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artigo 2 Imagem Ilustrativa Autores: Eduardo de Souza Matos 1 , Ronaldo Mohana-Borges *1 , Vitor Marcel Faça*2, Fábio César Gozzo *3 , Wagner Fontes4, Carlos André O. Ricart 4 , Fábio César Sousa Nogueira 5 , Mário Sérgio Palma §6 , Marcelo Valle de Sousa *4 . 28 REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19 sítio de clivagem perdido, carbamidometilcisteína como modificação fixa e oxidação de metionina como modificação variável. Os dados foram processados para um intervalo de significância de p
ácidos contido nas cadeias leves e pesadas do anticorpo bevacizumabe. Ambiguidades na verificação da sequência foram resolvidas utilizando-se espectros redundantes dos peptídeos. Resultados Laboratório 1 Perfil cromatográfico dos peptídeos obtidos após hidrólise enzimática do bevacizumabe Após uma digestão teórica in silico das sequências F(ab)-12 LC e F(ab)-12 HC por tripsina verificou- -se que alguns peptídeos poderiam ser de difícil caracterização por apresentarem massa molecular muito próxima a 3kDa. Desta forma, decidiu-se também realizar a co-digestão do anticorpo com duas enzimas, a tripsina e endoproteínase Glu-C. A co-digestão gerou peptídeos menores que os obtidos por digestão única com tripsina. A separação cromatográfica em coluna de fase reversa C18 dos peptídeos obtidos da hidrólise enzimática dos 3 lotes do bevacizumabe por digestão com tripsina ou pela co-digestão tripsina + endoproteinase Glu-C (resultados não mostrados), geraram um perfil cromatográfico muito similar, demonstrando alta reprodutibilidade do método de separação entre os diferentes lotes. Um segundo processo de hidrólise, separação e análise por EM foi necessário porque alguns pequenos peptídeos obtidos durante a hidrólise enzimática não foram selecionados para sequenciamento MS2 pela estratégia automática (DDA), sendo necessário o uso também da estratégia guiada (vide abaixo). Verificação da presença das sequências F(ab)-12 LC e F(ab)-12 HC, nas amostras do bevacizumabe À medida que os peptídeos foram eluídos da coluna cromatográfica, eles foram injetados imediatamente no espectrômetro de massas configuração ESI-q-TOF, que mediu a sua razão massa/carga (m/z). Além disso, o equipamento foi ajustado para realizar o sequenciamento MS 2 de forma automática dos peptídeos mais abundantes DDA ou de forma guiada dos peptídeos previamente selecionados. Os cromatogramas e os espectros MS e MS 2 de cada amostra de bevacizumabe foram compilados e processados pelo software Biotools. A primeira análise realizada comparou as sequências de aminoácidos obtidas experimentalmente a partir deste programa com as sequências teóricas do bevacizumabe depositada no DrugBank. As tabelas 1 e 2 (representativa para os três lotes analisados) compilam as sequências hipervariáveis de aminoácidos identificados em cada uma destas análises, i.e., os primeiros 123 resíduos de aminoácidos da cadeia pesada e os primeiros 108 resíduos da cadeia leve . Identificação do bevacizumabe a partir de busca de larga escala em bancos de dados usando algoritmo Mascot Uma alternativa ao protocolo experimental usado acima para a confirmação das sequências F(ab)-12 LC e F(ab)-12 HC foi feita utilizando-se o software Mascot. Assim, o objetivo da análise por este software foi verificar se as sequências dos peptídeos obtidos por EM neste projeto iriam identificar o anticorpo bevacizumabe Tabela 1: Dados de caracterização da sequência primária da sequência C com análise LC-MS dos peptídeos gerados por hidrólise do lote B7234B07 de Avastin. Tabela 1: Dados de caracterização da sequência primária da sequência C com análise LC-MS dos peptídeos gerados por hidrólise do lote B7234B07 de Avastin. No. de Tabela 1: Dados de caracterização da sequência primária da sequência F(ab)-12 HC com análise LC-MS dos aminoácidos Enzima Data de peptídeos gerados por No. de hidrólise do lote B7234B07 de Avastin. utilizada análise identificados na Sequência identificada região de aminoácidos Enzima Data de interesse identificados na Sequência identificada utilizada Tripsina 06/06/2018 análise No. 118/123 região de aminoácidos EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVR_____GLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS de Enzima interesse Sequência identificada Tripsina + Glu-C Data 06/06/2018 de identificados 118/123 na região EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVR_____GLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS utilizada Tripsina 06/06/2018 análise de interesse 118/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVR_____GLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS Tripsina 27/06/2018 123/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS Tripsina + Glu-C 06/06/2018 118/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVR_____GLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS Tripsina + Glu-C 27/06/2018 123/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS Tripsina 27/06/2018 123/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS Compilação de todas as 123/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS Tripsina + Glu-C análises 27/06/2018 123/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS Sequência F(ab)-12 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS Compilação de todas as 123/123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS análises Sequência F(ab)-12 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS Tabela 2: Dados de caracterização da sequência primária da sequência F(ab)-12 LC com análise LC-MS dos peptídeos gerados por hidrólise do lote Tabela B7234B07 Tabela 2: Dados de Avastin. 2: de Dados caracterização de caracterização da sequência primária da da sequência F(ab)-12 primária LC com da análise sequência LC-MS dos F(ab)-12 peptídeos gerados LC com por análise hidrólise do LC-MS lote dos B7234B07 peptídeos Avastin. gerados por hidrólise do lote B7234B07 de Avastin. No. de aminoácidos Enzima Data de identificados na Sequência identificada utilizada análise No. No. de de aminoácidos região de Enzima Data de identificados aminoácidos Enzima Data de interesse na região utilizada identificados na Sequência identificada utilizada análise análise Tripsina 06/06/2018 interesse Sequência identificada 66/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSR__________________________________________VEIKR região de Tripsina + Glu-C 06/06/2018 interesse 105/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGK___VLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR Tripsina 06/06/2018 66/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSR__________________________________________VEIKR Tripsina 27/06/2018 63/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGK___VLIYFTSSLHSGVPSR__________________________________________VEIKR Tripsina + Glu-C 06/06/2018 105/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGK___VLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR Tripsina + Glu-C 27/06/2018 108/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR Tripsina 27/06/2018 63/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGK___VLIYFTSSLHSGVPSR__________________________________________VEIKR Compilação de todas as análises 108/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR Tripsina + Glu-C 27/06/2018 108/108 Sequência F(ab)-12 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR Compilação de todas as análises 108/108 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR Sequência F(ab)-12 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19 29
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