VB9 8aa 0,813 0,195 0,398 VB21 8aa 0,196 1,429 1,245VB9 9aa 0,791 0,432 0,754 VB21 9aa 0,268 1,044 1,137VB9 10aa 1,838 1,442 1,372 VB21 10aa 0,473 1,037 1,273VB9 11aa 1,340 0,506 0,599 VB21 11aa 3,601 1,837 1,390VB9 12aa 0,142 0,691 0,376 VB21 12aa 0,064 0,638 0,361

Apêndice T 269VB9 13aa 0,262 0,054 0,150 VB21 13aa 0,118 0,144VB9 14aa 0,056 0,302 0,179 VB21 14aa 0,027VB9 15aa 0,075 VB21 15aa 0,081 0,040VB9 16aa 0,073 VB21 16aaVB9 Total 5,871 4,340 4,537 VB21 Total 4,717 7,370 6,329VB10 5aa VB22 5aa 0,132 0,095 0,079VB10 6aa 1,438 0,111 0,049 VB22 6aa 0,185 0,062 0,099VB10 7aa 0,133 0,067 0,044 VB22 7aa 2,202 4,202 2,471VB10 8aa 0,231 0,032 0,060 VB22 8aa 0,252 0,668 0,826VB10 9aa 0,640 0,636 0,362 VB22 9aa 0,356 0,964 1,007VB10 10aa 0,071 0,035 0,349 VB22 10aa 1,579 2,290 1,839VB10 11aa 0,947 0,881 0,871 VB22 11aa 1,432 2,646 1,772VB10 12aa 0,101 0,038 0,350 VB22 12aa 0,103 0,115VB10 13aa 0,804 0,068 0,065 VB22 13aa 0,026 0,036VB10 14aa 0,056 VB22 14aa 0,034VB10 15aa 0,171 0,037 VB22 15aaVB10 16aa 0,095 VB22 16aaVB10 Total 4,365 2,039 2,339 VB22 Total 6,139 11,056 8,278VB11 6aa 0,132 0,062 VB23 6aa 0,041VB11 7aa 0,069 0,348 0,287 VB23 7aa 0,320 0,619 0,381VB11 8aa 0,345 0,149 0,111 VB23 8aa 2,846 0,959 0,848VB11 9aa 0,453 0,535 0,636 VB23 9aa 0,841 2,167 1,763VB11 10aa 0,187 0,252 0,448 VB23 10aa 0,807 3,380 1,844VB11 11aa 0,394 0,125 0,252 VB23 11aa 0,623 1,262 0,974VB11 12aa 0,122 0,079 0,098 VB23 12aa 0,038 0,196 0,133VB11 13aa 0,053 0,053 0,087 VB23 13aa 0,052 0,050 0,033VB11 14aa 0,095 VB23 14aa 0,018VB11 15aa 0,071 VB23 15aaVB11 Total 1,717 1,741 1,982 VB23 Total 5,527 8,634 6,035VB12 6aa 0,034 VB24 6aaVB12 7aa 0,812 0,150 0,264 VB24 7aaVB12 8aa 0,496 0,787 0,551 VB24 8aa 0,002 0,005 0,003VB12 9aa 0,655 0,647 0,612 VB24 9aa 0,008 0,022 0,009VB12 10aa 0,527 0,668 0,574 VB24 10aa 0,007 0,023 0,009VB12 11aa 0,114 0,247 0,190 VB24 11aa 0,002 0,008 0,006VB12 12aa 0,280 0,216 0,093 VB24 12aa 0,056 0,012VB12 13aa 0,159 0,105 VB24 13aaVB12 14aa 0,075 0,040 VB24 14aaVB12 Total 3,043 2,896 2,359 VB24 Total 0,020 0,115 0,039

Apêndice U 270Apêndice U - Repertório da cadeia Vβ do TCR de linfócitos T do sangue periférico dopaciente com esclerose múltipla OLP (EM10), pré- e pós-TACTH.Pré-Tx D+270 Pré-Tx D+270VB1VB13VB2VB14VB3VB15VB4VB16VB5VB17VB6VB18VB7VB19VB8VB20VB9VB21VB10VB22VB11VB23VB12VB24-Figura U.1. Repertório da cadeia Vβ do TCR no paciente com esclerose múltipla OLP (EM10), pré e pós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usando

Apêndice U 271primers específicos para as famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBVCDR3 spectratyping. Cada gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número de transcritos paraa família Vβ, em unidades arbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases (eixo X). Ospicos destacados em azul em cada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos.Tabela U.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do TCR efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente comesclerose múltipla OLP (EM10), pré- e pós-TACTH.FamíliaVBPré-TxD+270FamíliaVBPré-TxD+270VB1 6aa VB13 6aa 0,484 0,705VB1 7aa 0,085 VB13 7aa 0,240 0,198VB1 8aa 0,709 1,446 VB13 8aa 0,698 0,607VB1 9aa 1,875 0,516 VB13 9aa 1,733 1,007VB1 10aa 0,781 0,049 VB13 10aa 2,319 3,514VB1 11aa 0,721 0,086 VB13 11aa 0,633 0,277VB1 12aa 0,164 0,269 VB13 12aa 0,243 0,048VB1 13aa 0,043 VB13 13aa 0,073VB1 14aa 0,074 VB13 14aa 0,081VB1 15aa VB13 15aa 0,035VB1 Total 4,453 2,366 VB13 Total 6,540 6,355VB2 4aa 0,071 1,678 VB14 4aaVB2 5aa 0,026 VB14 5aaVB2 6aa 0,183 0,348 VB14 6aaVB2 7aa 1,761 0,281 VB14 7aa 0,426VB2 8aa 0,914 1,027 VB14 8aa 1,100 0,353VB2 9aa 2,027 1,660 VB14 9aa 0,681 1,677VB2 10aa 0,965 1,279 VB14 10aa 0,705 0,260VB2 11aa 0,512 0,392 VB14 11aa 0,278 0,117VB2 12aa 0,124 0,095 VB14 12aa 0,040 0,069VB2 13aa 0,140 0,064 VB14 13aa 0,034VB2 14aa 0,077 0,045 VB14 14aaVB2 15aa 0,033 VB14 15aaVB2 Total 6,833 6,871 VB14 Total 2,805 2,934VB3 6aa 0,044 VB15 6aa 0,047 0,064VB3 7aa 1,258 0,104 VB15 7aa 0,129 0,281VB3 8aa 0,713 0,155 VB15 8aa 1,491 0,171VB3 9aa 0,260 0,529 VB15 9aa 1,145 1,948VB3 10aa 5,692 4,246 VB15 10aa 0,272 1,675VB3 11aa 0,066 VB15 11aa 0,840 1,002VB3 12aa VB15 12aa 0,485 1,155VB3 13aa VB15 13aa 0,055 0,041VB3 14aa VB15 14aa 0,078VB3 Total 7,966 5,101 VB15 Total 4,542 6,337VB4 4aa 0,048 VB16 4aaVB4 5aa 0,210 VB16 5aaVB4 6aa 0,263 0,061 VB16 6aa 0,078VB4 7aa 1,292 0,981 VB16 7aa 0,300 0,524VB4 8aa 1,387 0,519 VB16 8aa 0,279 0,535VB4 9aa 1,042 0,635 VB16 9aa 0,594 1,625

Apêndice U 272VB4 10aa 0,310 0,213 VB16 10aa 0,922 0,827VB4 11aa 0,081 0,199 VB16 11aa 0,667 1,173VB4 12aa 0,032 VB16 12aa 0,334 0,403VB4 13aa VB16 13aa 0,066 0,128VB4 14aa VB16 14aa 0,083 0,096VB4 15aa VB16 15aa 0,051VB4 16aa VB16 16aa 0,064VB4 Total 4,665 2,608 VB16 Total 3,322 5,425VB5 5aa 0,039 VB17 5aaVB5 6aa 0,132 0,075 VB17 6aa 0,365 2,808VB5 7aa 0,386 2,709 VB17 7aa 1,914 0,475VB5 8aa 1,930 0,360 VB17 8aa 0,219 0,672VB5 9aa 2,172 0,819 VB17 9aa 0,586 0,882VB5 10aa 2,535 1,981 VB17 10aa 1,038 0,903VB5 11aa 2,058 0,403 VB17 11aa 0,146 0,084VB5 12aa 0,324 0,244 VB17 12aa 0,071 0,136VB5 13aa 0,125 0,033 VB17 13aa 2,208 0,268VB5 14aa 0,100 0,048 VB17 14aaVB5 15aa 0,040 VB17 15aaVB5 Total 9,840 6,672 VB17 Total 6,546 6,229VB6 6aaVB18 6aaVB6 7aa 0,130 0,112 VB18 7aa 0,055VB6 8aa 0,920 0,513 VB18 8aa 0,239 0,440VB6 9aa 2,243 0,902 VB18 9aa 0,419 0,536VB6 10aa 5,106 2,404 VB18 10aa 0,645 0,546VB6 11aa 1,116 0,421 VB18 11aa 0,340 1,385VB6 12aa 0,242 0,067 VB18 12aa 0,181VB6 13aa 0,084 VB18 13aa 0,205 0,071VB6 14aa 0,050 0,121 VB18 14aaVB6 15aa 0,224 0,053 VB18 15aaVB6 Total 10,114 4,593 VB18 Total 2,084 2,978VB7 5aa VB19 5aa 0,053VB7 6aa 0,056 VB19 6aa 0,133 0,067VB7 7aa 0,032 VB19 7aa 0,059 0,015VB7 8aa 0,199 VB19 8aa 0,124 0,060VB7 9aa 0,760 0,255 VB19 9aa 0,146 0,387VB7 10aa 1,034 1,083 VB19 10aa 0,328 0,105VB7 11aa 0,680 0,383 VB19 11aa 0,154 0,282VB7 12aa 0,341 1,032 VB19 12aa 0,092 0,177VB7 13aa 0,057 VB19 13aa 0,062 0,020VB7 14aa 0,094 VB19 14aa 0,076 0,075VB7 15aa VB19 15aa 0,095VB7 Total 3,253 2,753 VB19 Total 1,174 1,336VB8 6aa 0,063 VB20 6aa 1,183 1,261VB8 7aa 1,963 0,288 VB20 7aa 0,038 1,717VB8 8aa 0,273 VB20 8aa 0,257VB8 9aa 0,151 0,688 VB20 9aa 0,100VB8 10aa 0,596 1,725 VB20 10aa 0,149VB8 11aa 0,026 0,049 VB20 11aa 0,030VB8 12aaVB20 12aaVB8 13aa 0,034 0,046 VB20 13aa

Apêndice U 273VB8 14aa VB20 14aa 0,079VB8 Total 2,771 3,131 VB20 Total 1,837 2,977VB9 6aa VB21 6aa 0,201VB9 7aa 0,139 VB21 7aa 0,123 0,068VB9 8aa 0,036 0,265 VB21 8aa 0,293 0,194VB9 9aa 1,215 2,013 VB21 9aa 0,600 0,563VB9 10aa 0,145 0,631 VB21 10aa 1,093 0,476VB9 11aa 0,144 0,329 VB21 11aa 0,356 0,440VB9 12aa 0,108 0,402 VB21 12aa 0,285 0,220VB9 13aa 0,190 0,479 VB21 13aa 1,487 2,602VB9 14aaVB21 14aaVB9 15aa VB21 15aa 0,498VB9 Total 1,837 4,257 VB21 Total 4,437 5,061VB10 5aa 0,058 VB22 5aa 0,057VB10 6aa 0,030 VB22 6aa 0,124 0,096VB10 7aa 0,409 0,177 VB22 7aa 0,195 0,111VB10 8aa 0,635 VB22 8aa 0,297 0,831VB10 9aa 0,480 0,129 VB22 9aa 0,556 0,774VB10 10aa 0,500 0,586 VB22 10aa 1,755 1,507VB10 11aa 0,031 0,209 VB22 11aa 0,600 0,696VB10 12aa 0,231 0,600 VB22 12aa 0,177 0,064VB10 13aa 0,081 VB22 13aa 0,262 3,529VB10 14aa 0,049 0,284 VB22 14aaVB10 15aa 0,036 0,234 VB22 15aaVB10 16aa 0,034 VB22 16aaVB10 Total 1,824 2,971 VB22 Total 4,023 7,608VB11 6aa 0,061 VB23 6aa 0,094VB11 7aa VB23 7aa 0,093 0,119VB11 8aa 0,758 VB23 8aa 0,558 1,012VB11 9aa 0,729 0,203 VB23 9aa 1,297 1,452VB11 10aa 0,536 0,076 VB23 10aa 0,998 0,114VB11 11aa 0,094 VB23 11aa 0,579 0,066VB11 12aa VB23 12aa 0,052 0,542VB11 13aa 0,130 VB23 13aa 0,167VB11 14aaVB23 14aaVB11 15aa 0,187 VB23 15aaVB11 Total 1,513 1,260 VB23 Total 3,837 3,304VB12 6aa 0,098 0,034 VB24 6aaVB12 7aa 0,541 1,826 VB24 7aaVB12 8aa 0,279 1,257 VB24 8aaVB12 9aa 2,233 1,518 VB24 9aaVB12 10aa 0,471 1,891 VB24 10aa 0,010VB12 11aa 0,044 0,080 VB24 11aa 0,006VB12 12aa 0,038 0,265 VB24 12aaVB12 13aa 0,064 VB24 13aaVB12 Total 3,769 6,872 VB24 Total 0,016 0,000

Apêndice V 274Apêndice V - Repertório da cadeia Vβ do TCR de linfócitos T do sangue periférico dosindivíduos-controle saudáveis DN12 e DN20.DN12 DN20 DN12 DN20VB1VB13VB2VB14VB3VB15VB4VB16VB5VB17VB6VB18VB7VB19VB8VB20VB9VB21VB10VB22VB11VB23VB12VB24Figura V.1. Repertório da cadeia Vβ do TCR nos indivíduos-controle saudáveis DN12 e DN20. O RNA totalfoi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usando primers específicos paraas famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBV CDR3 spectratyping. Cada

Apêndice V 275gráfico representa a intensidade de fluorescência, que é proporcional ao número de transcritos para a família Vβ, em unidadesarbitrárias (eixo Y), em função do comprimento da região CDR3, em pares de bases (eixo X). Os picos destacados em azul emcada gráfico correspondem ao tamanho de CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos.Tabela V.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do TCR efreqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico dos indivíduos-controlesaudáveis DN12 e DN20.FamíliaVBDN12DN20FamíliaVBDN12DN20VB1 6aa 0,047 VB13 6aa 0,175 0,077VB1 7aa 0,090 0,040 VB13 7aa 0,434 0,211VB1 8aa 0,327 0,188 VB13 8aa 0,947 0,770VB1 9aa 0,612 0,407 VB13 9aa 1,560 1,794VB1 10aa 0,580 0,416 VB13 10aa 2,002 1,216VB1 11aa 0,316 0,220 VB13 11aa 0,408 0,936VB1 12aa 0,127 0,078 VB13 12aa 0,197 0,066VB1 13aa 0,035 0,428 VB13 13aa 0,076VB1 Total 2,133 1,777 VB13 Total 5,798 5,071VB2 6aa 0,135 0,205 VB14 6aa 0,071 0,049VB2 7aa 0,447 0,482 VB14 7aa 0,114 0,246VB2 8aa 0,783 0,901 VB14 8aa 0,348 0,477VB2 9aa 1,093 1,740 VB14 9aa 0,913 0,639VB2 10aa 0,921 0,816 VB14 10aa 0,522 1,023VB2 11aa 0,283 0,411 VB14 11aa 0,418 0,293VB2 12aa 0,148 0,156 VB14 12aa 0,113 0,142VB2 13aa 0,070 VB14 13aa 0,060VB2 14aa 0,053 VB14 14aa 0,037VB2 15aa 0,019 VB14 15aa 0,036VB2 Total 3,810 4,854 VB14 Total 2,498 3,003VB3 6aa 0,126 0,115 VB15 6aa 0,068 0,071VB3 7aa 0,318 0,368 VB15 7aa 0,140 0,121VB3 8aa 0,535 0,549 VB15 8aa 1,508 0,615VB3 9aa 3,848 0,992 VB15 9aa 0,935 0,564VB3 10aa 0,537 1,227 VB15 10aa 1,102 1,340VB3 11aa 0,358 0,452 VB15 11aa 0,473 0,503VB3 12aa 0,129 0,159 VB15 12aa 0,135 1,403VB3 13aa 0,042 VB15 13aa 0,042VB3 14aa 0,034 VB15 14aaVB3 Total 5,851 3,938 VB15 Total 4,362 4,659VB4 5aa 0,057 VB16 5aaVB4 6aa 0,087 0,177 VB16 6aa 0,098 0,155VB4 7aa 0,250 0,449 VB16 7aa 0,344 0,389VB4 8aa 0,476 0,629 VB16 8aa 1,447 1,373VB4 9aa 0,382 0,425 VB16 9aa 1,622 1,412VB4 10aa 0,101 0,241 VB16 10aa 1,718 1,412VB4 11aa 0,059 0,141 VB16 11aa 1,723 1,143VB4 12aa 0,040 VB16 12aa 0,362 0,420VB4 13aa VB16 13aa 0,448 0,169VB4 14aa VB16 14aa 0,115 0,112

Apêndice V 276VB4 15aa VB16 15aa 0,037VB4 Total 1,354 2,158 VB16 Total 7,876 6,623VB5 6aa 0,099 0,173 VB17 6aa 0,223 0,170VB5 7aa 0,161 0,254 VB17 7aa 0,291 0,278VB5 8aa 0,951 1,439 VB17 8aa 1,079 0,864VB5 9aa 1,358 1,917 VB17 9aa 1,560 1,572VB5 10aa 1,742 0,987 VB17 10aa 1,642 1,662VB5 11aa 0,824 2,067 VB17 11aa 0,548 0,578VB5 12aa 0,248 0,137 VB17 12aa 0,279 0,156VB5 13aa 0,113 0,080 VB17 13aa 0,053 0,072VB5 14aa 0,044 0,034 VB17 14aa 0,074 0,051VB5 15aa VB17 15aa 0,054 0,071VB5 16aa VB17 16aa 0,085 0,064VB5 Total 5,539 7,088 VB17 Total 5,887 5,538VB6 6aa 0,194 0,145 VB18 6aa 0,044 0,044VB6 7aa 0,442 0,392 VB18 7aa 0,098 0,222VB6 8aa 1,798 1,434 VB18 8aa 0,499 1,007VB6 9aa 2,154 1,891 VB18 9aa 0,626 1,247VB6 10aa 2,003 3,624 VB18 10aa 0,749 2,055VB6 11aa 0,878 0,894 VB18 11aa 0,331 0,626VB6 12aa 0,481 0,420 VB18 12aa 0,168 0,257VB6 13aa 0,343 0,157 VB18 13aa 0,041 0,131VB6 14aa 0,133 VB18 14aa 0,048VB6 Total 8,293 9,090 VB18 Total 2,557 5,636VB7 7aa 0,073 VB19 7aaVB7 8aa 0,371 0,486 VB19 8aa 0,016VB7 9aa 0,516 0,545 VB19 9aa 0,011VB7 10aa 0,814 1,017 VB19 10aa 0,027 0,048VB7 11aa 0,554 1,001 VB19 11aa 0,005 0,021VB7 12aa 0,187 0,373 VB19 12aa 0,003 0,017VB7 13aa 0,118 0,142 VB19 13aa 0,004VB7 14aa 0,057 VB19 14aa 0,006VB7 Total 2,561 3,693 VB19 Total 0,036 0,123VB8 6aa 0,125 0,171 VB20 6aa 0,344VB8 7aa 0,172 0,271 VB20 7aa 0,494VB8 8aa 1,170 0,687 VB20 8aa 1,734VB8 9aa 0,741 1,065 VB20 9aa 1,050 0,015VB8 10aa 0,625 0,725 VB20 10aa 0,935VB8 11aa 0,209 0,521 VB20 11aa 0,539 0,008VB8 12aa 0,092 0,082 VB20 12aa 0,081VB8 13aa 0,049 VB20 13aa 0,008VB8 Total 3,133 3,572 VB20 Total 5,178 0,031VB9 6aa 0,048 1,124 VB21 6aa 0,120 0,068VB9 7aa 0,179 0,462 VB21 7aa 0,270 0,384VB9 8aa 0,798 0,731 VB21 8aa 0,849 0,843VB9 9aa 1,280 0,966 VB21 9aa 1,167 1,151VB9 10aa 0,974 1,205 VB21 10aa 1,644 1,920VB9 11aa 0,327 0,714 VB21 11aa 0,510 0,827VB9 12aa 0,162 0,278 VB21 12aa 0,388 0,249

Apêndice V 277VB9 13aa 0,110 VB21 13aa 0,130 0,144VB9 14aa 0,124 VB21 14aa 0,099 0,043VB9 Total 3,768 5,715 VB21 Total 5,180 5,630VB10 5aa VB22 5aa 0,135 0,042VB10 6aa 0,089 VB22 6aa 0,371 0,271VB10 7aa 0,076 0,227 VB22 7aa 1,003 0,578VB10 8aa 0,162 0,221 VB22 8aa 3,014 1,157VB10 9aa 0,335 0,732 VB22 9aa 2,488 1,679VB10 10aa 0,310 0,543 VB22 10aa 2,102 1,831VB10 11aa 0,286 0,420 VB22 11aa 0,469 0,475VB10 12aa 0,040 0,353 VB22 12aa 0,271 0,238VB10 13aa 0,423 0,124 VB22 13aa 0,184 0,056VB10 14aa 0,102 VB22 14aa 0,054VB10 15aa 0,371 0,080 VB22 15aaVB10 16aa 0,071 VB22 16aaVB10 Total 2,003 2,961 VB22 Total 10,038 6,380VB11 6aa 0,064 0,080 VB23 6aa 0,214 0,045VB11 7aa 0,217 0,136 VB23 7aa 0,378 0,154VB11 8aa 0,439 0,165 VB23 8aa 1,028 1,339VB11 9aa 0,958 1,496 VB23 9aa 1,279 1,815VB11 10aa 0,590 0,279 VB23 10aa 1,705 1,653VB11 11aa 0,402 0,267 VB23 11aa 1,097 1,712VB11 12aa 0,088 0,156 VB23 12aa 0,459 0,356VB11 13aa 0,066 VB23 13aa 0,086 0,487VB11 14aa VB23 14aa 0,089VB11 15aa VB23 15aa 0,073VB11 Total 2,759 2,645 VB23 Total 6,334 7,634VB12 6aa 0,127 VB24 6aaVB12 7aa 0,152 0,214 VB24 7aa 0,003 0,002VB12 8aa 0,621 0,299 VB24 8aa 0,011 0,005VB12 9aa 0,904 0,479 VB24 9aa 0,009 0,006VB12 10aa 0,577 0,295 VB24 10aa 0,017 0,018VB12 11aa 0,408 0,829 VB24 11aa 0,007 0,034VB12 12aa 0,112 VB24 12aa 0,002 0,002VB12 13aa 0,075 VB24 13aaVB12 14aa 0,030 VB24 14aaVB12 Total 3,005 2,117 VB24 Total 0,048 0,066

Apêndice W 278Apêndice W - Freqüência das 24 famílias Vβ do receptor de células T nos pacientes com diabete melito do tipo 1, pré- e pós-TACTH.Freqüência (%)15141312111098765432101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Família VBPre-TxD+100D+180D+270D+360Figura W.1. Freqüência das famílias Vβ do TCR em linfócitos T do sangue periférico do paciente com diabete melito do tipo 1 ALSR (DM2), pré- e pós-TACTH. O RNA total foiextraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usando primers específicos cada uma das 24 famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cadapaciente foi analisado pelo método de TCRBV CDR3 spectratyping.

Apêndice W 279AFreqüência (%)15141312111098765432101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Família VBPre-TxD+180D+360BFreqüência (%)1514131211109876543210Pre-TxD+180D+3601 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Família VBFigura W.2. Freqüência das famílias Vβ do TCR em linfócitos T do sangue periférico do paciente com diabete melito do tipo 1 LSM (DM1) (A) e WLS(DM3) (B) pré- e pós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usando primersespecíficos cada uma das 24 famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBV CDR3 spectratyping.

Apêndice W 280AFreqüência (%)15141312111098765432101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Família VBPre-TxD+180D+360BFreqüência (%)15141312111098765432101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Família VBPre-TxD+180Figura W.3. Freqüência das famílias Vβ do TCR em linfócitos T do sangue periférico do paciente com diabete melito do tipo 1 MGB (DM4) (A) eRLFS (DM5) (B) pré- e pós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usandoprimers específicos cada uma das 24 famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBV CDR3 spectratyping.

Apêndice X 281Apêndice X - Freqüência das 24 famílias Vβ do receptor de células T nos pacientes com esclerose múltipla, pré- e pós-TACTH.AFreqüência (%)15141312111098765432101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Família VBD+480D+720D+1020BFreqüência (%)15141312111098765432101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Família VBPre-TxD+360D+720Figura X.1. Freqüência das famílias Vβ do TCR em linfócitos T do sangue periférico do paciente com esclerose múltipla GG (DM1) (A) e SSS (EM3) (B) pré- epós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usando primers específicos cada uma das 24famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBV CDR3 spectratyping.

Apêndice X 282AFreqüência (%)15141312111098765432101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Família VBPre-TxD+360D+720BFreqüência (%)15141312111098765432101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Família VBPre-TxD+360Figura X.2. Freqüência das famílias Vβ do TCR em linfócitos T do sangue periférico do paciente com esclerose múltipla DFG (EM4) (A) e ARJTA(EM5) (B) pré- e pós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usando primersespecíficos cada uma das 24 famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBV CDR3 spectratyping.

Apêndice X 283AFreqüência (%)15141312111098765432101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Família VBPre-TxD+180D+360BFreqüência (%)15141312111098765432101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Família VBPre-TxD+180Figura X.3. Freqüência das famílias Vβ do TCR em linfócitos T do sangue periférico do paciente com esclerose múltipla SHGE (EM6) (A) e MFM(EM8) (B) pré- e pós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usando primersespecíficos cada uma das 24 famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBV CDR3 spectratyping.

Apêndice X 284AFreqüência (%)15141312111098765432101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Família VBPre-TxD+180D+360BFreqüência (%)15141312111098765432101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Família VBPre-TxD+270Figura X.4. Freqüência das famílias Vβ do TCR em linfócitos T do sangue periférico do paciente com esclerose múltipla WRS (EM9) (A) e OLP(EM10) (B) pré- e pós-TACTH. O RNA total foi extraído das células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usando primersespecíficos cada uma das 24 famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR de cada paciente foi analisado pelo método de TCRBV CDR3 spectratyping.

Apêndice Y 285Apêndice Y - Freqüência das 24 famílias Vβ do receptor de células T nos indivíduos controle-saudáveis DN12 e DN20.Freqüência (%)1514131211109876543210DN12DN201 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Família VBFigura Y.1. Freqüência das famílias Vβ do TCR em linfócitos T do sangue periférico dos indivíduos-controle saudáveis DN12 e DN20. O RNA total foi extraídodas células mononucleares do sangue periférico, transcrito em cDNA, amplificado usando primers específicos cada uma das 24 famílias Vβ, e o repertório Vβ do TCR decada paciente foi analisado pelo método de TCRBV CDR3 spectratyping.

Anexo A 286Anexo A - EDSS (Expanded Disability Status Score) (Kurtzke, 1983)ValorEDSSSintomas0 Normal1 Sem incapacidade, mas com alterações neurológicas em 1 sistema1,5 Sem incapacidade, mas com alterações neurológicas em 2 sistemas2 Incapacidade motora discreta2,5 Incapacidade discreta3 Incapacidade moderada3,5 Deambulação plena com incapacidade moderada4 Deambulação plena de até 500m4,5 Deambulação plena até 300m, com alguma limitação e mínima assistência5 Deambulação plena até 200m, com alguma limitação e moderada assistência5,5 Deambulação plena até 100m, com limitações importantes6 Assistência constante, intermitente ou com auxílio de bengala, muleta ou suporte6,5 Não anda, restrito a cadeira de rodas, transferência para cama e outros sem auxílio7 Não anda, restrito a cadeira de rodas, transferência para cama e outros com auxílio7,5 Restrito ao leito; às vezes consegue transferir-se sem auxílio para a cadeira de rodas8 Restrito ao leito8,5 Restrito ao leito, necessita de ajuda; comunica-se e alimenta-se sozinho9 Estrito ao leito, necessita de ajuda; não consegue se alimentar ou comunicar10 Morte devida à esclerose múltipla

LISTA DE PUBLICAÇÕESVoltarelli JC, Couri CEB, Oliveira MCB, Stracieri ABPL, Moraes DA, Coutinho MA, Malmegrim KCR,Foss-Freitas MC, Simões BP, Foss MC, Burt RK. Autologous hematopoietic stem cell transplantationfor type 1 diabetes mellitus. Bone Marrow Transplant. 2006, 37(S1):26.Voltarelli JC, Stracieri ABPL, Oliveira MCB, Godoi DF, Moraes DA, Pieroni F, Malmegrim KCR,Coutinho MA, Simões BP, Massumoto C, Hamerschlak N, Scheinberg M, Ferreira E, Coutinho M,Ostronoff M, Sturaro D, Dulley F. Transplante de células tronco hematopoéticas em doençasreumáticas - parte 2: experiência brasileira perspectivas futuras. Revista Brasileira de Reumatologia2005, 45: 301-312.Voltarelli JC, Stracieri ABPL, Oliveira MCB, Godoi DF, Moraes DA, Malmegrim KCR, Coutinho MA,Simões BP. Transplante de células tronco hematopoéticas em doenças reumáticas: experiênciainternacional. Revista Brasileira de Reumatologia 2005, 45: 229-241, 2005.Voltarelli JC, Oliveira MCB, Stracieri ABPL, Godoi DF, Moraes DA, Coutinho MA, Malmegrim KCR,Santos AC. Haematopoeitic stem cell transplantation for refractory Takayasu´s arteritis. Rheumatology2004, 43:1308-1309.Voltarelli JC, Couri CEB, Oliveira MCB, Stracieri ABPL, Moraes DA, Godoi DF, Coutinho MA,Malmegrim KCR, Foss-Freitas MC, Foss MC, Simões BP, Squiers EC, Burt RK.. Autologoushematopoeitic stem cell transplantation for type 1 diabetes mellitus. Blood 2004, 104:5224.Malmegrim de Farias KCR, Saelens X, Pruijn GJM, Vandenabeele P, van Venrooij WJ. Caspasemediatedcleavage of the UsnRNP associated Sm-F protein during apoptosis. Cell Death andDifferentiation 2003, 10: 570-579.Zampieri S, Mahler M, Blüthner M, Qiu Z, Malmegrim KCR, Ghirardello A, Doria A, van Venrooij WJ,Raats JMH. Recombinant anti-P protein autoantibodies isolated from a human autoimmune library:reactivity, specificity and epitope recognition. Cell and Molecular Life Sciences 2003, 60: 588-598.Malmegrim KCR, Pruijn GJM, van Venrooij WJ. The fate of U1 snRNP autoantigen during apoptosis:implications for systemic autoimmunity. IMAJ 2002, 4:706-716.Malmegrim KCR, Beishuizen A, Van der Sluijs Veer G, Vermes I. Time-resolved fluorometricimmunoassay of macrophage migration inhibitory factor: technical and clinical aspects. Journal ofClinical Ligand Assay 2000, 23:74-80.Medeiros BMM, Malmegrim KCR, Queiroz CA, Cangiani EE. Humoral immune response in Yersiniaenterocolitica O:3-infected Balb/c mice. Revista de Ciências Farmacêuticas 2000, 21:45-55.