DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA PARA QUANTIFICAÇÃO DE QUININA EM EXTRATO DE QUINA VERMELHA (Cinchona officinalis L.) PELO MÉTODO DE CLAE

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA PARA
QUANTIFICAÇÃO DE QUININA EM EXTRATO DE QUINA VERMELHA
(Cinchona officinalis L.) PELO MÉTODO DE CLAE
RESUMO
Giovanni Fernando France dos Santos, Thiago Henrique Döring¹,
Vanderlei Wessler 1 , Monique Carniel Beltrami 1 .
As quinas são conhecidas há séculos por diversos povos pelo seu uso medicinal.
Entretanto, sua ingestão em doses excessivas pode causar o cinchonismo, que é a intoxicação
devido a presença de quinina na planta. O presente estudo objetiva validar um método de
quantificação da quinina em extratos hidroalcoólicos de Quina vermelha (Cinchona
officinalis), levando-se em consideração os parâmetros de validação da resolução nº 899 da
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), utilizando-se para a separação
cromatográfica uma coluna Superspher®, RP-18, (4,6 x 150 mm, 5 mm; Agilent TM ); fase
móvel gradiente composta por tampão fosfato monopotássico 0,05M em água pH = 3,0 e
Acetonitrila com fluxo de 1 mL/min e detector DAD (arranjo de fotodiodos) ajustado em
comprimento de onda ʎ = 254 nm (split bandwidth = 4 nm; DAD off = 32 minutos). O volume
de injeção foi de 5 µL.
PALAVRAS-CHAVE: Quinina, Extrato, Quantificação, Quina vermelha, Cromatografia
líquida de alta eficiência.
ABSTRACT
Cinchonas are known for centuries by many people for its medicinal use. However,
their intake in excessive doses can cause cinchonism, which is an intoxication due to the
presence of quinine in the plant. This study aims to validate a quinine quantification method in
quinine bark (Cinchona officinalis) hydroalcoholic extracts, taking into account the Resolution
No. 899 validation parameters by National Health Surveillance Agency (ANVISA), using for
the chromatographic separation a Superspher® RP-18 column (4.6 x 150 mm, 5 mm;
Agilent TM ); gradient mobile phase composed of 0.05M potassium dihydrogen phosphate buffer
at pH = 3.0 in water and acetonitrile with a flow of 1 mL/min with DAD (diode array detector),
set wavelength ʎ = 254 nm (split bandwidth = 4 nm; DAD off = 32 minutes). The injection
volume was 5 uL.
KEYWORDS: Quinine, Extract, Quantification, Quinine bark, High performance liquid
chromatography.

1. INTRODUÇÃO
Tradicionalmente utilizadas nos Andes para o tratamento de febres, cascas de algumas
espécies de plantas chamadas popularmente por Quina são conhecidas há séculos por
possuírem propriedades terapêuticas. Quando introduzidas na Europa por missionários, em
meados do século 17, foram vastamente utilizadas como tratamento antimalárico. As Quinas
são compostas por diferentes espécies de plantas, sendo os principais gêneros Cinchona ou
Remijia (3, 9, 23, 25, 26).
Muitos compostos já foram identificados nos cascos das Quinas mais estudadas, como
compostos fenólicos, ácidos orgânicos e saponosídeos. Entre estes, destaca-se o grupo dos
compostos alcaloides quinolínicos, principalmente quinina, quinidina, cinchonina e
cinchonidina (12, 14,).
As cascas secas da árvore Cinchona contêm aproximadamente de 4 a 12% de alcaloides,
principalmente diastereoisômeros quinina/quinidina e cinchonina/cinchonidina. A Quinina é o
composto majoritário e equivale a aproximadamente 80% do total de alcaloides presentes nas
cascas. É um potente veneno protoplasmático que atua praticamente em qualquer célula.
Entretanto, é utilizada na medicina como antimalárico e também para o alívio de câimbras
musculares noturnas. Pode ser encontrada em alguns refrigerantes, como por exemplo, água
tônica, que pode conter mais de 80 µg/mL, o que é responsável pelo sabor amargo (6, 11, 17,
20).
A maior parte da quinidina absorvida é metabolizada pelo fígado, no entanto, 13% a
27% é excretado na forma intacta pelos rins. Muitos metabólitos da quinidina já foram
identificados, tais como 3-hidroxiquinidina, 2-oxoquinidinona, quinidina-N-oxido, quinidina-
10,11-dihidrodiol e O-desmetilquinidina, que quando estudados isoladamente ou em
combinação com a quinidina apresentaram atividade antiarrítmica (15, 16, 18).
Em termos toxicológicos, o consumo da quinina deve ser evitado por mulheres
grávidas, indivíduos com quadro de insuficiência hepática e, principalmente, crianças. Com o
consumo de quinina em doses excessivas, pode-se observar intoxicação e um quadro reversível
chamado cinchonismo (4, 24).
O cinchonismo é uma síndrome causada por envenenamento agudo e é comumente
observada após tentativas de abortos, suicídios ou envenenamento acidental em crianças. A
perda da visão é um dos mais importantes efeitos colaterais reportados na literatura, mas o local
onde ocorre o efeito tóxico na retina e a gestão para o seu tratamento continua sendo discutido
(1).
Tendo em vista todos os riscos e aspectos toxicológicos da quinina, o estudo tem como
objetivo o desenvolvimento e validação de uma metodologia para a quantificação de quinina
em extratos hidroalcoólicos de Quina vermelha (Cinchona officinalis).

2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Reagentes
Utilizou-se acetonitrilo com pureza superior a 99,98% (J.T.Baker®), água ultrapura
(sistema de purificação Synergy®), fosfato de potássio com pureza superior a 99,9% ( Merck®)
e ácido fosfórico, com teor superior a 85% (Quemis®). Como padrões de referência, foram
utilizadas quinina 98,6% (Sigma-aldrich®) e quinidina a 91,3% (Sigma-aldrich®).
2.2. Instrumentação
O sistema integrado de cromatografia líquida de alta eficiência Merck Hitachi
Chromaster® é composto por um detector DAD 5430 VWR®, um injetor automático VWR®
Hitachi 5210 Chromaster, um forno VWR® Hitachi 5310 Chromaster e uma bomba
quaternária VWR® Hitachi Chromaster 5110. As fases móveis foram desgaseificadas no
degasser Branson 3510 e o ajuste do pH foi efetuado com pHmetro Mettler Toledo MP 220
(7,8, 27).
2.3. Preparo das amostras
Para o preparo das amostras de extrato hidroalcoólico de Cinchona officinalis pesou-se
1 g do extrato em balão volumétrico de 5 mL e completou-se o volume com acetonitrilo,
obtendo-se uma solução de proporção 1:5, de extrato e acetonitrilo, respectivamente. Após a
amostra diluída, filtrou-se em filtro CHROMAFIL® Xtra, PET – 20/25 0,20 µm diretamente
dentro de um vial e, posteriormente, injetou-se no equipamento (17,21).
2.4. Preparo dos padrões
Para o preparo dos padrões, inicialmente pesou-se 10 mg do padrão de quinina em balão
volumétrico de 100 mL. Em seguida, adicionou-se aproximadamente 2 mL de acetonitrilo e
levou-se ao ultrassom por 10 minutos. Após dissolvido, completou-se o volume do balão com
acetonitrilo, obtendo uma solução estoque de 1mg/mL. A partir desta solução foi preparada
uma solução mãe de 100 µg/mL e, a partir dessa, foram feitas diluições nas concentrações de
5, 10, 20, 30 e 50 µg/mL para a construção da curva de calibração.
2.5. Condições cromatográficas
Utilizou-se uma Coluna Superspher®, RP-18, (4,6 x 150 mm, 5 mm; Agilent TM ); fase
móvel composta por tampão fosfato monopotássico 0,05M em água pH = 3,0 e acetonitrila
com fluxo de 1 mL/min com detector DAD (arranjo de fotodiodos) ajustado em comprimento
de onda ʎ = 254 nm (split bandwidth = 4 nm; DAD off = 32 minutos). O volume de injeção foi
de 5 µL (17, 7, 8).

Tempo (min) KH2PO4 0,05 M (pH=3,0) (%) ACN (%)
0 96 4
10 90 10
15 90 10
20 88 12
22 87 13
25 87 13
26 87 13
27 96 4
31 96 4
32 40 60
35 40 60
36 96 4
40 96 4
Tabela 1. Gradiente do método.
2.6. Parâmetros de validação
A validação seguiu os protocolos segundo a RE nº 899 para garantir que o método
atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados (2).
O método foi validado seguindo os parâmetros de especificidade/seletividade, linearidade e
faixa de aplicação, precisão, limite de detecção, limite de quantificação e exatidão adequados
à análise da quinina (19).
2.6.1. Especificidade/seletividade
A especificidade do método foi confirmada através da obtenção de resultados positivos
em amostras contendo o padrão quinina, comparadas a resultados negativos obtidos em
amostras que não contêm o padrão (branco). Também foi utilizado o teste de pureza de pico
com auxílio de detector de fotodiodos, com a finalidade de demonstrar que o pico
cromatográfico é atribuído somente à quinina (12, 13).
2.6.2. Linearidade e faixa de aplicação
Para verificar a linearidade foi construída a curva de calibração com o padrão do composto
quinina, obtidas a partir de uma solução mãe de 100 µg/mL (Tabela 2) (12,13).
Solução padrão Volume solução
mãe (mL)
Volume total (mL) Concentração de
quinina (µg/mL)
1 10 10 100
2 5 10 50
3 3 10 30
4 2 10 20
5 1 10 10
6 1 20 5
Tabela 2. Curva de calibração.

As injeções foram realizadas em triplicata e a construção da curva de calibração foi
realizada através do software EZChrom Elite® Versão 3,3,2.SP2 (Build 1037), através da
relação da média aritmética das áreas obtidas para cada ponto e suas respectivas concentrações.
2.6.3. Precisão
A precisão foi determinada através do método de repetibilidade. Foram realizadas três
determinações de 3 soluções contendo 5 µg/mL, 50 µg/mL e 100 µg/mL do padrão quinina,
contemplando, desta forma, três níveis de concentração, baixa, média e alta.
A precisão foi expressa como coeficiente de variação (CV%) ou desvio padrão relativo
(DPR), abrangendo valores menores que 5% (17).
2.6.4. Limite de detecção (LD) e quantificação (LQ)
Os limites de detecção e quantificação foram obtidos através do método da relação
sinal-ruído. Partiu-se de diluições sucessivas de soluções de concentração conhecidas contendo
100 μg/mL de quinina, obtendo-se soluções de baixa concentração, e estas foram injetadas até
que a relação sinal-ruído fosse de 3:1 para LD e 10:1 para LQ (5, 22).
2.6.5. Exatidão
Para a quinina utilizou-se soluções padrão com concentração de 5, 50 e 100 μg/mL. A
partir destas soluções, foi realizada a injeção e verificada a porcentagem de recuperação,
concentração prática em relação a concentração teórica (12, 13).
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1. Resolução Cromatográfica
O gradiente (tabela 1) foi ajustado conforme melhorias de tempo de corrida, resolução
e tempo de retenção do padrão, conforme se apresentam as figuras 1 e 2.
Figura 1.Cromatograma do extrato de Chinchona officinalis (1:5).

Figura 2.Cromatograma do padrão de quinina ( Concentração: 100 µg/mL).
3.2. Análise qualitativa
Com a metodologia adequada para a análise, foi injetada uma solução do padrão de
quinina 100 µg/mL, cujo perfil de absorção no ultra-violeta (UV) encontra-se apresentado na
figura 3. O lambda de absorção máxima encontrado para o composto com melhor resolução
cromatográfica foi de 254nm, e então o mesmo foi comparado ao extrato de Quina vermelha,
cujo tempo de retenção e perfil de absorção no ultravioleta permitiram a identificação da
quinina nos extratos hidroalcoólicos da planta (17, 21).
Figura 3. Perfil de absorção da quinina no UV.
Com os cromatogramas obtidos a partir do extrato de Cinchona officinalis, foi possível
a identificação da quinina nos extratos através do perfil de absorção no ultravioleta, com tempo
de retenção de 26,30 ± 0,5 minutos, sem eluição de outros compostos com mesmo RT. Para
verificar se não houve coeluição do isômero quinidina, foi injetado um padrão do mesmo, o
qual teve um tempo de retenção diferente da quinina, garantindo assim que o pico é somente
da quinina.

3.3. Validação analítica
A validação analítica para a quinina foi realizada conforme descrito no item 2.6 (21).
3.3.1. Especificidade/Seletividade
A especificidade foi confirmada através da comparação dos cromatogramas do padrão,
amostra e branco. Conforme observado na figura o método apresenta boa especificidade, visto
que não há eluição de outro composto junto com a quinina.
Figura 4. Comparação do cromatograma da amostra e do cromatograma do branco.
Utilizando-se o detector com arranjo de fotodiodos, foi possível observar a pureza do
pico do padrão de quinina, através da análise do perfil de absorção no UV.
3.3.2. Linearidade e faixa de aplicação
A linearidade do método foi verificada através da curva de calibração demostrada na
figura 5.
A curva de calibração foi obtida através da regressão linear, originando a equação da
reta, que pode ser representada por:
െ ݔ‏‎ǡ ൌ ݕ
A equação apresentou um bom coeficiente de determinação, r 2 = 0,999124, e coeficiente
de correlação, r= 0,999561, acima do valor mínimo determinado pela ANVISA que é r= 0,99
(2), portanto, pode-se dizer que o método apresenta boa linearidade e que os resultados para a
quantificação são diretamente proporcionais à concentração do analito dentro da faixa de
aplicação, de 5 a 100 µg/mL (10).

Figura 5. Curva de calibração da quinina.
3.3.3. Precisão
Para precisão, foi realizada a análise de três soluções em triplicata em três níveis
diferentes, baixo, médio e alto, 5, 50 e 100 mg/L do padrão de quinina, contemplando um total
de nove injeções. A análise foi avaliada através do desvio padrão (s) e coeficiente de variação
(CV).
Réplicas Área Média
183803
Desvio padrão
amostral (S)
Coeficiente
de variação
(CV, em %)
5 mg/L
50 mg/L
100 mg/L
186777
185832
2980065
2964964
2978485
6534676
6355665
6339590
185470,6667 1519,569128 0,81
2974504,667 8300,140983 0,27
6343310,333 10977,94108 0,17
Tabela 3. Repetibilidade do padrão de quinina, ensaio de precisão em três níveis.
Através da análise dos resultados, pode-se afirmar que os valores de coeficientes de
variação estão abaixo de 1%, sendo que o limite para ensaios laboratoriais estabelecidos na
resolução nº 899 é um coeficiente de variação de até 5% (2).

3.3.4. Limites de quantificação (LQ) e de detecção (LD)
Os limites de detecção e de quantificação foram determinados através do método de
relação sinal/ruído, e os valores encontrados foram de 0,3 µg/mL para o limite de detecção e 1
µg/mL para o limite de quantificação (2, 10).
3.3.5. Exatidão
A análise de exatidão do método foi realizada através do ensaio de recuperação,
conforme descrito no item 2.6.5. Os resultados estão apresentados na tabela 4.
Concentração teórica
padrão (mg/mL)
Concentração da média
recuperada ± desvio padrão
(mg/mL)
Recuperação (%)
4,5 4,86 ± 0,15 108,08
45 47,33 ± 0,12 105,18
90 99,77 ± 0,67 110,85
Média ± (s) 108,43 ± 2,83
Tabela 4. Ensaio de recuperação do padrão de quinina.
A média dos valores encontrados para a recuperação da quinina foi de 108,43 ± 2,83
%, com valores de desvio padrão e coeficiente de variação baixos.
Analisando o ensaio de recuperação da quinina, pode-se observar que o método está de
acordo com os limites estabelecidos (80-120%) na resolução ANVISA nº 899 de novembro de
2003 (2).
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O desenvolvimento do método apresentou uma boa resolução cromatográfica com
picos simétricos e sem caudas, capaz de quantificar a quinina.
A metodologia analítica apresentou-se específica, linear com coeficientes de correlação
superiores a 0,99; precisa (CV < 5%), sensível (com limite de detecção de 0,3 μg/mL e de
quantificação de 1 μg/mL para a quinina) e exata (com média de recuperação de 108,43%).
Estes valores permitem que a metodologia possa ser introduzida, por exemplo, no
controle de qualidade, sendo aplicada a análise de extratos hidroalcoólicos de Cinchona
officinalis para a quantificação de quinina nos mesmos.
De acordo com a literatura (5, 22), os valores encontrados para os parâmetros de
validação para este método estão adequados, tornando essa metodologia validada para a
quantificação de quinina em extrato hidroalcoólico de Cinchona officinalis.
A cromatografia líquida de alta eficiência tem um amplo espectro de utilidades, sendo
uma ferramenta fundamental para a quantificação de compostos que se encontram em
concentrações muito baixas, sendo assim essa ferramenta necessária para a quantificação de
componentes restritivos, que possuem como limites concentrações geralmente abaixo de 100
mg/Kg.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. BACON, P.; SPALTON, D.J.; SMITH, S.E. Blindness from quinine toxicity, British
Journal of Ophthalmology, v-72, p. 219-224, 1988.
2. BRASIL, Resolução RE. nº 899, de 29 de maio de 2003. Guia para validação de métodos
analíticos, 2003.
3. BREMER, Birgitta; ANDREASEN, Katarina; OLSSON, Daniel. Subfamilial and tribal
relationships in the Rubiaceae based on rbcL sequence data. Annals of the Missouri Botanical
Garden, p. 383-397, 1995.
4. CASTRO, F. F. M. et al. Alergia alimentar. 2010.
5. CHANDRAN, S.; SINGH, R. S. P. Comparison of various international guidelines for
analytical method validation. Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical
Sciences, v. 62, n. 1, p. 4-14, 2007.
6. CECHINEL-FILHO, Valdir. Plant bioactives and drug discovery: principles, practice,
and perspectives. John Wiley & Sons, p. 367-368, 2012.
7. CIOLA, Remolo. Fundamentos da cromatografia a líquido de alto desempenho: HPLC.
Edgard Blucher, 1998.
8. COLLINS, Carol H.; BRAGA, Gilberto L.; BONATO, Pierina S. Fundamentos de
cromatografia. In: Fundamentos de cromatografia. 2. ed. Unicamp, 2009.
9. CRONQUIST, Arthur. The evolution and classification of flowering plants. 1988.
10. DE LIMA RIBEIRO, Fabiana Alves et al. Planilha de validação: uma nova ferramenta para
estimar figuras de mérito na validação de métodos analíticos univariados. Quim. Nova, v. 31,
n. 1, p. 164-171, 2008.
11. DIONÍZIO, A.P.; MOLINA, G.; DOS SANTOS, R. Natural flavourings from
biotechnology for foods and beverages, Natural Food Additives, Ingredients and
Flavourings, p.231-259, 2012.
12. FABIANO-TIXIER, Anne-Sylvie et al. rapid and green analytical method for the
determination of quinoline alkaloids from Cinchona succirubra based on microwave-integrated
extraction and leaching (MIEL) prior to high performance liquid chromatography.
International journal of molecular sciences, v. 12, n. 11, p. 7846-7860,
2011.
13. FEGAS, R. et al. Reversed-phase HPLC Seperation of Quinine and its Diastereoisomer
Quinidine in Pharmaceutical Tablets. Asian Journal of Chemistry, v. 18, n. 3, p. 1705-1709,
2006.
14. GENTRY, Alwyn H. A field guide to the families and genera of woody plants of northwest
South America (Colombia, Ecuador, Peru) with supplementary notes on herbaceous taxa.

Washington, DC: Conservation International xxiii, 895 p.-illus.. ISBN, v. 1881173011,
1993.
15. HOSTETTMANN, Kurt; QUEIROZ, Emerson F.; VIEIRA, Paulo C.Princípios ativos de
plantas superiores. EdUFSCar, 2003.
16. HOYER, G. L. et al. High-performance liquid chromatographic method for the quantitation
of quinidine and selected quinidine metabolites. Journal of Chromatography B: Biomedical
Sciences and Applications, v. 572, n. 1, p. 159-169, 1991.
17. HUBER, Udo. Analysis of Quinine and Quinidine in Cinchona Bark Extract (Cortex
Cinchonae) by HPLC. Disponível em:
http://www.chem.agilent.com/Library/applications/59682974.pdf>. Acesso em: 21 set. 2014.
18. KOUZNETSOV, Vladimir V.; MÉNDEZ, Leonor Y. Vargas; GÓMEZ, Carlos M.
Meléndez. Recent progress in the synthesis of quinolines. Current Organic Chemistry, v. 9,
n. 2, p. 141-161, 2005.
19. LANÇAS, Fernando Mauro. Validação de métodos cromatográficos de análise. In:
Métodos cromatográficos de análise. Rima, 2004. 62 p.
20. MARRIOTT, R. Natural flavourings from green chemistry for foods and beverages.
Natural Food Additives, Ingredients and Flavourings, p. 260-278, 2012.
21. MCCALLEY, David V. Analysis of the Cinchona alkaloids by high-performance liquid
chromatography and other separation techniques. Journal of chromatography A, v. 967, n.
1, p. 1-19, 2002.
22. RIBANI, Marcelo et al. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Química
Nova, v. 27, p. 771-780, 2004.
23. ROBBRECHT, E. Tropical woody Rubiaceae. Opera Botanica Belgica, v. 1, n. 272, p.
599-602, 1988.
24. SÁNCHEZ, Xesús Feás et al. Aspectos toxicológicos del consumo de bebidas refrescantes
que contienen quinina. Nutrición clínica y dietética hospitalaria, v. 28, n. 2, p. 20-25, 2008.
25. STELL, R. Flores para el Rey. Serbal, p. 347, 1982.
26. STEYERMARCK, J. A. Rubiaceae. Instituto Botânico, 1974.
27. VILEGAS, W. et al. Controle químico de qualidade de fitoterápicos e plantas medicinais.
Yunes RA, Cechinel Filho V. Química de produtos naturais, novos fármacos e a moderna
farmacognosia, v. 2, p. 163-187, 2009.
Endereço para correspondência:
Laboratório de Cromatografia
Departamento de Controle de Qualidade – CPA
Duas Rodas Industrial
Rua Rodolfo Hufenussler, 755
Jaraguá do Sul – SC
CEP 89251-901.