Podstawowe procedury laboratoryjne w ... - digicollection.or..

Podstawowe procedury 

laboratoryjne 

w bakteriologii klinicznej 

1

Podstawowe 

procedury 

laboratoryjne 

w bakteriologii 

klinicznej 

3

Wydane przez World Health Organization w 2003 r. pod tytułem ,,Basic Laboratory 

Procedures in Clinical Bacteriology’’, wydanie 2 

© World Health Organization 2003 

© Copyright for the Polish edition by Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005 

Dyrektor Generalny World Health Organization udzielił praw 

na wydanie w języku polskim Wydawnictwu Lekarskiemu PZWL, 

które jest całkowicie odpowiedzialne za polskie wydanie. 

Wszelkie prawa zastrzeżone. 

Przedruk i reprodukcja w jakiejkolwiek postaci 

całości bądź części książki 

bez pisemnej zgody wydawcy są zabronione. 

Redaktor ds. publikacji medycznych mgr Anna Plewa 

Redaktor mgr Alicja Pałkiewicz 

Redaktor techniczny Maria Karczewska 

Korekta Zespół 

Projekt okładki i stron tytułowych Jolanta Krafft-Przeździecka 

Dawkowanie leków 

Autorzy i Wydawnictwo dołożyli wszelkich starań, aby wybór i dawkowanie leków w tym 

opracowaniu były zgodne z aktualnymi wskazaniami i praktyką kliniczną. Mimo to, ze 

względu na stan wiedzy, zmiany regulacji prawnych i nieprzerwany napływ nowych 

wyników badań dotyczących podstawowych i niepożądanych działań leków, Czytelnik 

musi brać pod uwagę informacje zawarte w ulotce dołączonej do każdego opakowania, aby 

nie przeoczyć ewentualnych zmian we wskazaniach i dawkowaniu. Dotyczy to także 

specjalnych ostrzeżeń iśrodów ostrożności. Należy o tym pamiętać, zwłaszcza w przypadku 

nowych lub rzadko stosowanych substancji. 

ISBN 83-200-3133-8 

Wydanie I 

Wydawnictwo Lekarskie PZWL 

00-251 Warszawa, ul. Miodowa 10 

tel. (0-prefiks-22) 695-40-33 

Księgarnia wysyłkowa: 

tel. (0-prefiks-22) 695-44-80 

infolinia: 0 801-142-080 

www.pzwl.pl 

e-mail: promocja 0 pzwl.pl 

Skład i łamanie: EGRAF, Warszawa 

Druk i oprawa: Pabianickie Zakłady Graficzne S.A., Pabianice 

4

Przedmowa do polskiego wydania 

Pierwszym, podstawowym celem diagnostyki mikrobiologicznej jest identyfikacja 

czynnika etiologicznego zakażenia. Wskazanie drobnoustroju odpowiedzialnego 

za infekcję jest podstawą wyboru sposobu leczenia, postępowania zmierzającego 

do ograniczenia jego rozprzestrzeniania się, a także oceny rokowania. 

Rozpoznanie danego mikroorganizmu może być dokonane przez bakterioskopowe 

badanie próbki od pacjenta, hodowlę i identyfikację. Czynnik etiologiczny 

zakażenia można też identyfikować na podstawie obecności w próbkach 

antygenów, które wykrywa się za pomocą serologicznych metod diagnostycznych. 

Jeszcze inną drogą postępowania jest wykrywanie charakterystycznego dla 

drobnoustroju kwasu nukleinowego, do czego służą wprowadzone w ostatnich 

latach techniki molekularne. Pośrednio czynnik etiologiczny zakażenia może być 

rozpoznany na podstawie swoistych przeciwciał wytworzonych w zakażonym 

organizmie. Odpowiednio dobrane antygeny i metody pozwalają na oznaczenie 

zarówno klas, jak i miana przeciwciał. 

Wybór metody diagnostycznej jest podyktowany wieloma względami, takimi jak: 

zdolność drobnoustrojów do wzrostu w warunkach in vitro i szybkość jego 

wzrostu, charakter zakażenia i jego przebieg, wyposażenie laboratorium, wykształcenie 

personelu, wreszcie możliwości finansowe. Prawidłowe wykonanie 

badania mikrobiologicznego, niezależnie od zastosowanej metody, wymaga 

postępowania według określonych szczegółowo procedur, które obejmują: 

pobranie i transport próbek, metodę przeprowadzenia badania w pracowni 

mikrobiologicznej, sposób opracowania, wydania i interpretacji wyniku. Wydane 

pod patronatem WHO ,,Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii 

klinicznej’’ (Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology) to publikacja 

podsumowująca aktualne wytyczne w zakresie doboru materiału w określonych 

zakażeniach i pobierania próbek, identyfikacji drobnoustrojów oraz oznaczania 

lekooporności. Informacje w niej zawarte mają na celu ujednolicenie techniki 

badań mikrobiologicznych i podniesienie jakości usług laboratoryjnych w krajach 

rozwijających się i tych, w których diagnostyka mikrobiologiczna nie jest dobrze 

zorganizowana lub doceniana, na co wskazuje wysokie zużycie antybiotyków 

i szybko wzrastająca liczba szczepów wieloopornych. 

Publikacji, którą mają Państwo przed sobą, nie można traktować jako zbioru 

obowiązujących procedur, może ona jednak pomóc w tworzeniu własnych 

procedur w laboratorium mikrobiologicznym, być cennym źródłem nauki metod 

diagnostycznych, szczególnie prostych i tanich, szczegółowo w podręczniku 

opisanych. Niektóre metody diagnostyczne dotyczą chorób w Polsce nie spotykanych, 

np. cholera, wrzód miękki, mycetoma, jednak szybkie i częste przemieszczanie 

się ludzi ustawicznie grozi przemieszczaniem się drobnoustrojów, a łatwy 

dostęp domało popularnych w Polsce procedur diagnostycznych może pomóc 

w rozpoznaniu, a więc w zapobieganiu i rozpowszechnieniu się niekonwencjonalnego 

zakażenia. Niniejsza publikacja będzie z pewnością cennym podręcznikiem, 

szczególnie dla studentów analityki medycznej, wydziału lekarskiego i stomatologii, 

na rynku brak bowiem opracowania z zakresu diagnostyki mikrobiologicznej, 

której studenci uczą się na ćwiczeniach. 

Opisane w publikacji procedury nie uwzględniają komercyjnych metod badawczych 

opartych na aparatach i podłożach do monitorowanego posiewu krwi 

ipłynów ustrojowych, do przyspieszonej diagnostyki gruźlicy oraz gotowych 

5

podłożach do przesiewowych półilościowych badań moczu. ,,Podstawowe procedury 

laboratoryjne w bakteriologii klinicznej’’ zawierają opis metod identyfikacji 

i oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów opierających się na podłożach 

różnicujących i prostych testach wskaźnikowych, bez uwzględnienia metod 

półautomatycznych lub automatycznych. Metody oznaczania lekowrażliwości 

i identyfikacja nowych mechanizmów oporności, ze względu na zmieniającą się 

sytuację epidemiologiczną, wymagają ciągłej modyfikacji i aktualizacji, stąd 

procedury opisane w podręczniku należy traktować jako ogólne, w praktyce 

opierając się przede wszystkim na rekomendacjach Krajowego Ośrodka Referencyjnego 

ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów. 

Podręcznik nie uwzględnia metod molekularnych i immunochemicznych w diagnozowaniu 

zakażeń. Zgodnie z tytułem przedstawione są rzeczywiście podstawowe 

procedury laboratoryjne i warto podkreślić,że korzyści dla mikrobiologa 

z takiego podejścia do diagnostyki są naprawdę duże. Szczególnie cenne jest 

przypomnienie, jak ważny jest i ile informacji może dostarczyć preparat 

bezpośredni: można nauczyć się oszczędności, liczyć czas badania. Cenną częścią 

podręcznika jest podkreślanie w każdym z rozdziałów konieczności kontroli 

wewnątrz- i zewnątrzlaboratoryjnych procedur oraz kontroli sprzętu i testów. 

Podsumowując, przedstawiona publikacja może być pomocna w opracowaniu 

i wdrożeniu tańszych, a jednocześnie rzetelnych metod diagnostyki mikrobiologicznej. 

Prof. dr hab. med. Anna Przondo-Mordarska 

6

Spis treści 

Wstęp ................................................ 10 

Wprowadzenie .......................................... 11 

Zapewnienie jakości badań bakteriologicznych ................. 12 

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 

Definicje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 

Wewnętrzna kontrola jakości ............................... 16 

Zewnętrzna kontrola jakości ............................... 27 

CZE˛ŚĆ I. BADANIA BAKTERIOLOGICZNE ..................... 29 

Krew ................................................. 30 

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 

Kiedy i u kogo może wysta˛pić bakteriemia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 

Pobieranie próbek krwi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 

Podłoża do posiewu krwi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 

Prowadzenie hodowli z krwi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 

Płyn mózgowo-rdzeniowy ................................. 36 

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 

Pobieranie i transport próbek .............................. 36 

Ocena makroskopowa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 

Badanie mikroskopowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 

Wstępna identyfikacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 

Oznaczanie lekowrażliwości ............................... 40 

Mocz ................................................. 41 

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 

Pobieranie materiału do badania . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 

Hodowla i interpretacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 

Interpretacja wyników posiewu ilościowego moczu . . . . . . . . . . . . . . . 46 

Identyfikacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 

Oznaczanie lekowrażliwości ............................... 47 

Kał ................................................... 48 

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 

Czynniki etiologiczne i objawy kliniczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 

Właściwe ukierunkowanie diagnostyki laboratoryjnej . . . . . . . . . . . . . . 50 

Pobieranie i przesyłanie próbek kału . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 

Badanie wizualne próbek kału . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 

Podłoża transportowo-wzbogacaja˛ce i posiew próbek kału . . . . . . . . . 53 

Podłoża do hodowli patogenów jelitowych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 

Wstępna izolacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 

Wstępna identyfikacja izolowanych szczepów ................... 56 

Końcowa identyfikacja mikrobiologiczna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 

Identyfikacja serologiczna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 

7

SPIS TREŚCI 

Zakażenia górnych dróg oddechowych ....................... 73 

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 

Flora fizjologiczna gardła ................................. 73 

Bakteryjne czynniki zapalenia gardła ......................... 74 

Pobieranie i przesyłanie próbek ............................. 75 

Mikroskopia bezpośrednia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 

Hodowla i identyfikacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 

Badanie lekowrażliwości .................................. 78 

Zakażenia dolnych dróg oddechowych ....................... 79 

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 

Najczęstsze postacie kliniczne zakażeń ....................... 79 

Pobieranie próbek plwociny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 

Opracowanie plwociny w laboratorium 

(w zakażeniach niegruźliczych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 

Hodowla Mycobacterium tuberculosis ........................ 85 

Interpretacja hodowli M. tuberculosis ......................... 88 

Podstawowe zasady bezpieczeństwa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 

Choroby przenoszone droga˛ kontaktów seksualnych ............ 89 

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 

Zapalenie cewki moczowej u mężczyzn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 

Próbki z żeńskich narza˛dów płciowych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 

Próbki z owrzodzeń narza˛dów płciowych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 

Ropne wydzieliny, rany i ropnie ............................ 100 

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 

Postacie kliniczne i najczęstsze czynniki etiologiczne . . . . . . . . . . . . . 100 

Pobieranie i transport próbek .............................. 103 

Ocena makroskopowa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 

Badanie mikroskopowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 

Hodowla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 

Identyfikacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 

Badanie lekowrażliwości .................................. 112 

Zakażenia bakteriami beztlenowymi .......................... 113 

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 

Podział bakterii ze względu na wymagania tlenowe . . . . . . . . . . . . . . 113 

Diagnostyka zakażeń bakteriami beztlenowymi . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 

Oznaczanie wrażliwości na antybiotyki ....................... 119 

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 

Podstawowe zasady oznaczania lekowrażliwości ................ 119 

Kliniczna definicja terminów ,,oporny’’ i ,,wrażliwy’’ ............... 120 

Wskazania do rutynowego oznaczania lekowrażliwości ............ 122 

Wybór leków do oznaczania lekowrażliwości 

w laboratoriach klinicznych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 

Zmodyfikowana metoda Kirby-Bauera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 

Bezpośrednie a pośrednie oznaczanie lekowrażliwości ............ 133 

Czynniki techniczne wpływaja˛ce na wielkość 

strefy zahamowania w metodzie dyfuzyjno-kra˛żkowej . . . . . . . . . . . 134 

Kontrola jakości ........................................ 136 

8

SPIS TREŚCI 

Badania serologiczne .................................... 138 

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138 

Metody kontroli jakości ................................... 138 

Reakcje serologiczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 

Odczyny serologiczne w diagnostyce kiły ...................... 142 

Wykrywanie aglutynin w gora˛czce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150 

Odczyn ASO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 

Wykrywanie antygenów bakteryjnych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155 

CZE˛ŚĆ II. NAJWAŻNIEJSZE PODŁOŻA I ODCZYNNIKI ........... 157 

Wprowadzenie .......................................... 158 

Patogeny, podłoża i odczynniki diagnostyczne ................. 159 

Krew . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 

Płyn mózgowo-rdzeniowy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161 

Mocz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161 

Kał ................................................. 162 

Górne drogi oddechowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164 

Dolne drogi oddechowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 

Próbki z układu moczowo-płciowego do diagnostyki chorób 

przenoszonych droga˛ kontaktów seksualnych . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 

Ropa i wysięki ......................................... 166 

Lista rekomendowanych podłoży i odczynników diagnostycznych dla 

laboratoriów mikrobiologicznych o średnim poziomie referencyjności 167 

Wybrana literatura uzupełniaja˛ca ............................ 171 

Skorowidz ............................................. 172 

9

Wstęp 

Choroby zakaźne są najczęstszą przyczyną zgonów w krajach rozwijających się, 

ich diagnozowanie i leczenie stanowi ważne wyzwanie dla służby zdrowia. 

Światowa Organizacja Zdrowia (WHO, World Health Organization) od wielu lat 

wspiera rozwój i wprowadzanie standardowych technik w diagnostyce laboratoryjnej. 

Pierwszy program pod patronatem WHO z 1960 roku dotyczył standaryzacji 

oznaczania lekowrażliwość patogenów bakteryjnych. W 1976 roku 1 

WHO Expert Committee on Biological Standardization wskazał na konieczność 

stosowania metody dyfuzyjno-krążkowej w oznaczaniu wrażliwości na antybiotyki 

2 . 

Równocześnie podjęto działania w celu wprowadzenia kontroli jakości badań 

laboratoryjnych. W 1981 roku WHO ustanowiła Międzynarodowy Program 

Kontroli Jakości Badań Mikrobiologicznych. Laboratoria, które uczestniczą 

w programie, mogą pełnić przewodnią rolę we wprowadzaniu kontroli jakości 

badań w skali kraju na wszystkich poziomach systemu usług medycznych. 

Publikacja, którą mają Państwo przed sobą, jest podsumowaniem aktualnych 

wytycznych WHO, dotyczących pobierania próbek do badań laboratoryjnych, 

identyfikacji drobnoustrojów oraz oznaczania lekooporności. Wprowadzenie do 

praktyki laboratoryjnej informacji zawartych w podręczniku ma na celu ujednolicenie 

techniki badań mikrobiologicznych i oceny lekowrażliwości oraz 

podniesienie jakości usług laboratoryjnych, zarówno na poziomie centralnym, jak 

iśrednim. Podręcznik koncentruje się raczej na procedurach niż na podstawowych 

technikach mikroskopowania i barwienia, które zostały opisane szczegółowo 

w innych publikacjach WHO 3 . 

1 

The public health aspects of antibiotics in feedstuffs. Report on a Working Group, Bremen, 

1–5 October 1973. Copenhagen, WHO Regional Office for Europe, 1973 (document no. EURO 3604 

(2)). 

2 

WHO Expert Committee on Biological Standardization. Twenty-eight report. Geneva, World Health 

Organization, 1977 (WHO Technical Report Series, No. 610). 

3 

Manual of basic techniques for a health laboratory, 2 nd ed. Geneva, World Health Organization, 

2003. 

10

Wprowadzenie 

Koszty związane z chorobami zakaźnymi wciąż stanowią nieproporcjonalnie duże 

obciążenie dla budżetu zdrowia w krajach rozwijających się. Według Światowego 

Raportu Zdrowia (The world health report) 1 ostra biegunka jest przyczyną 

2,2 milionów zgonów rocznie. Ostre infekcje układu oddechowego (głównie 

zapalenie płuc) są kolejną ważną przyczyną śmiertelności, odpowiedzialną za 

około 4 miliony zgonów rocznie. Analiza dostępnych danych wskazuje, że 

w krajach rozwijających się patogenami wywołującymi zapalenie płuc w dzieciństwie 

są częściej niż wirusy, takie bakterie, jak Haemophilus influenzae 

i Streptococcus pneumoniae. Wróżnych regionach świata pojawiły się szczepy 

H. influenzae wytwarzające β-laktamazy i S. pneumoniae o zmniejszonej wrażliwości 

na benzylopenicylinę, sprawiając, że nadzór nad tymi patogenami jest 

coraz bardziej istotny. 

Choroby przenoszone drogą kontaktów seksualnych są coraz częstsze. W konsekwencji 

niewystarczającego nadzoru epidemiologicznego i niedostatecznych 

działań profilaktycznych aktualne są wciąż zagrożenia epidemią lub pandemią, 

wywołaną czynnikami bakteryjnymi lub wirusowymi. Dla skutecznej kontroli 

i profilaktyki chorób zakaźnych konieczny jest rozwój prostych narzędzi nadzoru 

epidemiologicznego i monitorowania choroby oraz prostych i czułych metod 

diagnostycznych. 

Aby sprostać wyzwaniom w wyżej opisanej sytuacji, system usług laboratoryjnych 

musi być oparty na współpracy sieci laboratoriów wykonujących diagnostykę 

mikrobiologiczną dla centrów medycznych, lekarzy klinicystów i epidemiologów. 

Złożoność zadań powinna wzrastać proporcjonalnie: od podstawowych, 

poprzez średnie, do centralnych laboratoriów (zależnie od poziomu referencyjności 

laboratorium — przyp. tłum.). Tylko w ten sposób możliwe będzie dostatecznie 

szybkie zebranie istotnych informacji, które usprawnią nadzór, umożliwią 

wczesną diagnostykę epidemii lub nietypowych zakażeń oraz rozwój, zastosowanie 

i ocenę określonych środków interwencji. 

1 

The world health report 2000, Geneva, World Health Organization, 2000. 

11

Zapewnienie jakości badań 

bakteriologicznych 

Wprowadzenie 

Programy zapewniania jakości są skutecznym sposobem zagwarantowania 

standardówusług diagnostyki laboratoryjnej i podnoszenia tych standardów, jeśli 

zachodzi potrzeba. W mikrobiologii pojęcie jakości wykracza poza zagadnienia 

techniczne, dotycząc szybkości, kosztów oraz przydatności klinicznej testu. Testy 

laboratoryjne są stosunkowo drogie i wraz z postępem medycyny proporcjonalnie 

zwiększają obciążenie budżetu służby zdrowia. 

Definicje 

Cechą testu dobrej jakości jest jego wartość kliniczna, np.: w profilaktyce 

i leczeniu choroby. Inne cechy jakości testu, to: 

• Niezawodność: Czy wynik jest wiarygodny? 

• Powtarzalność: Czy otrzymamy taki sam wynik w powtórnym badaniu? 

• Szybkość: Czy test jest wystarczająco szybki, aby był użyteczny dla lekarza 

zalecającego leczenie? 

• Współczynnik koszt–korzyść: Czy koszt badania jest proporcjonalny do korzyści 

dla pacjenta i społeczeństwa? 

Czynniki wpływaja˛ce na wiarygodność 

i powtarzalność wyników laboratoryjnych 

Przyczyny błędów: 

• Personel. Wyniki pracy personelu laboratorium pozostają wścisłym związku 

ze stopniem edukacji i dokształcaniem, doświadczeniem oraz warunkami 

zatrudnienia. 

• Czynniki środowiskowe. Na wyniki mogą wpływać: warunki przestrzenne, 

oświetlenie, wentylacja, temperatura, nadmierny poziom hałasu, niebezpieczne 

warunki pracy. 

• Materiał do badań. Sposób i czas pobrania materiału do badań oraz pochodzenie 

próbki, często pozostające poza kontrolą laboratorium, mają bezpośredni 

związek z możliwością uzyskania wiarygodnych wyników. Czynnikami, 

wpływającymi na jakość wyników, które pozostają pod kontrolą laboratorium, 

są: transport, przechowywanie, przygotowanie próbek do badania oraz identyfikacja. 

Laboratorium pełni funkcję edukacyjną wobec osób odpowiedzialnych 

za pobieranie i transport próbek. Pisemne instrukcje powinny być 

przygotowane w przystępny sposób i regularnie omawiane z klinicystami 

i pielęgniarkami. 

• Materiały laboratoryjne. Jakość odczynników, chemikaliów, szklanych naczyń, 

barwników, podłoży do hodowli oraz zwierząt laboratoryjnych wpływa 

na wiarygodność wyników badań. 

• Metody badań. Niektóre metody są bardziej wiarygodne niż inne. 

• Sprzęt. Brak sprzętu, niewystarczające lub niezgodne ze standardem wyposażenie 

są przyczyną uzyskiwania niewiarygodnych wyników. 

12

PODSTAWOWE PROCEDURY LABORATORYJNE W BAKTERIOLOGII KLINICZNEJ 

• Badanie i odczyt. Pospieszne odczytywanie wyników lub brak badania 

wystarczającej liczby pól mikroskopowych mogą być powodem błędów. 

• Sprawozdanie. Błędy w przepisywaniu lub niekompletne opisy wyników. 

Jakość interpretacji wyników badań 

W mikrobiologii szczególnie ważna jest interpretacja wyników. Na każdym etapie 

badania próbki rezultaty powinny być interpretowane w celu wyboru, do 

kolejnego etapu badania, testu optymalnego pod względem szybkości i wiarygodności. 

Zapewnienie jakości w laboratorium 

mikrobiologicznym 

Zapewnienie jakości jest sumą działań, w które zaangażowane jest laboratorium, 

aby zapewnić dobrą jakość wyników. Działania te muszą być: 

– kompletne: aby zapewnić kontrolę na każdym etapie procesu — od pobrania 

próbki do przedstawienia końcowego wyniku lekarzowi (ryc. 1); 

– racjonalne: aby skoncentrować się na najbardziej krytycznych etapach procesu; 

– regularne: aby zapewnić stałą kontrolę procedur; 

– częste: aby szybko wykryć i skorygować błędy. 

DOBRA JAKOŚĆ BADAŃ LABORATORYJNYCH 

TO DOBRA JAKOŚĆ MEDYCYNY 

Zapewnienie jakości pozwala na możliwie oszczędne stosowanie drogich testów; 

określa także zasadność i wartościowość nowych testów, podnosi jakość usług 

szpitalnych i pozaszpitalnych laboratoriów oraz zapewnia porównywalność 

otrzymanych wyników niezależnie od miejsca ich wykonania. 

Rodzaje gwarancji jakości 

Istnieją dwa rodzaje gwarancji jakości: wewnętrzna i zewnętrzna. 

• Wewnętrzna. Tak zwana KONTROLA JAKOŚCI. Każde laboratorium ma 

system sprawdzania jakości wykonywanych przez siebie testów. 

Na wewnętrzną kontrolę jakości składają się: 

– cia˛gły monitoring jakości testów; 

– pełne sprawdzanie wszystkich etapów diagnostyki: od pobrania próbki do 

badania (jeśli jest to możliwe) do odesłania końcowego wyniku. 

Laboratoria mają etyczną odpowiedzialność wobec pacjenta za przedstawienie 

dokładnych i przydatnych wyników. 

WEWNE˛TRZNA KONTROLA JAKOŚCI JEST NIEZBE˛DNA 

DLA PRAWIDŁOWEGO FUNKCJONOWANIA PROCEDURY 

13

ZAPEWNIENIE JAKOŚCI BADAŃ BAKTERIOLOGICZNYCH 

PACJENT Z INFEKCJA˛ 

Przechowywanie 

▲ 

Pobieranie 

materiału 

10 

▼ 

Próbka, 

dane kliniczne 

Transport, oznaczanie 

▼ 

Ocena makroskopowa, zapach 

▼ 

Mikroskopia, interpretacja 

▼ 

WYNIK WSTE˛PNY 

przekazany lekarzowi 

▼ 

▼ 

Hodowla: wybór podłoża, temperatury, atmosfery 

▼ 

Izolacja czystych kolonii, antybiogram 

▼ 

Identyfikacja, interpretacja 

(zanieczyszczenie, komensal lub patogen) 

Ryc. 1. Etapy diagnostyki mikrobiologicznej zakażenia u pacjenta. 

WYNIK KOŃCOWY 

przekazany lekarzowi 

• Zewnętrzna. Tak zwana OCENA JAKOŚCI. Wyniki działalności laboratorium 

kontrolowane są przez zewnętrzną instytucję. W niektórych krajach podleganie 

zewnętrznej ocenie jakości jest obowiązkowe (regulacje rządowe) i wymagane 

do uzyskania licencji. 

Na zewnętrzną ocenę jakości składają się: 

– okresowy monitoring jakości testów; 

– wybiórcza kontrola procesu identyfikacji i niekiedy technik izolacji. 

▼ 

WHO 90960 

Kryteria jakości w mikrobiologii 

Przydatność kliniczna 

Ważnym kryterium jakości badania mikrobiologicznego jest jego przydatność 

w zapobieganiu i leczeniu chorób zakaźnych; jest to tak zwana przydatność 

kliniczna. Warunkiem koniecznym do uzyskania pożądanego efektu klinicznego 

jest współpraca między lekarzem i laboratorium. 

Poniższe przykłady obrazują przydatność kliniczną: 

1. Izolacja kilku kolonii Gram-ujemnych pałeczek z plwociny lub z wymazu 

z gardła hospitalizowanego pacjenta oraz identyfikacja drobnoustrojów z antybiogramem 

nie mają żadnego znaczenia klinicznego, ponieważ żadna z tych 

procedur nie wpłynie na podjęte leczenie. 

2. W przypadku izolacji Streptococcus pyogenes wykonanie pełnego antybiogramu 

nie ma znaczenia klinicznego, ponieważ benzylopenicylina jest lekiem 

z wyboru, zawsze aktywnym in vitro. 

3. W przypadku izolacji Escherichia coli u pacjenta z biegunką bez domieszki 

krwi, identyfikacja serotypu nie jest klinicznie przydatna, jeśli nie można 

wykazać związku między serotypem a chorobotwórczością. 

4. Rutynowa identyfikacja mieszanej flory beztlenowej widocznej w preparacie 

barwionym metodą Grama nie ma znaczenia klinicznego. Jest czasochłonna, 

droga i nie wpłynie na leczenie pacjenta. 

5. Jeśli z próbek pobranych z dróg oddechowych zostaną wyizolowane grzyby, 

celowe jest wykonanie testu identyfikującego Cryptococcus. Dalsza iden- 

14


tyfikacja nie ma znaczenia klinicznego, ponieważ nie wpłynie na sposób 

leczenia pacjenta. 

Podsumowując, badanie dobrej jakości to takie, które jest dokładne i dostarcza 

informacji użytecznych w zapobieganiu i leczeniu chorób zakaźnych. Izolacja 

i identyfikacja wszystkich mikroorganizmów w próbce nie jest konieczna. 

Wiarygodność 

Dla badań ilościowych wiarygodność badania jest mierzona przez porównanie 

otrzymanych wyników z rzeczywistą wartością. Poniżej przedstawiono przykłady 

badań tego typu: 

– określanie stężenia antybiotyków w surowicy; 

– pomiar wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC) antybiotyków 

in vitro; 

– określanie miana przeciwciał w surowicy. 

Dla badań jakościowych wiarygodność badania określana jest przez ocenę 

zgodności wyniku ze stanem rzeczywistym. Poniżej przedstawiono przykłady 

opisanych badań: 

– identyfikacja patogenów; 

– oznaczanie wrażliwości izolatów na antybiotyki metodą dyfuzji krążkowej. 

Konieczne jest stosowanie standardowej terminologii. Zawsze należy używać 

międzynarodowych nazw drobnoustrojów, np.: Staphylococcus aureus, NIE 

,,patogenne gronkowce’’; Streptococcus pyogenes, NIE: ,,paciorkowce hemolizujące’’. 

Niezbędne jest stosowanie jednolitych, uznanych metod diagnostycznych. Oznaczanie 

lekowrażliwości metodą dyfuzji krążkowej powinno być wykonywane 

zgodnie z przyjętymi, międzynarodowymi standardami, na przykład zmodyfikowaną 

metodą Kirby-Bauera (str. 125). 

Powtarzalność 

Powtarzalność i precyzja wykonywanych badań ograniczone są przez dwa 

czynniki: 

1. Brak jednorodności. Pojedyncza próbka pochodząca od pacjenta może 

zawierać więcej niż jeden drobnoustrój. Powtarzanie hodowli może więc 

prowadzić do izolacji różnych mikroorganizmów. 

2. Brak stabilności. Wraz z upływem czasu mikroorganizmy w próbce w różnym 

stopniu namnażają się lub giną. Powtarzanie hodowli może prowadzić do 

izolacji różnych drobnoustrojów. W związku z powyższym, w celu uzyskania 

większej dokładności, badania powinny być przeprowadzane jak najszybciej 

po pobraniu próbek. 

Skuteczność 

Skuteczność badań mikrobiologicznych jest to możliwość uzyskania właściwej 

diagnozy dotyczącej patogenu lub stanu patologicznego. Powyższa wartość 

oceniana jest według dwóch kategorii: 

15


1. Czułość diagnostyczna. 

Czułość = 

ogólna liczba dodatnich wyników 

ogólna liczba zakażonych pacjentów 

Im większa czułość testu, tym mniejsza liczba fałszywie ujemnych wyników. 

Na przykład czułość agaru MacConkeya jest zbyt niska w odniesieniu do izolacji 

Salmonella typhi zkału. Ten ważny patogen jelitowy może zostać przeoczony 

z powodu nadmiernego wzrostu niepatogennych bakterii jelitowych. 

2. Swoistość diagnostyczna 

Swoistość = 

ogólna liczba ujemnych wyników 

ogólna liczba niezakażonych pacjentów 

Im większa swoistość testu, tym mniejsza liczba fałszywie dodatnich wyników. 

Przykłady: 

• Barwienie preparatów z plwociny metodą Ziehl-Neelsena jest wysoce 

swoiste w diagnostyce gruźlicy, ponieważ daje nieliczne fałszywie dodatnie 

wyniki. 

• Barwienie preparatów moczu metodą Ziehl-Neelsena jest dużo mniej 

swoiste, ponieważ daje wiele fałszywie dodatnich wyników (z powodu 

obecności atypowych prątków). 

• Test Widala ma bardzo niską swoistość w diagnostyce duru brzusznego, 

ponieważ krzyżowo reagujące przeciwciała, powstałe w przebiegu infekcji 

wywołanych pokrewnymi serotypami Salmonella, dają fałszywie dodatnie 

wyniki. 

Czułość i swoistość testu są ze sobą związane. Czułość testu może być wyższa 

kosztem zmniejszenia jego swoistości i vice versa. Obydwie wartości pozostają 

także w związku z częstością występowania danej choroby w badanej populacji. 

Wewnętrzna kontrola jakości 

Wymagania 

Program wewnętrznej kontroli jakości powinien być praktyczny, realny i ekonomiczny. 

Program wewnętrznej kontroli jakości nie powinien oceniać każdej procedury, 

odczynnika czy podłoża do hodowli każdego dnia pracy. Powinien oceniać 

procedurę, odczynniki czy podłoże do hodowli zgodnie z praktycznym schematem, 

uwzględniającym wpływ każdego elementu na jakość badania. 

Procedury 

Wewnętrzna kontrola jakości rozpoczyna się od właściwych działań laboratorium. 

16


Spis działań laboratoryjnych 

Każde laboratorium powinno mieć wykaz działań, który obejmuje: 

– sprzątanie miejsca pracy, 

– zasady higieny osobistej, 

– zasady bezpieczeństwa, 

– wyznaczone poza obszarem laboratorium strefy socjalne i dla palących, 

– postępowanie ze skażonym materiałem i jego usuwanie, 

– odpowiednie szczepienia personelu, np. przeciw wirusowemu zapaleniu 

wątroby typu B, 

– dbałość o sprzęt, 

– pobieranie próbek na badania, 

– rejestrację próbek, 

– eliminację nieodpowiednich próbek, 

– postępowanie z próbką, 

– zapis wyników, 

– wydawanie wyników. 

Zawarte w spisie działania powinny być dokładnie realizowane, regularnie 

oceniane i aktualizowane. 

Dbałość o sprzęt 

Istotne znaczenie ma dbałość o wyposażenie laboratorium. Badania wysokiej 

jakości nie mogą być wykonywane sprzętem niskiej jakości lub niewłaściwie 

utrzymanym. 

W tabeli 1 przedstawiono wykaz rutynowych działań, mających zapewnić 

właściwą dbałość o sprzęt. Zakres temperatur działającego urządzenia może być 

rejestrowany w formie przedstawionej na ryc. 2. 

Podłoża do hodowli 

Podłoża do hodowli mogą być przygotowywane ze składników podstawowych, 

z komercyjnie dostępnych podłoży sypkich lub zakupione w formie gotowej do 

użycia. Ze względów ekonomicznych, z uwagi na łatwość transportu i przechowywania 

oraz wyższą jakość w porównaniu z podłożami przygotowanymi 

w laboratorium, rekomendowane są komercyjnie dostępne podłoża sypkie. Dla 

uzyskania najlepszych wyników konieczne jest uwzględnienie uwag ujętych 

w poniższych punktach. 

Wybór podłoża 

Sprawnie działające laboratorium zaopatrzone jest w najmniejszy możliwy 

asortyment podłoży zgodnych z profilem wykonywanych badań. Dobrym 

przykładem jest podłoże agarowe, które może być użyte jako baza do przygotowania 

agaru z krwią, agaru czekoladowego oraz kilku innych selektywnych podłoży. 

Do izolacji patogennych Enterobacteriaceae zkału niezbędne jest jedno wysoce 

selektywne podłoże (agar Salmonella-Shigella lub agar z cytry- 

17


nianem deoksycholanu) oraz jedno mniej selektywne podłoże (agar MacConkeya). 

W celu identyfikacji Campylobacter spp. należy zastosować specjalne podłoże. 

Zamawianie i przechowywanie suchych podłoży 

1. Należy zamawiać ilość, która zostanie zużyta w ciągu 6 miesięcy lub 

maksymalnie w ciągu roku. 

2. Całość należy podzielić i umieścić w pojemnikach, których zawartość powinna 

zostać zużyta w ciągu 1–2 miesięcy. 

3. Szczelnie domknąć pokrywki pojemników. Suche podłoża absorbują wilgoć 

z otoczenia. W wilgotnym klimacie należy uszczelnić zamknięcie pojemnika, 

używając parafiny woskowej (wypełnić przestrzeń między pokrywką i pojemnikiem 

roztopionym woskiem i poczekać do zastygnięcia). 

4. Zapisać datę zamknięcia na każdym pojemniku. 

5. Przechowywać w ciemnym, chłodnym, przewiewnym miejscu. 

6. Odwracać pojemnik tak, aby najpierw został zużyty starszy materiał. 

Tabela 1. Kontrola jakości sprzętu 

Anaerostat 

Sprzęt Podstawowe czynności Monitorowanie 

Cotygodniowe czyszczenie wnętrza pojemników. 

Reaktywacja katalizatora po każdym cyklu 

(160°C, 2 h). 

Wymiana katalizatora co 3 miesia˛ce 

Użycie paska wskaźnikowego z błękitem 

metylenowym w każdym cyklu. 

Odnotowanie czasu odbarwienia wskaźnika 

co tydzień 

Autoklaw Co miesia˛c czyszczenie i wymiana wody Sprawdzenie poziomu i uzupełnienie 

wody przed każdym cyklem. 

Zapis czasu i temperatury lub ciśnienia 

każdego cyklu. 

Cotygodniowy zapis wyniku testu z użyciem 

przetrwalników (przyp. tłum.: 

testy biologiczne) 

Wirówka 

Sterylizator szkłana 

suche, gora˛ce powietrze 

Przemywanie ścian wewnętrznych środkiem 

dezynfekcyjnym co tydzień oraz 

po uszkodzeniu probówki lub rozlaniu 

zawartości 

Czyszczenie urza˛dzenia wewna˛trz co 

miesia˛c 

Cieplarka Czyszczenie ścianek wewnętrznych 

ipółek co miesia˛c 

Mikroskop 

Chłodziarka 

Łaźnia wodna 

Przecieranie soczewek szmatka˛ lub bibuła˛ 

do soczewek po każdym dniu 

pracy 

Czyszczenie i smarowanie mechanizmu 

stolika co tydzień 

Przykrycie pokrowcem nie używanego 

urza˛dzenia 

Czyszczenie i rozmrażanie co 2 miesia˛ce 

i po każdym przerwaniu zasilania pra˛dem 

Przecieranie ścian wewnętrznych i wymiana 

wody co miesia˛c 

Zapis czasu i temperatury każdego 

cyklu 

Zapis temperatury na pocza˛tku każdego 

dnia pracy (zakres temp. 35 

± 1°C) 

Sprawdzenie ustawienia kondensatora 

co miesia˛c 

Umieszczenie w pokrowcu z mikroskopem 

naczynia z błękitem krzemionkowym, 

w celu zapobiegania wzrostowi 

grzybów w wilgotnym środowisku 

Zapis temperatury każdego dnia rano 

(zakres temp.: 2 –8°C) 

Codzienne sprawdzanie poziomu wody 

Zapis temperatury pierwszego dnia każdego 

tygodnia (zakres temp.: 

55 –57°C) 

Przegla˛d 

techniczny 

i konserwacja 

Cotygodniowa 

kontrola uszczelek 

i szczelności 

zamknięcia 

Co 6 miesięcy 

Wymiana szczotek 

co rok 



Co rok 



18


Temperatura 

Urza˛dzenie 

Pokój 

Odczytywać codziennie. Sprawdzić, czy odczytana wartość temperatury jest dopuszczalna. 

W przypadku nieprawidłowości zapisać temperaturę w rubryce. 

Data I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII Data 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

1 1 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

2 2 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

3 3 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

4 4 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

5 5 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

6 6 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

7 7 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

8 8 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

9 9 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

10 10 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

11 11 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

12 12 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

13 13 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

14 14 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

15 15 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

16 16 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

17 17 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

18 18 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

19 19 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

20 20 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

21 21 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

22 22 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

23 23 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

24 24 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

25 25 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

26 26 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

27 27 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

28 28 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

29 29 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

30 30 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

31 31 

Ryc. 2. Zapisy temperatury działaja˛cych urza˛dzeń. 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

19


7. Jeśli pojemnik został otwarty, zapisać datę jego otwarcia. 

8. Wyrzucić wszystkie suche podłoża, które ściemniały lub w których powstały 

zlepione grudki. 

9. Prowadzić rejestr przechowywanych podłoży. 

Przygotowanie podłoża 

1. Należy ściśle przestrzegać zaleceń producenta. 

2. Przygotować ilość, która zostanie zużyta przed upływem terminu przydatności 

(patrz poniżej). 

Tabela 2. Zestaw szczepów zalecanych w kontroli jakości a 

Gram-dodatnie ziarenkowce 

Enterococcus faecalis (ATCC 29212 lub 

33186) 

Staphylococcus aureus (ATCC 25923) 

Staphylococcus epidermidis 

Streptococcus agalactiae 

Streptococcus mitis 

Streptococcus pneumoniae 

Streptococcus pyogenes 

Gram-ujemne kwasooporne bakterie 

Moraxella catarrhalis 

Haemophilus influenzae typ b 

β-laktamazoujemne 

β-laktamazododatnie 

Haemophilus parainfluenzae 

Neisseria gonorrhoeae 

Neisseria meningitidis 

Bakterie beztlenowe 

Bacteroides fragilis 

Clostridium perfringens 

Enterobacteriaceae 

Citrobacter freundii 

Enterobacter cloacae 

Escherichia coli (ATCC 25922) 

Klebsiella pneumoniae 

Proteus mirabilis 

Salmonella typhimurium 

Serratia marcescens 

Shigella flexneri 

Yersinia enterocolitica 

Inne Gram-ujemne pałeczki 

Acinetobacter lwoffi 

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) 

Vibrio cholerae (nie-01) 

Grzyby 

Candida albicans 

a 

Powinny zostać wybrane szczepy najbardziej odpowiadaja˛ce wymaganiom laboratorium. 

Przechowywanie gotowych podłoży 

1. Ochrona przed światłem. 

2. Ochrona przed ciepłem. Podłoża zawierające krew, inne składniki organiczne 

lub antybiotyki powinny być przechowywane w chłodziarce. 

3. Termin przydatności gotowego podłoża, które jest przechowywane w niskiej 

temperaturze, w ciemnym miejscu, zależy od jego składu. 

Przeciętne terminy użyteczności: 

– probówki z bawełnianym korkiem — 3 tygodnie; 

– probówki z nieszczelną nakładką — 2 tygodnie; 

– pojemniki z zakrętką — 3 miesiące; 

– płytki Petriego szczelnie zamknięte w plastikowych woreczkach — 4 tygodnie. 

Kontrola jakości przygotowanych podłoży 

1. Oznaczenie pH. Wartość pH prawidłowo przygotowywanych sypkich podłoży 

nie musi być rutynowo sprawdzana. Podłoża przygotowywane ze składników 

20


Tabela 3. Testy kontrolne dla powszechnie stosowanych podłoży 

Podłoże Inkubacja Organizm wskaźnikowy Oczekiwany wynik 

Agar z żółcia˛ i eskulina˛ 24 h Enterococcus faecalis Wzrost i zaczernienie 

Streptococcus α-hemolizuja˛cy Brak wzrostu 

Agar z krwia˛ 24 h, CO 2 Streptococcus pyogenes Wzrost i β-hemoliza 

S. pneumoniae Wzrost i α-hemoliza 

Agar czekoladowy 24 h, CO 2 Haemophilus influenzae Wzrost 

Dekarboksylaza (pokryta sterylnym 

olejem) 

– lizyny 48 h Shigella typhimurium Dodatni 


Ujemny 

– ornityny 48 h S. typhimurium Dodatni 


Ujemny 

Dihydrolaza 

– argininy 48 h S. typhimurium Dodatni 

Proteus mirabilis 

Ujemny 

Żelatynaza (szybki test) 24 h Escherichia coli Ujemny 

Serratia marcescens 

Dodatni 

Agar Kliglera (patrz Trójcukrowy agar 

żelazowy) 

Agar MacConkeya z fioletem krystalicznym 

24 h E. coli Czerwone kolonie 

P. mirabilis Bezbarwne kolonie (brak wzrostu 

mgławicowego) 

E. faecalis Brak wzrostu 

Bulion malonianowy 24 h E. coli Ujemny (kolor zielony) 

K. pneumoniae Dodatni (kolor niebieski) 

Agar z mannitolem 24 h Staphylococcus aureus Żółte kolonie 

Staphylococcus epidermidis Różowe kolonie 

E. coli Brak wzrostu 

Czerwień metylowa/Voges-Proskauer 48 h E. coli Dodatni/ujemny 

K. pneumoniae Ujemny/dodatni 

Agar Mueller-Hintona 24 h E. coli ATCC 25922 

S. aureus ATCC 25923 

Pseudomonas aeruginosa ATCC 

27853 

Bulion azotanowy 24 h E. coli Dodatni 

Acinetobacter lwofii 

Ujemny 

Utlenianie/fermentacja dekstrozy (bez 

oleju) 

Akceptowane rozmiary strefy zahamowania 

(tab. 24, str. 126) 

24 h P. aeruginosa Utlenianie na powierzchni 

A. lwofii Brak reakcji 

Woda peptonowa (indol) 24 h E. coli Dodatni 

K. pneumoniae Ujemny 

Deaminaza fenyloalaniny/chlorek żelaza 

Salmonella-Shigella agar lub agar z cytrynianem 

deoksycholanu 

24 h E. coli Ujemny 

P. mirabilis Dodatni 

24 h E. coli Bez wzrostu 

S. typhimurium Bezbarwne kolonie 


Bezbarwne kolonie 

S. flexneri Bezbarwne kolonie 

Bulion seleninowy 24 h S. typhimurium Wzrost po przesianiu 

E. coli Brak wzrostu po przesianiu 

Agar cytrynianowy Simmonsa (inkubacja 

z luźna˛ zakrętka˛) 

Agar z solami żółci i cytrynianem tiosiarczanowym 

48 h E. coli Brak wzrostu 

K. pneumoniae Wzrost, kolor niebieski 

24 h Vibrio spp. (nieaglutynuja˛ce) Żółte kolonie 

Agar Thayer-Martina 24 h, CO 2 Neisseria meningitidis Wzrost 


Wzrost 

Staphylococcus spp. 

Brak wzrostu 

E. coli Brak wzrostu 

C. albicans Brak wzrostu 

Bulion tioglikolanowy 24 h Bacteroides fragilis Wzrost 

21


Tabela 3 cd. 

a 

Podłoże Inkubacja Organizm wskaźnikowy Oczekiwany wynik 

Trójcukrowy agar żelazowy (głębokość 

co najmniej 2,5 cm; inkubacja z luźna˛ 

zakrętka˛) 

24 h Citrobacter freundii A/A gaz a +H 2 S 

S. typhimurium K/A gaz a +H 2 S 

S. flexneri K/A gaz a 

A. lwofii Brak reakcji 

Podłoże z mocznikiem 24 h E. coli Ujemny 

P. mirabilis Dodatni (różowy) 

Voges-Proskauer (patrz Czerwień metylowa/Voges-Proskauer) 

A/A: punkt kwaśny; K/A: punkt zasadowy. 

podstawowych należy wcześniej schłodzić. W przypadku stałych podłoży do 

oznaczenia pH należy użyć powierzchniowej elektrody lub rozmiękczyć 

podłoże w wodzie destylowanej. Jeśli pH różni się od zalecanego więcej niż 

o 0,2 jednostki, należy je skorygować kwasem lub zasadą, lub przygotować 

nową partię. 

2. Kontrola sterylności. Testy sterylności powinny być przeprowadzane rutynowo 

dla podłoży, do których po sterylizacji w autoklawie dodano krew lub inne 

składniki. 3–5% próbek należy poddać inkubacji w temperaturze 35°C przez 

2 dni. Pozostałe schłodzić. Jeśli na płytce pojawią się więcej niż dwie kolonie, 

należy odrzucić całą badaną partię. 

3. Kontrola jakości. Laboratorium powinno mieć zapas zestawów szczepów 

wzorcowych do monitorowania jakości podłoży. Lista zalecanych szczepów 

wzorcowych została przedstawiona w tabeli 2. Szczepy te mogą być uzyskane 

w trakcie rutynowej pracy lub pochodzić z komercyjnych czy też oficjalnych 

źródeł. Rekomendacje dotyczące utrzymania i wykorzystania szczepów 

wzorcowych opisane zostały na str. 24. 

Lista testów przeprowadzanych dla powszechnie używanych podłoży przedstawiona 

została w tabeli 3. 

Procedury postępowania przy ocenie jakości nowych partii podłoża: 

1. Przygotować lekko mętną zawiesinę szczepów kontrolnych, porównującjąze 

wzorcem standardowego roztworu siarczanu baru używanego w zmodyfikowanej 

metodzie Kirby-Bauera (McFarland 0,5) (patrz str. 125) i użyć jedno 

oczko ezy jako inoculum. 

2. Inkubować przez rutynowo stosowany okres i odczytać zgodnie z przyjętymi 

zasadami. 

3. Właściwie zapisać wyniki. 

Barwniki i odczynniki 

Zalecenia dotyczące testowania niektórych odczynników przedstawiono w tabeli 

4. Testy powinny być przeprowadzane: 

– za każdym razem przy przygotowywaniu nowej partii roztworu roboczego; 

– co tydzień (niezbędne w przypadku zimnego barwnika Ziehl-Neelsena: 

klasyczny ma kilkumiesięczny termin przydatności). 

Odczynniki i barwniki powinny być dyskwalifikowane, jeśli: 

– termin ważności określony przez producenta jest przekroczony; 

– widoczne są oznaki psucia (zmętnienie, osad, zmiana barwy). 

22


Antygeny i surowice odpornościowe 

do diagnostyki 

W celu otrzymania możliwie najlepszych wyników badań zużyciem antygenów 

i surowic odpornościowych należy: 

• Zawsze przestrzegać instrukcji producenta. 

• Przechowywać w zalecanej temperaturze. Niektóre odczynniki serologiczne 

nie tolerują zamrażania. 

Tabela 4. Testy jakości powszechnie stosowanych odczynników 

Odczynnik lub barwnik 

Gatunek użyty do testowania 

Wzrost 

Brak wzrostu 

Podłoże 

Kra˛żek z bacytracyna˛ 

S. pyogenes (strefa zahamowania) 

E. faecalis Agar z krwia˛ 

Katalaza S. aureus E. faecalis Agar tryptozowo-sojowy 

Osocze do koagulazy S. aureus S. epidermidis Agar tryptozowo-sojowy 

β-Glukuronidaza (PGUA) a E. coli K. pneumoniae Agar tryptozowo-sojowy 

Barwienie metoda˛ Grama Staphylococcus spp. E. coli Preparaty z mieszanki 

szczepów 

ONPG b E. coli S. typhimurium Trójcukrowy agar żelazowy 

lub agar Kliglera 

Kra˛żek z optochina˛ 

S. pneumoniae (strefa zahamowania) 

Streptococcus mitis Agar z krwia˛ 

Oksydaza Pseudomonas aeruginosa E. coli Agar tryptozowo-sojowy 

Kra˛żek z tellurydem 

E. faecalis (brak strefy zahamowania) 


(strefa zahamowania) 

Agar z krwia˛ 

Czynnik V (kra˛żek lub pasek) Haemophilus parainfluenzae Haemophilus influenzae Agar tryptozowo-sojowy 

Czynnik XV (kra˛żek lub pasek) H. influenzae Agar tryptozowo-sojowy 

Barwienie metoda˛ Ziehl-Neelsena Mycobacterium tuberculosis Mieszana, niekwasooporna 

flora 

Preparat z rozmazem 

z plwociny c 

a 

Kwas 4-nitrofenylo-β-D-glukopiranozydouronowy (PGUA). 

b 

o-Nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd. 

c 

Przygotować wymazy od pacjentów zdrowych i chorych. Utrwalić w cieple, owina˛ć każdy papierem i przechowywać 

wchłodziarce. 

• Unikać powtarzanych zamrożeń i rozmrożeń. Przed zamrożeniem podzielić 

surowicę na odpowiednie porcje, wystarczające do wykonania kilku 

testów. 

• Wyrzucić, jeśli upłynął termin ważności podany przez producenta. 

• Do testu aglutynacji z surowicami odpornościowymi należy używać zawsze 

świeżych, czystych, zidentyfikowanych hodowli. 

• Zawsze, w każdej serii badań, wykonać test z surowicą kontrolną o znanej 

reaktywności. Surowica może pochodzić od pacjenta lub z komercyjnego 

źródła. 

• Jeśli to możliwe, aktywność surowicy powinna być wyrażana w jednostkach 

międzynarodowych (International Units, IU) na mililitr. 

• Pary surowic, pobranych od jednego pacjenta w ostrej fazie choroby i w fazie 

zdrowienia, powinny być badane z użyciem odczynników z tej samej 

partii. 

• Diagnostykę serologiczną kiły prowadzić zgodnie z przyjętymi krajowymi 

i międzynarodowymi procedurami. 

• Każda partia testów serologicznych powinna zawierać: 

– surowicę ujemną (kontrola swoistości); 

23


– surowicę słabo dodatnią (kontrola czułości); 

– surowicę silnie dodatnią (kontrola miareczkowania), która powinna być 

przygotowana w rozcieńczeniu odpowiadającym jej mianu uzyskanemu 

w ostatnio wykonywanym teście. 

• Zawsze zapisywać wszystkie miana surowic kontrolnych. 

Oznaczanie wrażliwości na antybiotyki 

Zalecane jest rutynowe stosowanie zmodyfikowanej metody Kirby-Bauera (str. 

125). W celu uniknięcia błędów, należy przestrzegać poniższych zasad: 

• Krążki powinny mieć właściwą średnicę (6,35 mm). 

• Krążki powinny zawierać właściwe stężenie antybiotyku (tabela 24, str. 126). 

• Zapas krążków powinien być przechowywany w zamrażarce (–20°C). 

• Zestaw podręczny powinien być przechowywany nie dłużej niż 1 miesiąc 

wchłodziarce (2 – 8°C). 

• Do przeprowadzania badania jakości należy używać tylko agaru Mueller- 

-Hintona. 

• Właściwe pH (7,2 – 7,4) gotowego podłoża jest bardzo istotne w przypadku 

niektórych antybiotyków. 

• Gęstość inoculum powinna być standaryzowana, określona na podstawie 

wzorca zmętnienia (str. 127). 

• Pomiar wielkości strefy powinien być dokładny. 

• Uzyskana średnica strefy zahamowania wzrostu powinna być interpretowana 

według wartości granicznych podanych w tabeli. Średnica strefy 

dla szczepów kontrolnych powinna zgadzać się z zakresami podanymi w tabeli 

24 (str. 126). 

• Trzy standardowe szczepy kontrolne, to 1 : 

– Staphylococcus aureus (ATCC 25923; NCTC 6571); 

– Escherichia coli (ATCC 25922; NCTC 10418); 

– Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853; NCTC 10622). 

• Badania kontrolne z wykorzystaniem wymienionych szczepów powinny być 

przeprowadzane: 

– dla każdej nowej partii krążków; 

– dla każdej nowej partii podłoży; 

– raz w tygodniu, równolegle do antybiogramów wykonywanych rutynowo. 

• W celu zapisu i interpretacji wyników kontroli jakości, zalecane jest stosowanie 

wykresu przedstawionego na ryc. 16 (str. 137). 

Pozyskiwanie i przechowywanie 

szczepów kontrolnych 

Wybór szczepów iźródło ich pochodzenia 

Należy wybrać szczepy, których maksymalna liczba morfologicznych, metabolicznych 

i serologicznych cech może być identyfikowana możliwie najmniejszą 

liczbą testów; zalecane szczepy kontrolne zebrano w tabeli 2. 

1 

Wymienione szczepy mogą być uzyskane z: American Type Culture Collection (ATCC), 10801 

University Boulevard, Manassas, VA 20110, USA; lub National Collection of Type Cultures (NCTC), 

PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, England. 

24


Szczepy te można uzyskać z następujących źródeł: 

– prawidłowo zidentyfikowane izolaty z próbek klinicznych; 

– oficjalne kolekcje szczepów; 

– komercyjni producenci; 

– referencyjne laboratoria; 

– inne źródła z zewnętrzną kontrolą jakości. 

Przechowywanie szczepów 

Długoterminowe przechowywanie szczepów 

Metody długoterminowego przechowywania szczepów pozwalają na kilkumiesięczne 

lub nawet kilkuletnie przerwy między przesiewami. Najlepszymi 

metodami są: liofilizacja (suchy lód), przechowywanie w zamrażarce lub 

w ciekłym azocie, w temperaturze –70°C lub niższej. Metody alternatywne 

opisano poniżej. 

Glicerol w temperaturze –20°C 

1. Wzrost czystych hodowli na odpowiednim stałym podłożu. 

2. Wyrosłe kolonie zebrać ezą. 

3. Zawiesić niewielką ilość materiału w sterylnym neutralnym glicerolu. 

4. Umieścić 1 – 2 ml porcje w zakręcanych pojemnikach lub w fiolkach. 

5. Przechowywać w temperaturze –20°C. Unikać powtarzania zamrożeń i rozmrożeń. 

Przesiewać co 12 – 18 miesięcy. 

Olej mineralny w temperaturze pokojowej 1 

1. Przygotować probówki ze skosem agarowym zawierającym wyciąg z serca. 

Dla wymagających mikroorganizmów dodać świeżą lub ogrzaną krew. 

2. Wysterylizować olej mineralny (liquid petrolatum) w suchym gorącym 

powietrzu (170°C przez godzinę). 

3. Posiać szczep na skosy agarowe. 

4. Jeśli widoczny jest wzrost hodowli, dodać sterylny olej mineralny na wysokość 

około 1 cm ponad poziom agaru. 

5. Konieczne przesiewy uzyskuje się przez zebranie hodowli spod warstwy oleju. 

6. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Przesiewać co 6 – 12 miesięcy. 

Przechowywanie hodowli w temperaturze pokojowej (stosowane tylko dla 

niewymagających bakterii, takich jak gronkowce i Enterobacteriaceae) 

1. Przygotować probówki z wysokim słupkiem agaru, bez węglowodanu. 

Zalecany jest agar tryptozowo-sojowy (trawiony kazeiną agar sojowy). 

2. Posiać szczepy wkłuwając je w agar. 

3. Inkubować przez noc w temperaturze 35°C. 

4. Zamknąć probówkę zakrętką lub korkiem. W celu uszczelnienia zanurzyć 

zakrętkę lub korek w płynnej parafinie. 

5. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Przesiewać raz w roku. 

1 

Morton H.E., Pulaski E.J.: The preservation of bacterial cultures. Journal of Bacteriology, 1938, 

38: 163 – 183. 

25


Przechowywanie szczepów na agarze cysteinowo-tryptozowym (CTA) (dla 

Neisseria i paciorkowców) 

1. Przygotować probówki zawierające podstawowe podłoże CTA. 

2. Posiać wkłuwając bakterie w podłoże. 


4. Zamknąć probówkę zakrętką lub korkiem. W celu uszczelnienia zanurzyć 

zakrętkę lub korek w płynnej parafinie. 

5. W przypadku Neisseria, przechowywać w temperaturze 35°C i przesiewać co 

2 tygodnie. W przypadku paciorkowców, przechowywać w temperaturze 

pokojowej i przesiewać co miesiąc. 

Podłoża z wyciągiem mięsnym dla bakterii beztlenowych 

1. Posiać szczepy. 


3. Zamknąć probówkę zakrętką lub korkiem. 

4. Przechowywać w temperaturze pokojowej i przesiewać co 2 miesiące. 

Krótkoterminowe przechowywanie szczepów 

Hodowle szczepów kontrolnych, aktualnie wykorzystywane do badań rutynowych, 

mogą być przygotowywane w poniższy sposób. 

Szybko rosnące mikroorganizmy 

1. Posiać na skos agarowy tryptozowo-sojowy w zakręcanych probówkach. 


3. Przechowywać wchłodziarce. Przesiewać co 2 tygodnie. 

Paciorkowce 

1. Posiać na skos agarowy z krwią w zakręcanych probówkach. 


3. Przechowywać wchłodziarce. Przesiewać co 2 tygodnie. 

Meningokoki i Haemophilus 

1. Posiać na skos lub płytkę z agarem czekoladowym. 


3. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Przesiewać 2 razy w tygodniu. 

Gonokoki 

1. Posiać na agar czekoladowy. 

2. Inkubować przez noc w temperaturze 35°C. Przesiewać co 2 dni. 

3. Zastępować szczepy kontrolne nowymi klinicznymi izolatami. 

26


Rola referencyjnych laboratoriów 

Poniższe rodzaje materiałów do badań powinny być przesyłane do regionalnych 

lub centralnych laboratoriów referencyjnych: 

– materiały badane w kierunku rzadko izolowanych drobnoustrojów lub wymagające 

zastosowania wysoko specjalistycznych testów (np.: wirusologia, 

diagnostyka serologiczna chorób pasożytniczych); 

– pojedyncze duplikaty materiałów do badań, w celu kontroli wydawanych przez 

laboratorium wyników; 

– materiały wymagające w przyszłości badań potwierdzających, różnicujących, 

oznaczania grup bądź typów patogenów o dużym znaczeniu dla zdrowia 

publicznego (np.: Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae, Brucella, meningokoki 

i pneumokoki). 

Referencyjne laboratoria powinny dostarczać zestawy szczepów kontrolnych 

oraz, na potrzeby szkoleń, standardowe surowice i odczynniki używane w laboratorium 

referencyjnym. 

Jeśli laboratorium nie jest objęte programem zewnętrznej kontroli jakości, 

referencyjne laboratorium jest zobowiązane do przygotowywania ślepych, kodowanych 

próbek i hodowli, które służą do kontroli jakości pracy laboratorium 

w zakresie izolacji i hodowli. 

Zewnętrzna kontrola jakości 

W części tej omówiono elementy podlegające ocenie w programie zewnętrznej 

kontroli jakości (określanym jako ,,program testowania biegłości’’). 

Cele 

Celem programu kontroli jakości jest: 

– zagwarantowanie lekarzom i społeczeństwu dobrej jakości diagnostyki laboratoryjnej; 

– ocena i porównanie wiarygodności wyników laboratoryjnych w skali kraju; 

– identyfikacja powszechnie popełnianych błędów; 

– motywacja do przestrzegania ujednoliconych procedur; 

– motywacja do używania standardowych odczynników; 

– podjęcie czynności administracyjnych (łącznie z cofnięciem licencji) wobec 

laboratoriów nie spełniających standardów; 

– motywacja do wprowadzenia wewnętrznych programów jakości. 

Zasady kontroli 

Zewnętrzna kontrola jakości polega na wysyłaniu kodowanych próbek do 

uczestniczących w niej laboratoriów. Powyższe próbki powinny być włączone do 

badań rutynowych, traktowane i badane dokładnie w ten sam sposób, jak próbki 

kliniczne. 

Kontrolę należy prowadzić zgodnie z poniższymi zaleceniami: 

– powinna być przeprowadzana co najmniej 4 razy w roku; 

– powinna obejmować co najmniej 3 próbki; 

– czas na przygotowanie sprawozdania powinien być krótki, np. 2 tygodnie od 

otrzymania materiału do badań; 

27


– instrukcje i formularze dotyczące sprawozdania powinny być dołączone do 

każdego zestawu próbek, a raport powinien być przygotowany w dwóch 

kopiach i przesłany w ściśle ustalonym terminie. 

Hodowle 

Hodowle powinny być włączone do identyfikacji i oznaczania wrażliwości na 

określoną liczbę antybiotyków; może to być czysta hodowla lub mieszanina 

dwóch lub więcej szczepów. 

Hodowle powinny należeć do co najmniej 3 pierwszych z poniższych 6 grup: 

1. Bakterie o dużym znaczeniu dla zdrowia publicznego, które są rzadko 

izolowane w rutynowej diagnostyce, np.: Corynebacterium diphtheriae, 

Salmonella paratyphi A. 

UWAGA: Brucella i Salmonella typhi nie powinny być wykorzystywane 

w programach kontroli jakości, ponieważ mogą wywoływać poważne, 

przypadkowe zakażenia. 

2. Nietypowe biotypy, które są często identyfikowane nieprawidłowo, np.: 

H 2 S-dodatnie Escherichia coli, laktozoujemne E. coli, ureazoujemne Proteus. 

3. Nowe lub oportunistyczne patogeny, np.: Yersinia enterocolitica, Vibrio 

parahaemolyticus, Burkholderia, Pseudomonas cepacia. 

4. Mieszane hodowle Shigella, Citrobacter, E. coli i Klebsiella mogą zostać 

wykorzystane w celu oceny zdolności laboratorium do izolacji patogenów 

spośród wielu mikroorganizmów komensalnych. 

5. Mieszane hodowle niepatogennych mikroorganizmów mogą zostać wykorzystane 

w celu oceny zdolności rozpoznawania próbek ujemnych. 

6. Bakterie o specyficznym wzorze oporności, np.: metycylinooporny S. aureus 

(MRSA). 

Surowice 

Program kontroli jakości powinien obejmować także badania serologiczne 

stosowane w poniższych zakażeniach: 

– kiła, 

– różyczka, 

– bruceloza, 

– infekcje paciorkowcowe, 

– dur brzuszny. 

Ocena i przedstawienie wyników 

Gdy wszystkie objęte programem kontroli laboratoria dostarczą swoje wyniki, 

należy przesłać im zestaw prawidłowych odpowiedzi. W ciągu miesiąca do 

laboratoriów powinny zostać wysłane sprawozdania z analizą wyników. Każde 

laboratorium oceniane jest według punktacji. Laboratorium powinno mieć 

nadany, sobie tylko znany numer. W ten sposób może porównać własne rezultaty 

z wynikami innych laboratoriów, które pozostają anonimowe. 

28

Część I 

Badania bakteriologiczne 

29

Krew 

Wprowadzenie 

Hodowle z krwi prowadzone są w celu izolacji i identyfikacji bakterii lub innych 

możliwych do wyhodowania mikroorganizmów (drożdże, grzyby nitkowate). 

Obecność powyższych drobnoustrojów we krwi określa się mianem bakteriemii 

lub fungemii, która zazwyczaj jest stanem patologicznym. U zdrowych osób krew 

jest jałowa. Istnieje jednak kilka wyjątków: okresowa bakteriemia, która pojawia 

się krótko po ekstrakcji zęba lub po innych zabiegach stomatologicznych 

i chirurgicznych w obrębie zakażonych błon śluzowych, po bronchoskopii lub po 

cewnikowaniu pęcherza. Opisany typ bakteriemi dotyczy zwykle bakterii komensalnych 

i zazwyczaj przemija samoistnie dzięki fagocytozie zachodzącej w wątrobie 

i śledzionie. 

Sepsa jest terminem klinicznym, określającym bakteriemię z objawami klinicznymi 

ciężkiej infekcji, takimi jak: dreszcze, gorączka, złe samopoczucie i spadek 

ciśnienia tętniczego. Skrajną postacią sepsy jest wstrząs. Wstrząs może być 

wywołany toksynami produkowanymi przez Gram-ujemne pałeczki lub Gram- 

-dodatnie ziarenkowce. 

Kiedy i u kogo może wysta˛pić bakteriemia 

Bakteriemia jest cechą niektórych chorób zakaźnych, np.: brucelozy, leptospirozy 

i duru brzusznego. Przewlekła bakteriemia występuje w zakażeniach łożyska 

naczyniowego, np.: w zapaleniu wsierdzia (endocarditis), zakażonym tętniaku 

i w zakrzepowym zapaleniu żył (thrombophlebitis). 

Przejściowa bakteriemia często towarzyszy zlokalizowanym infekcjom, takim 

jak: zapalenie stawów (arthritis), odleżyny, zapalenie pęcherzyka żółciowego 

(cholecystitis), zapalenie jelita cienkiego i okrężnicy (enterocolitis), zapalenie 

opon mózgowo-rdzeniowych (meningitis), zapalenie szpiku (osteomyelitis), 

zapalenie otrzewnej (peritonitis), zapalenie płuc (pneumonia), odmiedniczkowe 

zapalenie nerek (pyelonephritis) oraz zakażenia ran pourazowych i chirurgicznych. 

Może pojawić się w wyniku różnych interwencji chirurgicznych, lecz 

u zdrowych osób zwykle ustępuje samoistnie. 

Bakteriemia i fungemia mogą być pochodzenia jatrogennego i wystąpić w wyniku 

wprowadzenia mikroorganizmów drogą dożylną: przez skażony płyn podawany 

dożylnie, cewnik lub miejsce wkłucia. Obydwa typy infekcji mogą wystąpić 

u osób przyjmujących dożylnie narkotyki oraz u osób w immunosupresji, do 

których zalicza się pacjentów zakażonych ludzkim wirusem upośledzenia 

odporności — z zespołem nabytego upośledzenia odporności (HIV/AIDS). Są one 

często wynikiem zakażeń ,,oportunistycznymi’’ mikroorganizmami i mogą mieć 

poważne konsekwencje. W tabeli 5 przedstawiono najczęstsze przyczyny bakteriemii 

i fungemii. 

30

CZE˛ŚĆ I 

Pobieranie próbek krwi 

Czas pobrania próbki 

Jeśli to możliwe, krew powinna zostać pobrana przed zastosowaniem antybiotyków. 

Najlepiej przed wystąpieniem dreszczy lub szczytu temperatury. 

Zaleca się pobranie dwu lub korzystniej trzech próbek krwi w około godzinnych 

odstępach (lub krótszych, jeśli nie można opóźniać rozpoczęcia leczenia). Rzadko 

wskazane jest pobranie więcej niż trzech próbek. Zalety powtarzanych hodowli 

z krwi, to: 

– zmniejszone prawdopodobieństwo przeoczenia przejściowej bakteriemii; 

– potwierdzenie patogennej roli ,,saprofitycznych izolatów (np.: Staphylococcus 

epidermidis) przez wykazanie ich obecności w próbkach z kilku wkłuć. 

Tabela 5. Częste przyczyny bakteriemii i fungemii 

Gram-ujemne mikroorganizmy 

Gram-dodatnie mikroorganizmy 

Escherichia coli 

Staphylococcus aureus 

Klebsiella spp. 

S. epidermidis 

Enterobacter spp. 

α-Hemolizuja˛ce (zielenieja˛ce paciorkowce) 

Proteus spp. 


Salmonella typhi E. faecalis (grupa D) 

Salmonella spp., inne niż S. typhi S. pyogenes (grupa A) 

Pseudomonas aeruginosa S. agalactiae (grupa B) 


Listeria monocytogenes 

Haemophilus influenzae 


Bacteroides fragilis (beztlenowe) 

Peptostreptococcus spp. (beztlenowe) 

Brucella spp. 

Candida albicans i inne drożdżopodobne 

Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei grzyby (np. Cryptococcus neoformans) 

(w niektórych regionach) 

Ważne jest pobranie próbek krwi przed wprowadzeniem antybiotykoterapii 

empirycznej. Jeśli to konieczne, wybór antybiotyków może zostać zmodyfikowany 

po uzyskaniu wyników antybiogramu. 

Objętość próbki krwi 

Ponieważ liczba bakterii w mililitrze krwi jest zwykle mała, ważne jest pobranie 

właściwej objętości krwi: 10 ml z wkłucia u dorosłych; 2 – 5 ml mogą być 

wystarczające u dzieci, u których zwykle bakteriemia osiąga wyższe wartości; 

u niemowląt i noworodków często można uzyskać maksymalnie 1 – 2 ml. Każda 

próbka powinna być posiana do dwóch butelek: pierwszej do optymalnej hodowli 

ściśle tlenowych mikroorganizmów, drugiej dla szczepów beztlenowych. 

Dezynfekcja skóry 

Skóra w miejscu wkłucia powinna być starannie przygotowana, z użyciem 

bakteriobójczego preparatu dezynfekującego: 2% roztworu jodyny, 10% roztworu 

poliwidonu jodyny, 70% alkoholu lub 0,5% roztworu chlorheksydyny w 70% 

alkoholu. Przed pobraniem krwi środek dezynfekujący powinien odparować 

z powierzchni skóry. W celu uniknięcia ewentualnych podrażnień przy stosowaniu 

jodyny skórę należy przetrzeć 70% alkoholem. 

31

KREW 

Nawet po starannym przygotowaniu skóry niektóre bakterie mogą przetrwać 

wgłębszych warstwach i przedostać się do krwi, np.: S. epidermidis, Propionibacterium 

acnes, przetrwalniki Clostridium. 

Pseudobakteriemia (fałszywie dodatnie hodowle z krwi) może być efektem użycia 

skażonych roztworów dezynfekujących, strzykawek lub igieł. 

Powtarzalne izolacje nie występujących powszechnie mikroorganizmów (np.: 

Burkholderia (Pseudomonas) cepacia, Pantoea (Enterobacter) agglomerans lub 

Serratia spp.) z jednego szpitala wzbudzają podejrzenie zakażenia szpitalnego 

i wymagają szczegółowych badań. Inną przyczyną skażenia próbki jest kontakt 

igły z niesterylnymi probówkami (lub roztworami), jeśli ta sama strzykawka 

została wcześniej użyta do pobrania krwi do badań biochemicznych lub odczynu 

opadania krwinek czerwonych (OB — odczyn Biernackiego — przyp. tłum.). 

Antykoagulant 

Zalecane jest użycie jako środka przeciwkrzepliwego polianetosulfonianu sodu 

(sodium polyanethol sulfonate — SPS), ponieważ hamuje on jednocześnie 

aktywność przeciwbakteryjną osocza i fagocytów. Jeśli natychmiast po pobraniu 

krew zostanie dodana do wystarczającej objętości (50 ml) bulionu i dokładnie 

wymieszana w celu uniknięcia tworzenia się skrzepów, zastosowanie antykoagulantu 

nie jest konieczne. Każdy szpital i większość ośrodków zdrowia 

powinna być wyposażona w butelki z podłożem do posiewu krwi. Jeśli płynne 

podłoże jest niedostępne, krew należy przesłać do laboratorium w probówce 

zawierającej sterylny roztwór antykoagulantu (cytrynian, heparyna lub SPS). 

W laboratorium próbka krwi natychmiast po otrzymaniu powinna zostać 

w warunkach aseptycznych przeniesiona do butelki z podłożem. Jeśli krew 

pobrana jest bez antykoagulantu, skrzep w laboratorium może zostać w aseptycznych 

warunkach przeniesiony do bulionu, a surowica wykorzystana do wykonania 

niektórych testów serologicznych (np.: odczyn Widala). 

Podłoża do posiewu krwi 

Wybór podłoży płynnych 

Bulion do posiewu z krwi i bulion tryptozowo-sojowy (TSB) powinny umożliwić 

wzrost wszystkich bakterii o znaczeniu klinicznym. 

Objętość bulionu 

Optymalnie krew powinna być wymieszana z bulionem w stosunku 1:10 (5 ml 

krwi w 50 ml podłoża), co zmniejsza stężenie antybiotyku i redukuje aktywność 

przeciwbakteryjną ludzkiego osocza. 

Butelki z podłożem do posiewu krwi 

Należy używać butelek z podłożem do posiewu krwi (125 ml), z podwójną 

nakrętką, której drugą warstwę stanowi gumowy krążek. Po napełnieniu butelki 

32

CZE˛ŚĆ I 

50 ml podłoża odkręcić nakrętkę opół obrotu. Nakryć zamknięcie kwadratowym 

fragmentem folii aluminiowej i umieścić butelkę w autoklawie w 120°C na 

20 minut. Natychmiast po autoklawowaniu, gdy butelka i podłoże sąjeszcze 

gorące, delikatnie dokręcić nakrętkę, bez usuwania folii aluminiowej (w innym 

przypadku nakrętka nie będzie sterylna). Podczas stygnięcia podłoża wytwarza się 

częściowa próżnia, która ułatwi wprowadzenie próbki krwi przez gumową 

warstwę. 

Tuż przed wprowadzeniem materiału do butelki należy starannie zdezynfekować 

gumową część nakrętki. 

Przed wydaniem gotowej butelki z podłożem i przed jej użyciem powinno się 

sprawdzić przejrzystość zawartości. Podłoże, które wykazuje zmętnienie, nie 

powinno zostać użyte. 

Jeśli podejrzewa się obecność bakterii tlenowych (Pseudomonas, Neisseria) lub 

drożdży, w laboratorium po otrzymaniu próbki należy zdezynfekować gumową 

część nakrętki i przekłuć ją sterylną igłą z bawełnianą zatyczką. Igła może zostać 

usunięta w chwili, gdy ciśnienie wewnątrz butelki osiągnie wartość ciśnienia 

atmosferycznego. Komercyjne butelki do posiewu krwi zawierają dwutlenek 

węgla stymulujący wzrost. W krajach, gdzie powszechnie występuje bruceloza, 

zalecane jest stosowanie, umożliwiającego wzrost Brucella spp., dwufazowego 

podłoża, złożonego z bulionu oraz stałej warstwy agaru na jednej z gładkich 

powierzchni naczynia (Castaneda bottle). Do hodowli większości szczepów 

B. abortus wymagana jest obecność dwutlenku węgla. 

Prowadzenie hodowli z krwi 

Czas inkubacji 

Butelki do posiewu krwi powinny być inkubowane w 35 – 37°C i kontrolowane 

dwukrotnie w ciągu dnia (co najmniej przez pierwsze 3 dni) w celu oceny cech 

mikrobiologicznych wzrostu. Jałowe posiewy zwykle zawierają warstwę osadu 

krwi, pokrytą jasnożółtym przezroczystym bulionem. Dowodem wzrostu są: 

– kłaczkowaty osad na powierzchni warstwy krwi, 

– jednolite lub podpowierzchniowe zmętnienie, 

– hemoliza, 

– koagulacja bulionu, 

– kożuszek na powierzchni, 

– wytwarzanie gazu, 

– białe ziarna na powierzchni lub w głębszej warstwie krwi. 

Kiedy tylko pojawi się wzrost, butelkę należy otworzyć w warunkach aseptycznych, 

pobrać sterylną ezą lub pipetą Pasteura niewielką ilość bulionu i przygotować 

rozmaz barwiony metodą Grama w celu oceny obecności mikroorganizmów. 

Jednocześnie należy wykonać przesiew ezą na odpowiednie podłoża: 

– dla Gram-ujemnych pałeczek: agar MacConkeya, agar Kliglera, podłoże 

ruch-indol-ureaza (MIU), cytrynianowy agar Simmonsa; 

– dla małych Gram-ujemnych pałeczek: agar z krwią; 

– dla gronkowców: agar z krwią, agar z mannitolem; 

– dla paciorkowców: agar z krwią, z krążkiem z optochiną, bacytracyną 

i telurynem, agar z krwią baranią do testu CAMP, agar z żółcią i eskuliną. 

33

KREW 

W rutynowych posiewach krwi inkubacja dłuższa niż 7 dni nie jest konieczna. 

W niektórych przypadkach inkubacja może być przedłużona o kolejne 7 dni, na 

przykład przy podejrzeniu zakażenia pałeczkami Brucella lub innymi mikroorganizmami 

o wysokich wymaganiach odżywczych, w przypadku zapalenia 

wsierdzia lub jeśli pacjent jest w trakcie antybiotykoterapii. 

Próbki krwi z niewidocznym wzrostem 

Niektóre mikroorganizmy mogą rosnąć bez zmętnienia lub widocznych zmian 

w podłożu. Inne, jak na przykład pneumokoki, wykazują tendencję do autolizy 

i szybko giną. Z tego powodu niektóre laboratoria prowadzą rutynowe przesiewy 

na agar czekoladowy po 18 – 24 godzinach inkubacji. Próbki z niewidocznym 

wzrostem mogą być opracowywane w siódmym dniu inkubacji przez przeniesienie 

kilku kropel dobrze zmieszanej hodowli krwi (z użyciem sterylnych pipet 

Pasteura) do probówki z podłożem tioglikolanowym, którą inkubuje się i obserwuje 

przez kolejne 3 dni. 

Antybiogram 

Przy podejrzeniu obecności gronkowców lub Gram-ujemnych pałeczek można 

oszczędzając czas wykonać bezpośredni, niestandaryzowany antybiogram, używając 

dodatnich próbek jako inoculum. Sterylną wymazówkę należy zanurzyć we 

wstrząśniętym podłożu i odsączając nadmiar płynu, posiać na podłoże Mueller- 

-Hintona jak w metodzie standardowej (patrz str. 126). Wstępny odczyt może być 

wykonany po 6 – 8 godzinach inkubacji. W 95% przypadków rezultaty uzyskane 

tą metodą są zgodne ze standaryzowanym testem. 

Zanieczyszczenia 

Zanieczyszczenia hodowli krwi można uniknąć przez staranne przygotowanie 

skóry i dokładne przestrzeganie procedur aseptycznych w czasie posiewu 

i przesiewów. Jednakże nawet w idealnych warunkach 3 – 5% posiewów krwi jest 

,,skażonych’’ bakteriami ze skóry (S. epidermidis, P. acnes, Clostridium spp., 

dyfteroidy) lub ze środowiska (Acinetobacter spp., Bacillus spp.). 

Powyższe mikroorganizmy mogą być w niektórych sytuacjach patogenne, 

wywołując np. zapalenie wsierdzia. Rzeczywistą infekcję należy podejrzewać 

w poniżej wymienionych sytuacjach: 

– jeżeli ten sam organizm wyhodowano z dwóch butelek tej samej próbki krwi; 

– jeżeli ten sam organizm rośnie w hodowli więcej niż jednej próbki; 

– jeżeli wzrost jest szybki (w ciągu 48 godzin); 

– jeżeli różne izolaty jednego gatunku wykazują ten sam biotyp i wzór 

lekowrażliwości. 

Wszystkie wyniki hodowli powinny być przedstawiane lekarzowi łącznie 

z wynikami próbek prawdopodobnie zanieczyszczonych. Jednakże dla tych 

ostatnich nie należy wykonywać antybiogramu, a jedynie umieścić na wyniku 

odpowiedni komentarz, np. Propionibacterium acnes (flora skóry), Staphylococcus 

epidermidis (prawdopodobnie zanieczyszczenie). Jest to istotne dla 

nawiązania dobrej współpracy między lekarzami a personelem laboratorium. 

34

CZE˛ŚĆ I 

Identyfikacja dwóch lub więcej drobnoustrojów z krwi prawdopodobnie wskazuje 

na wieloczynnikową bakteriemię, która może występować u wyniszczonych 

pacjentów, ale może być również rezultatem skażenia próbki. ,,Beztlenowcowa’’ 

bakteriemia często wywołana jest przez kilka patogenów, np. w ciężkiej, 

piorunującej bakteriemii, związanej z poważnym urazem lub zabiegiem chirurgicznym 

na jelicie grubym, występuje jeden lub kilka patogenów beztlenowych 

z jednym lub kilkoma patogenami tlenowymi. 

35

Płyn mózgowo-rdzeniowy 

Wprowadzenie 

Badanie płynu mózgowo-rdzeniowego jest ważne w diagnostyce bakteryjnego 

i grzybiczego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i musi być traktowane jako 

badanie nadrzędne, wymagające właściwej uwagi personelu laboratoryjnego. 

Prawidłowy płyn mózgowo-rdzeniowy jest jałowy i przejrzysty, zwykle zawiera 

trzy lub mniej leukocytów w1mm 3 , nie zawiera erytrocytów. Jego chemiczny 

i cytologiczny skład zmienia się w stanach zapalnych opon mózgowo-rdzeniowych 

i mózgu, np. w zapaleniu mózgu (encephalitis) lub opon mózgowo- 

-rdzeniowych (meningitis). W rozdziale omówione zostanie jedynie badanie 

mikrobiologiczne, choć ocena liczby białych krwinek w płynie mózgowo- 

-rdzeniowym ma także istotne znaczenie. 

Najczęstsze, zależnie od wieku pacjenta, przyczyny zapalenia opon mózgowo- 

-rdzeniowych, zostały wymienione w tabeli 6, należy jednak pamiętać, że 

czynniki te mogą współistnieć. 

Pobieranie i transport próbek 

Podczas wykonywania przez lekarza punkcji lędźwiowej lub komorowej do 

dwóch sterylnych probówek należy pobrać około 5– 10 ml płynu mózgowo- 

-rdzeniowego. Ze względu na niebezpieczeństwo jatrogennego bakteryjnego 

zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, konieczna jest dokładna dezynfekcja 

skóry. Część próbki płynu mózgowo-rdzeniowego jest przeznaczona do przeprowadzenia 

badań biochemicznych i cytologicznych, pozostałą objętość płynu 

wykorzystuje się do badań mikrobiologicznych. Ponieważ komórki szybko 

ulegają rozpadowi, próbka powinna zostać niezwłocznie dostarczona do laboratorium 

i opracowana. Każde opóźnienie może być przyczyną nieprawidłowej oceny 

liczby komórek, nie odzwierciedlającej klinicznego stanu pacjenta. 

Tabela 6. Częste przyczyny bakteryjnego i grzybiczego zapalenia opon mózgowo- 

-rdzeniowych 

U niemowla˛t (do 2 miesia˛ca życia) 


Inne Enterobacteriaceae: Salmonella spp., Citrobacter spp. 


Streptococcus agalactiae (grupa B) 

W innych grupach wiekowych 

Haemophilus influenzae (otoczkowy typ b) a 



Mycobacterium tuberculosis 

Listeria monocytogenes b 

Cryptococcus neoformans b 

Staphylococcus spp. c 

a 

Rzadko powyżej 5. roku życia. 

b 

U pacjentów z niedoborem odporności (ła˛cznie z pacjentami z zespołem nabytego 

niedoboru odporności — AIDS). 

c 

Zwia˛zane z zabiegami neurochirurgicznymi i drenami pooperacyjnymi. 

36

CZE˛ŚĆ I 

Ocena makroskopowa 

Wygląd płynu mózgowo-rdzeniowego powinien być oceniony i opisany jako: 

klarowny, mglisty, mętny, ropny, żółty (związany z hemolizą lub żółtaczką jąder 

podkorowych), z domieszką krwi, z włóknami lub warstwą fibryny. 

Badanie mikroskopowe 

Przygotowanie próbki 

Jeśli w ocenie makroskopowej stwierdza się ropny płyn mózgowo-rdzeniowy 

(bardzo mętny), to badanie można przeprowadzić bez odwirowania. W pozostałych 

przypadkach płyn mózgowo-rdzeniowy powinien zostać odwirowany 

w sterylnej probówce (najlepiej o objętości 15 ml) w 10 000 g przez 5 – 10 minut. 

Usunąć supernatant, używając sterylnej pipety Pasteura z dopasowanym gumowym 

kapturkiem, i przenieść do innej probówki do testów biochemicznych i/lub 

serologicznych. Osad użyć do wykonania dalszych testów mikrobiologicznych. 

Mikroskopia bezpośrednia 

Do badania mikroskopowego użyć kropli osadu umieszczonej między szkiełkiem 

podstawowym i nakrywkowym, oceniając obecność: 

– leukocytów (wielojądrzaste neutrofile lub limfocyty), 

– erytrocytów, 

– bakterii, 

– grzybów. 

Przy podejrzeniu obecności drożdżaków Cryptococcus neoformans na szkiełku 

podstawowym należy zmieszać pobrany ezą osad z tuszem chińskim, nakryć 

szkiełkiem nakrywkowym i oglądać preparat, poszukując typowych, otoczkowych, 

sferycznych form grzybów. 

W regionach, w których występuje śpiączka afrykańska, konieczne jest uważne 

poszukiwanie aktywnego ruchu wyposażonych w witkę świdrowców z rodzaju 

Trypanosoma. 

Wolno żyjące w wodzie ameby (Naegleria fowleri), które dostają się do 

ośrodkowego układu nerwowego przez nos, wywołują rzadkie i zazwyczaj 

śmiertelne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Mogą być widoczne w preparacie 

bezpośrednim w postaci aktywnie poruszających się ogranizmów, wielkością 

zbliżonych do neutrofilów. 

Barwienie preparatów metoda˛ Grama 

Czynniki wywołujące zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych są często widoczne 

w preparatach barwionych metodą Grama, stąd badanie to jest bardzo istotne. 

Preparaty należy wysuszyć na powietrzu, utrwalić łagodnie podgrzewając 

i wybarwić metodą Grama. Oglądać pod powiększeniem ×1000 (w immersji) 

przez co najmniej 10 minut lub do chwili stwierdzenia obecności bakterii. 

W tabeli 7 przedstawiono ważne obserwacje diagnostyczne związane z różnymi 

formami zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. 

37

PŁYN MÓZGOWO-RDZENIOWY 

Tabela 7. Cechy płynu mózgowo-rdzeniowego w zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych 

Badana cecha 

Leukocytoza 

Stężenie glukozy 

Typ zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych 

Bakteryjne Gruźlicze Grzybicze Wirusowe (,,aseptyczne’’) 

Segmentowe polimorficzne 

neutrofile 

Bardzo niskie: 

0,28 –1,1 mmol/l 

Monocyty (młode neutrofile) 

Niskie: 

1,1 –2,2 mmol/l 

Monocyty 

Niskie: 

1,1 –2,2 mmol/l 

Monocyty 

Prawidłowe: 

3,6 –3,9 mmol/l 

Stężenie białka Podwyższone Podwyższone Podwyższone Nieco podwyższone we 

wczesnej fazie zakażenia 

Preparat barwiony 

Zwykle widoczne bakterie 

(Gram) 

Rzadko dodatni 

(kwasooporne) 

Zwykle dodatni (tusz 

chiński) 

Ujemny 

Tabela 8. Wybór podłoża dla płynu mózgowo-rdzeniowego w zależności od wyników barwienia metoda˛ Grama a 

a 

b 

Obserwacja 

Gram-ujemne 

pałeczki 

Noworodki 

Inne grupy 

wiekowe 

Gram-dodatnie 

ziarenkowce 

Noworodki 

Inne grupy 

wiekowe 

Agar z krwia˛b + + + + z 

kra˛żkiem 

z optochina˛ 

Gramujemne 

ziarenkowce 

Gramdodatnie 

pałeczki 

Brak 

mikroorganizmów 

+ + + 

Agar z krwia˛ z S. aureus b + + + 

Agar czekoladowy (+) (+) (+) 

Agar MacConkeya + + + + + + + 

Bulion tryptozowo-sojowy + + + + + + + 

+=użyć; (+) = ewentualnie użyć. 

Inkubacja w atmosferze wzbogaconej CO 2 (eksykator). 

Barwienie bakterii kwasoopornych 

(metoda Ziehl-Neelsena) 

Pomimo niskiej czułości metody, przy podejrzeniu gruźliczego zapalenia opon 

mózgowo-rdzeniowych, zalecane jest barwienie rozmazu z osadu metodą Ziehl- 

-Neelsena. Barwiony preparat należy starannie oglądać przez co najmniej 

15 minut. Jeśli wynik jest ujemny, następnego dnia powtórzyć badanie, wykonując 

następny preparat z próbki. 

Hodowle 

Po stwierdzeniu obecności bakterii w preparacie barwionym metodą Grama 

należy wykonać posiew na odpowiednie podłoża (tabela 8). Jeśli nie wykazano 

obecności drobnoustrojów, należy wykonać posiew na podłoża o szerokim 

spektrum wzrostu, takie jak agar z krwią z posianym Staphylococcus aureus, który 

umożliwia wzrost H. influenzae. Płytki zawierające agar z krwią i agar 

czekoladowy powinny być inkubowane w 35°C w powietrzu atmosferycznym 

wzbogaconym w dwutlenek węgla. Wszystkie podłoża inkubować przez 3 dni 

i codziennie obserwować. 

Przy podejrzeniu gruźliczego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych należy 

wykonać posiew z osadu na co najmniej 3 podłoża Löwensteina-Jensena 

i inkubować przez 6 tygodni. Przez pierwsze 2 – 3 dni probówki powinny być 

inkubowane w pozycji poziomej z odkręconą opół obrotu nakrętką. Wzrost 

38

CZE˛ŚĆ I 

oceniać w cotygodniowych odstępach. Po zaobserwowaniu jakiegokolwiek 

wzrostu, najlepiej w bakteriologicznie bezpiecznych komorach, należy przygotować 

preparat, wysuszyć, utrwalić ciepłem i wybarwić metodą Ziehl-Neelsena. 

Obecność kwasoopornych prątków jest równoznaczna z diagnozą gruźlicy. 

Wszystkie izolaty powinny zostać przesłane do laboratorium referencyjnego 

w celu potwierdzenia diagnozy i określenia lekowrażliwości. 

Gdy na podstawie barwienia tuszem chińskim lub objawów klinicznych podejrzewa 

się zakażenie Cryptococcus neoformans, należy wykonać posiewy z osadu 

do dwóch probówek z agarem Sabouraud i inkubować w35°C do miesiąca. 

C. neoformans rośnie takżenapłytkach zawierających agar z krwią, które, jeśli to 

wskazane, powinny być inkubowane w 35°C przez tydzień. 

Wstępna identyfikacja 

Wzrost na agarze MacConkeya sugeruje obecność Enterobacteriaceae, która 

następnie powinna być potwierdzona z użyciem metod i podłoży zalecanych dla 

patogenów jelitowych. 

Kolonie Gram-dodatnich ziarenkowców ze strefą brzeżnej hemolizy typu β mogą 

wskazywać na obecność S. agalactiae (paciorkowce grupy B), która powinna 

zostać potwierdzona w odwrotnym teście CAMP (str. 117). 

Płaskie kolonie z wklęsłą częścią centralną i niewielką zieloną strefą hemolizy 

typu α to prawdopodobnie S. pneumoniae. Dla potwierdzenia należy na agarze 

z krwią, zawierającym gęsto posiane czyste kolonie badanego szczepu, umieścić 

6-milimetrowy krążek z optochiną.Pocałonocnej inkubacji pneumokoki wykażą 

14-milimetrową lub większą strefę zahamowania wzrostu wokół krążka. Najlepsze 

rezultaty uzyskuje się po inkubacji na agarze zawierającym krew baranią 

w atmosferze wzbogaconej w dwutlenek węgla. Jeśli odczyt pierwszej hodowli na 

agarze z krwią nie jest jednoznaczny, należy przesiać szczep i powtórzyć badanie. 

Kolonie H. influenzae rosną tylko na agarze czekoladowym oraz jako kolonie 

satelitarne w pobliżu gronkowcowych posiewów na agarze z krwią. Dalsza 

identyfikacja może być przeprowadzona w teście aglutynacji szkiełkowej przy 

użyciu surowicy odpornościowej H. influenzae typ b. 

Gram-ujemne dwoinki rosnące na agarze z krwią lub agarze czekoladowym, które 

dają szybko dodatni test oksydazowy, mogą być uznane za meningokoki. 

Potwierdzenie i identyfikacja grup serologicznych N. meningitidis (A, B, C) są 

oparte na odczynie aglutynacji szkiełkowej z użyciem właściwych surowic 

odpornościowych. Ujemny odczyn aglutynacji nie wyklucza meningokoków, 

ponieważ istnieją co najmniej cztery dodatkowe serogrupy. W tej sytuacji dla 

izolowanych szczepów należy określić zdolność do rozkładu węglowodanów, 

a hodowle przesłać do referencyjnego laboratorium centralnego. Wstępne wyniki 

powinny być przedstawiane lekarzowi na każdym etapie identyfikacji (barwienie 

metodą Grama, wzrost, aglutynacja itp.), z komentarzem, że zostanie przygotowany 

raport końcowy. 

Kolonie Gram-dodatnich pałeczek z brzeżną strefą β-hemolizy na agarze z krwią 

mogą wskazywać na Listeria monocytogenes. Zalecane jest wykonanie następujących 

testów potwierdzenia: dodatnia reakcja z katalazą, ruch w podłożu 

płynnym lub w MIU, wzrost i czarne przebarwienie na agarze z żółcią i eskuliną. 

39

PŁYN MÓZGOWO-RDZENIOWY 

Oznaczanie lekowrażliwości 

W przypadku Gram-ujemnych pałeczek i gronkowców należy zastosować 

standardową metodę krążkową (Kirby-Bauera). 

Niepotrzebne jest oznaczanie lekowrażliwości dla szczepów Listeria monocytogenes, 

S. agalactiae lub N. meningitidis, ponieważ w tej grupie oporność na 

ampicylinę i benzylopenicylinę jest wyjątkowo rzadka.Wszystkie szczepy pneumokoków 

powinny mieć oznaczoną na agarze z krwią wrażliwość na chloramfenikol 

i benzylopenicylinę. W ostatnim przypadku zalecany jest test krążkowy 

z oksacyliną (1 µg) (patrz str. 84, ,,Zakażenia dolnych dróg oddechowych’’). 

Szczepy H. influenzae powinny mieć oznaczoną wrażliwość na chloramfenikol na 

agarze czekoladowym lub wzbogaconym krwią. Większość ampicylinoopornych 

szczepów wytwarza β-laktamazy, których obecność można wykazać wykonując 

szybkie testy rekomendowane do badań skriningowych dla β-laktamazododatnich 

gonokoków (str. 92). 

40

Mocz 

Wprowadzenie 

Mocz jest materiałem najczęściej pobieranym do badań. Sprawia także najwięcej 

problemów, związanych z właściwym pobraniem, wyborem metod hodowli 

i interpretacją wyników. Podobnie jak w przypadku innych materiałów, uzupełniające 

informacje dostarczone przez lekarza pozwalają laboratorium na uzyskanie 

możliwie najlepszych wyników posiewu. 

Najczęstszą lokalizacją zakażeń układu moczowego jest pęcherz moczowy 

(cystitis) i cewka moczowa. Stąd infekcja drogą wstępującą może dotrzeć do 

moczowodów (ureteritis), a następnie objąć nerkę (pyelonephritis). Kobiety są 

bardziej predysponowane do zakażeń układu moczowego niż mężczyźni, trudniejsze 

w ich przypadku jest także prawidłowe pobranie próbki moczu. 

Zarówno u kobiet, jak i mężczyzn zakażenie układu moczowego może przebiegać 

bezobjawowo, ostro lub przewlekle. Bezobjawowe infekcje mogą być zdiagnozowane 

przez posiew. Ostre zakażenie obserwowane jest częściej u kobiet 

(w różnym wieku); pacjenci zwykle leczeni są ambulatoryjnie i rzadko poddawani 

hospitalizacji. Przewlekłe zakażenie u mężczyzn, podobnie jak i u kobiet 

w każdym wieku, zwykle skojarzone jest z chorobą podstawową (np.: odmiedniczkowe 

zapalenie nerek, choroba prostaty, wady wrodzone układu moczowo- 

-płciowego) i wiąże się z częstszą hospitalizacją. Bezobjawowe, ostre i przewlekłe 

zakażenia układu moczowego to trzy różne jednostki chorobowe, dlatego wyniki 

badań laboratoryjnych często wymagają różnej interpretacji. 

Bezobjawowe odmiedniczkowe zapalenie nerek u kobiet może pozostać nierozpoznane, 

często diagnozowane jest dopiero po wykonaniu dokładnego ilościowego 

badania mikrobiologicznego moczu. Występujące powszechnie przewlekłe 

zapalenie prostaty często jest przyczyną nawracających zakażeń układu 

moczowego. 

Niezależnie od typu najczęstszym czynnikiem etiologicznym zakażenia układu 

moczowego są bakterie jelitowe, w tym izolowana znacznie częściej niż inne 

patogeny Escherichia coli. U około 10% pacjentów mogą być obecne dwa 

patogeny jednocześnie odpowiedzialne za proces chorobowy. Obecność trzech 

i więcej różnych drobnoustrojów w posiewie moczu zdecydowanie wskazuje na 

niewłaściwe pobranie materiału do badania lub zanieczyszczenie próbki. Obecność 

licznych patogenów obserwowana jest u pacjentów zzałożonym na stałe 

cewnikiem moczowym. 

Pobieranie materiału do badania 

W badaniu mikrobiologicznym moczu trudno przecenić znaczenie prawidłowego 

pobrania próbek moczu, transportu do laboratorium oraz badania wstępnego 

i posiewu. Laboratorium jest odpowiedzialne za dostarczenie lekarzowi sterylnych, 

szklanych lub plastikowych kubków, słoików czy innych odpowiednich 

pojemników o szerokim wlocie. Powinny one zostać wysterylizowane gorącym 

suchym powietrzem w autoklawie, następnie szczelnie zamknięte, a wieczka 

przykryte folią aluminiową. 

41

MOCZ 

Próbka moczu może zostać pobrana z wykorzystaniem metod chirurgicznych, np.: 

przez nakłucie nadłonowe pęcherza moczowego, cystoskopię lub cewnikowanie. 

W innym przypadku laboratorium powinno dopilnować, aby mocz został pobrany 

ze środkowego strumienia po dokładnym umyciu okolicy cewki moczowej, 

zwłaszcza u kobiet i dzieci. Ponieważ mocz sam jest dobrą pożywką dla 

drobnoustrojów, posiew powinien zostać wykonany w ciągu 2 godzin od pobrania 

lub przechowywany w chłodziarce w 4°C do czasu dostarczenia do laboratorium 

i posiany nie później niż 18 godzin od pobrania. 

Jeśli to możliwe, do posiewu należy użyć moczu pobranego rano. Zaleca się 

poprosić pacjenta w przeddzień wieczorem o powstrzymanie się od oddania 

moczu do chwili pobrania próbki. 

Pacjentki powinny: 

1. Umyć dokładnie ręce wodą z mydłem i wytrzeć w czysty ręcznik. 

2. Rozchylić wargi sromowe, łechtaczkę i wargi sromowe przemyć starannie 

sterylnym płatkiem gazy i ciepłą wodą z mydłem, w kierunku od przodu do 

tyłu. Nie powinno się używać środków do dezynfekcji. 

3. Spłukać dokładnie łechtaczkę i wargi sromowe ciepłą wodą i osuszyć 

sterylnym płatkiem gazy. Podczas tej czynności wargi sromowe powinny 

pozostawać rozchylone, pacjentka nie powinna dotykać umytej powierzchni 

palcami. 

4. Oddać niewielką ilość moczu. Następnie zebrać większość pozostałego moczu 

do sterylnego pojemnika, zamykając pokrywkę zaraz po pobraniu próbki. Jest 

to próbka ze środkowego strumienia moczu. 

5. Zanieść do pielęgniarek zamknięty pojemnik, który powinien zostać niezwłocznie 

dostarczony do laboratorium. 

Pacjenci powinni: 

1. Umyć dokładnie ręce wodą z mydłem i wytrzeć w czysty ręcznik. 

2. Odsunąć napletek (jeśli pacjent nie jest obrzezany) i umyć żołądź sterylnym 

płatkiem gazy i ciepłą wodą z mydłem. Nie powinno się używać środków do 

dezynfekcji. 

3. Spłukać dokładnie żołądź ciepłą wodą i osuszyć sterylnym płatkiem gazy. 

Podczas tej czynności pacjent nie powinien dotykać palcami umytej powierzchni. 

4. Nasunąć napletek i oddać niewielką ilość moczu. Trzymając nasunięty 

napletek pacjent powinien zebrać większość pozostałego moczu do sterylnego 

pojemnika, zamykając pokrywkę zaraz po pobraniu. Jest to próbka ze 

środkowego strumienia moczu. 

5. Zanieść do pielęgniarek zamknięty pojemnik, który powinien zostać niezwłocznie 

dostarczony do laboratorium. 

Dla pacjentów leżących obowiązuje ta sama procedura, z wyjątkiem konieczności 

skorzystania z pomocy pielęgniarki lub, jeśli to konieczne, wykonania przez nią 

całej procedury przygotowania pacjenta przed oddaniem moczu. 

W obydwu sytuacjach powinny zostać podjęte starania, aby właściwie pobrać 

mocz do sterylnego pojemnika oraz aby niezwłocznie przesłać do laboratorium 

próbkę wraz z informacjami o pacjencie, rozpoznaniem klinicznym, z zachowaniem 

wymaganych procedur. 

42

CZE˛ŚĆ I 

Niemowlęta i dzieci 

Uzyskanie właściwie pobranej próbki moczu w przypadku chorych leżących 

i nie współpracujących niemowląt oraz dzieci może stanowić problem. 

Należy podać dziecku wodę lub inny napój do wypicia. Umyć narządy płciowe 

zewnętrzne. Dziecko można posadzić na kolanach matki, pielęgniarki 

lub innej osoby z personelu medycznego, która powinna zachęcić dziecko do 

oddania jak największej ilości moczu do sterylnego pojemnika. Pojemnik należy 

zamknąć i dostarczyć do laboratorium, gdzie niezwłocznie podjęta zostanie 

diagnostyka. 

Hodowla i interpretacja 

Wszystkie próbki moczu dostarczone do laboratorium medycznego powinny być 

od razu posiane lub umieszczone w chłodziarce w 4°C do momentu wykonania 

badania. Procedura badania obejmuje następujące etapy: 

1. Barwienie preparatów metodą Grama. 

2. Testy przesiewowe w kierunku znamiennej bakteriurii. 

3. Hodowle próbek moczu, w których wykazano obecność drobnoustrojów 

w badaniach przesiewowych i wszystkich próbek uzyskanych podczas 

cystoskopii, przez nakłucie nadłonowe (suprapubic bladder puncture — SBP) 

i cewnikowanie. 

4. Badanie lekowrażliwości izolatów bakteryjnych o znaczeniu klinicznym. 

Przygotowanie preparatów i barwienie metodą Grama jest ważnym elementem 

diagnostyki laboratoryjnej. Używając sterylnej pipety Pasteura (jedna dla jednej 

próbki) należy nanieść na szkiełko kroplę wstrząśniętego, nie odwirowanego 

moczu. Pozostawić kroplę do wyschnięcia, bez rozmazywania, utrwalić przez 

podgrzanie i wybarwić. Oglądać używając olejku immersyjnego (w powiększeniu 

× 600 lub więcej) — poszukiwać bakterii, polimorficznych leukocytów i komórek 

płaskonabłonkowych. 

Jedna lub więcej komórek bakteryjnych w polu widzenia w olejku immersyjnym 

zwykle wskazuje na obecność 10 5 lub więcej bakterii w mililitrze próbki. 

Obecność jednego lub więcej leukocytów w polu widzenia w olejku immersyjnym 

jest kolejną wskazówką zakażenia układu moczowego. W niezakażonych próbkach 

moczu bakterie i leukocyty występują w niewielkiej liczbie lub nie stwierdza 

się ich wcale. W próbkach pochodzących od pacjentek wykazanie licznych 

komórek płaskonabłonkowych, bez lub z obecnością bakterii, wskazuje na 

zanieczyszczenie florą pochwową i konieczność powtórnego badania z oceną 

liczby bakterii w polu widzenia. Jeśli konieczny jest szybki wynik badania, 

lekarzowi powinna być dostarczona wstępna ocena barwionych preparatów 

z informacją o prowadzonej hodowli. 

Metody badań przesiewowych 

Brak leukocytów i bakterii w preparatach moczu barwionych metodą Grama, 

pochodzących z próbek pobranych według powyżej opisanych zasad, wyklucza 

infekcję. ,,Ujemna’’ próbka moczu w starannie wykonanym badaniu mikroskopowym 

nie musi być poddana hodowli. Alternatywnym prostym i skutecznym 

testem przesiewowym jest test paskowy na obecność esterazy leukocytowej 

43

MOCZ 

(redukcji azotanów). Paski zanurza się w próbce moczu zgodnie z instrukcją 

zawartą w ulotce. Różowe zabarwienie jest dodatnim wynikiem i wskazuje na 

obecność esterazy leukocytowej i/lub bakteriurię rzędu 10 5 w 1 ml. Próbki 

dodatnie w testach przesiewowych należy jak najszybciej poddać hodowli, aby 

zapobiec przerostowi przez nieznaczące szczepy. Jeśli paski nie wykażą różowego 

zabarwienia, badanie przesiewowe interpretowane jest jako ujemne i hodowla 

nie jest konieczna. Testy paskowe nie są wystarczająco czułe, aby wykryć 

bakteriurię mniejszą niż 10 5 komórek w 1 ml moczu. 

Posiew ilościowy i wstępna identyfikacja 

Zalecane są dwie metody posiewu ilościowego i wstępnej identyfikacji: metoda 

zużyciem kalibrowanej ezy oraz metoda z użyciem zanurzonego papierowego 

filtra paskowego. 

Metoda z użyciem kalibrowanej ezy 

Zalecane jest użycie kalibrowanej plastikowej lub platynowej ezy, za pomocą 

której należy przenieść 1 µl moczu na podłoże do hodowli (agar MacConkeya 

z fioletem krystalicznym i nieselektywny agar z krwią). 

1. Wstrząsnąć delikatnie mocz, a następnie przechylić i 1-mikrolitrową ezą 

dotknąć powierzchni w taki sposób, aby zawiesić w niej płyn. Nigdy nie 

zanurzać oczka ezy w moczu. 

2. Umieścić 1 µl moczu na podłożu agarowym z krwią i rozmazać, tworząc prostą 

linię do środka płytki (1), następnie gęstym zygzakiem, pod kątem w prawo, 

przez początkową linię (2) i na koniec skośnym zygzakiem, przecinającym 

dwa poprzednie pasma (3) (ryc. 3). 

3. Posiać na podłoże MacConkeya w ten sam sposób. 

4. Inkubować płytki przez noc w 35°C. 

Agar z krwią i podłoże MacConkeya można zastąpić innymi nieselektwnymi 

podłożami (np.: CLED 1 , agar z fioletem krystalicznym i laktozą). 

Metoda pasków bibułowych 

Metoda pasków bibułowych Leigh&Williams 2 polega na absorpcji określonej 

ilości moczu, który następnie jest przenoszony na płytkę zwłaściwym podłożem 

agarowym. 

Paski o długości 7,5 cm i szerokości 0,6 cm mogą być przygotowane na miejscu 

zużyciem specjalnego typu bibuły (patrz ryc. 4). Są oznaczone ołówkiem z jednej 

strony — 1,2 cm od końca. Metoda pasków bibułowych przed wprowadzeniem do 

rutynowych badań powinna zostać porównana z metodą zużyciem kalibrowanej 

ezy. 

Bibułowe paski należy przygotować w odpowiedniej ilości, umieścić we 

właściwym pojemniku i autoklawować. Sterylne paski są komercyjnie dostępne. 

1 

CLED: z niedoborem cystyny, laktozy i elektrolitów; Cystine-Lactose-Electrolyte Deficient. 

2 

Leigh D.A., Williams J.D.: Metoda wykorzystywana do oznaczenia znamiennej bakteriurii 

w szerokiej grupie pacjentów. Journal of Clinical Pathology, 1964, 17: 498 – 503. 

44

CZE˛ŚĆ I 

Ryc. 3. 

Posiew bakterii na płytki hodowlane. 

1,2 cm 0,6 cm 

6,3 cm 

Ryc. 4. Bibułowy pasek stosowany w metodzie Leigh & Williamsa. 

WHO 91125 

CFU — colony-forming units (jednostki tworza˛ce kolonie) 

Ryc. 5. Odciski zanurzonych w moczu bibułowych pasków napłytce agarowej i przeliczenie 

liczby kolonii na liczbę żywych komórek bakterii w 1 ml. 

Dla każdej badanej próbki moczu wyjąć z pojemnika sterylny pasek. Oznaczony 

koniec zanurzyć do wyznaczonej linii w dokładnie wstrząśniętej próbce moczu. 

Pasek natychmiast wyciągnąć, nadmiar moczu zostanie wchłonięty. 

Obszar poniżej oznaczenia, który zagina się na kształt litery ,,L’’, należy umieścić 

na 2 – 3 sekundy na płytce z agarem brolacynowym 1 lub agarze z fioletem 

krystalicznym i laktozą. Na jednej płytce można posiać kilka pasków, dzieląc 

powierzchnię na maksymalnie 16 prostokątów (ryc. 5). Należy zapewnić możliwość 

identyfikacji każdego prostokąta na podstawie numeru lub nazwiska 

pacjenta. Wyciągnąć drugi pasek z pojemnika i dokładnie powtórzyć procedurę, 

wykonując kolejne odciski identycznie jak pierwsze. Po naniesieniu duplikatu 

1 

Agar laktozowo-cystynowy z błękitem bromotymolowym. 

45

MOCZ 

odcisków płytkę inkubować w 35– 37°C, a następnie zliczyć wyrosłe 

kolonie z powierzchni każdego odcisku paska. Posługując się ryc. 5, na podstawie 

średniej liczby kolonii każdej pary pasków, można określić liczbę bakterii w 1 ml 

moczu. 

Natychmiast po wykonaniu powyższej procedury, używając sterylnej ezy, posiać 

próbki moczu na pół płytki agaru MacConkeya (z fioletem krystalicznym). 

Hodowla na agarze z krwią ułatwia szybką identyfikację Gram-dodatnich 

ziarenkowców. Płytki należy inkubować przez noc w temperaturze 35 – 37°C 

i następnego dnia ocenić wzrost. Do identyfikacji użyć izolowanych kolonii 

o podobnym wyglądzie. Jeśli istnieje taka potrzeba, inoculum konieczne do 

oznaczenia lekowrażliwości szczepu metodą dyfuzyjno-krążkową można przygotować 

z każdej z płytek (str. 112). W ten sposób następnego dnia dostępne będą 

zarówno wyniki identyfikacji, jak i lekowrażliwości. 

Interpretacja wyników posiewu ilościowego 

moczu 

Przez wiele lat warunkiem rozpoznania zakażenia układu moczowego było 

wykazanie obecności co najmniej 10 5 jednostek tworzących kolonie (CFU 

— colony-forming units) w 1 ml odpowiednio pobranego moczu ze środkowego 

strumienia. Założenie to zostało zakwestionowane; według niektórych ekspertów 

obecność 10 4 CFU lub mniej może świadczyć o infekcji. Inni twierdzą, że 

obecność polimorficznych leukocytów odgrywa istotną rolę w patologii i klinicznej 

manifestacji zakażenia układu moczowego. Nie można zdefiniować precyzyjnie 

minimalnej liczby bakterii w 1 ml moczu, która jednoznacznie świadczy 

o ZUM. Ogólne zasady sporządzania raportów przedstawiono poniżej. 

Kategoria 1: mniej niż 10 4 CFU w 1 ml. W raporcie prawdopodobnie brak 

ZUM. (Wyjątki: jeśli mniej niż 10 4 CFU w 1 ml moczu pobranego 

bezpośrednio z pęcherza moczowego przez nakłucie nadłonowe 

lub cystoskopię; u kobiet z objawami zakażenia lub 

leukocyturią należy przeprowadzić identyfikację i wykonać antybiogram.) 

Kategoria 2: 10 4 – 10 5 CFU w 1 ml. Jeśli pacjent bez objawów, powtórzyć 

badanie moczu. Jeśli pacjent zgłasza objawy zakażenia układu 

moczowego, przeprowadzić identyfikację i wykonać antybiogram 

jednego lub dwu różnych obecnych w moczu typów kolonii 

bakteryjnych. Powyższa liczba bakterii przemawia za zakażeniem 

układu moczowego u pacjentów z objawami lub z leukocyturią. 

Jeśli liczba bakterii, jakość próbki moczu lub charakter zgłaszanych 

objawów wzbudzają wątpliwości, należy powtórzyć badanie. 

Raport powinien zawierać wartość CFU. 

Kategoria 3: więcej niż 10 5 CFU w 1 ml. Przedstawić wynik lekarzowi, 

przeprowadzić identyfikację i wykonać antybiogram jednego lub 

dwu różnych obecnych w moczu typów kolonii bakteryjnych. 

Powyższa liczba bakterii zdecydowanie wskazuje na zakażenie 

układu moczowego u wszystkich pacjentów, również u kobiet bez 

objawów zakażenia. 

Jeśli w próbkach moczu kategorii 2 lub 3 obecne są więcej niż dwa różne typy 

bakterii, należy przedstawić wynik jako: ,,Prawdopodobnie materiał zanieczyszczony. 

Proszę dostarczyć świeżą próbkę moczu ze środkowego strumienia’’. 

46

CZE˛ŚĆ I 

Identyfikacja 

Identyfikacja powinna zostać przeprowadzona możliwie najszybciej. Jeśli masywna 

infekcja dróg moczowych wywołana jest przez E. coli, do identyfikacji 

czerwonych kolonii na podłożu agarowym MacConkeya należy użyć szybkiego 

testu. 

Test β-glukuronidazowy do szybkiej identyfikacji 

E. coli 1 

Test określa zdolność drobnoustroju do wytwarzania enzymu β-glukuronidazy. 

Enzym hydrolizuje kwas 4-nitrofenylo-β-D-glukopyranozydouronowy (PGUA), 

produkt reakcji kwasu glukuronowego i p-nitrofenolu. Pojawienie się żółtego 

zabarwienia wskazuje na reakcję dodatnią. 

Procedura 

1. Przygotować gęstą mleczną zawiesinę bakterii w małej probówce zawierającej 

0,25 ml fizjologicznego roztworu soli. Zawiesina powinna zostać przygotowana 

z kolonii rosnących na podłożu agarowym MacConkeya. 

2. Rozpuścić 300 mg kwasu 4-nitrofenylo-β-D-glukopyranozydouronowego 

(PGUA) i 100 mg wyciągu drożdży (Oxoid L21) 2 w 20 ml buforu fosforanowego 

(bufor Tris, pH 8,5). Uzyskać pH 8,5 ± 0,1. Dodać 0,25 ml podłoża 

do każdej z przygotowanych sterylnych probówek. Zamknąć probówki. 

Oznaczyć probówki jako PGUA i wpisać datę. 

3. Zawiesić w jednej z probówek z PGUA badaną gęstą zawiesinę bakterii. 

Inkubować probówkę przez 4 godziny w 35°C. Pojawienie się żółtego 

zabarwienia wskazuje na obecność β-glukuronidazy (wynik dodatni); jeśli nie 

pojawia się zmiana zabarwienia, wynik jest ujemny. Obecność żółtego 

pigmentowania wskazuje na brak wiarygodności testu; w takich przypadkach 

test należy powtórzyć. 

Szczepy kontrolne: 

Escherichia coli dodatni (żółty) wynik 

Shigella flexneri ujemny (bezbarwny) wynik 

Tabletki PGUA są dostępne komercyjnie. 

Oznaczanie lekowrażliwości 

Antybiogram (str. 112) powinien być wykonany tylko dla istotnych, według 

przedstawionych powyżej kryteriów, czystych hodowli zawierających kolonie 

o jednakowej morfologii. Oznaczanie wrażliwości ma zazwyczaj większe 

znaczenie dla pacjentów hospitalizowanych lub z nawracającymi zakażeniami 

dróg moczowych w wywiadzie. Szczepy uzyskane w posiewach od pacjenta 

z ZUM występującym po raz pierwszy mogą nie wymagać wykonania antybiogramu. 

1 

Kilian M., Borrow P.: Rapid diagnosis of Enterobacteriaceae. 1. Detection of bacterial glycosidases. 

Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica, Section B, 1976, 84: 245 – 251. 

2 

Dostępny z Oxoid Ltd, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, RG24 8PW, England. 

47

Kał 

Wprowadzenie 

Zakażenia bakteriami jelitowymi, wywołującymi biegunkę, czerwonkę i gorączki 

jelitowe, stanowią ważny problem zdrowotny na świecie. Infekcje biegunkowe są 

drugą po chorobach sercowo-naczyniowych, a wśród dzieci najczęstszą przyczyną 

zgonu. W krajach rozwijających się z powodu biegunek rocznie umiera 

1,5 miliona dzieci w wieku od 1 roku do 4 lat. Ryzyko zgonu w tej grupie 

wiekowej jest 600-krotnie wyższe niż w krajach rozwiniętych. W niektórych 

krajach rozwijających się biegunki występują u dzieci dziesięć lub więcej razy 

w ciągu roku. 

Dzieci ulegając zakażeniom licznymi patogenami, często bez wystąpienia 

biegunki, wydalają zkałem potencjalnie chorobotwórcze szczepy. Prowadzone 

obserwacje wykazały, że aktywna immunizacja przez wielokrotną ekspozycję 

oraz przedłużony okres karmienia piersią mogą zapobiegać zachorowaniom 

i zabezpieczać przed wystąpieniem biegunek. Na uwagę zasługują trudności 

w ustaleniu czynnika etiologicznego biegunki w hodowli z pojedynczej próbki 

kału. 

Ze względu na wzrost częstości zakażeń HIV/AIDS i stosowanie chemioterapii 

immunosupresyjnej, biegunka pojawiająca się u pacjentów z niedoborem odporności 

stanowi coraz poważniejsze wyzwanie. Zakażenia te występują wpóźniejszym 

okresie choroby, chorzy z HIV/AIDS są często leczeni do końca życia, 

a uzyskanie poprawy jest trudne. Lista bakterii jelitowych wywołujących 

biegunkę u pacjentów z HIV/AIDS jest długa i obejmuje: Campylobacter, 

Salmonella, Shigella oraz mykobakterie. Ocenia się,że salmonelozy u pacjentów 

z HIV/AIDS, w porównaniu do osób niezakażonych, występują 20-krotnie 

częściej, a 5-krotnie częściej dochodzi u nich do bakteriemii. W Zairze 40% 

pacjentów z HIV/AIDS zgłaszało przewlekłą biegunkę, a u 84% pacjentów 

z biegunką utrzymującą się dłużej niż miesiąc wykryto zakażenie HIV. 

Czynniki etiologiczne i objawy kliniczne 

Rodzaj Salmonella obejmuje ponad 2000 serotypów. Wiele z nich może 

wywoływać infekcje zarówno u ludzi, jak i u zwierząt domowych. U ludzi 

zakażenie prowadzi do rozwoju nieżytu żołądka i jelit, duru brzusznego 

i bakteriemii z zajęciem lub bez zajęcia innych narządów. Nieżyt żołądka i jelit 

wywołany przez Salmonella zaczyna się zwykle nudnościami, wymiotami, 

kolkowym bólem brzucha i biegunką 8 – 48 godzin od spożycia skażonego 

pokarmu. Bez leczenia objawy utrzymują się zazwyczaj 3 – 5 dni. Leczenie 

przeciwbakteryjne nie przyspiesza ustąpienia objawów klinicznych, a może 

przedłużyć okres rekonwalescencji i bezobjawowego stanu nosicielstwa. W niepowikłanych 

przypadkach zakażeń wykonanie antybiogramu i leczenie przeciwbakteryjne 

nie są zalecane. Zastosowanie antybiotyków jest wskazane w przypadku 

wystąpienia bakteriemii. Niektórzy pacjenci stając się bezobjawowymi 

nosicielami Salmonella spp. mogą wydalać bakterie z kałem i moczem przez rok 

lub dłużej. Dodatnie posiewy z kału uzyskuje się przez okres dłuższy niż rok 

u około 3% pacjentów z durem brzusznym i u 0,2 – 0,6% pacjentów z zakażeniem 

innym serotypem Salmonella. 

48

CZE˛ŚĆ I 

Zakażenie Shigella spp. może przebiegać wróżny sposób: od bezobjawowych 

infekcji przez biegunkę bez gorączki do czerwonki o ciężkim przebiegu. Objawy 

obejmują kolkowe bóle brzucha, nieefektywne i bolesne parcie (tenesmus) oraz 

częste oddawanie małej objętości podbarwionych krwią stolców. Shigella spp. jest 

główną przyczyną czerwonki bakteryjnej, przed enteroinwazyjnymi i enterokrwotocznymi 

E. coli. Wiele przypadków choroby o średnim nasileniu nie 

wymaga leczenia przyczynowego. Jednakże w ciężkich zakażeniach lub gdy 

istnieje ryzyko rozwoju wtórnego rozsiewu w organizmie, wskazane jest 

zastosowanie antybiotykoterapii po wcześniejszym określeniu lekowrażliwości, 

koniecznym ze względu na dużą w wielu krajach oporność na powszechnie 

stosowane antybiotyki. Znane są cztery grupy Shigella, obejmujące 39 serotypów 

i podtypów. Grupa A (S. dysenteriae), grupa B (S. flexneri), obejmująca liczne 

serotypy grupa C (S. boydii) oraz grupa D (S. sonnei), do której należy tylko jeden 

serotyp. Najczęściej izolowanymi gatunkami Shigella w krajach rozwijających się 

są S. dysenteriae i S. flexneri, podczas gdy w krajach rozwiniętych występuje 

głównie S. sonnei. 

Zidentyfikowano co najmniej sześć różnych klas Escherichia coli wywołujących 

biegunki: enteropatogenne E. coli (EPEC), enterotoksyczne E. coli (ETEC), 

enterokrwotoczne i produkujące werotoksynę E. coli (EHEC lub VTEC), 

enteroinwazyjne E. coli (EIEC), enteroadhezyjne E. coli (EAEC) oraz enteroagregacyjne 

E. coli (EAggEC). Cztery z powyższych klas są częstą przyczyną 

chorób biegunkowych w krajach rozwijających się. Jednakże identyfikacja 

szczepów wymaga przeprowadzenia testów serologicznych, testów toksyczności 

na hodowlach komórkowych, oceny patogeniczności na zwierzętach oraz zastosowania 

sond genetycznych, które pozostają poza zakresem możliwości 

laboratorium średniego stopnia referencyjności. Wstępna identyfikacja najczęściej 

występującego serotypu O157:H7 szczepów VTEC możliwa jest na podstawie 

charakterystycznie ujemnego testu z sorbitolem. Test ten jednak jest 

ujemny także w przypadku E. fergusonii i E. hermanii. Sorbitoloujemne szczepy 

E. coli wymagają więc dodatkowej identyfikacji przez serotypowanie z użyciem 

surowicy odpornościowej E. coli O157. Wykazanie wytwarzania werotoksyny 

wskazuje na szczep VTEC. 

Cholera jest typowym przykładem toksycznej infekcji. Wszystkie objawy są 

związane z utratą płynów, spowodowaną działaniem wytwarzanej w jelitach 

enterotoksyny Vibrio cholerae. Stolec jest obfity, wodnisty i nie zawiera komórek 

zapalnych. Głównym celem leczenia jest uzupełnianie utraty płynów, a leczenie 

przeciwbakteryjne ma znaczenie jedynie drugoplanowe. 

V. cholerae rozprzestrzenia się bardzo szybko. Na podstawie różnic w antygenach 

somatycznych O wyróżnia się kilka serotypów, a serotyp O1 występuje w dwóch 

odmianach, określanych jako ,,klasyczna’’ i ,,El Tor’’. Do 1992 roku uważano, że 

tylko serotyp O1 V. cholerae (klasyczny lub El Tor) może wywołać epidemię 

cholery, a pozostałe serogrupy odpowiedzialne są za sporadyczne przypadki 

cholery i zakażenia pozajelitowe. W 1992 roku na wschodnim wybrzeżu Indii 

wybuchła epidemia, która szybko rozprzestrzeniła się na sąsiednie kraje. Ta 

epidemia była wywołana V. cholerae należącym do wcześniej nieznanej 

serogrupy O139 Bengal. V. cholerae O139 izolowano dotychczas w 10 krajach 

południowo-wschodniej Azji, ale serotyp ten wydaje się zanikać. 

V. parahaemolyticus i kilka innych gatunków Vibrio (V. fluvialis, V. hollisae, 

V. mimicus)iAeromonas (A. hydrophila, A. sobria, A. caviae) wywołują zatrucia 

pokarmowe lub nieżyty żołądkowo-jelitowe u osób spożywających surowe lub 

niedogotowane owoce morza. 

49

KAŁ 

W większości regionów świata Campylobacter jejuni i C. coli okazały się 

głównymi patogenami jelitowymi, które są izolowane równie często jak Salmonella 

i Shigella spp. Badania przeprowadzone wśród dzieci w Afryce i Azji 

wykazały, że częstość zakażeń wynosi od 19 do 38%, a bezobjawowe nosicielstwo 

dotyczy od 9 do 40% badanych. Choroba może mieć różny przebieg, od 

samoograniczającego się, krótkotrwałego zapalenia jelita cienkiego po piorunujące 

zapalenie jelita cienkiego i okrężnicy, z ciężką biegunką, kolką brzuszną, 

gorączką i bólami mięśniowymi. Stolce są początkowo śluzowe i płynne, 

a następnie mogą zmienić się w chlustające, wodniste, zawierające krew i ropę. 

Objawy wycofują się zwykle po tygodniu. 

U około 25% pacjentów dochodzi do nawrotu, który zwykle ma łagodniejszy 

przebieg. Infekcja ustępuje zazwyczaj samoistnie, bez antybiotykoterapii, stąd 

określanie lekowrażliwości izolowanych szczepów nie jest konieczne. 

Arcobacter butzleri, traktowane dotychczas jako rosnące w niskiej temperaturze 

Campylobacter, zostały ostatnio uznane za przyczynę biegunek występujących 

u dzieci w krajach rozwijających się. 

Występowanie u ludzi infekcji wywołanych Yersinia enterocolitica obserwowano 

głównie w północnej Europie, Japonii i Stanach Zjednoczonych. Większość 

izolowanych patogenów pochodziła od dzieci ze sporadycznie występującą 

biegunką. 

Clostridium difficile jest główną przyczyną biegunki poantybiotykowej. Może 

wywołać różne postacie choroby, od średnio nasilonej biegunki do potencjalnie 

śmiertelnego pseudobłoniastego zapalenia okrężnicy. Rozpoznanie rzekomo 

błoniastego colitis jest możliwe na podstawie badania kolonoskopowego, a potwierdzenie 

laboratoryjne w tym przypadku nie jest konieczne. W diagnostyce 

laboratoryjnej dostępne są komercyjne testy, w tym hodowla, test aglutynacji 

lateksowej wykrywający białka komórkowe, testy ELISA wykrywające cytotoksyny 

i/lub enterotoksyny, hodowle komórkowe do oceny toksyczności cytotoksyn. 

Wielu pacjentów szpitalnych, zwłaszcza leczonych antybiotykami o szerokim 

spektrum działania, wydala bakterie z kałem przy braku objawów. Dlatego też 

hodowla bez wykazania obecności toksyn ma ograniczoną wartość diagnostyczną. 

Rotawirusy są jedynym niebakteryjnym czynnikiem opisanym w tym miejscu. 

Inne wirusy mogą także być przyczyną biegunek, ale rotawirus występuje 

podobnie często zarówno w krajach rozwijających się, jak i w krajach rozwiniętych. 

Infekcje zwykle pojawiają się u dzieci między 6. a 18. miesiącem 

życia, częściej w chłodnych miesiącach roku. Rozpoznanie może być potwierdzone 

laboratoryjnie na podstawie testu immunoenzymatycznego (ELISA) lub 

prostszego i bardziej praktycznego testu aglutynacji lateksowej. Odczynniki 

potrzebne do wykonania powyższych badań są komercyjnie dostępne, lecz drogie. 

Właściwe ukierunkowanie diagnostyki 

laboratoryjnej 

Laboratorium ściśle współpracujące ze szpitalem lub kliniką w krajach rozwijających 

się może szybko zostać obciążone nadmierną liczbą próbek do badań. 

W większości przypadków czerwonki bakteryjnej i biegunek wykonanie posiewu 

nie jest konieczne do podjęcia efektywnego leczenia, ponieważ pacjenci wymagają 

jedynie nawodnienia, a nie antybiotykoterapii. W niektórych przypadkach (np. 

50

CZE˛ŚĆ I 

pacjenci z durem brzusznym) do podjęcia właściwego leczenia wyniki hodowli są 

niezbędne. Problem, jak najlepiej wykorzystać ograniczone możliwości (diagnostyki 

laboratoryjnej — przyp. tłum.) jest wciąż rozważany. 

Często najważniejsze stają się aspekty zdrowia publicznego, stąd laboratorium 

jest zobligowane do dostarczania danych dotyczących powszechnie występujących 

w danym regionie patogenów i ich wrażliwości na antybiotyki, a także 

powinno uczestniczyć w badaniu epidemiologicznym. Konieczna jest ścisła 

współpraca klinicystów z laboratorium. Utworzenie przez laboratorium wartościowej 

bazy danych jest możliwe na podstawie systematycznie przeprowadzanych, 

randomizowanych badań, szpitalnych lub klinicznych pacjentów z biegunką. 

Badanie proporcjonalnej części pacjentów umożliwia ograniczenie liczby 

próbek, z jednoczesną pełną diagnostyką każdej z nich. Jeśli badania wykonuje się 

u określonych, pojedynczych chorych (np. u co dwudziestego piątego), wyniki 

można wykorzystać do oszacowania częstości występowania infekcji w całej 

populacji pacjentów. W szczególnych grupach pacjentów lub o szczególnej porze 

roku, w sytuacji pojawienia się typowego zespołu objawów, laboratorium może 

ukierunkować diagnostykę na określony problem. 

Laboratorium podejmuje decyzję o ewentualnym ograniczeniu diagnostyki do 

pewnych patogenów jelitowych. Yersinia enterocolitica występuje wyjątkowo 

rzadko w regionach tropikalnych. Jeśli nie obserwuje się występowania określonego 

patogenu w danym regionie, laboratorium może zrezygnować z wykonywania 

wykrywających go testów. W wyniku laboratorium powinno uwzględnić 

fakt wykrywania tylko określonych patogenów. Jeśli wykonywane są badania 

jedynie w kierunku Salmonnella i Shigella, w wyniku nie można napisać ,,brak 

patogenów’’. Należy umieścić informację: ,,nie wykazano obecności Salmonella 

i Shigella spp.’’ 

Pobieranie i przesyłanie próbek kału 

Próbki powinny być pobierane we wczesnym okresie biegunki, ponieważ w tym 

czasie liczba patogenów w kale jest najwyższa, oraz, jeśli to możliwe, przed 

rozpoczęciem ewentualnej antybiotykoterapii. Próbkę należy pobrać rano i dostarczyć 

jądo laboratorium do południa, tak by można było wykonać badanie tego 

samego dnia. Uformowany stolec należy odrzucić. Najlepszym materiałem do 

badań jest świeży kał. Jeżeli jednak pobranie kału nie jest możliwe lub gdy 

transport materiału do laboratorium jest zbyt długi, można pobrać wymaz 

z odbytu. 

Procedura pobierania kału do badania 

Przygotować dla pacjenta dwie drewniane szpatułki i odpowiedniej wielkości 

pojemnik ze szczelnym zamknięciem (np.: czysty szklany kubek, plastikowe lub 

pokryte warstwą wosku tekturowe pudełko, specjalny pojemnik z łopatką 

przymocowaną do wieczka). Nie wolno używać butelek po lekach. 

Poinstruować pacjenta, aby oddał stolec na papier toaletowy lub do basenu, 

a następnie przeniósł część do pojemnika za pomocą szpatułek. 

Próbka powinna zawierać co najmniej 5 g stolca i fragmenty z widoczną krwią, 

śluzem lub ropą, jeśli są obecne w kale. Materiał nie powinien być zanieczyszczony 

moczem. Po umieszczeniu próbki pojemnik szczelnie zamknąć. 

51

KAŁ 

Pacjenta należy poinformować, aby dostarczył materiał do badania natychmiast 

po pobraniu. Jeśli dostarczenie próbki do laboratorium w ciągu 2 godzin nie jest 

możliwe, należy niewielką ilość materiału (łącznie ze śluzem, krwią i pasmami 

nabłonka, jeśli są obecne) podzielić i umieścić w dwu lub trzech pojemnikach 

z podłożem transportowym (Cary-Blair, Stuart lub Amies) lub w 33 mmol/l buforu 

fosforanowo-glicerolowego. W przypadku cholery i zakażeń innymi Vibrio spp., 

doskonałym (i wzbogaconym) podłożem transportowym jest alkaliczna woda 

peptonowa. Patogeny mogą przetrwać w takich warunkach przez okres do 

tygodnia w temperaturze pokojowej, chociaż zalecane jest przechowywanie 

takich próbek w chłodziarce. 

Procedura pobierania wymazów z odbytu 

1. Zwilżyć bawełnianą wymazówkę sterylną wodą. Umieścić za zwieraczem 

odbytu, obrócić i wyjąć. Sprawdzić, czy widoczna jest wystarczająca ilość 

materiału, jeśli nie, powtórzyć czynność. Liczba wymazów uzależniona jest od 

rodzaju prowadzonych badań. 

2. Jeśli materiał zostanie zbadany w ciągu 1 – 2 godzin, umieścić wymazówkę 

w pustej, sterylnej probówce z zatyczką z waty lub zakrętką. Jeśli wymazówka 

musi być przechowywana dłużej niż przez 2 godziny, należy umieścić ją 

w podłożu transportowym. 

Badanie wizualne próbek kału 

1. Obejrzeć próbkę, zwracając uwagę na: 

– konsystencję (uformowany, nieuformowany, płynny), 

– kolor (biały, żółty, brązowy lub czarny), 

– obecność nietypowych elementów (np. śluz, krew). 

2. Umieścić niewielką ilość kału lub wymazu z odbytu razem ze śluzem (jeśli jest 

obecny) w kropli 0,05% roztworu błękitu metylenowego na czystym szkiełku 

i dokładnie wymieszać. 

3. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym zabarwioną zawiesinę uważając, aby nie 

powstałypęcherzyki powietrza. Poczekać 2 – 3 minuty. Oglądać preparat pod 

mikroskopem w dużym powiększeniu (obiektyw × 100). 

4. Zwrócić uwagę na komórki jednojądrzaste lub o polimorficznych jądrach; 

pominąć zdegenerowane komórki. 

Badanie wysięku komórkowego biegunkowego kału może dostarczyć wskazówek 

pozwalających na identyfikację czynników wywołujących: 

– zlepy leukocytów wielojądrzastych (> 50 komórek w polu widzenia), makrofagi 

i erytrocyty są typowe dla zakażeń pałeczkami Shigella; 

– mniejsza liczba wielojądrzastych leukocytów(< 20 komórek w polu widzenia) 

obecna jest w salmonelozach i w zakażeniach inwazyjnymi szczepami E. coli. 

W czerwonce pełzakowej większość komórek jest zdegenerowana (cienie 

komórek). W około 50% przypadków biegunki wywołanej przez Campylobacter 

spp. obecne są leukocyty i erytrocyty; 

– w przypadku cholery, zakażeń wywołanych przez enterokrwotoczne i enteropatogenne 

E. coli oraz biegunek wirusowych obecne są nieliczne leukocyty 

(2 – 5 komórek w polu widzenia). 

52

CZE˛ŚĆ I 

Podłoża transportowo-wzbogacaja˛ce 

i posiew próbek kału 

Podłoża transportowo-wzbogacające są powszechnie stosowane do izolacji 

Salmonella spp. i Vibrio cholerae zkału. W przypadku Salmonella spp. zalecane 

są buliony zawierające selenin F lub tetrationian, natomiast dla Vibrio cholerae 

stosowana jest alkaliczna woda peptonowa (APW, alkaline peptone water). 

Podłoża takie nie są zalecane w hodowli Shigella spp., Campylobacter spp., 

Yersinia enterocolitica i Clostridium difficile. 

Procedura posiewu na podłoża wzbogacaja˛ce 

1. Przygotować zawiesinę kału zawieszając około 1 g próbki w probówce 

zawierającej 1 ml sterylnego fizjologicznego roztworu soli. Jeśli próbka jest 

płynna, nie trzeba dodawać roztworu soli. Wymazy z odbytu, świeże lub 

w podłożu Cary’ego-Blaira, wytrząsnąć w 1 ml fizjologicznego roztworu soli. 

Przed wyrzuceniem wymazówki odcisnąć resztę płynu na ściance probówki. 

2. Ezą dodać trzy lub więcej oczek zawiesiny do odpowiedniego podłoża 

wzbogacającego. 

3. Inkubować bulion z seleninem F przez 18 godzin, APW przez 6 – 8 godzin. 

W niektórych laboratoriach dwa lub trzy oczka zawiesiny początkowej w APW 

są przesiewane do świeżego APW i inkubowane przez kolejne 6 – 8 godzin. 

4. Przesiać hodowle z bulionu ezą na płytki z selektywnym i nieselektywnym 

podłożem. 

V. cholerae szybko rośnie w APW i przez 6 – 8 godzin przerasta inne mikroorganizmy. 

Po dłuższej inkubacji, powyżej 8 godzin, pozostałe bakteriemogązdominować 

V. cholerae. Szczepy nie-V. cholerae O1 rosną szybciej niż V. cholerae O1 i, 

jeśli obecne są jednocześnie dwa serotypy, mogą przerosnąć całą płytkę. 

Podłoża do hodowli patogenów jelitowych 

Dla Shigella spp., Salmonella spp. i Y. enterocolitica zalecane są podłoża 

stosowane do posiewu ogólnego o niskiej selektywności oraz podłoża ośredniej 

lub wysokiej selektywności. Agar MacConkeya z fioletem krystalicznym jest 

zalecany jako podłoże podstawowe. W przypadku Y. enterocolitica agar MacConkeya 

należy inkubować przez dzień w35°C, a następnie, przez kolejny dzień, 

w temperaturze pokojowej (22 – 29°C). 

Agar ksylozo-lizyno-deoksycholanowy (XLD) jest rekomendowany jako podłoże 

ośredniej lub wysokiej selektywności do izolacji Shigella spp. i Salmonella spp. 

Agar deoksycholanowo-cytrynianowy (DCA), agar Hektoen dla pałeczek jelitowych 

(HEA) lub agar Salmonella-Shigella (SS agar) mogą być stosowane 

alternatywnie. Shigella dysenteriae typ 1, S. sonnei i enteroinwazyjne E. coli nie 

rosną dobrze na agarze SS. Jednakże agar SS może być wykorzystany do izolacji 

Y. enterocolitica z zastosowaniem zasad izolacji opisanych dla agaru MacConkeya. 

Wiele laboratoriów do izolacji Salmonella typhi i innych gatunków 

Salmonella stosuje agar siarczanowo-bizmutowy. 

Dla Campylobacter spp. stosowanych jest kilka podłoży selektywnych (Blaser, 

Butzler, Skirrow), zawierających różne dodatki antybakteryjne. Można również 

53

KAŁ 

zastosować podstawowy agar z krwią zawierający 5 – 10% krwi baraniej 

z dodatkiem cefalosporyny (15 µg/ml), wankomycyny (10 µg/ml), amfoterycyny 

B (2 µg/ml) i 0,05% siarczanu żelaza–metadwusiarczanu sodu–pirogronianu 

sodu (FBF). 

Dla Vibrio spp. konieczne są selektywne podłoża, aczkolwiek wiele szczepów 

może rosnąć na agarze MacConkeya. Agar zawierający cytrynian tiosiarczanowy, 

sole żółci i sacharozę (TCBS) jest podłożem selektywnym dla V. cholerae O1 

i nie-O1 oraz dla V. parahaemolyticus, ale drogim. Podłoże selektywne, 

zawierające telluryn, taurocholan i żelatynę (TTG), nie jest komercyjnie dostępne. 

Prostymi, niedrogimi podłożami, które mogą być przygotowywane we własnym 

zakresie i stosowane z bardzo dobrym efektem, są: agar z zasadowym ekstraktem 

mięsnym (MEA) i zasadowy agar z solami żółci (BSA). 

Izolacja Clostridium difficile przed wprowadzeniem agaru cefoksytyno-cykloseryno-fruktozowego 

(CCFA) była trudna. W przypadku lecytynazo- i lipazoujemnych 

C. difficile zalecane jest stosowanie podłoży agarowych, zawierających 

żółtko jaja; inne laseczki występujące w jelicie, takie jak C. perfringens, 

C. bifermentans i C. sordelli, sąlecytynazododatnie. 

Wstępna izolacja 

Próbka powinna być badana i hodowana natychmiast po dostarczeniu do 

laboratorium, co daje najwyższy wskaźnik izolacji Shigella spp. i Campylobacter 

spp. Jeśli nie jest to możliwe, próbka powinna być przechowywana w temperaturze 

4°C. 

Do posiewu na podłoża o wysokiej selektywności powinna być użyta gęsta 

zawiesina kału, a na podłoża o niskiej selektywności — mniej gęsta. W wielu 

laboratoriach wymaz z odbytu posiewany jest bezpośrednio na podłoża, należy 

jednak uważać, aby nie doszło do przerośnięcia płytki. 

Procedura posiewu na podłoża 

do wstępnej izolacji 

1. Posiać ezą na wysoko selektywne podłoża trzy oczka zawiesiny kału, a jedno 

na podłoże o niskiej selektywności. Inoculum umieścić centralnie na płytce 

agarowej, a następnie rozprowadzić w górę, w dół i w poprzek płytki, 

jak zilustrowano na ryc. 6. Procedura ta umożliwia uzyskanie maksymalnej 

liczby pojedynczych kolonii. Drobne kolonie pojawią się peryferycznie na 

płytce. 

2. Po inokulacji inkubować płytki agarowe. W celu izolacji Salmonella, Shigella 

i Yersinia spp. oraz V. cholerae płytki inkubować w cieplarce w warunkach 

tlenowych (bez CO 2 )w35°C, w przypadku Campylobacter spp. w 42°C 

wśrodowisku mikroaerofilnym z 10% CO 2 ,apłytki z Clostridium difficile 

w35°C wśrodowisku beztlenowym. 

Warunki inkubacji Campylobacter 

Płytki do izolacji Campylobacter spp. powinny być inkubowane w 42 – 43°C 

wśrodowisku mikroaerofilnym, zawierającym 5% O 2 , 10% CO 2 i 85% N 2 . 

54

CZE˛ŚĆ I 

Powyższa temperatura hamuje wzrost naturalnej flory jelitowej, nie wpływającna 

wzrost bakterii z rodzaju Campylobacter. Podczas izolacji gatunków nie tolerujących 

podwyższonej temperatury, inkubacja powinna być prowadzona 

w35– 37°C. 

Ryc. 6. Posiew bakterii na płytkę. 

• Odpowiednie warunki wzrostu dla Campylobacter spp. są uzyskiwane na kilka 

sposobów. Wybór metody zależy od zakresu i obciążenia pracą danego 

laboratorium oraz relatywnych kosztów. 

• Eksykator zapewnia atmosferę zawierającą ok. 17 – 19% O 2 

i2– 3% CO 2 

. Nie 

są to optymalne warunki wzrostu Campylobacter spp. i nie wszystkie szczepy 

w nich wyrosną. Według niektórych źródeł inkubacja w 42°C podłoży 

z dodatkiem FBP wpływa korzystnie na skuteczność izolacji. Dodatek FBP 

inaktywując nadtlenki i nadtlenek wodoru poprawia tolerancję tlenu przez 

Campylobacter spp. Ujemną stroną metody jest dłuższa inkubacja i zahamowanie 

wzrostu niektórych wrażliwych na tlen Campylobacter spp. 

• Inna prosta i niedroga metoda wykorzystuje technikę wspólnych hodowli. 

Płytki z szybko rosnącymi fakultatywnie beztlenowymi bakteriami inkubowane 

są zpłytkami do izolacji Campylobacter spp. w zamkniętym pojemniku lub 

plastikowym woreczku. Przy wzroście fakultatywnie beztlenowych bakterii 

zawartość tlenu maleje, a CO 2 

rośnie. Ujemną stroną metody jest zwykle 

dłuższy czas inkubacji potrzebny do wzrostu Campylobacter spp. 

• Komercyjnie dostępna jest specjalnie przystosowana do izolacji Campylobacter 

spp. saszetka z generatorem wodoru i CO 2 oraz katalizatorem. Saszetkę 

należy umieścić w anaerostacie używając każdorazowo przy otwarciu pojemnika 

nowej saszetki. Aby uzyskać maksymalną skuteczność izolacji, w słoju nie 

należy umieszczać więcej niż sześciu płytek. 

• Zestaw do inkubacji w plastikowym woreczku jest także dostępny komercyjnie. 

Wskład zestawu wchodzi plastikowy woreczek, za każdym razem opróżniany 

dwu- lub trzykrotnie ręcznie bądź za pomocą próżniociągu, a następnie 

każdorazowo wypełniany 5% O 2 , 10% CO 2 i 85% N 2 . 

• System opróżnianego i wypełnianego anaerostatu bez katalizatora. Pojemnik 

jest dwukrotnie opróżniany do uzyskania ciśnienia 38 cm (15 mm Hg) 

i wypełniany za każdym razem mieszaniną 10% H 2 

i 90% N 2 

. 

55

KAŁ 

Wstępna identyfikacja izolowanych szczepów 

Identyfikacja odbywa się na podstawie testów zarówno biochemicznych, jak 

i serologicznych, których zakres zależy od możliwości laboratorium. Schemat 

identyfikacji ważnych bakterii jelitowych przedstawiony jest na ryc. 7a-c. 

Na płytce Petriego, zawierającej pierwszy posiew, należy oznaczyć na dnie dobrze 

odgraniczone kolonie o typowym wyglądzie. Wybrane kolonie zostaną poddane 

dalszej identyfikacji. Jeśli w posiewie widoczne są różne typy kolonii, należy 

przeprowadzić identyfikację każdej z nich. 

Małe i bezbarwne kolonie niefermentujących laktozy bakterii, takich jak 

Salmonella spp. i Shigella spp., rosną na podłożu agarowym MacConkeya, agarze 

SS i DCA. Kolonie Proteus spp. mogą być mylone z Salmonella spp. i Shigella 

spp., zwłaszcza na podłożu MacConkeya ze względu na ich wygląd, typowy 

dla bakterii laktozoujemnych. Fermentujące laktozę mikroorganizmy, takie 

jak E. coli i Enterobacter/Klebsiella spp., wytwarzają małe różowe i czerwone 

kolonie na podłożu agarowym MacConkeya, DCA i agarze SS. Na agarze 

XLD Salmonella spp. i Shigella spp. wytwarzają małe czerwone kolonie, 

z czarnym środkiem w przypadku większości szczepów Salmonella. Kolonie 

z czarnym centrum mogą tworzyć na tym podłożu również niektóre szczepy 

Proteus spp. Na agarze bizmutowo-siarkowym Salmonella typhi wytwarzają 

czarne kolonie z metalicznym połyskiem, dobrze widocznym w przypadku 

odgraniczonych kolonii. Yersinia enterocolitica rośnie na agarze MacConkeya 

i agarze SS w postaci małych, bladych kolonii, najszybszy wzrost następuje 

w temperaturze 22 – 29°C. 

Salmonella i Shigella spp. 

Do wstępnych badań szczepów Salmonella spp. i Shigella spp. zalecane są trzy 

różne podłoża: 

– bulion z mocznikiem, lekko buforowany (UREA), 

– podłoże ruch-indol-lizyna (MIL), 

– agar Kliglera (KIA). 

Procedura posiewu i odczytu UREA 

1. Używając do posiewu ezy zebrać zpłytki 2 – 3 nie fermentujące laktozy 

kolonie i przenieść do probówki zawierającej UREA. 

2. Inkubować probówki przez 2 – 4 godziny w 35°C i obserwować ewentualną 

zmianę zabarwienia na różowe (ureazododatnie). Odrzucić ureazododatnie 

probówki. 

3. Przesiać materiał z probówek zawierających szczepy ureazoujemne na MIL 

i KIA (patrz poniżej) i inkubować wszystkie probówki, łącznie z ureazoujemnymi, 

przez noc w 35°C, w warunkach tlenowych. 

Procedura posiewu i odczytu MIL i KIA 

1. Posiać materiał do podłoża MIL przez nakłucie prostą igłą (ezą) nagłębokość 

2 mm od dna probówki. Wyjąć igłę w tej samej linii. 

56

CZE˛ŚĆ I 

Gram-ujemne pałeczki względnie 

beztlenowe fermentuja˛ce cukry 

oksydazoujemne 

▼ 

Laktoza 

+ – 

▼ 

▼ 

Siarkowodór 

Siarkowodór 

+ – + – 

Citrobacter 

▼ ▼ ▼ 

freundii Lizyna Lizyna Fenyloalanina 

+ – + – + – 

▼ 

▼ 

▼ 

▼ ▼ ▼ 

Ureaza Indol Indol Ornityna Lizyna 

+ – + – 

+ – + – 

+ – 

▼ 

Indol 

+ – 

Klebsiella 

oxytoca 

Klebsiella 

pneumoniae 

▼ ▼ ▼ 

Indol 

+ – 

Enterobacter 

aerogenes 

Escherichia 

coli 

Citrobacter 

koseri 

Enterobacter 

cloacae 

Indol 

+ – 

Proteus 

vulgaris 

Proteus 

mirabilis 

Edwardsiella Ornityna 

tarda 

+ – 

Salmonella 

większość serotypów 

▼ 

Morganella 

morgani 

Salmonella 

typhi 

Trehaloza 

+ – 

▼ 

Providencia Mannitol 

stuartii 

+ – 

Providencia 

rettgeri 

Serratia 

liquifaciens 

Ryc. 7a. Schemat wstępnej identyfikacji często występuja˛cych Enterobacteriaceae. 

2. Posiać materiał na podłoże KIA nakłuwając słupek agaru prostą igłą 

i prowadząc zygzakiem po powierzchni skosu. 

3. Opisać wszystkie probówki numerem próbki i inkubować przez noc w temperaturze 

35°C. 

4. Obserwować probówki UREA w kierunku opóźnionej reakcji rozkładu 

mocznika (patrz powyżej). Odrzucić hodowle z reakcją ureazododatnią. 

5. Obserwować podłoża MIL w kierunku obecności ruchu, reakcji rozkładu 

lizyny i wytwarzania indolu. Ruchliwe mikroorganizmy rozprzestrzenią się 

w podłożu poza linię nakłucia i widoczny będzie rozsiany wzrost. Bakterie 

niezdolne do ruchu będą rosły jedynie w kanale wkłucia. Na dodatnią reakcję 

lizynową wskazuje odczyn zasadowy (kolor fioletowy) na dnie podłoża, na 

reakcję ujemną odczyn kwaśny (kolor żółty) spowodowany jedynie fermentacją 

glukozy. Aby wykazać obecność indolu, należy dodać do podłoża 3– 4 

krople odczynnika Kovacsa. Czerwony i różowy kolor wskazują na reakcję 

dodatnią, natomiast kolor jasnożółty świadczy o ujemnym wyniku testu. 

6. Obserwować podłoże KIA. Wszystkie Enterobacteriaceae fermentują glukozę 

z wytworzeniem kwasu i gazu lub tylko kwasu, który jest odpowiedzialny za 

żółte zabarwienie podłoża. Powstający gaz powoduje powstanie pęcherzyków 

ipęknięć na powierzchni agaru, który, jeśli powstaje duża ilość gazu, może 

unieść się w probówce (np. w przypadku Enterobacter spp.). Jeśli równocześnie 

fermentacji ulega laktoza, zarówno słupek agarowy, jak i skos stają się żółte 

z powodu kwaśnego pH (np. w przypadku E. coli). Jeśli nie zachodzi 

fermentacja laktozy (np. Shigella spp. i Salmonella spp.), słupek agaru jest 

żółty, a skos pozostaje czerwony. Zaczernienie wzdłuż linii wkłucia lub 

w całym agarze wskazuje na obecność siarkowodoru. Należy zanotować 

rezultaty i przeprowadzić wstępną identyfikację mikroorganizmu, wykorzystując 

schemat przedstawiony w tabeli 10 i 11. 

▼ 

Providencia 

alcalifaciens 

▼ 

Sorbitol 

+ – 

▼ 

Arabinoza Hafnia 

+ – alvei 

Ureaza 

+ – 

▼ 

Yersinia Ruch 

enterocolitica 

+ – 

▼ 

Salmonella Ornityna 

paratyphi A 

Serratia 

marcescens 

Shigella 

sonnei 

Shigella 

serotyp A, B, C 

57

KAŁ 

Clostridium 

perfringens 

Gram-dodatnie tworza˛ce spory laseczki, 

niektóre gatunki nie tworza˛ce spor, 

względnie beztlenowe lub 

katalazoujemne 

+ – 

Podwójna strefa hemolizy 

Indol 

+ – + – 

Indol 

+ – 

Ureaza 

+ – 

C. sordelli Wzrost 

mgławicowy 

+ – 

C. tetani Laktoza 

+ – 

C. sphenoides C. bifermentans 

Ruch 

+ – 

Charakterystyczna 

fluorescencja 

+ – 

Mannitol 

+ – 

C. ramosum 

C. clostridioforme 

C. difficili Laktoza 

+ – 

Wzrost 

mgławicowy 

Wzrost 

mgławicowy 

+ – + – 

C. septicum C. tertium C. sporogenes C. novyi typ A 

Propionibacterium 

Redukcja 

acnes 

azotanu 

+ – 

Małe (1µm) przezroczyste 

kolonie ziarenko-pałeczek 

+ – 

Eubacterium 

lentum 

Ryc. 7b. Schemat wstępnej identyfikacji Gram-dodatnich pałeczek beztlenowych. 

Katalaza 

15% H 2 O 2 

+ – 

Redukcja 

azotanu 

+ – 

Actinomyces 

viscosus 

,,Beztlenowe pałeczki 

Gram-dodatnie nie 

tworza˛ce spor, 

niemożliwe do 

zidentyfikowania’’ 

(obejmuje Lactobacillus, 

Bifidobacterium i inne 

gatunki Eubacterium) 

Actinomyces species 

(kolonie ,,zębów 

trzonowych’’) 

Propionibacterium 

species 

Szczepy Salmonella są oksydazoujemne, ruchliwe i indoloujemne. Nie hydrolizują 

mocznika i — z wyjątkiem S. paratyphi A — wytwarzają dekarboksylazę 

lizyny. Na agarze KIA obserwowany jest żółty słupek, czerwony skos, H 2 S i gaz, 

z wyjątkiem S. typhi, która nie wytwarza gazu, i większości szczepów S. paratyphi 

A, które są H 2 S-ujemne. Jeśli powyższe kryteria są spełnione, zanotować: 

,,izolacja Salmonella (identyfikacja wstępna)’’. 

Szczepy Shigella są oksydazoujemne, nieruchliwe, nie wytwarzają dekarboksylazy 

lizyny i nie hydrolizują mocznika. Na KIA obserwowany jest zasadowy 

(czerwony) skos i kwaśny (żółty) słupek, bez H 2 S i bez gazu, z wyjątkiem S. flexnerii 

serotyp 6 (warianty Newcastle i Manchester) i S. boydii serotyp 14, które 

wytwarzają gaz. Z wyjątkiem S. dysenteriae serotyp 1 bakterie wytwarzają 

katalazę. Jeśli powyższe kryteria są spełnione, zanotować: ,,izolacja Shigella 

(wstępna identyfikacja)’’. 


Wzrost małych, bladych, czy też bezbarwnych koloni na podłożu MacConkeya 

lub agarze SS po całonocnej inkubacji może wskazywać na obecność Yersinia 

enterocolitica. Typowe kolonie należy posiać na KIA i inkubować w temperaturze 

25°C przez noc. Inne kolonie, prawdopodobnie chorobotwórczych szczepów, 

posiać na dwa podłoża UREA i dwa podłoża MIL, inkubować równolegle po 

jednej z probówek w temperaturze 25°C i w temperaturze 35°C. Typowe szczepy 

Yersinia enterocolitica na podłożu KIA zakwaszają słupek, nie ma gazu i H 2 

S. 

58

CZE˛ŚĆ I 

Wzrost na agarze 

zżółcia˛ i eskulina˛ 

+ – 

▼ 

Wrażliwe na kanamycynę (Km) 

i wankomycynę (Vm) 

▼ 

Wrażliwe na kanamycynę (Km) 

i wankomycynę (Vm) 

▼ 

Km-oporne 

Vm-wrażliwe 

▼ 


Vm-oporne 

▼ 

Km-wrażliwe 


▼ 



▼ 



Porphyromonas Prevotella Grupa 

▼ 


Kolonie z pigmentem 

lub fluoryzuja˛ce 

na czerwono 

+ – 

Prevotella 

Ureaza 

+ – 

▼ 

▼ 

Grupa 

Fusobacterium 

mortiferum/varium 

Katalaza 

Indol 

+ – + – 

Bilophila 

wadsworthia 

▼ 

Bacteroides 

ureolyticus 

Fusobacterium nucleatum 

F. necrophorum 

inne gatunki Fusobacterium 

Jeśli szczep jest ruchliwy i ureazododatni w temperaturze 25°C oraz nieruchliwy 

i słabo ureazododatni lub ureazoujemny w temperaturze 35°C, zanotować: 

,,izolacja Yersinia (wstępna identyfikacja)’’. 

▼ 

▼ 

Kolonie, bardzo małe 

przezroczyste 

+ – 

▼ 

Nierozpuszczalne 

wżółci 

+ – 

▼ 

Katalaza 

+ – 

▼ 

Bilophila 

wadsworthia 

Ryc. 7c. Schemat wstępnej identyfikacji Gram-ujemnych pałeczek beztlenowych. 

▼ 

Suterella 

wadsworthensis 

▼ 

Campylobacter 

species 

▼ 

Fusobacterium 

species 

WHO 01.50 

Vibrio cholerae i V. parahaemolyticus 

Szczepy Vibrio rosną na agarze MacConkeya w postaci bladych, nie fermentujących 

laktozy kolonii. Na agarze TCBS V. cholerae tworzą średniej wielkości, 

wypukłe, gładkie, żółte kolonie, w odróżnieniu od V. parahaemolyticus, których 

kolonie są duże, płaskie i niebieskozielone. 

Niektóre szczepy V. cholerae, z powodu opóźnionej fermentacji sacharozy, mogą 

również na podłożu TCBS tworzyć zielone lub bezbarwne kolonie. Na podłożu 

TTGA kolonie są ciemne w centrum, z powodu redukcji tellurynu, oraz otoczone 

strefą zmętnienia, związaną z aktywnością żelatynazy. Na podłożu BSA i MEA 

kolonie V. cholerae są bezbarwne, zwykle płaskie i dobrze odgraniczone; 

zazwyczaj łatwo je odróżnić od kolonii Enterobacteriaceae w ukośnym oświetleniu 

lub podczas badania w świetle dziennym padającym pod kątem. Dla 

podejrzanych kolonii należy wykonać test na obecność oksydazy i test śluzowy. 

59

KAŁ 

Tabela 9. Morfologia kolonii powszechnie występuja˛cych bakterii jelitowych na różnicuja˛cych i selektywnych 

podłożach 

Gatunki 


Agar 

MacConkeya 

z fioletem 

krystalicznym 

Różowoczerwone 

Agar XLD Agar SS DCA HEA 

Różowoczerwone 

zahamowanie 

wzrostu 

Różowe, otoczone 

strefa˛ precypitacji 

Shigella spp. Bezbarwne Czerwone Bezbarwne Bezbarwne lub jasnobra˛zowe 

Salmonella spp. Bezbarwne Czerwone z czarnym 

centrum 

lub bez 

Enterobacter/ 

/Klebsiella spp. 

Proteus/ 

/Providencia 

spp. 

Yersinia 

enterocolitica 

Różowe, śluzowe 

Bezbarwne, zahamowane 

pełzanie 

Bezbarwne 

Żółte, śluzowe 

Czerwone, niektóre 

Proteus spp. maja˛ 

czarne centrum 

Żółte, nieregularne 

Enterococcus spp. Brak wzrostu Brak lub słaby 

wzrost 

Bezbarwne z czarnym 

centrum 

lub bez 

Różowe, zahamowanie 

wzrostu 

Bezbarwne, z szaroczarnym 

centrum 

lub bez 

Bezbarwne lub jasnobra˛zowe 

z czarnym 

centrum lub bez 

Duże, bezbarwne lub 

jasnobra˛zowe z 

czarnym centrum 

lub bez 

Bezbarwne Bezbarwne Łososiowe 

Duże, płaskie, żółte, 

nieprzejrzyste 

Duże, łososioworóżowe 

lub pomarańczowe, 

otoczone 

strefa˛ precypitacji 

Zielone, wilgotne, wypukłe 

Niebieskozielone z 

czarnym centrum 

lub bez 

Duże, blade, śluzowe, 

z różowym centrum 

Duże, łososiowopomarańczowe 

Niebieskozielone lub 

łososiowe z czarnym 

centrum lub 

bez 

Brak wzrostu Brak lub słaby wzrost Brak lub słaby wzrost 

XLD: deoksycholan ksylozo-lizynowy; DCA: cytrynian deoksycholowy; SS: Salmonella-Shigella; HEA: hektoen jelitowy. 

Tabela 10. Interpretacja reakcji pałeczek Enterobacteriaceae na agarze żelazowym 

Kliglera (KIA) 

Reakcja 

Interpretacja 

Słupek kwaśny (żółty) i skos zasadowy (czerwony) 

Tylko fermentacja glukozy 

Kwaśne całe podłoże (słupek i skos żółte) Fermentacja glukozy i laktozy 

Zasadowe całe podłoże (słupek i skos czerwone) 

Brak fermentacji glukozy i laktozy 

Pęcherzyki gazu w słupku lub pęknięcia Bakterie wytwarzaja˛ce gaz 

w podłożu 

Zaczernienie w słupku Wytwarzanie siarkowodoru (H 2 S) 

Procedura testu na oksydazę 

1. Na papierowym filtrze w szalce Petriego umieścić 2 – 3 krople odczynnika do 

testu na oksydazę (1% tetrametylo-parafenylenodiamina). 

2. Platynową (nie niklowo-chromową) ezą, czystą drewnianą szpatułką lub 

wykałaczką zebrać niewielką liczbę świeżych kolonii z agaru MacConkeya. 

Rozprowadzić bakterie na nawilżonej części papierowego filtra. 

3. O reakcji dodatniej świadczy ciemnofioletowe zabarwienie papierka w ciągu 

10 sekund. Spośród Gram-ujemnych pałeczek oksydazododatnie są Vibrio, 

Aeromonas, Plesiomonas, Pseudomonas i Alcaligenes; wszystkie Enterobacteriaceae 

są oksydazoujemne. Odczynnik do testu na oksydazę powinien być 

regularnie testowany za pomocą dodatnich i ujemnych szczepów kontrolnych. 

60

CZE˛ŚĆ I 

Tabela 11. Wzory typowych reakcji pałeczek Enterobacteriaceae na agarze Kliglera 

(KIA) 

Reakcja Fermentacja cukru(ów) Gatunek bakterii 

Kwaśny słupek 1 Glukoza: kwas i gaz Escherichia coli 

Kwaśny skos 1 Laktoza: kwas i gaz Klebsiella 

Gaz w słupku 

Enterobacter 

Brak H 2 S 

Citrobacter diversus 

Serratia liquefaciens 

Kwaśny słupek Glukoza: kwas i gaz Salmonella 

Zasadowy skos 2 Laktoza: brak fermentacji Proteus 

Gaz w słupku 

Citrobacter freundii* 

Wytwarzanie H 2 S 

Kwaśny słupek Glukoza: tylko kwas Shigella 

Zasadowy skos Laktoza: brak fermentacji Yersinia 

Brak gazu w słupku 

Serratia marcescens* 

Brak H 2 S 

Providencia stuartii 

Providencia rettgeri* 

Kwaśny słupek Glukoza: kwas i gaz Salmonella paratyphi A 

Zasadowy skos Laktoza: brak fermentacji Hafnia alvei 

Gaz w słupku 

Serratia marcescens* 

Brak H 2 S 

Morganella morgani 

Obojętny/zasadowy słupek 2 Brak fermentacji cukrów Alcaligenes 

Zasadowy skos 

Pseudomonas 

Brak gazu 

Acinetobacter 

Brak H 2 S 

1 

Kwaśne pH powstałe w wyniku rozkładu cukru, obserwowane na podstawie żółtego 

zabarwienia podłoża (przyp. tłum.). 

2 

Zasadowe lub obojętne pH w wyniku braku rozkładu cukru, obserwowane na podstawie 

niezmienionego, różowego koloru podłoża (przyp. tłum.). 

* Reakcje atypowe. 

Procedura testu śluzowego 

1. Umieścić na szkiełku kroplę 0,5% roztworu dezoksycholanu sodu i wymieszać 

zmałą liczbą kolonii pobranych z podłoża MacConkeya. 

2. Wskaźnikiem dodatniej reakcji jest zmiana charakteru zawiesiny w ciągu 

60 sekund: z mętnej w śluzowatą; obecność śluzowych włókien może być 

wykazana za pomocą ezy, którą zanurza się w zawiesinie i odsuwa od szkiełka. 

Niektóre szczepy Aeromonas mogą wykazywać słabą i opóźnioną o około 

60 sekund reakcję. 

Jeśli powyższe testy są dodatnie, przenieść część kolonii na KIA i po całonocnej 

inkubacji obserwować w kierunku obecności żółtego zabarwienia słupka, zasadowego 

skosu, braku wytwarzania gazu i H 2 S. Jeśli wystąpią ww. cechy, zanotować: 

,,izolacja Vibrio cholerae (wstępna identyfikacja)’’. 

Campylobacter jejuni i Campylobacter coli 

Płytki Campylobacter należy oglądać po 48 – 72 godzinach inkubacji. Zalecane 

jest wykonanie testu na oksydazę, oglądanie preparatu natywnego w ciemnym 

polu widzenia lub w mikroskopie fazowo-kontrastowym oraz preparatu barwionego 

metodą Grama. Jeśli mikroskop z ciemnym polem widzenia lub 

fazowo-kontrastowy nie jest dostępny, morfologię komórek można określić na 

podstawie preparatu barwionego metodą Grama, używając obok fioletu krystalicznego 

0,3% fuksyny karbolowej. Campylobacter spp. są oksydazododatnie, 

61

KAŁ 

wykazują ruch, w preparacie widoczne są jako lekko lub spiralnie zagięte pałeczki 

(kształt skrzydeł mewy lub ,,S’’). Jeśli wystąpią ww. cechy, zanotować: ,,izolacja 

Campylobacter (wstępna identyfikacja)’’. 

Clostridium difficile 

Kolonie C. difficile na podłożu CCFA są duże, żółte, ze szklistą podstawą. Na 

agarze z krwią wśrodowisku beztlenowym kolonie mogą wykazywać różną 

morfologię, dlatego niezbędna jest identyfikacja bakterii na podstawie innych 

cech. Typowe kolonie na tym podłożusąszare, nieprzejrzyste, bez cech hemolizy 

po 24 – 48 godzinach, tylko niekiedy zielononiebieskie z powodu α-hemolizy. 

Po 48 – 72 godzinach inkubacji może pojawić się wyraźne szare zabarwienie 

z białym centrum. Z doświadczenia wynika jednak, że mimo różnic w morfologii 

kolonii C. difficile jest łatwo rozpoznawany na podstawie charakterystycznego 

zapachu, przypominającego odchody końskie. Jeśli kolonie są lecytynazoi 

lipazoujemne, a ponadto wykazują żółtozieloną fluorescencję wświetle lampy 

Wooda, należy zanotować: ,,izolacja Clostridium difficile (wstępna identyfikacja)’’. 

Końcowa identyfikacja mikrobiologiczna 

Przed wydaniem wyniku należy sprawdzić czystość hodowli i potwierdzić 

identyfikację za pomocą dodatkowych testów biochemicznych. 

1. Pobrać zpłytki dobrze odgraniczone od innych kolonie i przesiać na bulion 

odżywczy w celu wykonania testów biochemicznych, na skos agarowy do 

testów serologicznych oraz na płytkę MacConkeya w celu potwierdzenia 

czystości hodowli. 

2. Wykonać dodatkowe testy biochemiczne zgodnie z tabelami. Wyniki odczytać 

po całonocnej inkubacji i zidentyfikować izolowane szczepy. 

Identyfikacja Shigella i Salmonella może niekiedy stanowić problem, ponieważ 

niektóre szczepy różnią się wynikami reakcji biochemicznych, a także mogą 

wykazywać obecność antygenów wspólnych z innymi Gram-ujemnymi bakteriami. 

Nieruchliwe, laktozoujemne, nie wytwarzające gazu szczepy E. coli są 

często trudne do odróżnienia od szczepów Shigella, a ponadto identyfikacja może 

być skomplikowana w związku z faktem wywoływania czerwonki bakteryjnej 

przez niektóre z tych szczepów. 

Salmonella 

Jeśli wyniki wstępnych testów wskazują na obecność szczepów Salmonella, 

należy posiać szczepy na podłoże z ornityną, podłoże Simmonsa z cytrynianem, 

ONPG i wodę peptydową wzbogaconą mannitolem, ramnozą, trehalozą lub 

ksylozą. Obserwować reakcje po całonocnej inkubacji i zidentyfikować szczepy 

według schematu przedstawionego w tabeli 12. Jeśli wyniki wskazują na hodowlę 

Salmonella, przeprowadzić identyfikację serologiczną. 

62

CZE˛ŚĆ I 

Tabela 12. Biochemiczne reakcje biotypów Salmonella i innych pałeczek 

Tabela 13. Biochemiczne reakcje biotypów Shigella i innych pałeczek 

Oksydaza 

Ruch 

Indol 

Lizyna 

Ureaza 

VP 

Cytrynian 

Ornityna 

Fenyloalanina 

ONPG 

Sacharoza 

Ksyloza 

Ruch 

mgławicowy 

H 2 SKIA 

Indol 

Lizyna 

Ornityna 

Cytrynian 

ONPG 

Ureaza 

Mannitol 

Trehaloza 

Ramnoza 

Ksyloza 

Salmonella (większość 

– – – + + + – – + + + + 

serotypów) 

S. choleraesuis – d – + + d – – + – + + 

S. arizonae – + – + + + + – + + + + 

S. typhi – +w – + – – – – + + – + 

S. paratyphi A – d– – – + – – – + + + – 

Edwardsiella tarda – + + + + – – – – – – – 

Citrobacter freundii – + – – – + + d + + + + 

Proteus spp. + + –/+ – +/– v – + – + – + 

Skróty: +: > 95% dodatnich; d: 26 –74% dodatnich; d–:5–25% dodatnich; –: < 5% dodatnich; v: zmienne wyniki; w: słaba reakcja. 

H 2 S/KIA: wytwarzanie siarkowodoru na agarze Kliglera; Lizyna: dekarboksylaza lizyny; Ornityna: dekarboksylaza ornityny; 

Cytrynian: agar cytrynianowy Simmonsa; ONPG: β-galaktozydaza. 

Shigella sonnei – – – – – – – + – d+ – – 

Shigella, inne gatunki – – d – – – – – – – – – 

E. coli, nieaktywne szczepy – – d+ d – – – d– – d d– d 

Providencia – + + – v – + – + d– d – 

Morganella – d+ + – + – – + d+ d– – – 

Hafnia alvei – + – + – d+ d– + – + d– + 

Serratia marcescens – + – + d– + + + – + + – 

Salmonella paratyphi A – + – – – – – + – – – – 

Plesiomonas shigelloides + + + + – – – + – + – – 

Skróty: +: > 95% dodatnich; d+: 75 –95% dodatnich; d: 26 –74% dodatnich; d–: 5–25% dodatnich; –: < 5% dodatnich; Lizyna: 

dekarboksylaza lizyny; VP: Voges-Proskauera; Cytrynian: agar cytrynianowy Simmonsa; Ornityna: dekarboksylaza ornityny; 

Fenyloalanina: deaminaza fenyloalaniny; ONPG: β-galaktozydaza. 

Tabela 14. Biochemiczne reakcje gatunków i serotypów Shigella 

Dekarboksylaza 

ornityny 

Fermentacja: 

laktoza/sacharoza 

Fermentacja: 

mannitol 

Katalaza 

Glukoza: gaz 

Shigella dysenteriae 

Serotyp 1 (shigae) – – – – – 

Serotyp 2 (schmitzii) – – – + – 

Serotypy 3 –10 – – – + – 


Serotyp 1 –5, X i Y – – + + – 

Serotyp 6 Newcastle – – – + + 

Serotyp 6 Manchester – – + + + 

Serotyp 6 Boyd 88 – – + + – 

Shigella boydii 

Serotyp 1 –13, 15 – – – – – 

Serotyp 14 – – – – + 

Shigella sonnei + + (opóźniona) + + – 

63

KAŁ 

Shigella 

Jeśli wyniki wstępnych testów wskazują na pałeczki Shigella, należy posiać 

badany szczep na podłoża z ornityną, fenyloalaniną i ONPG oraz wodę peptonową 

z sacharozą i ksylozą. Obserwować reakcje po całonocnej inkubacji i zidentyfikować 

izolaty według schematu przedstawionego w tabeli 13. Jeśli wyniki 

wskazują na hodowlę Shigella, przeprowadzić identyfikację serologiczną. 

Do rodzaju Shigella należą cztery gatunki: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii 

i S. sonnei. Zwykle oznaczane są jako podgrupy, odpowiednio A, B, C i D. 

Niektóre serotypy można wstępnie zidentyfikować i podzielić na biotypy na 

podstawie reakcji biochemicznych. 

Wśród S. dysenteriae (podgrupa A) wyróżnia się 10 serotypów. Serotyp 1 jest 

katalazoujemny i wytwarza toksynę Shiga. Pozostałe serotypy są katalazododatnie. 

Większość szczepów nie fermentuje mannitolu i laktozy. 

Wśród S. flexneri (podgrupa B) wyróżnia się 8 serotypów. Większość szczepów 

fermentuje mannitol, nie fermentuje sacharozy ani laktozy. Należący do serotypu 

6 szczep Newcastle nie fermentuje mannitolu, ale wytwarza gaz z glukozy; 

szczep Manchester wytwarza kwas i gaz z glukozy oraz mannitolu; szczep 

Boyd 88 rozkłada glukozę i mannitol do kwasu, bez wytwarzania gazu. 

Wśród S. boydii (podgrupa C) wyróżnia się 15 serotypów. Fermentują one 

mannitol, nie fermentują laktozy. 

Wśród S. sonnei (podgrupa D) wyróżnia się jeden serotyp, wykazujący dwie fazy 

reakcji: I i II. Fermentuje mannitol. Wykazuje dodatnią reakcję ONPG, ale 

fermentacja laktozy i sacharozy zachodzi później niż po 24 godzinach (patrz 

tabela 14). 


Jeśli wyniki wstępnych testów wskazują na obecność szczepów Yersinia, należy 

posiać szczep na podłoża z ornityną, Voges-Proskauera, ONPG, cytrynianowe 

podłoże Simmonsa oraz wodę peptonową wzbogaconą sacharozą, ramnozą, 

melibiozą, sorbitolem lub celobiozą. Obserwować reakcje po jednodniowej 

inkubacji i zidentyfikować izolaty według schematu przedstawionego w tabeli 15. 

Jeśli wyniki wskazują na hodowlę Y. enterocolitica, wydać wynik: ,,Yersinia 

enterocolitica’’. 

Tabela 15. Biochemiczne reakcje Yersinia enterocolitica i innych niepatogennych gatunków Yersinia 

MIL 

Ureaza 

Ornityna 

VP 25°C 

Cytrynian 

Sacharoza 

Ramnoza 

Melibioza 

Sorbitol 

Celobioza 

Y. enterocolitica +/v/– + + v – v – – +* + 

Y. frederiksenii +/+/– + + + d + + – + + 

Y. intermedia +/+/– + + + + + + + + + 

Y. kristensenii +/d/– + + – – – – – + + 

Y. pseudotuberculosis +/–/– + – – – – + + – – 

Skróty: +: > 95% dodatnich; d: 26 –74% dodatnich; –: < 5% dodatnich; v: zmienny wynik; MIL: podłoże ruch-indol-lizyna; VP 25°C: 

inkubacja w 25°C na agarze Voges-Proskauera; Cytrynian: agar cytrynianowy Simmonsa. 

* Z wyja˛tkiem biotypu 5. 

64

CZE˛ŚĆ I 

Vibrio cholerae 

Jeśli wyniki wstępnych testów wskazują na obecność szczepów Vibrio, należy 

wykonać posiew na podłoże z ornityną, agar cytrynianowy Simmonsa oraz wodę 

peptonową z sacharozą i inkubować przez noc. Jeśli jedna z opisanych reakcji jest 

ujemna, wykonać posiew na podłoże Voges-Proskauera i przeprowadzić test na 

hydrolizę eskuliny, fermentację mannitolu, arabinozy i arbutyny. Obserwować 

reakcje po całonocnej inkubacji i zidentyfikować izolaty według schematu 

przedstawionego w tabeli 16. 

Tabela 16. Reakcje biochemiczne przecinkowców występuja˛cych w kale 

Oksydaza 

KIA 

słupek/skos 

MIL 

Ornityna 

Cytrynian 

Sacharoza 

Mannitol 

Arabinoza 

Eskulina 

Komentarz 

Vibrio cholerae + K/A +/+/+ + + + + – – 

V. mimicus + v/A +/+/+ + + – + – – 

V. parahaemolyticus + K/A +/+/+ + – – + d+ – 

V. fluvialis + K/A +/d/– – + + + + – 

V. furnissii + K/AG +/–/– – + + + + – 

V. hollisae + K/A +/+/– – – – – + – słaby wzrost 

Aeromonas hydrophila + A/AG +/+/+ – d + + + + Arb+/VP+ 

A. caviae + A/A +/+/– – + + + + d Arb–/VP– 

A. veronii biotyp sobria + A/AG +/+/+ – + + + – – Arb–/VP+ 

Plesiomonas shigelloides + K/A +/+/+ + – – – – + Arb–/VP– 

Skróty: +: > 95% dodatnich; d+: 75 –95% dodatnich; d: 26 –74% dodatnich; –: < 5% dodatnich; KIA: agar Kliglera; MIL: podłoże 

ruch-indol-lizyna; Ornityna: dekarboksylaza ornityny; Eskulina: hydroliza eskuliny; K: odczyn zasadowy; A: odczyn kwaśny; G: 

gaz; Arb: fermentacja arbutyny; VP: Voges-Proskauer. 

Jeśli dostępna jest swoista surowica anty-Vibrio cholerae serogrupy O1, należy 

wykonać szybki test aglutynacji szkiełkowej. W przypadku makroskopowej 

aglutynacji, opisać: ,,Vibrio cholerae O1’’. Jeśli surowica nie jest dostępna 

lub identyfikacja nie jest pewna, przesłać szczep do referencyjnego laboratorium. 

Różnicowanie V. cholerae O1 na biotypy klasyczny i El Tor nie jest niezbędne do 

leczenia lub monitorowania, powinno jednak zostać przeprowadzone dla niektórych 

izolatów (tabela 17). 

Tabela 17. Różnice biotypów Vibrio cholerae 

Klasyczny 

Biotyp 

El Tor 

Hemaglutynacja Reakcja ujemna, brak wzrostu* Reakcja dodatnia, wzrost* 

Polimyksyna B (50 j.) Wrażliwy Oporny 

Voges-Proskauer Reakcja ujemna, brak wzrostu* Reakcja dodatnia, wzrost* 

Hemoliza Reakcja ujemna, brak wzrostu Zmienne 

* Moga˛ wysta˛pić odchylenia od normy. 

65

KAŁ 

Test hemaglutynacji pośredniej 

1. Przez wielokrotne odwirowanie przygotować w fizjologicznym roztworze soli 

2,5% zawiesinę kurzych lub bydlęcych krwinek czerwonych. 

2. Na szkiełku zaznaczyć ołówkiem kilka pól i ezą nanieść na każde z nich oczko 

(3 mm) zawiesiny krwinek czerwonych. 

3. W każdej z przygotowanych zawiesin krwinek umieścić niewielką liczbę 

bakterii pobranych z agaru lub skosu KIA, dobrze wymieszać. 

W przypadku szczepów biotypu El Tor, aglutynacja pojawia się w ciągu 

30 – 60 sekund. Znane szczepy hemaglutynujące (El Tor) i nie hemaglutynujące 

powinny być użyte jako kontrola dla każdej z nowo przygotowanych zawiesin 

krwinek. Świeżo izolowane szczepy klasycznych biotypów dają zwykle ujemny 

wynik testu, jednak w przypadku starych szczepów laboratoryjnych wynik ten nie 

zawsze jest ujemny. 

Test wrażliwości na polimiksynę B 

1. Na podłożu Mueller-Hintona lub na agarze z wyciągiem mięsnym rozprowadzić 

oczko hodowli szczepów inkubowanej przez noc w wodzie 

peptonowej. 

2. Umieścić krążek zawierający 50 jednostek polimiksyny B w centrum hodowli. 

3. Umieścić płytkę wchłodziarce na 1 godzinę. 

4. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 36°C. 

Zidentyfikowane szczepy biotypu klasycznego i El Tor powinny być zawsze 

włączane do grupy szczepów kontrolnych. Klasyczne szczepy są wrażliwe na 

polimiksynę B, dlatego zawsze obserwuje się wyraźną strefę zahamowania 

wzrostu wokół krążka. Szczepy El Tor są niewrażliwe i strefa zahamowania nie 

jest widoczna. 

Campylobacter jejuni i Campylobacter coli 

W laboratoriach klinicznych dostępnych jest tylko kilka testów do identyfikacji 

gatunków i podgatunków Campylobacter. Ze względu na temperaturę wzrostu 

Campylobacter spp. można podzielić na dwie grupy: gatunki ciepłolubne, które 

rosną w temperaturze 42 – 43°C, i gatunki nieciepłolubne, które rosną w temperaturze 

15 – 25°C. 

Do gatunków ciepłolubnych należą: Campylobacter jejuni podgatunek jejuni, 

C. coli, C. lari, C. upsaliensis i niektóre szczepy C. hyointestinalis. C. lari 

i C. hyointestinalis są oporne, natomiast C. jejuni, C. coli i C. upsaliensis są 

wrażliwe na kwas nalidyksowy; C. jejuni podgatunek jejuni, C. coli, C. lari są 

oporne, natomiast C. hyointestinalis i C. upsaliensis są wrażliwe na cefalotynę. 

Różnicowanie między tymi grupami odbywa się na podstawie zdolności do 

hydrolizy hipuranu i wytwarzania siarkowodoru na agarze Kliglera. 

Do gatunków nieciepłolubnych należą: C. jejuni podgatunek doylei, C. fetus 

i Arcobacter butzleri. C. jejuni podgatunek doylei nie rośnie w temperaturze 15°C 

ani w temperaturze 25°C; C. fetus rośnie dobrze w 25°C, ale nie rośnie w 15°C; 

A. butzleri rośnie w obydwu temperaturach. A. butzleri jest oporny na cefalotynę, 

a C. jejuni podgatunek doylei i C. fetus są na nią wrażliwe (tabela 18). 

66

CZE˛ŚĆ I 

Tabela 18. Identyfikacja biochemiczna gatunków Campylobacter izolowanych z kału 

Wzrost w temperaturze 

15°C 25°C 42°C 

H 2 S/KIA 

Hydroliza 

hipuranu a 

Redukcja 

azotanu 

Wrażliwość 

Kwas 

nalidyksowy b 

Cefalotyna c 

Campylobacter jejuni – – + – + + S R 

subsp. jejuni 

C. jejuni subsp. doylei – – – – d – S S 

C. coli – – + + – + S R 

C. lari – – + – – + R R 

C. upsaliensis – – + – – + S S 

C. fetus subsp. fetus – + – – – + R S 

C. hyointestinalis – + v + – + R S 

Arcobacter butzleri d + + – – – + v R 

Skróty: +: > 95% dodatnich; d+: 75 –95% dodatnich; d: 26 –74% dodatnich d–:5–25% dodatnich; –: < 5% dodatnich; v: reakcja 

zmienna; S: wrażliwy; R: oporny; H 2 S/KIA: agar Kliglera. 

a 

Jedynie kolor ciemnej purpury jest dowodem na reakcje dodatnia˛. 

b 

Kra˛żek zawieraja˛cy 30 µg kwasu nalidyksowego. 

c 

Kra˛żek zawieraja˛cy 30 µg cefalotyny. 

d 

Katalazoujemne lub słabo dodatnie; agar Kliglera. 

Identyfikacja serologiczna 

Salmonella 

Nazewnictwo i klasyfikacja pałeczek Salmonella kilkakrotnie ulegały zmianom 

i nadal poddawane są pod dyskusję. Zgodnie z obecnym nazewnictwem wszystkie 

serotypy Salmonella należą do jednego gatunku, który podzielony jest na sześć 

podgrup (zwanych także podgatunkami), do których zaliczany jest dawny rodzaj 

Arizona. Podgrupa 1 odpowiada typowym pałeczkom Salmonella i obejmuje 

m.in.: Salmonella typhi, S. paratyphi A, S. enteritidis, S. typhimurium, S. choleraesuis. 

Podgrupa ta obejmuje około 2000 serotypów, które mogą być różnicowane 

na podstawie wzoru antygenów (antygeny O, H, Vi). Serotypy należące 

do podgrupy 1 są nazywane w sposób sugerujący przynależność do rzeczywistych 

gatunków: Salmonella podgrupa 1 serotyp typhimurium jest nazywana po prostu 

S. typhimurium. Ponad 99% izolowanych od ludzi pałeczek Salmonella należydo 

podgrupy 1. 

Ważnymi antygenami w serotypowaniu Salmonella są antygeny somatyczne 

O i antygeny rzęskowe H. Antygeny O występują zarówno u ruchliwych, jak 

i u nieruchliwych szczepów, są odporne na gotowanie; antygeny H występują 

jedynie u ruchliwych pałeczek i są wrażliwe na gotowanie. Większość gatunków 

Salmonella wykazuje dwufazową ruchliwość i może wytwarzać dwie formy 

antygenów określanych jako antygeny fazy I i II. W obu fazach szczepy mają ten 

sam antygen O, lecz różnią się formą antygenu H. Do identyfikacji serotypu 

konieczne jest określenie specyficzności antygenu H obu faz. Nie zawsze jest to 

możliwe, dlatego niekiedy, dla potwierdzenia obecności fazy latencji, konieczne 

jest jej zahamowanie. 

Antygeny O oznaczone są cyframi arabskimi. Antygeny H fazy I oznaczone są 

małymi literami rzymskimi, a antygeny H fazy II cyframi arabskimi. Na przykład, 

wzór antygenowy S. typhimurium to 1,4,[5],12:i:1,2, gdzie antygeny O to 1,4,5 

i 12; antygeny H fazy I to ,,i’’, a fazy II to 1 i 2. Nawiasy oznaczają, że antygen 

może być nieobecny, a podkreślenie wskazuje, że antygen związany jest 

z lizogenną konwersją wywołaną przez bakteriofagi. Taka zmiana we wzorze 

67

KAŁ 

antygenów możliwa jest jedynie w obecności bakteriofaga i może stanowić jedyną 

różnicę między niektórymi serotypami. 

Gatunki Salmonella podzielono na grupy na podstawie obecności określonych 

antygenów O. Wspomniany podział jest także określany jako schemat Kauffmanna-White’a. 

Duże litery rzymskie określają grupy O. W oryginalnym schemacie 

grupy oznaczone były literami A, B, C, D i E; stopniowo poszerzono zakres grup 

od A do Z, z czterema podgrupami C, trzema D, czterema E i dwiema G. Grupy 

O określane są na podstawie obecności następujących antygenów O: 

Grupa: A B a C 1 C 2 D E 1 F 

Antygen: 2 4;5 6;7 6;8 9 3;10 11 

Istnieją inne różnice w strukturze antygenowej: zmiana w wyglądzie kolonii 

od gładkich do szorstkich w zależności od obecności lub braku antygenu 

Vi. Obecność antygenu Vi hamuje aglutynację w swoistej surowicy anty-O. 

Antygen Vi jest zwykle wykrywany w świeżo izolowanych szczepach i szybko 

tracony podczas ich przechowywania. Antygen ten jest ważny w identyfikacji 

szczepów S. typhi, często nie ulegających aglutynacji w heterogennej surowicy 

anty-H. 

Procedura identyfikacji antygenu somatycznego O 

Bezpośredni test aglutynacji szkiełkowej 

1. Przed rozpoczęciem badania umieścić roztwór soli i odczynniki w temperaturze 

pokojowej. 

2. Umieścić kroplę roztworu soli na czystym szkiełku mikroskopowym. 

3. Za pomocą sterylnej ezy pobrać niewielką ilość materiału z hodowli na skosie 

agarowym i rozprowadzić w kropli soli uzyskując jednolitą, mętną zawiesinę. 

4. Pod lupą lub pod mikroskopem w niewielkim powiększeniu (× 10) obejrzeć 

zawiesinę bakterii, aby wykluczyć autoaglutynację zawiesiny w soli. 

5. Pobrać ezą 10 µl poliwalentnej surowicy odpornościowej O Salmonella (A-I 

i Vi) i umieścić ją na szkiełku tuż obok zawiesiny bakterii. 

6. Wymieszać surowicę z zawiesiną bakterii i przechylać szkiełko do przodu i do 

tyłu przez 1 minutę. Obserwować tworzenie się grudek oglądając szkiełko 

w dobrym świetle. Pojawienie się w tym czasie wyraźnych grudek jest 

wynikiem dodatnim. 

7. Jeśli wynik jest dodatni, powtórzyć badanie z monowalentną surowicą 

odpornościową. 

Niektóre pałeczki Salmonella mają antygen powierzchniowy Vi i żywe lub 

nieinaktywowane termicznie nie ulegają aglutynacji z surowicą odpornościową 

grupy C1 (O:6,7) lub grupy D (O:9). Aby zapobiec otrzymaniu nieprawidłowego 

wyniku, w celu usunięcia antygenu Vi, zawiesinę należy podgrzać w gotującej 

się wodzie, schłodzić, oddzielić bakterie przez wirowanie, ponownie 

zawiesić wświeżym fizjologicznym roztworze soli i przeprowadzić test z tą 

samą surowicą. 

a 

Wszystkie szczepy Salmonella podgrupy B zawierają antygen 4, tylko niektóre antygen 5. 

68

CZE˛ŚĆ I 

Biochemiczna identyfikacja: 

gatunek Salmonella 


Salmonella typhi 


Salmonella paratyphi A 

Test z poliwalentna˛ surowica˛ 

anty-Salmonella A-I + Vi 

Test z poliwalentna˛ surowica˛ Test z poliwalentna˛ surowica˛ 

anty-Salmonella A-I + Vi anty-Salmonella A-I + Vi 

dodatni 

ujemny ujemny 

anty-grupa B anty-grupa D 

dodatni dodatni 

Test z anty-H:b; anty-H:1,2; H:i 


wszystkie 

ujemne 

anty-H:m 

ujemny 

anty-grupa D 

+anty-Vi* anty-grupa A 

ujemny 

H:b H:1,2 H:i 

dodatni dodatni dodatni 

obydwa 

dodatnie 

jeden lub 

obydwa ujemne 

dodatni 

Agar do oceny Agar do oceny Agar do oceny 

ruchu ruchu ruchu 

z anty-H:b z anty-H:1,2 z anty-H:i 

anty-H:d anty-H:a 

ujemny 

H:1,2 ujemny 

Test z anty-H:1,2 Test z anty-H:i Test z anty-H:1,2 

H:1,2 

dodatni anty-H:b 

H:i H:1,2 


H:1,2 

ujemny 

dodatni dodatni dodatni 

ujemny D-winian dodatni 

dodatni 

Salmonella 

species 

Salmonella 

paratyphi B 

Salmonella 

serotyp 

paratyphi B 

Salmonella 

species 

Salmonella 

typhimurium 

Salmonella 

species 

Salmonella 

enteritidis 

Salmonella 

species 

Salmonella 

typhi 

Salmonella 

species 

Salmonella 

paratyphi A 

Salmonella 

species 

WHO 01.51 

*Jeśli reakcja aglutynacji zachodzi jedynie z surowica˛ anty-Vi, należy zagotować zawiesinę bakterii i powtórzyć badanie z surowica˛ O:D. 

Ryc. 8. Identyfikacja serologiczna gatunku Salmonella. 

69

KAŁ 

Procedura identyfikacji antygenu H 

Wstępna identyfikacja antygenu rzęskowego H może być przeprowadzona 

w teście bezpośredniej aglutynacji, jak opisano powyżej dla antygenu somatycznego 

O. Niekiedy konieczne jest zwiększenie ekspresji ruchu badanych szczepów 

przez kilkakrotne kolejne przesiewy na półpłynne podłoża odżywcze (,,swarm 

agar’’, patrz niżej). Surowice odpornościowe do wykonania testu z tymi 

antygenami są dostępne komercyjnie. Mimo to, jeśli identyfikacja obu faz 

rzęskowych jest niezbędna do klasyfikacji, wymagana jest faza zahamowania. 

Często konieczna jest także inwersja faz z użyciem przeznaczonych do tego celu 

surowic 1 . 

1. Przygotować półpłynne podłoża odżywcze zawierające 0,2 – 0,4% agaru. 

Umieścić po 1 ml podłoża w probówkach. 

2. Zastąpić korki probówek korkami z waty. 

3. Upłynnić agar w gotującej się wodzie i umieścić probówki z płynnym agarem 

w łaźni wodnej w temperaturze 45°C na 30 minut. 

4. Opisać każdą probówkę numerem próbki i surowicy anty-H (H:b, H:i i H:1,2). 

Również probówkę kontrolną. 

5. Dodać 10 µl heterogennej surowicy H każdej fazy inwersji do odpowiednich 

agarów, delikatnie wstrząsnąć probówki i pozostawić agar do skrzepnięcia 

w skosie. 

6. Sporządzić gęstą zawiesinę izolowanych kolonii w roztworze fizjologicznym 

soli, posiać ezą, nakłuwając skos, i inkubować przez noc. 

7. Z hodowli uzyskanej na skosie pobrać ezą materiał i rozprowadzić równomiernie 

w kropli roztworu fizjologicznego soli. 

8. Ezą o objętości 10 µl pobrać kroplę jednej z heterogennych surowic 

odpornościowych H i umieścić ją na szkiełku, tuż obok zawiesiny 

bakterii. 

9. Wymieszać surowicę z zawiesiną bakterii, przechylając szkiełko do przodu 

idotyłu przez 1 minutę. Obserwować tworzenie się grudek, oglądając 

szkiełko w dobrym świetle. Pojawienie się w tym czasie wyraźnych grudek 

świadczy o dodatnim wyniku. 

10. Jeśli to konieczne, należy powtórzyć test aglutynacji z innymi heterogennymi 

surowicami i zidentyfikować serotyp, wykorzystując schemat przedstawiony 

na str. 69. 

Salmonella typhi 

Dla potwierdzenia identyfikacji biochemicznej należy przeprowadzić testy 

z surowicami odpornościowymi Vi, O grupy D (O:D) i H:d. Z powodu obecności 

antygenu Vi hodowle aglutynujące w surowicy Vi mogą nie aglutynować 

w surowicy O:D. Należy usunąć antygen Vi, podgrzewając zawiesinę w temperaturze 

100°C przez 20 minut, i powtórnie przeprowadzić test z surowicą O:D. 

Po uzyskaniu aglutynacji w surowicach Vi, O:D i H:d zanotować: ,,Salmonella 

typhi’’. Jeśli wynik jest dodatni jedynie w surowicy O:D, zanotować:,,Salmonella, 

grupa D’’. 

1 

Dostępne w Statens Serum Institut, 5 Artillerivej, 2300 Copenhagen S, Denmark. 

70

CZE˛ŚĆ I 

Salmonella paratyphi A 

Dla potwierdzenia identyfikacji biochemicznej należy przeprowadzić test z surowicą 

odpornościową Salmonella grupy A. Jeśli wynik jest dodatni, przeprowadzić 

test z surowicą H:a i w przypadku uzyskania dodatniego wyniku zanotować: 

,,Salmonella paratyphi A’’. Jeśli wynik z surowicą H:a jest ujemny, zanotować: 

,,Salmonella grupa A’’. Jeśli nie wykazano ruchu, można rozważyć obecność 

S. flexneri typ 6 lub S. boydii typ 13 lub 14 i przeprowadzić test z surowicą 

odpornościową Shigella BiD. 

Inne serotypy Salmonella 

Jeśli wyniki powyżej opisanych testów wskazują na obecność typowych pałeczek 

Salmonella, należy przeprowadzić testy z surowicami odpornościowymi Salmonella 

O grup A, B, C, D i E. 

• Jeśli dodatni wynik wskazuje na grupę B, wykonać test z surowicą H:b, H:i 

i H:1,2. Jeśli uzyskamy wynik dodatni z surowicą H:b, identyfikowanym 

mikroorganizmem może być S. wien lub S. paratyphi B. S. wien można odróżnić 

od S. paratyphii B w odczynie alutynacji z surowicą H:1,w i H:2 (jeśli są 

dostępne). S. wien aglutynuje w surowicy H:1,w, a S. paratyphi w H:2. 

• Jeśli wynik z surowicą H:i lub H:1,2 jest dodatni, wywołać inwersję fazy 

i przeprowadzić test z heterogenną surowicą H. Jeśli wynik jest dodatni, 

zanotować:,,S. typhimurium’’. Jeśli wynik jest ujemny, zanotować:,,Salmonella 

grupa B’’. 

• Jeśli wynik z surowicą C jest dodatni, zanotować: ,,Salmonella grupa C’’. 

• Jeśli wynik z surowicą D jest dodatni, przeprowadzić testy z surowicami Vi, H:d 

i H:m. Jeśli wynik z surowicą Vi lub H:d jest dodatni, zanotować: ,,Salmonella 

typhi’’. Jeśli wynik z surowicą H:m jest dodatni, zanotować: ,,Salmonella 

enteritidis’’. Jeśli testy z surowicami Vi, H:d i H:m są ujemne, zanotować: 

,,Salmonella grupa D’’. 

• Jeśli identyfikacja biochemiczna wskazuje na szczep Salmonella, ale testy ze 

wszystkimi surowicami grup O są ujemne, zanotować: ,,Prawdopodobnie 

gatunek Salmonella’’ i przesłać do Centralnego Laboratorium Referencyjnego. 

Shigella 

Pałeczki Shigella można podzielić na serogrupy i serotypy na podstawie 

szkiełkowych i probówkowych odczynów aglutynacji ze swoistymi surowicami 

odpornościowymi O. Odczyn aglutynacji szkiełkowej zwykle wystarcza, jeśli 

wynik badania jest jednoznaczny. Zawiesina antygenu powinna być przygotowana 

z nieselektywnego podłoża, np. z agaru odżywczego lub KIA, i uważnie 

obserwowana w celu wykluczenia autoaglutynacji przed dodaniem surowicy. 

Testy z surowicami odpornościowymi Shigella 

grupy A, B, C i D 

• Jeśli pojawi się aglutynacja z surowicą grupy A, zanotować: ,,Shigella 

dysenteriae’’. Przeprowadzić test z surowicą S. dysenteriae typ 1. Jeśli jest 

dodatni, zanotować: ,,S. dysenteriae typ 1’’. 

71

KAŁ 

• Jeśli pojawi się aglutynacja z surowicą grupy B, zanotować: ,,Shigella 

flexneri’’. 

• Jeśli pojawi się aglutynacja z surowicą grupy C, zanotować:,,Shigella boydii’’. 

• Jeśli pojawi się aglutynacja z surowicą grupy D, zanotować:,,Shigella sonnei’’. 

Czasami szczepy Shigella z powodu obecności antygenu K mogą nie ulegać 

aglutynacji w homologicznych surowicach. Podgrzanie zawiesiny szczepów 

w roztworze fizjologicznym soli w łaźni wodnej przez 20 minut i ponowne 

przeprowadzenie testu może znieść hamujący wpływ antygenu K. 

Niektóre Gram-ujemne mikroorganizmy mogą mieć antygeny wspólne ze 

szczepami Shigella i dawać fałszywie dodatnie wyniki aglutynacji z surowicami 

do typowania Shigella. Dobrze znanym przykładem bakterii dających krzyżową 

reakcję są szczepy Plesiomonas shigelloides i Shigella sonnei fazy I oraz Hafnia 

i Shigella flexneri serotyp 4a; najważniejsza jest jednak krzyżowa reakcja 

z niektórymi odpowiedzialnymi za biegunkę szczepami E. coli. 


Y. enterocolitica ma kilka antygenów somatycznych O, które zostały wykorzystane 

do podziału gatunku na 17 serogrup. Większość zakażeń u ludzi w Kanadzie, 

Europie i Japonii wywołana jest przez serotyp O3. Infekcje wywołane przez 

serotyp O9 opisywano głównie w Skandynawii, infekcje wywołane przez serotyp 

O8 występują prawie wyłącznie w USA. Istnieje krzyżowa reakcja serologiczna 

między Y. enterocolitica O9 i Brucella spp. 

72

Zakażenia górnych dróg 

oddechowych 

Wprowadzenie 

Górne drogi oddechowe obejmują obszar od krtani do nozdrzy, w skład którego 

wchodzą: jama ustna, gardło i jama nosowo-gardłowa oraz przylegające jamy 

zatok i ucho środkowe. 

Zakażenia występujące w górnych drogach oddechowych, to: 

– zapalenie gardła, niekiedy z zapaleniem migdałków, prowadzące do ,,bolesnego 

gardła’’, 

– zapalenie jamy nosowo-gardłowej, 

– zapalenie ucha środkowego, 

– zapalenie zatok, 

– zapalenie nagłośni. 

Spośród wymienionych infekcji zdecydowanie najczęściej występuje zapalenie 

gardła; nie leczone zakażenia mogą mieć poważne konsekwencje. W niniejszym 

opracowaniu zostanie omówione tylko zapalenie gardła. 

Większość przypadków zapalenia gardła ma etiologię wirusową i samoograniczający 

się przebieg. Jednakże około 20% infekcji wywołanych jest przez bakterie 

i zwykle wymaga leczenia odpowiednimi antybiotykami. Lekarz opierając się 

tylko na badaniu fizykalnym rzadko może rozróżnić zakażenie wirusowe 

i bakteryjne, dlatego najlepiej, jeśli leczenie jest oparte na wyniku badania 

mikrobiologicznego. 

Diagnostyka bakteriologiczna zapalenia gardła jest skomplikowana ze względu na 

obecność licznej, mieszanej flory fizjologicznej złożonej z tlenowych i beztlenowych 

bakterii. Flora naturalna przewyższa zwykle liczebnie patogenną, rola 

mikrobiologa polega więc na rozróżnieniu komensali od patogenów. Jeśli to 

możliwe, w wyniku badania należy uwzględnić tylko bakterie patogenne. 

Flora fizjologiczna gardła 

Wskład naturalnej flory gardła wchodzi tak duża liczba gatunków, że pełna 

identyfikacja i uwzględnienie wszystkich w wyniku nie jest konieczne, zwłaszcza 

gdy w posiewie zaobserwowano: 

• paciorkowce zieleniejące (α-hemolizujące) i pneumokoki, 

• niepatogenne Neisseria spp., 

• Moraxella (wcześniej Branhamella) catarrhalis (może być również patogenem 

układu oddechowego), 

• gronkowce (S. aureus, S. epidermidis), 

• dyfteroidy (z wyjątkiem C. diphtheriae), 

• Haemophilus spp., 

• drożdże (Candida spp.) w ograniczonej liczbie, 

• różne bezwzględnie beztlenowe ziarenkowce Gram-dodatnie, pałeczki Gram- 

-ujemne, krętki i formy nitkowate. 

73

ZAKAŻENIA GÓRNYCH DRÓG ODDECHOWYCH 

U osób starszych, o obniżonej odporności lub niedożywionych, zwłaszcza 

po antybiotykoterapii, gardło może być skolonizowane przez pałeczki Enterobacteriaceae 

(Escherichia coli, Klebsiella spp. i in.) oraz Gram-ujemne 

pałeczki niefermentujące (Acinetobacter spp. i Pseudomonas spp.). Równie 

często u takich pacjentów dochodzi do namnażania się w gardle szczepów S. 

aureus lub Candida spp. i innych gatunków drożdżopodobnych grzybów. 

Wymienione mikroorganizmy mogą wywoływać zapalenie gardła jedynie u pacjentów 

w okresie granulocytopenii, zaleca się jednak uwzględnienie w wyniku 

informacji o izolacji takich szczepów, ponieważ ich obecność może wskazywać 

na infekcję (czy też ryzyko infekcji) dolnych dróg oddechowych (np.: zapalenie 

płuc) lub bakteriemię. Dla kolonizujących gardło mikroorganizmów zwykle nie 

nastawia się antybiogramu. 

Bakteryjne czynniki zapalenia gardła 

Streptococcus pyogenes (grupa A wg Lancefielda) jest z pewnością najczęstszą 

przyczyną bakteryjnego zapalenia gardła i migdałków. Zakażenie występuje 

najczęściej u małych dzieci (5 – 12 lat). Jeśli zapaleniu gardła towarzyszy 

charakterystyczna wysypka, chorobę określa się mianem gorączki płoniczej. 

U dzieci podczas paciorkowcowej infekcji gardła może dojść do zajęcia jamy 

nosowo-gardłowej z towarzyszącą ropną wydzieliną z nosa. 

Nie należące do grupy A β-hemolizujące paciorkowce (np. grupa B, C i G) rzadko 

są przyczyną bakteryjnego zapalenia gardła i ich izolację należy odnotować 

w wyniku. Nieodpowiednio leczone infekcje gardła wywołane przez S. pyogenes 

mogą mieć konsekwencje w postaci gorączki reumatycznej i — rzadziej 

— kłębuszkowego zapalenia nerek. Dokładna identyfikacja i ukierunkowane 

leczenie przeciw S. pyogenes mają na celu zapobieganie pojawieniu się gorączki 

reumatycznej. 

Corynebacterium diphtheriae wywołuje błonicę, chorobę występującą endemicznie 

w wielu krajach. Tam, gdzie przerwano realizację programów 

szczepień, choroba może przyjąć rozmiary epidemii. Typowy dla C. diphtheriae 

przebieg infekcji (z kilkoma wyjątkami) charakteryzuje się obecnością szarawobiałych 

nalotów w miejscu zakażenia (gardło, migdałki, nos lub krtań). Błonica 

jest ciężką chorobą, w której diagnoza stawiana jest na podstawie objawów. 

Lekarz może zlecić dodatkowo wykonanie posiewu w kierunku maczugowców 

błonicy. 

W niektórych krajach coraz częściej rozpoznawane jest gonokokowe zapalenie 

gardła, którego częstość występowania staje się porównywalna do rzeżączkowego 

zapalenia szyjki macicy i cewki moczowej. Posiew wymazów z gardła powinien 

być wykonywany na wyraźne polecenie lekarza z użyciem właściwego podłoża 

selektywnego (zmodyfikowane podłoże Thayer-Martina). 

Martwicze, wrzodziejące zapalenie gardła (angina Vincenta) jest rzadkim stanem, 

charakteryzującym się występowaniem martwiczych owrzodzeń gardła z tworzeniem 

błon rzekomych lub bez błon rzekomych. W miejscu infekcji obecna jest 

liczna, bezwzględnie beztlenowa flora mieszana z przewagą Gram-ujemnych 

bakterii nitkowatych i spiralnych, należących głównie do Fusobacterium spp. 

i Treponema vincenti. Bakterie te należą do fizjologicznej flory jamy ustnej, 

jednak ich duża liczba widoczna w barwionym metodą Grama preparacie 

74

CZE˛ŚĆ I 

z wrzodziejących zmian powinna zostać odnotowana jako ,,kompleks wrzecionowcowo-krętkowy’’. 

Rozpoznanie mikroskopowe nie wymaga potwierdzenia 

w hodowli beztlenowej, która jest trudna i czasochłonna. Obecność kompleksu nie 

wyklucza potrzeby poszukiwania innych patogenów, zwłaszcza S. pyogenes. 

C. albicans i inne gatunki Candida obecne w niewielkiej liczbie uznawane są za 

element flory fizjologicznej jamy ustnej, jednak w pewnych stanach chorobowych, 

np. u niedożywionych wcześniaków, u dorosłych z niedoborami odporności 

(np. pacjenci z HIV/AIDS) lub u pacjentów otrzymujących antybiotykoterapię, 

ich liczba wzrasta, prowadząc do wystąpienia kandydozy jamy ustnej. Zakażone 

powierzchnie — język, migdałki, gardłoibłona śluzowa policzków — mogą być 

intensywnie czerwone, pokryte białymi plamkami lub zlewającą się szarobiałą 

błoną (pleśniawka). Potwierdzeniem kandydozy jest obecność w preparacie 

bezpośrednim barwionym metodą Grama licznych, drożdżopodobnych grzybów, 

tworzących niekiedy długie, przypominające grzybnię nici. 

Posiewy z górnych dróg oddechowych mogą być przesyłane do laboratorium 

nie tylko w celu zdiagnozowania infekcji, ale także w celu wykrycia obecności 

potencjalnie patogennych szczepów u zdrowych ludzi — ,,nosicieli’’. 

Takie badania powinny być wykonywane w ramach dobrze prowadzonego 

nadzoru epidemiologicznego. W górnych drogach oddechowych występuje 

nosicielstwo: 

• Staphylococcus aureus. Badania wymazów z nosa pacjentów i personelu 

szpitalnego w kierunku nosicielstwa jest zalecane podczas ustalania źródła 

zakażenia metycylinoopornym S. aureus (MRSA). 

• Neisseria meningitidis. Nawet poza okresem epidemii nosicielstwo meningokoków 

może być bardzo częste (20% i więcej). Identyfikacja nosicieli rzadko 

jest konieczna i nie ma potrzeby wykonywania badań w tym kierunku przed 

zaleceniem profilaktyki antybiotykowej u rodziny i u osób z bliskiego kontaktu 

pacjenta z zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych. 

• Streptococcus pyogenes. Nosicielstwo niewielkiej liczby tych bakterii może 

być powszechne, zwłaszcza wśród dzieci szkolnych (20 – 30%). 

• Corynebacterium diphtheriae. Wysoki odsetek nosicielstwa występuje w populacjach 

nie szczepionych. W takich społecznościach uzasadnione może być 

wykonywanie identyfikacji i leczenie nosicielstwa u osób z otoczenia pacjenta 

z potwierdzoną błonicą. Nosicielstwo jest rzadkie w krajach, w których 

właściwie realizowany jest program szczepień. 

Pobieranie i przesyłanie próbek 

Najlepiej, jeśli materiał pobierany jest przez lekarza lub przez inną osobę 

wykwalifikowaną. Pacjent powinien siedzieć twarzą do źródła światła. Należy 

przytrzymać język szpatułką i sterylną wymazówką energicznie pobrać wymaz 

z każdego migdałka, z tylnej ściany gardła i z innych zmienionych zapalnie 

miejsc (wymazówkę należy wcześniej zwilżyć jałowym fizjologicznym 

roztworem soli — przyp. tłum.). Należy uważać, aby nie dotknąć 

języka lub błony śluzowej policzków. Najlepiej, jeśli zostaną pobrane po dwa 

wymazy z każdego miejsca. Jeden może być wykorzystany do przygotowania 

preparatu bezpośredniego, a drugi należy umieścić w szklanej lub plastikowej 

probówce i przesłać do laboratorium. Można także obydwa wymazy przesłać do 

laboratorium. Jeśli posiew pobranego materiału nie może być wykonany w ciągu 

4 godzin, wymazówki należy umieścić w podłożu transportowym (np. Amies lub 

Stuart). 

75



Charakterystyczny dla wrzodziejącego zapalenia gardła (angina Vincenta) kompleks 

wrzecionowcowo-krętkowy oraz grzyby Candida są najlepiej widoczne 

w preparacie barwionym metodą Grama, który powinien być wykonany na 

zlecenie lekarza. Barwienie metodą Grama jest nieprzydatne w wykrywaniu 

paciorkowców czy Neisseria spp. Preparat bezpośredni jest także niewystarczająco 

specyficzny i czuły w wykrywaniu maczugowca błonicy, chyba że 

materiał został pobrany bardzo starannie i zbadany przez doświadczonego 

mikrobiologa. Przy braku wskazań klinicznych lub bez zlecenia lekarza nie ma 

potrzeby wykonywania preparatów bezpośrednich z gardła. 

Hodowla i identyfikacja 

Hodowla Streptococcus pyogenes 

Natychmiast po dostarczeniu do laboratorium materiał musi zostać posiany 

wymazówką na jedną czwartą płytki agarowej z krwią i rozsiany ezą na pozostałą 

część płytki. Agar z krwią powinien być przygotowany z podstawowego podłoża 

agarowego bez glukozy (lub z małą zawartością glukozy), np. z agaru tryptozowo- 

-sojowego (TSA). Kwaśny rozkład glukozy przez S. pyogenes hamuje wytwarzanie 

hemolizyn. Do przygotowania podłoży można wykorzystać krew 

każdego gatunku (świeżo pobraną) w stężeniu 5%. Płytki należy wypełnić 

4 – 5 mm warstwą podłoża. Preferowana jest krew wołowa, ponieważ ulega 

hemolizie pod wpływem pewnych komensalnych pałeczek Haemophilus spp. i nie 

daje hemolizy w obecności zymogennego wariantu Enterococcus faecalis. 

Można poprawić rozpoznawanie β-hemolizujących kolonii i przyspieszyć ich 

wstępną identyfikację, umieszczając na płytce w strefie pierwszego posiewu 

krążek z kotrimoksazolem (taki, jakiego używa się podczas określania lekowrażliwości) 

i specjalny krążek o niskiej zawartości bacytracyny. Ponieważ 

S. pyogenes w odróżnieniu od wielu innych bakterii jest oporny na kotrimoksazol, 

krążek ułatwia obserwację β-hemolizy. Inkubacja w eksykatorze pozwala na 

wykrycie większości β-hemolizujących paciorkowców. Prostym sposobem nasilającym 

hemolizę jest głębokie, pionowe nakłucie agaru ezą, które przyspiesza 

wzrost kolonii pod powierzchnią. Po 18 godzinach i ponownie po 48 godzinach 

inkubacji w 35 – 37°C odczytać płytki z krwią, poszukując małych (0,5 – 2 mm) 

kolonii, otoczonych stosunkowo dużą strefą wyraźnej hemolizy. Po wykonaniu 

preparatu barwionego metodą Grama i potwierdzeniu obecności Gram-dodatnich 

ziarenkowców bakterie należy identyfikować w kierunku S. pyogenes. Dla 

potrzeb klinicznych wstępna identyfikacja oparta jest na ocenie wrażliwości na 

niskie stężenie bacytracyny. W tym celu wykorzystuje się specjalnie przygotowane 

krążki różnicujące, zawierające 0,02 – 0,05 IU bacytracyny. Zwykłe krążki 

wykorzystywane do antybiogramów zawierają 10 IU i są nieprzydatne do 

identyfikacji. Obecność β-hemolizujących paciorkowców ze strefą zahamowania 

wzrostu wokół krążka świadczy o izolacji S. pyogenes. Jeśli w pierwszym 

posiewie hemolizujące kolonie są liczne, obecność lub brak strefy zahamowania 

wzrostu są wyraźnie widoczne już na pierwszej posianej płytce zawierającej agar 

z krwią. Jeśli kolonie są mniej liczne, należy z pierwszej płytki pobrać jedną lub 

dwie kolonie, posiać je na 1 / 5 kolejnej płytki w celu uzyskania ciągłego wzrostu 

i na każdym posianym polu umieścić krążek z bacytracyną. Strefy zahamowania 

wzrostu należy odczytać po całonocnej inkubacji. 

76

CZE˛ŚĆ I 

W niektórych laboratoriach wstępna identyfikacja potwierdzana jest serologicznie 

przez wykazanie obecności specyficznych polisacharydów ściany komórkowej. 

Test może być przeprowadzony z użyciem klasycznej metody precypitacji lub 

— szybciej — zużyciem komercyjnych przeciwciał w teście szybkiej koaglutynacji 

szkiełkowej lub w teście aglutynacji lateksowej. Jeśli istnieje taka 

potrzeba, β-hemolizujące paciorkowce oporne na bacytracynę można identyfikować 

wykorzystując do tego celu proste testy (patrz tabela 19). 

Obecność S. pyogenes w posiewie z gardła powinna zostać określona w wyniku 

w sposóbpółilościowy (nieliczne, +, ++ lub +++). Masywny wzrost S. pyogenes 

na całej powierzchni płytki jest charakterystyczny dla materiałów pobranych od 

pacjentów z paciorkowcowym zapaleniem gardła. Hodowle od nosicieli wykazują 

zwykle wzrost mniej niż 20 kolonii na płytce. Obecność nawet nielicznych kolonii 

β-hemolizujących paciorkowców powinna zostać potwierdzona i zanotowana. 

Tabela 19. Różnicowanie β-hemolizuja˛cych paciorkowców 

Gatunki S. pyogenes S. agalactiae 

E. faecalis 

var. zymogenes a 

Inne 

Grupa Lancefield A B D C, G, F 

Hemoliza β β b β β 

Strefa wokółróżnicuja˛cego 

+ 0 c 0 c 0 d 

kra˛żka z bacytracy- 

na˛ 

Agar z żółcia˛ i z eskulina˛ 0 0 + 0 

(wzrost i zaczernienie) 

Odwrotny test CAMP 0 + 0 0 

Wrażliwość na kotrimoksazol 

0 0 0 + 

e 

Test PYR f + 0 + 0 

a 

b 

c 

d 

e 

f 

E. faecalis var. zymogenes wykazuja˛ce β-hemolizę tylko na agarze z krwia˛ końska˛. 

5% niehemolizuja˛cych. 

5% dodatnich. 

10% dodatnich. 

Kra˛żek jak w teście Kirby-Bauera. 

PYR: pirolidonylo-β-naftylamid. 

Hodowla Corynebacterium diphtheriae 

Mimo że maczugowiec błonicy dobrze rośnie na zwykłym agarze z krwią, lepszy 

wzrost uzyskuje się przy posiewie na jedno z dwóch specjalnych podłoży: 

• Skoagulowana surowica Löfflera lub podłoże jajeczne Dorseta. Jakkolwiek 

nieselektywne, obydwa te podłoża umożliwiają obfity wzrost maczugowca 

błonicy po jednodniowej inkubacji. Ponadto morfologia komórek jest bardziej 

,,typowa’’: nieregularnie wybarwione, krótkie lub długie, lekko zakrzywione 

pałeczki wykazujące metachromatyczne ziarnistości i ułożone w kształt V lub 

równoległych palisad. Metachromatyczne ziarnistości są wyraźniej widoczne 

po wybarwieniu błękitem metylenowym lub barwieniu Alberta niż po zabarwieniu 

metodą Grama. 

• Selektywny agar tellurynowy z krwia˛. Podłoże to ułatwia izolację, jeśli 

maczugowce są nieliczne, jak np. w przypadku nosicieli. Na tym podłożu 

kolonie maczugowców błonicy są szarawe lub czarne, a pełny wzrost pojawia 

się po 48 godzinach. Charakterystyczne kolonie, zawierające w preparacie 

barwionym metodą Grama pałeczki o morfologii podobnej do maczugowców, 

należy przesiać na płytkę z agarem z krwią i określić ich czystość oraz 

77


,,typową’’ morfologię. Należy pamiętać, że kolonie C. diphtheriae najczęściej 

występującego biotypu mitis, wytwarzają na agarze z krwią wyraźną strefę 

β-hemolizy. 

Wstępny wynik identyfikacji C. diphtheriae może zostać wydany już na tym 

etapie. Wynik ten powinien zostać potwierdzony lub wykluczony za pomocą 

prostych testów biochemicznych oraz przez wykazanie zdolności szczepu do 

wytwarzania toksyn. Badanie immunogenności jest wykonywane na świnkach 

morskich lub za pomocą testu toksygenności in vitro (próba Eleka) i powinno być 

przeprowadzane w centralnych laboratoriach, w pozostałych identyfikacja jest 

oparta na szybkich testach biochemicznych. C. diphtheriae jest katalazoi 

azotanododatni. Nie hydrolizuje mocznika. Z glukozy i maltozy, ogólnie nie 

z sacharozy, wytwarza kwas bez gazu. Test fermentacji glukozy może być 

przeprowadzony na podłożu Kliglera. Aktywność ureazy można wykryć na 

podłożu MIU, a redukcję azotanu na bulionie azotanowym, w ten sam sposób, jak 

dla Enterobacteriaceae. Do oceny fermentacji maltozy i sacharozy można użyć 

jako bazy wody peptonowej Andrade’a z końcowym 1% stężeniem każdego 

wodorowęglanu. Wyniki zwykle odczytuje się po 24 godzinach, choć konieczna 

może okazać się reinkubacja przez noc. Należy podkreślić, że diagnostyka 

laboratoryjna ma na celu potwierdzenie klinicznie rozpoznanej błonicy. Nie 

należy zwlekać z rozpoczęciem terapii do czasu otrzymania wyników z laboratorium. 

Więcej informacji na temat izolacji i identyfikacji C. diphtheriae znaleźć 

można w podręczniku Guidelines for laboratory diagnosis of diphtheria 1 . 

Badanie lekowrażliwości 

Rutynowe badanie lekowrażliwości szczepów izolowanych z gardła zazwyczaj 

nie jest wymagane, a nawet może okazać się mylące. W większości bakteryjnych 

zakażeń gardła czynnikami etiologicznymi są S. pyogenes i C. diphtheriae, 

a lekiem z wyboru w antybiotykoterapii są benzylopenicylina i erytromycyna. 

W przypadku błonicy wskazane jest również leczenie antytoksyną. 

1 

Begg N.: Manual for the menagement and control of diphtheria in the European region. 

Copenhagen, WHO Regional Office for Europe, 1994. 

78

Zakażenia dolnych dróg 

oddechowych 

Wprowadzenie 

Zakażenia dolnych dróg oddechowych występują poniżej poziomu krtani, np. 

w tchawicy, oskrzelach lub tkance płucnej (zapalenie tchawicy, zapalenie 

oskrzeli, ropień płuca, zapalenie płuc). Czasami w zapaleniu płuc zakażeniem 

objęta jest przyległa błona pokrywająca płuca, w konsekwencji pojawia się 

zgrubienie opłucnej (zapalenie opłucnej) i płyn w jamie opłucnej (wysięk 

opłucnej). 

Specyficzną formą zakażenia dolnych dróg oddechowych jest gruźlica płucna, 

która występuje powszechnie w wielu krajach. Pacjent kaszląc może uwalniać 

aerozol zawierający prątki gruźlicy (Mycobacterium tuberculosis), które mogą 

zostać zainhalowane przez innych ludzi. Taka forma choroby (,,czynna’’ gruźlica) 

szybko szerzy się z osoby na osobę i dlatego zaliczana jest do niebezpiecznych 

chorób zakaźnych. 

Wielu pacjentów z zakażeniem dolnych dróg oddechowych odkrztusza ropną 

(zawierającą ropę) wydzielinę, która zwykle ma zielony lub żółtawy kolor; taka 

plwocina może być posiewana, badana makroskopowo i mikroskopowo. 

W niektórych zakażeniach plwociny jest bardzo niewiele lub nie obserwuje się jej 

wcale: choroba legionistów (wywołana przez Legionella pneumophila), zapalenie 

płuc wywołane przez Mycoplasma pneumoniae (,,pierwotne atypowe zapalenie 

płuc’’) i zapalenie płuc wywołane przez chlamydie. Choroby te wymagają 

specjalnych metod diagnostycznych (serologia, izolacja na specjalnych podłożach) 

i nie będą omawiane w niniejszym opracowaniu. Poza gruźlicą płuc (patrz 

poniżej) większość badań mikrobiologicznych plwociny dotyczy pacjentów 

z infekcjami dróg oddechowych, u których występuje ropna plwocina. 

Najczęstsze postacie kliniczne zakażeń 

Ostre i przewlekłe zapalenie oskrzeli 

U pacjentów z ostrym zapaleniem oskrzeli (rozwijającym się najczęściej po ostrej 

infekcji wirusowej, takiej jak typowe przeziębienie czy grypa) zwykle nie 

wykonuje się posiewu plwociny, chyba że stan kliniczny pacjenta się nie 

poprawia. 

Przewlekłe zapalenie oskrzeli jest długotrwającą chorobą upośledzającą funkcję 

układu oddechowego, która przebiega z okresowymi zaostrzeniami. Większość 

pacjentów codziennie wykrztusza szarą, śluzową plwocinę; w trakcie choroby 

występują epizody pogorszenia stanu pacjenta i wykrztuszania wyraźnie ropnej 

plwociny. Jest to tak zwane zaostrzenie przewlekłego zapalenia oskrzeli. 

W próbkach plwociny często obecne są typowe patogeny układu oddechowego 

(Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae lub — rzadziej — Moraxella 

(Branhamella) catarrhalis). 

79

ZAKAŻENIA DOLNYCH DRÓG ODDECHOWYCH 

Ropień płuca 

Ropień płuca może uformować się w następstwie aspiracji ciała obcego, 

zawartości żołądka lub wydzieliny górnych dróg oddechowych (jama ustna lub 

gardło). Ten stan niekiedy jest określany terminem ,,aspiracyjnego zapalenia 

płuc’’. Można podjąć próbę hodowli z odkrztuszonej plwociny (która zwykle ma 

wyjątkowo brzydki zapach), lecz — jeśli obecny jest ropień (uwidoczniony 

w badaniu radiologicznym) — materiałem do badań powinna być zawarta w nim 

ropa, którą należy wykorzystać do badania mikroskopowego i posiewu. Niestety 

brak jest wytycznych dotyczących sposobu jej uzyskania, choć jedną z możliwości 

jest bezpośrednia biopsja i usunięcie ropy. Częstym i ważnym czynnikiem 

etiologicznym są bakterie beztlenowe, takie jak Prevotella melaninogenica 

(wcześniej Bacteroides melaninogenicus) iPeptostreptococcus spp., pochodzące 

z flory jamy ustnej i gardła. Należy pobrać ropę, dostarczyć do laboratorium 

i opracować zgodnie ze standardowymi metodami hodowli bakterii beztlenowych 

z ropy (patrz str. 104 i str. 117). 

Zapalenie płuc oraz zapalenie oskrzeli i płuc 

Ostre płatowe zapalenie płuc zwykle dotyczy pojedynczego płata płuca. Prawie 

zawsze wywoływane jest przez S. pneumoniae. Ta postać zapalenia pojawia się 

epidemicznie. Przyczyną rzadziej występującej podobnej formy zapalenia płuc 

jest Klebsiella pneumoniae. 

Klasyczna postać zapalenia płuc rozwija się u niewielu pacjentów zakażonych 

S. pneumoniae lub K. pneumoniae, częstszą formą choroby jest zapalenie oskrzeli 

ipłuc z plamkami naciekowymi i zapalnymi (określanymi jako ,,konsolidacja’’), 

rozproszonymi w jednym lub częściej w obu płucach. 

Z zapaleniem oskrzeli i płuc związanych jest wiele różnych czynników wirusowych 

i bakteryjnych. Poza S. pneumoniae i niekiedy H. influenzae, przyczyną 

zapalenia oskrzeli i płuc, zwłaszcza podczas epidemii grypy lub odry, jest 

Staphylococcus aureus. Często także stwierdza się obecność Gram-ujemnych 

pałeczek (szczególnie E. coli i K. pneumoniae) oraz Pseudomonas aeruginosa. 

Zakażenia te występują powszechnie na oddziałach intensywnej terapii, zwłaszcza 

w trakcie stosowania antybiotyków o szerokim spektrum działania lub przy 

prowadzeniu wentylacji mechanicznej i są efektem nadmiernego zużycia antybiotyków 

oraz niewłaściwego monitorowania wczesnych objawów infekcji 

u pacjentów. 

W przypadku wystąpienia wysięku w jamie opłucnej płyn należy zbadać 

mikroskopowo i wykonać posiew zgodnie z procedurą opisaną dla ropy 

i wysięków. 

Gruźlica płuc 

Plwocina pacjentów z gruźlicą płuc zwykle nie jest wyraźnie ropna, niemniej 

ropny charakter nie jest przeciwwskazaniem do jej wykorzystania w diagnostyce 

gruźlicy. Wybarwione preparaty (metodą Ziehl-Neelsena) należy obejrzeć w mikroskopie 

w celu szybkiej identyfikacji pacjentów z obecnością kwasoopornych 

80

CZE˛ŚĆ I 

bakterii w plwocinie 1 . Po wykonaniu preparatu plwocina powinna zostać poddana 

procedurze dekontaminacji (patrz str. 85) w celu zniszczenia możliwie największej 

liczby nieprątkowych drobnoustrojów i zachowania żywych prątków gruźlicy 

do posiewu na podłoże Löwensteina-Jensena. 

Ponieważ procedury bakteriologicznej diagnostyki ropnych infekcji dróg oddechowych, 

takich jak zapalenie oskrzeli i zapalenia płuc, zasadniczo różnią się 

od procedur stosowanych w gruźlicy, zostaną one omówione oddzielnie. Lekarz 

w skierowaniu do laboratorium musi jasno określić kierunek badań: 

• bakterie ropotwórcze (H. influenzae, S. pneumoniae i in.), 

• prątki gruźlicy (M. tuberculosis), 

• obydwa typy bakterii. 

Pobieranie próbek plwociny 

Pobieranie odpowiednich próbek plwociny jest sztuką samą w sobie i zostało 

opisane w innych opracowaniach 2 . Badanie źle pobranej próbki plwociny może 

dać fałszywe wyniki z powodu zanieczyszczenia próbki bakteriami wchodzącymi 

wskład naturalnej flory jamy ustnej i gardła; ,,plwocina’’ zawierająca ślinę 

i cząstki pożywienia nie powinna być badana. 

Próbkę plwociny należy pobrać do sterylnego pojemnika z szerokim wlotem oraz 

z bezpiecznym, szczelnym zamknięciem i niezwłocznie przesłać do laboratorium. 

Opóźnione przesłanie plwociny po pobraniu może spowodować przerost próbki 

zanieczyszczającymi ją bakteriami i prowadzi do otrzymania mylących wyników 

barwienia i hodowli. Z tego powodu nie zaleca się przesyłania próbek do 

laboratorium pocztą. Wyjątek stanowią próbki pobrane do badań w kierunku 

gruźlicy, które mogą być przesyłane do lokalnych lub regionalnych laboratoriów. 

Należy ściśle przestrzegać lokalnych i państwowych przepisów, dotyczących 

przesyłania zakaźnego (patogennego) materiału. 

Opracowanie plwociny w laboratorium 

(w zakażeniach niegruźliczych) 

Po pobraniu plwocina musi zostać natychmiast opracowana lub umieszczona 

wchłodziarce. 


Należy odnotować ocenę makroskopową plwociny. Możliwe opisy obejmują: 

ropna, zielona 

ropna, żółta 

śluzowo-ropna (tj. częściowo śluzowa i częściowo ropna) 

1 

Patrz Manual of basic techniques for a health laboratory, 2nd ed. Geneva, World Health 

Organization, 2003. 

2 

Specimen collection and transport for microbiological investigation. Alexandria, WHO Regional 

Office for the Eastern Mediterranean, 1995 (WHO Regional Publicatinos, Eastern Mediterranean 

Series 8). 

Manual of basic techniques for a health laboratory, 2nd ed. Geneva World Health Organization, 2003. 

Technical guide for sputum examination for tuberculosis by direct microscopy. Bulletin of the 

International Union Against Tuberculosis and Lung Disease, 4th ed. 1996. 

81


podbarwiona krwią 

podbarwiona krwią, z zielonymi kłaczkami 

*szara, śluzowa 

*szara, spieniona 

*biała, śluzowa 

*biała, spieniona 

*biała, śluzowa z cząstkami pożywienia 

*wodnista (tj. obecna tylko ślina) 

*wodnista z cząstkami pożywienia 

Próbki oznaczone gwiazdkami nie powinny być badane w kierunku zakażeń 

niegruźliczych. 


Preparat barwiony metodą Grama należy przygotować z próbki ropnej lub 

śluzowo-ropnej plwociny. 

Jeśli nie obserwuje się śladów ropy (np. w próbce szarej, śluzowej plwociny), 

barwienie metodą Grama może wykazać jedynie obecność dużych komórek 

nabłonka płaskiego, często pokrytych masą przylegających bakterii. Jest to 

wskazówka, że próbka zawiera głównie wydzielinę jamy ustnej lub gardła i nie 

powinno się prowadzić hodowli, której wyniki będą niewiarygodne czy też bardzo 

mylące. Zaleca się rezygnację z hodowli w przypadku, gdy próbka zawiera mniej 

niż 10 neutrofilów wielojądrzastych na 1 komórkę nabłonka 1 . 

U wielu pacjentów z ostrą infekcją oddechową (np. zapalenie płuc) i ropną 

plwociną natychmiastowe wykonanie preparatu barwionego metodą Grama może 

pomóc klinicyście w wyborze antybiotykoterapii. Możliwe wyniki to: 

• Gram-dodatnie dwoinki otoczone pustą przestrzenią z powodu niezabarwionych 

otoczek (podejrzenie S. pneumoniae); 

• małe Gram-ujemne krótkie pałeczki (prawdopodobnie H. influenzae); 

• Gram-ujemne dwoinki, widoczne wewnątrz- i zewnątrzkomórkowo (podejrzenie 

Moraxella catarrhalis); 

• Gram-dodatnie ziarenkowce w skupiskach, przypominających grona (podejrzenie 

S. aureus); 

• Gram-ujemne pałeczki (podejrzenie obecności Enterobacteriaceae lub Pseudomonas 

spp.); 

• duże Gram-dodatnie drożdżopodobne komórki często z grzybnią (wskazują na 

obecność Candida spp.). 

Procedury hodowli i interpretacja 

Jeśli mikroskopowo próbka przedstawia akceptowalną jakość plwociny, wybrać 

fragment ropnego materiału (lub najbardziej przypominającego ropny) używając 

sterylnej wymazówki lub ezy i posiać na różne podłoża hodowlane. 

1 

Heinemann H.S., Radano R.R.: Acceptability and cost savings of selective sputum microbiology in 

a community teaching hospital. Journal of Clinical Microbiology, 1979, 10: 567 – 573. 

82

CZE˛ŚĆ I 

Sugerowany zestaw podłoży obejmuje: 

• agar z krwią z rozmazem S. aureus, ułatwiającym satelitarny wzrost H. influenzae 

i z krążkiem zawierającym optochinę, umieszczonym w centrum 

rozsiewu, 

• agar czekoladowy, 

• agar MacConkeya. 

Płytki z agarem z krwią i z agarem czekoladowym należy inkubować w35– 36°C 

w atmosferze wzbogaconej dwutlenkiem węgla (np. eksykator), a płytkę 

MacConkeya w powietrzu atmosferycznym. 

Jeśli w barwionym preparacie obecne są skupiska Gram-dodatnich ziarenkowców, 

przypominające kształtem winogrona, zaleca się wykorzystanie dodatkowo 

płytki agarowej z mannitolem (MSA). Obecność Gram-dodatnich drożdżopodobnych 

struktur może być wskazaniem do posiewu na podłoże Sabouraud (dla 

którego konieczna jest inkubacja przez co najmniej 3 dni w 35 – 37°C). Posiew na 

podłoża MSA i Sabouraud nie musi być wykonywany rutynowo dla wszystkich 

próbek plwociny. 

Posiewy powinny być odczytywane po całonocnej inkubacji (18 godzin), 

a reinkubacja przez dodatkowe 24 godziny jest wskazana, jeśli wzrost jest słabszy 

niż oczekiwany na podstawie obserwacji mikroskopowych lub gdy obecne są 

bardzo drobne kolonie. 

Typowe wyniki obserwacji przedstawiono poniżej: 

• Płaskie, jasne kolonie z wgłębionymi środkami i strefą zielonej (α-) hemolizy 

oraz strefą zahamowania wzrostu wokół krążka z optochiną mogą wskazywać 

na S. pneumoniae. Jeśli odczyt testu z krążkiem z optochiną w pierwszym 

posiewie nie jest rozstrzygający, należy powtórzyć test na przesiewie. Nie 

można zapominać, że w fizjologicznej florze jamy ustnej i gardła występują 

inne α-hemolizujące szczepy (wspólnie nazywane paciorkowcami zieleniejącymi). 

• Drobne, kropelkowe kolonie rosnące na płytce agarowej z krwią w postaci 

niehemolizujących kolonii satelitarnych i znacznie większe kolonie na płytce 

agaru czekoladowego lub agaru z krwią sugerują obecność H. influenzae. 

Kolonie te najczęściej są liczne, zwykle ponad 20 na płytce. Niektóre 

laboratoria dla potwierdzenia identyfikacji wykonują testy z czynnikami 

wzrostu X i V, które jednak wymagają uważnej kontroli. Serologiczne 

typowanie szczepów izolowanych z układu oddechowego najczęściej nie jest 

przydatne, ponieważ większość z nich jest ,,szorstka’’ i nie podlega typowaniu. 

• Kruche, suche, szarobiałe kolonie na płytkach agaru z krwią lub agaru 

czekoladowego, które można przesuwać wcałości za pomocą ezy, mogą 

wskazywać na M. catarrhalis. Jeśli istnieje potrzeba, można przeprowadzić 

testy rozkładu cukrów (wszystkie wyniki testów ujemne), ale większość 

laboratoriów ich nie wykonuje. Drobnoustroje Moraxella są silnie oksydazododatnie, 

a wygląd ich kolonii i obraz mikroskopowy są bardzo charakterystyczne. 

Jakkolwiek morfologicznie Moraxella przypomina Neisseria spp., do różnicowania 

można użyć testu z trójmaślanem glicerolu, który jest hydrolizowany 

przez Moraxella. 

• Średniej wielkości, złotoszare kolonie tworzone są przez S. aureus. Testy 

koagulazowy i test fermentacji mannitolu są dodatnie, choć szkiełkowy odczyn 

koagulacji (odczyn ,,związanej’’ koagulazy) jest czasami ujemny. Jeśli istnieje 

sprzeczność między wyglądem kolonii i testem szkiełkowym, należy przeprowadzić 

probówkowy test koagulazy (,,wolna’’ koagulaza). 

83


• Kolonie na agarze MacConkeya sugerują obecność Enterobacteriaceae lub 

Pseudomonas spp. lub Acinetobacter spp. 

• Białawe, okrągłe, matowe kolonie na agarze z krwią i agarze czekoladowym 

mogą wskazywać na Candida albicans, który będzie również rosnąć po 3 – 4 

dniach na podłożu Sabouraud. 

Warto podkreślić, że pojedyncze kolonie każdego z powyższych organizmów 

pochodzą z flory naturalnej układu oddechowego lub są wynikiem kolonizacji (np. 

bakterie jelitowe, grzyby). Ponieważ nie mają wpływu na postępowanie z pacjentem, 

nie należy uwzględniać ich w wyniku lub, jeżeli zostaną uwzględnione, 

zaznaczyć, że jest to flora kolonizująca. 


Badanie lekowrażliwości należy wykonywać tylko dla drobnoustrojów dominujących 

w hodowli, natomiast nie ma takiej potrzeby w przypadku szczepów 

obecnych w posiewie jedynie w niewielkiej liczbie. 

Interpretację niektórych uzyskiwanych wyników przedstawiono w tabeli 20. 

Tabela 20. Interpretacja wyników testów wrażliwości dla bakterii o wyższych wymaganiach 

odżywczych a 

Średnica strefy (mm) 

Oporny Średnio wrażliwy Wrażliwy 

S. pneumoniae (podłoże Mueller-Hintona 

z 5% krwi baraniej, inkubacja 

w5%CO 2 ) 

Oksacylina (1 µg) (dla benzylopenicyliny) 

2 19 b — 1 20 

Tetracyklina (30 µg) 2 18 19 –22 1 22 

Erytromycyna (15 µg) 2 15 16 –20 1 21 

Chloramfenikol (30 µg) 2 20 — 1 21 

Kotrimoksazol (25 µg) 2 15 16 –18 1 19 

M. catarrhalis (podłoże Mueller-Hintona) 

Tetracyklina (30 µg) 2 14 15 –18 1 19 

Erytromycyna (15 µg) 2 13 14 –22 1 23 

Kotrimoksazol (25 µg) 2 10 11 –15 1 16 

a 

b 

National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Performance standards for 

antimicrobial susceptibility testing. M100-S8. Vol 18, 1998. 

Oporny lub średnio wrażliwy. 

W badaniu lekowrażliwości pałeczek Enterobacteriaceae i gronkowców należy 

wykorzystać standaryzowaną metodę dyfuzyjno-krążkową (Kirby-Bauera). Wrażliwość 

szczepów S. pneumoniae na tetracyklinę, chloramfenikol, erytromycynę 

i benzylopenicylinę powinna być oceniana na agarze Mueller-Hintona, wzbogaconym 

5% krwią bydlęcą. Można również użyć zwykłego agaru z krwią. 

Wrażliwość na benzylopenicylinę lepiej oznaczyć używając krążka zawierającego 

1 µg oksacyliny, który wykazuje większą zgodność z wartościami MIC dla 

benzylopenicylin; jest również bardziej stabilny. Krążki zawierające benzylopenicylinę 

mogą szybko ulegać dezaktywacji w wyższych temperaturach, co powoduje 

uzyskanie niewiarygodnych wyników. 

84

CZE˛ŚĆ I 

Dla szczepów H. influenzae należy określić zdolność wytwarzania β-laktamaz, 

np. za pomocą testu z nitrocefiną. Nie wytwarzające β-laktamaz H. influenzae 

rzadko wykazują oporność na ampicylinę. W związku z powyższym nie zaleca się 

oznaczania wrażliwości metodą dyfuzyjno-krążkową. 

Izolaty M. catarrhalis powinny być badane w kierunku wytwarzania β-laktamaz. 

Dodatkowo można oznaczyć wrażliwość na tetracyklinę i erytromycynę. 

Dla Candida albicans należy ocenić wrażliwość na wszystkie leki przeciwgrzybicze. 

Większość laboratoriów przedstawia półilościowe wyniki hodowli bakteryjnych 

na podłożach stałych, które można określić jako: 

(+) = kilka kolonii 

+ = słaby wzrost 

++ = średnio intensywny wzrost 

+++ = intensywny wzrost. 

Hodowla Mycobacterium tuberculosis 

Poza przygotowaniem preparatu bezpośredniego barwionego metodą dla bakterii 

kwasoopornych, zawsze gdy istnieje kliniczne podejrzenie choroby, materiał 

(zwykle, choć nie zawsze, plwocina) należy posiać w kierunku M. tuberculosis. 

Niektórzy pacjenci z podejrzeniem gruźlicy płuc mogą nie odkrztuszać plwociny. 

Wytwarzana przez nich niewielka ilość plwociny jest natychmiast połykana. 

W takiej sytuacji lekarz powinien pobrać próbkę soku żołądkowego na czczo 

(zwykle wcześnie rano) i zneutralizowaną wodorowęglanem sodu (100 mg) 

przesłać do laboratorium. Sok żołądkowy należy traktować w ten sam sposób jak 

plwocinę. Wykonywanie posiewów w kierunku prątków gruźlicy wszystkich 

pobranych próbek plwociny jest drogie i (chociaż pozwala zdiagnozować 

pacjentów bez podejrzenia gruźlicy) nie zalecane rutynowo. 

Procedura przygotowania próbki do badania 

Plwocina pochodząca od pacjentów z infekcją gruźliczą często zawiera fragmenty 

tkanki płucnej, które, jeśli są obecne, należy pobrać na posiew. Plwocina gruźlicza 

wykrztuszana jest przez jamę ustną i gardło, dlatego zanieczyszczenie próbki florą 

fizjologiczną gardła jest nieuniknione. Bakterie zanieczyszczające próbkę muszą 

zostać zniszczone, aby nie doszło do przerostu podłoża Löwensteina-Jensena. 

Procedura przygotowania próbki (zagęszczenie–trawienie–dekontaminacja) obowiązuje 

w przypadku każdej próbki pobranej z miejsca występowania flory 

fizjologicznej. Szeroko stosowane są trzy procedury z użyciem: 

– wodorotlenku sodu (NaOH) (Petroff); 

– wodorotlenku sodu N-acetyl-L-cysteiny (NALC-NaOH); 

– Zephiranu i fosforanu trójsodowego. 

Procedura z użyciem wodorotlenku sodu (Petroff) 

Procedura ta pozwala na eliminację zanieczyszczających mikroorganizmów, 

a ponadto umożliwia upłynnienie niekiedy śluzowej plwociny. Wodorotlenek 

85


sodu jest toksyczny również dla prątków, dlatego w trakcie wykonywania metody 

należy upewnić się, że: 

– końcowe stężenie NaOH nie przekracza 2%; 

– prątki gruźlicze nie są eksponowane na wodorotlenek sodu dłużej niż przez 

30 minut, wliczając czas wirowania. 

1. Wymieszać równe objętości plwociny i 4% wodorotlenku sodu 40 g/l 

(uprzednio poddanego sterylizacji w autoklawie) w sterylnej, szczelnej, 

50-mililitrowej szklanej butelce lub plastikowej stożkowatej probówce wirówkowej. 

2. Inkubować w temperaturze pokojowej (25 – 30°C) przez 15 minut, delikatnie 

wstrząsać mieszaninę w mechanicznym mieszadle przez 5 minut. W gorącym 

klimacie potrzebne może być schłodzenie lub skrócenie czasu reakcji do 

10 – 15 minut. 

3. Odwirować lub uzupełnić mieszaninę do 50 ml destylowaną wodą lub buforem 

fosforanowym (pH 6,8), hamując działanie NaOH. 

4. Po 15 minutach odwirować w 3000 g przez 15 minut. Ostrożnie zlać 

supernatant do pojemnika wypełnionego odpowiednim środkiem dezynfekującym 

(na bazie fenolu lub aldehydu glutarowego). Zneutralizować osad 

wkraplając 2 mol/l roztworu HCl zawierającego 2% czerwień fenolową, 

połączyć, wstrząsając do chwili, gdy kolor zmieni się trwale z czerwonego na 

żółty. Alternatywnie: dodać kroplę roztworu wskaźnikowego, a następnie 

dodawać po kropli HCl ciągle mieszając. 

5. Jeśli posiew na podłoże będzie wykonywany natychmiast, zawiesić zneutralizowany 

osad w 1 – 2 ml sterylnego 0,85% NaCl lub sterylnej wody 

destylowanej. W innym przypadku zawiesić osad w 1 – 2 ml sterylnej frakcji 

V albumin bydlęcych. 

Procedura z użyciem wodorotlenku sodu 

N-acetyl-L-cysteiny 

Niższe stężenie NaOH w obecności czynników mukolitycznych, takich jak 

N-acetyl-L-cysteina (NALC), jest mniej agresywne wobec prątków gruźlicy. 

Zarówno czas inkubacji, jak i temperatura nie mają tak kluczowego znaczenia, jak 

w przypadku procedury z NaOH. Krótki, nie przekraczający 24 godzin, czas 

przechowywania aktywnego roztworu NALC-NaOH wymaga przeprowadzenia 

procedury w ciągu jednego dnia. 

1. Połączyć równe objętości roztworu cytrynianu sodu (29 g dwuwodzianu 

cytrynianu sodu na litr wody destylowanej) oraz 4% wodorotlenku sodu 

(40 g/l) i autoklawować mieszaninę. Roztwór może być przechowywany 

w temperaturze pokojowej. 

2. Tuż przed użyciem dodać 0,5 g NALC do 100 ml roztworu zawierającego 

NaOH i cytrynian sodu. 

3. W zależności od liczby próbek przeznaczonych do dekontaminacji przygotować 

2,5 g NALC w 500 ml roztworu NaOH i cytrynianu sodu lub 5 g NALC 

w 1000 ml roztworu NaOH i cytrynianu sodu. Odczynniki są przydatne do 

badania przez 24 godziny. 

4. Do próbki umieszczonej w sterylnej, szczelnej, 50-mililitrowej szklanej 

butelce lub plastikowej stożkowej probówce wirówkowej dodać 

równą objętość aktywnego roztworu NALC-NaOH. Ostrożnie dokręcić 

86

CZE˛ŚĆ I 

zakrętkę, odwrócić probówkę i wstrząsać delikatnie, nie dłużej niż 30 

sekund. 

5. Pozostawić na 15 minut w temperaturze pokojowej (20 – 25°C). 

6. Uzupełnić mieszaninę do 50 ml wodą destylowaną lub 67 mmol/l buforem 

fosforanowym (pH 6,8) w celu zahamowania działania NaOH. Ostrożnie zlać 

supernatant do pojemnika wypełnionego odpowiednim środkiem dezynfekującym 

(na bazie fenolu lub aldehydu glutarowego). 

7. Jeśli posiew na podłoże będzie wykonywany natychmiast, zawiesić osad 

w1– 2 ml sterylnego 0,85% NaCl lub sterylnej wody destylowanej. W innym 

przypadku zawiesić osad w 1 – 2 ml sterylnej frakcji V albumin bydlęcych. 

Procedura z użyciem fosforanu trójsodowego 

Prątki mogą przeżyć mimo przedłużonego poddawania ich tej łagodnej procedurze. 

Dlatego czas inkubacji i temperatura nie są restrykcyjne. 

1. Przygotować roztwór 1 kg trójfosforanu sodu (Na 3 PO 4·12H 2 O) w 4 litrach 

gorącej wody destylowanej, dodać 7,5 ml 17% chlorku benzylidenu (Zephiran), 

dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze pokojowej. 

2. Wymieszać równe objętości plwociny (do 10 ml) z roztworem Zephiranu 

i fosforanu trójsodowego w 50-mililitrowej, sterylnej, szczelnej, szklanej 

probówce wirówkowej. Dokręcić zakrętkę i wytrząsać energicznie przez 

30 minut. 

3. Odstawić mieszaninę na dodatkowe 30 minut. 

4. Odwirować w 3000 g przez 15 minut. Ostrożnie zlać supernatant do pojemnika 

wypełnionego odpowiednim środkiem dezynfekującym (na bazie fenolu lub 

aldehydu glutarowego) i ponownie zawiesić osad w 20 ml neutralizującego 

buforu fosforanowego, pH 6,6 1 . 

5. Odwirować ponownie w 3000 g przez 15 minut. Zlać supernatant, a osad posiać 

na podłoże. 

Hodowla 

1. Posiać 3 krople (około 0,1 ml) osadu na co najmniej trzy probówki z podłożem 

Löwensteina-Jensena lub inne. 

2. Sprawdzać regularnie wskaźnik zanieczyszczenia inkubowanych podłoży 

i notować liczbę zanieczyszczonych płytek. 

Wskaźnik zanieczyszczenia powinien wynosić 3 – 5%. Wyższy wskaźnik (ponad 

5%) zanieczyszczonych hodowli na podłożu Löwensteina-Jensena zwykle wskazuje 

na niewystarczającą skuteczność procedury dekontaminacji. Wskaźnik 

zanieczyszczenia < 3% sugeruje, że procedura dekontaminacji została przeprowadzona 

zbyt intensywnie i obecne w próbce prątki mogą nie wyrosnąć. 

1 

Przygotowanie neutralizującego buforu fosforanowego 67 mmol/l. 

Roztwór podstawowy: 

A. Rozpuścić 9,47 g nieuwodnionego fosforanu sodu w 1 litrze wody destylowanej. 

B. Rozpuścić 9,07 g nieuwodnionego fosforanu potasu w 1 litrze wody destylowanej. 

Dla buforu o pH 6,8: zmieszać 50 ml roztworu podstawowego A z 50 ml roztworu podstawowego 

B. 

Dla buforu o pH 6,6: zmieszać 37,5 ml roztworu podstawowego A z 62,5 ml roztworu 

podstawowego B. 

Sprawdzić pH. Jeśli potrzeba, dodać roztworu A, aby podnieść pH, lub roztworu B, aby 

obniżyć pH. 

87


Interpretacja hodowli M. tuberculosis 

Probówki z podłożem Löwensteina-Jensena powinny być inkubowane przez 

2 – 3 dni w 35 – 37°C w pozycji poziomej, z odkręconą opół obrotu nakrętką. 

Następnie hodowle należy inkubować w temperaturze 37°C przez 6 tygodni 

i obserwować wzrost w cotygodniowych odstępach czasu. Podczas tej kilkutygodniowej 

obserwacji każdy pojawiający się wzrost bakterii powinien zostać 

odnotowany. Przygotować preparat barwiony metodą Ziehl-Neelsena. Jeśli 

mikroorganizmy nie są kwasoopornymi bakteriami, hodowlę można uznać za 

zanieczyszczoną. 

Typowe ludzkie szczepy Mycobacterium tuberculosis mają ,,szorstkie, twarde 

ipłowożółte’’ kolonie, czasem widoczne już po 2 – 3 tygodniach inkubacji (rzadko 

wcześniej). Kolonie szczepów bydlęcych (M. bovis) są zwykle gładkie 

i białawokremowe. Inne, zwykle niepatogenne gatunki mykobakterii mogą rosnąć 

szybciej (niekiedy już po kilku dniach), wytwarzając — lub nie — pigmenty 

(czerwony, żółty lub pomarańczowy). Jeśli szczep tworzy kolonie o typowym 

wyglądzie i barwienie Ziehl-Neelsena preparatu z hodowli potwierdza obecność 

kwasoopornych prątków, w wyniku należy podać: ,,Mycobacterium spp., prawdopodobnie 

M. tuberculosis’’; izolaty należy przesłać do referencyjnego laboratorium 

krajowego lub lokalnego w celu potwierdzenia identyfikacji i oznaczenia 

lekowrażliwości izolowanych szczepów. 

Podstawowe zasady bezpieczeństwa 

Z plwociną należy zawsze postępować bardzo uważnie i używać szczelnych 

pojemników na próbki. Jest to bardzo ważne, zwłaszcza gdy konieczne jest 

przesłanie próbek pocztą. Zaleca się, aby wszystkie procedury postępowania 

z plwociną (nawet jeśli na skierowaniu nie ma informacji o gruźlicy) były 

przeprowadzane w bakteriologicznie bezpiecznych warunkach. Zaleca się, aby 

laboratorium przeprowadzające badania próbek prawdopodobnie zawierających 

prątki gruźlicy spełniało wymagania bezpieczeństwa biologicznego przynajmniej 

na poziomie 2 1 . 

Szczególną uwagę należy zachować podczas otwierania, zamykania i wstrząsania 

butelek oraz podczas wirowania materiału. Tworzenie skażonego aerozolu może 

być niebezpieczne dla personelu, dlatego należy przestrzegać właściwych 

procedur medycyny pracy 2 . 

Pocztowy transport hodowli M. tuberculosis do referencyjnego laboratorium 

krajowego wymaga szczególnej ostrożności z powodu ryzyka ewentualnego 

wypadku lub uszkodzenia pojemnika. Należy używać jedynie pojemników 

i materiałów wysyłkowych uznanych za bezpieczne i dostosowanych do wymagań 

poczty. 

1 

Manual of basic techniques for a health laboratory, 2nd ed. Geneva, World Health Organization, 

2003. 

2 

Laboratory services in tuberculosis control Part I: Organization and management. Geneva, World 

Health Organization, 1998 (niepublikowane dokumenty WHO/TB/98.258). 

88

CHOROBY PRZENOSZONE DROGA˛ KONTAKTÓW SEKSUALNYCH 

Choroby przenoszone droga˛ 

kontaktów seksualnych 

Wprowadzenie 

W ciągu ostatnich dwudziestu lat ogromnie wzrosła liczba drobnoustrojów 

przenoszonych drogą kontaktów seksualnych oraz związanych z nimi objawów 

klinicznych. W tabeli 21 wymienione zostały wybrane mikroorganizmy przenoszone 

drogą płciową i wywoływane przez nie choroby. Diagnostyka niektórych 

z nich stanowi ważne wyzwanie dla klinicznego laboratorium mikrobiologicznego. 

Diagnostyka laboratoryjna jest istotnym elementem w postępowaniu 

z pacjentem, w kontroli takich chorób, jak rzeżączka czy kiła, i ma znaczenie nie 

tylko dla pacjenta, ale także dla jego partnera seksualnego. 

W rozdziale zostanie krótko przedstawiona identyfikacja najczęściej pojawiających 

się mikroorganizmów przenoszonych drogą seksualną, występujących 

Tabela 21. Wybrane mikroorganizmy przenoszone droga˛ płciowa˛ i towarzysza˛ce im 

objawy 

Czynnik etiologiczny 


Chlamydia trachomatis 

(serotypy D –K) 


(serotypy L 1 ,L 2 ,L 3 ) 

Treponema pallidum 

Haemophilus ducreyi 

Calymmatobacterium 

granulomatis 

Mobiluncus spp. 

Ludzki (alfa) wirus opryszczki 

(HSV1 i HSV2) 

Wirus cytomegalii (CMV) 

Ludzki Papillomavirus 

(HPV) 

Ludzki wirus nabytego 

niedoboru odporności 

(HIV) 

Wirus zapalenia wa˛troby 

typu B (HBV) 

Gardnerella vaginalis 


Objaw 

Zapalenie gruczołu przedsionkowego większego (Bartholina), 

zapalenie szyjki macicy, zapalenie kosmówkowo-owodniowe, 

zapalenie spojówek, uogólniona infekcja gonokokowa 

(zapalenie stawów, skóry, pochewek ścięgnistych), zapalenie 

endometrium, zapalenie naja˛drzy, bezpłodność, zapalenie 

gardła, przedpokwitaniowe zapalenie pochwy, zapalenie torebki 

wa˛troby, zapalenie odbytu, zapalenie prostaty, zapalenie 

jajowodów, zapalenie cewki moczowej 

Zapalenie gruczołu przedsionkowego większego (Bartholina), 

zapalenie szyjki macicy, zapalenie spojówek u noworodków, 

zapalenie endometrium, zapalenie naja˛drzy, zapalenie płuc 

u noworodków, bezpłodność, zapalenie ucha środkowego 

uniemowla˛t, zapalenie narza˛dów miednicy, zapalenie torebki 

wa˛troby, przedpokwitaniowe zapalenie pochwy, zapalenie 

odbytu, zespółReitera, zapalenie jajowodów, zapalenie cewki 

moczowej 

Ziarniniak weneryczny 

Kiła 

Wrzód miękki 

Ziarniniak pachwinowy (donovanosis) 

Bakteryjna waginoza 

Opryszczka narza˛dów płciowych oraz warg i jamy ustnej, 

zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, opryszczka noworodków, 

zapalenie odbytu 

Zakażenie wrodzone 

Rak szyjki macicy, kłykciny wirusowe 

Zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS) oraz choroby 

towarzysza˛ce AIDS 

Wirusowe zapalenie wa˛troby typu B 

Zapalenie cewki moczowej, zapalenie pochwy 

Zapalenie żołędzi i napletka, zapalenie sromu i pochwy 

89


w próbkach pochodzących z żeńskich i męskich dróg moczowo-płciowych. 

Czynniki wirusowe i bakteryjne, takie jak: Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma 

hominis i Mobiluncus spp., nie zostaną tu omówione. W celu uzyskania 

bardziej szczegółowych informacji, odsyłamy czytelnika do odnośnych publikacji 

WHO 1 . 

Zapalenie cewki moczowej u mężczyzn 

Zapalenie cewki moczowej u mężczyzn klinicznie charakteryzuje się wydzieliną 

z cewki i/lub zaburzeniami w oddawaniu moczu, często jednak występują 

bezobjawowe infekcje wywołane przez Neisseria gonorrhoeae lub Chlamydia 

trachomatis. Nieleczone gonokokowe lub chlamydialne zapalenie cewki moczowej 

może rozwinąć się w zapalenie najądrzy. U homoseksualnych mężczyzn 

mogą występować infekcje odbytu i jamy ustnej wywołane przez N. gonorrhoeae 

i C. trachomatis. 

W celu ustalenia postępowania z pacjentem zapalenia cewki moczowej powinny 

być podzielone na gonokokowe i niegonokokowe (NGU). Blisko połowa 

przypadków NGU wywołana jest przez C. trachomatis, jednak etiologia większości 

nawracających zakażeń nie została wpełni wyjaśniona. Zgodnie z badaniami 

przyczyną zapalenia cewki moczowej może być zakażenie Ureaplasma urealyticum, 

aw1– 3% przypadków NGU Trichomonas vaginalis. Notowano również 

infekcje wywołane przez ludzki Herpesvirus. Czynniki bakteryjne, takie jak: 

gronkowce, pałeczki Enterobacteriaceae, Acinetobacter spp. i Pseudomonas spp., 

mogą być izolowane z cewki zdrowych mężczyzn, lecz nie udowodniono ich 

udziału w zapaleniu cewki moczowej. 

Badanie próbki w kierunku obecności C. trachomatis nie jest przedmiotem 

niniejszego opracowania. Poza izolacją na hodowlach komórkowych bardziej 

dostępne stały się ostatnio niehodowlane metody wykrywania chlamydii za 

pomocą testów immunoenzymatycznych, immunofluorescencji i amplifikacji 

kwasu nukleinowego (PCR). Powyższe metody nadal są zbyt drogie. 


W celu pobrania do badania wydzieliny z cewki moczowej należy wprowadzić do 

cewki wymazówkę omałej średnicy lub sterylną ezę bakteryjną i przed jej 

wyciągnięciem delikatnie przekręcić. Ropną wydzielinę można pobrać bezpośrednio 

na wymazówkę lub ezę do posiewu. Ważny jest rodzaj użytej wymazówki. 

Do hodowli N. gonorrhoeae zalecana jest wymazówka bawełniana z węglem 

aktywnym lub z alginianem wapnia, a także wymazówka z dakronu. Jeśli do 

pobierania materiału te specjalne, przygotowywane komercyjnie, wymazówki nie 

są dostępne i użyto zwykłych wymazówek z waty, próbkę należy natychmiast 

posiać. W przypadku zapalenia cewki moczowej masaż prostaty nie zwiększa 

odstetka izolacji gonokoków lub chlamydii. 

Wymazy odbytnicze należy pobrać wymazówką wprowadzając jądo kanału 

odbytu na głębokość 4 – 5 cm. Próbki z tylnej ściany gardła i krypt migdałków 

należy pobrać wymazówką i natychmiast posiać. 

1 

Van Dyck E., Meheus A.Z., Piot P.: Laboratory diagnosis of sexually transmitted diseases. Geneva, 

World Health Organization, 1999. 

90

CZE˛ŚĆ I 

Najlepiej, jeśli próbki w kierunku obecności N. gonorrhoeae posiewane są na 

podłoże hodowlane bezpośrednio po pobraniu. Posiane płytki należy umieścić 

w eksykatorze lub w atmosferze zawierającej 5 – 10% dwutlenku węgla, o wysokiej 

wilgotności. Jeśli natychmiastowy posiew i inkubacja są niemożliwe, należy 

użyć podłoża transportowego, takiego jak Amies lub Stuart. Czas transportu 

powinien być możliwie najkrótszy, maksymalnie do 12 godzin, w temperaturze 

otoczenia do 30°C. Należy unikać schłodzenia. 

Badanie bezpośrednie i interpretacja 

W większości badań wykazano, że obecność czterech lub więcej wielojądrzastych 

(PMN) leukocytów w polu widzenia w immersji olejowej zdecydowanie wskazuje 

na zapalenie cewki moczowej u mężczyzn. Opisane kryterium jest szczególnie 

użyteczne dla lekarza, który musi podjąć decyzję o rozpoczęciu leczenia pacjenta 

ze słabo nasilonymi objawami. 

W większości przypadków rzeżączki u kobiet wydzielina jest ropna, a w rozmazie 

z cewki moczowej widoczne są liczne wielojądrzaste leukocyty (> 10 w polu 

widzenia w immersji olejowej). Jakkolwiek nie zawsze jest tak w przypadku 

NGU, które daje mniej nasiloną reakcję zapalną. Rozmazy z więcej niż 4 PMN 

leukocytami w polu widzenia i bez wewnątrzkomórkowych Gram-ujemnych 

dwoinek wskazują na NGU. 

Cienką warstwę materiału należy nanieść wymazówką na szkiełko podstawowe, 

preparat utrwalić temperaturą i wybarwić błękitem metylenowym lub metodą 

Grama. Obecność Gram-ujemnych wewnątrzkomórkowych dwoinek w wielojądrzastych 

leukocytach w preparacie bezpośrednim z cewki moczowej wskazuje na 

rzeżączkę. 

Nie zaleca się wykonywania barwionych metodą Grama preparatów z próbek 

pobranych z cewki moczowej u kobiet bez objawów zakażenia, ze ślepych 

wymazów odbytniczych lub z próbek z jamy ustnej. Jednakże badanie mikroskopowe 

ropnego materiału otrzymanego w anoskopii ma wysoką wartość 

diagnostyczną. 

Hodowla Neisseria gonorrhoeae 

Posiane płytki z modyfikowanym podłożem agarowym Thayer-Martina (MTM) 1 

(lub agarem New York City (NYC)) 2 należy inkubować w35°C w wilgotnej 

1 

Modyfikowany agar Thayer-Martina przygotowuje się przez dodanie w 50°C mieszaniny antybiotyków 

i IsoVitaleX lub równoważnego suplementu do agaru czekoladowego przygotowanego 

z agaru GC lub agaru Columbia, stanowiącego podstawowe podłoże. Komercyjnie dostępna z wielu 

źródeł jest mieszanina zawierająca 3 lub 4 antybiotyki; mieszanina VCN zawiera wankomycynę, 

kolistynę i nystatynę: VCNT zawiera również trimetoprim. 

Końcowe stężenie antybiotyków w przygotowanym podłożu: 

– wankomycyna: 3 µg/ml – nystatyna: 12,5 IU/ml 

– kolistyna: 7,5 µg/ml – mleczan trimetoprimu: 5 µg/ml 

2 

Modyfikowane podłoże New York City przygotowuje się przez dodanie do 500 ml bazowego 

sterylnego agaru GC schłodzonego do 50°C następujących dodatków: 

– 50 ml krwi końskiej lizowanej przez dodanie 5 ml/l saponiny, 

– sterylny autolizat drożdżowy, 

– zestaw antybiotyków zawierający: wankomycynę, kolistynę, amfoterycynę i trimetoprim. 

Składniki dostępne są komercyjnie z Oxoid Ltd. Wade Rd, Basingstoke, Hants RG24 8PW, England. 

91


atmosferze wzbogaconej dwutlenkiem węgla (eksykator) i obserwować codziennie 

przez dwa dni. Laboratoria przeprowadzające dużą liczbę badań próbek 

w kierunku N. gonorrhoeae, poza selektywnym MTM, stosują często nieselektywny 

agar czekoladowy wzbogacony dodatkiem IsoVitaleX lub innym, ponieważ 

3 – 10% gonokoków może wykazywać wrażliwość na stężenia wankomycyny 

użyte w podłożu selektywnym. 

Kolonie gonokoków po 24 godzinach mogą być jeszcze niewidoczne. Pojawiają 

się po 48 godzinach jako szare lub białe, nieprzezroczyste, uniesione i opalizujące 

kolonie różnych rozmiarów i morfologii. 

Identyfikacja Neisseria gonorrhoeae 

Wstępna identyfikacja N. gonorrhoeae izolowanych z materiałów pobranych 

z dróg moczowo-płciowych oparta jest na dodatniej reakcji oksydazowej 

i obecności Gram-ujemnych dwoinek widocznych w preparacie barwionym 

metodą Grama. W celu potwierdzenia identyfikacji można przeprowadzić testy 

rozkładu węglowodanów lub inne, stosując metody i podłoża omówione szczegółowo 

w innych opracowaniach 1 . 

Badanie wrażliwości na antybiotyki 

Istnieje geograficzne zróżnicowanie wrażliwości N. gonorrhoeae na benzylopenicylinę. 

W niektórych regionach, takich jak Afryka podsaharyjska czy południowo-wschodnia 

Azja, większość szczepów gonokokowych wykazuje zdolność 

do produkcji β-laktamaz. Przenoszona chromosomalnie, niezwiązana z wytwarzaniem 

β-laktamaz oporność na benzylopenicylinę staje się coraz częstsza 

w wielu krajach. Metoda dyfuzji krążkowej nie jest jednak przydatna do 

wykrywania takich szczepów. 

Na obszarach, gdzie w zakażeniach gonokokowych stosowane są benzylopenicylina, 

ampicylina i amoksycylina, szczepy N. gonorrhoeae (szczególnie w razie 

niepowodzenia terapii) powinny być rutynowo badane w kierunku wytwarzania 

β-laktamaz jednym z zalecanych testów, takich jak test z nitrocefiną 2 . Do testu 

z nitrocefiną należy wmałej probówce przygotować gęstą zawiesinę z kilku 

kolonii i 0,2 ml fizjologicznego roztworu soli; następnie do zawiesiny dodać 

0,025 ml nitrocefiny, mieszać przez minutę. Szybka zmiana koloru z żółtego na 

różowy lub czerwony jest dowodem na wytwarzanie β-laktamazy przez badany 

szczep. 

Rutynowe badanie wrażliwości N. gonorrhoeae na antybiotyki metodą dyfuzyjno- 

-krążkową nie jest zalecane. 

1 



2 

Odczynnik Nitrocefin jest dostępny w firmie Oxoid Ltd, Wade Road, Basingstoke, Hants RG24 

8PW, England; zawiera 1 mg nitrocefiny (SR112) i fiolkę rozpuszczalnika (SR112A). Test 

probówkowy może być zastąpiony testem krążkowym z użyciem krążka nasyconego nitrocefiną 

(krążek cefinazowy dostępny z BD Diagnostic Systems, 7 Loveton Circle, Sparks, MD 21152, 

USA). 

92

CZE˛ŚĆ I 

Próbki z żeńskich narza˛dów płciowych 

Flora pochwy kobiety przed menopauzą składa się głównie z laseczek kwasu 

mlekowego i różnych fakultatywnie tlenowych i beztlenowych bakterii. 

Nieprawidłowa wydzielina z pochwy może być wynikiem: 

– zapalenia pochwy: Gardnerella vaginalis, Candida albicans; 

– bakteryjnej waginozy: przerost bakterii beztlenowych i Mobiluncus spp.; 

– zapalenia szyjki macicy: Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis. 

Inne bakterie, takie jak Enterobacteriaceae, nie są udowodnioną przyczyną 

zapalenia pochwy. Zapalenie pochwy u dziewczynek przed okresem pokwitania 

może być wywołane przez N. gonorrhoeae lub C. trachomatis. 

Bakteryjna waginoza (niespecyficzne zapalenie pochwy) jest stanem charakteryzującym 

się obfitą, brzydko pachnącą wydzieliną, z towarzyszącym znaczącym 

wzrostem Mobiluncus spp. i różnych bezwzględnych beztlenowców oraz 

spadkiem liczby pochwowych laseczek kwasu mlekowego. Minimalnym warunkiem 

rozpoznania bakteryjnej waginozy jest obecność co najmniej trzech 

z następujących objawów: nieprawidłowa wydzielina z pochwy, pH pochwy 

> 4,5, komórki wskaźnikowe (komórki nabłonkowe z tak licznie przylegającymi 

bakteriami, że niewidoczne stają się obrysy komórki) i rybi, aminopodobny 

zapach po dodaniu do wydzieliny pochwowej kropli 10% wodorotlenku potasu. 

Zapalenie cewki moczowej może być wywołane także przez N. gonorrhoeae 

i C. trachomatis. 

Zakażenia wstępujące N. gonorrhoeae, C. trachomatis, beztlenowymi i względnie 

beztlenowymi bakteriami mogą powodować zapalenie narządów miednicy 

(pelvic inflammatory disease — PID) i w konsekwencji niemożność donoszenia 

ciąży lub ciążę pozamaciczną. 

Bakteryjne zakażenia narządów płciowych podczas ciąży, w tym zakażenia 

N. gonorrhoeae i C. trachomatis, mogą być przyczyną powikłań, takich jak: 

przedwczesny poród, przedwczesne pęknięcie pęcherza płodowego, zapalenie 

błon płodowych, poporodowe zapalenie błony śluzowej macicy u matki i zapalenie 

spojówek, zapalenie płuc oraz zespół zakażenia owodni u noworodka. 

Na specjalne zlecenie materiały pobrane z szyjki macicy i pochwy można 

posiewać w kierunku S. aureus (zespół szoku toksycznego), S. agalactiae 

(paciorkowiec grupy B, zakażenia noworodków), Listeria monocytogenes (zakażenia 

noworodków) i Clostridium spp. (poronienie septyczne). 

Jakkolwiek infekcje C. trachomatis i ludzkim Herpesvirus są powszechne, ich 

diagnostyka laboratoryjna wymaga drogiego sprzętu oraz odczynników i nie 

będzie tutaj omawiana. 


Wszystkie próbki powinny być pobierane podczas badania we wziernikach. 

Wziernik przed użyciem można zwilżyć ciepłą jałową wodą, nie można natomiast 

używać antyseptyków i kremów do badania ginekologicznego, ponieważ mogą 

one działać letalnie na gonokoki. 

93


Do badania w kierunku obecności drożdży, G. vaginalis i bakteryjnej waginozy 

próbki wydzieliny pochwowej można pobrać wymazówką z tylnego sklepienia 

pochwy. Próbki do hodowli gonokoków i chlamydii powinny być pobrane z błony 

śluzowej szyjki macicy. Po założeniu wzierników bawełnianą wymazówką należy 

usunąć czop śluzowy. Wymazówkę do pobierania materiału (patrz str. 90) należy 

wprowadzić do kanału szyki macicy i obracać przez co najmniej 10 sekund przed 

wyciągnięciem. 

Próbki z cewki moczowej, odbytu i z jamy ustnej pobiera się w podobny sposób 

jak u mężczyzn. 

W każdym przypadku zapalenia narządów miednicy (PID) należy pobrać 

przynajmniej próbki z szyjki macicy w kierunku N. gonorrhoeae. Pobieranie 

materiału z jajowodu jest bardziej wiarygodne, ale w większości regionów 

najlepszą dostępną próbką jest aspirat z zagłębienia odbytniczo-macicznego 

(jamy Douglasa). 

U dzieci z ciężkim noworodkowym zapaleniem spojówek należy wymazówką lub 

ezą pobrać wydzielinę z worka spojówkowego. 

Z wyjątkiem próbek badanych w kierunku C. trachomatis, do transportu 

wymazów z szyjki i pochwy najbardziej odpowiednie są podłoża transportowe 

Amies i Stuart. 

Badanie bezpośrednie i interpretacja 

Bezpośrednie badanie wydzieliny z pochwy jest metodą z wyboru w diagnostyce 

zapalenia pochwy, lecz mniej przydatną w diagnostyce zapalenia szyjki 

macicy. 

Preparat bezpośredni przygotowywany jest na szkiełku podstawowym, na którym 

w fizjologicznym roztworze soli umieszcza się próbkę materiału pobranego 

z pochwy, a następnie nakrywa szkiełkiem nakrywkowym. Zapewnia to rozdzielenie 

komórek, które w innym przypadku mogą sklejać się w grudki. Preparat 

należy oglądać pod powiększeniem × 400 poszukując typowych ruchliwych 

T. vaginalis, pączkujących drożdży i komórek wskaźnikowych (,,clue cells’’). 

C. albicans może tworzyć pseudogrzybnie, obserwowane niekiedy w materiale 

z pochwy. Komórki wskaźnikowe są obecne u większości kobiet z bakteryjną 

waginozą. Ziarnisty lub brudny wygląd cytoplazmy komórek nabłonkowych jest 

mniej obiektywnym kryterium niż utrata granic komórki. Badanie mikroskopowe 

preparatów bezpośrednich z szyjki macicy nie jest zalecane. 

W diagnostyce bakteryjnej waginozy metodą z wyboru jest przygotowanie preparatów 

barwionych metodą Grama. Preparat należy wykonać delikatnie przetaczając 

wymazówkę po szkiełku podstawowym. Prawidłowy rozmaz z pochwy 

zawiera głównie laseczki kwasu mlekowego (duże, Gram-dodatnie) oraz mniej 

niż 5 leukocytów w polu widzenia. W rozmazach pochodzących od kobiet z waginozą 

bakteryjną obserwuje się pokryte małymi Gram-ujemnymi pałeczkami 

komórki wskaźnikowe (,,clue cells’’) oraz mieszaną florę: liczne małe Gram- 

-ujemne i Gram-zmienne pałeczki, ziarenko-pałeczki, często także Gram-ujemne 

zakrzywione pałeczki, nie stwierdza się natomiast większych, Gram-dodatnich 

laseczek. W polu widzenia widoczne są jedynie nieliczne (< 5) leukocyty. Obraz 

ten jest czułym i swoistym wskaźnikiem bakteryjnej waginozy. 

94

CZE˛ŚĆ I 

Duża liczba leukocytów (> 10 komórek w polu widzenia) w bezpośrednim 

preparacie z pochwy barwionym metodą Grama wskazuje na rzęsistkowicę lub 

zapalenie szyjki macicy. 

Barwienie Grama nie jest szczególnie przydatne w diagnostyce zakażeń gonokokowych 

u kobiet. Badanie oparte na poszukiwaniu Gram-ujemnych wewnątrzkomórkowo 

zlokalizowanych dwoinek w barwionych metodą Grama preparatach 

bezpośrednich z szyjki macicy ma czułość 50 – 70% i swoistość 50 – 90%, co 

wskazuje na niewielką wartość tej metody diagnostycznej w populacji o niskiej 

częstości występowania rzeżączki. Obecność Gram-ujemnych wewnątrzkomórkowych 

dwoinek widocznych w preparatach z szyjki macicy powinna zostać 

odnotowana bez określenia, że sąto N. gonorrhoeae lub gonokoki. Można w ten 

sposób uniknąć nadinterpretacji rozmazów z szyjki macicy, które często zawierają 

Gram-ujemne ziarenko-pałeczki oraz dwubiegunowo zabarwione pałeczki. 

Głównym celem wykonywania preparatów bezpośrednich z szyjki macicy jest 

potwierdzenie rozpoznania śluzowo-ropnego zapalenia szyjki macicy: obecność 

więcej niż 10 wielojądrzastych leukocytów w polu widzenia wskazuje na rozpoznanie 

zakażenia, wywołanego zwykle przez N. gonorrhoeae i/lub C. trachomatis. 

Badanie preparatów bezpośrednich ze spojówek barwionych metodą Grama jest 

czułą i swoista metodą diagnostyczną rzeżączkowego zapalenia spojówek. 

Obecność wewnątrzkomórkowych Gram-ujemnych dwoinek potwierdza rozpoznanie. 

Hodowla 

Próbki z szyjki macicy, odbytu, cewki moczowej, spojówek i z zagłębienia 

odbytniczo-macicznego mogą być posiewane w kierunku N. gonorrhoeae metodą 

opisaną na str. 91, 92. Badanie próbek należy rozpocząć natychmiast po ich 

dostarczeniu do laboratorium lub — korzystniej — jeszcze w klinice. U kobiet, 

w odróżnieniu od mężczyzn, posiewy mają kluczowe znaczenie w diagnostyce 

infekcji gonokokowych. Czułość pojedynczego posiewu u kobiet wynosi 

80 – 90%. Jest mniejsza w przypadku próbek pobranych w okresie okołoporodowym. 

W diagnostyce bakteryjnej waginozy nie zaleca się prowadzenia hodowli w kierunku 

G. vaginalis lub beztlenowców, ponieważ są one wykrywane u 20 – 40% 

kobiet bez infekcji pochwy. Obecność G. vaginalis w wydzielinie z pochwy nie 

jest wystarczającym wskazaniem do leczenia; leczone powinny być tylko 

pacjentki spełniające wszystkie kryteria diagnostyczne bakteryjnej waginozy. 

W porównaniu z badaniem mikroskopowym hodowla zwiększa wykrywalność 

C. albicans o50– 100%. Ponieważ posiew w kierunku Candida jest dodatni nawet 

przy niewielkiej liczbie grzybów, która może występować u10– 30% kobiet bez 

objawów zapalenia pochwy, tylko obfity wzrost C. albicans stanowi dowód 

kandydiazy pochwy. W związku z tym nie zaleca się rutynowego prowadzenia 

hodowli. Podobnie, poza preparatem bezpośrednim nie zaleca się posiewu 

w kierunku G. vaginalis, który najczęściej wykrywa jedynie bezobjawowe 

nosicielstwo. 

95


Próbki z owrzodzeń narza˛dów płciowych 

Owrzodzenia narządówpłciowych są częstym problemem w wielu rozwijających 

się krajach. Ich diagnostyka i leczenie są wyzwaniem zarówno dla lekarzy, jak 

i dla laboratorium. Powszechne są infekcje mieszane. Zmiany owrzodzeniowe 

narządów płciowych mogą być wywołane przez różne czynniki przenoszone 

drogą kontaktów seksualnych: 

– ludzki Herpesvirus, 

– Treponema pallidum, 

– Haemophilus ducreyi, 

– Calymmatobacterium granulomatis, wywołujący ziarniniaka pachwiny (donovanosis), 

– Chlamydia trachomatis serotypy L 1 ,L 2 ,L 3 . 

W wielu rozwijających się krajach wirus opryszczki jest najczęstszą przyczyną 

owrzodzeń narządów płciowych i zagrażających życiu powikłań u pacjentów 

z niedoborami odpornościowymi oraz u noworodków kobiet z infekcją. Diagnostyka 

laboratoryjna zakażenia nie będzie tu omawiana. 

Kiła jest wciąż najpoważniejszą chorobą weneryczną, która może prowadzić do 

ciężkich późnych następstw oraz kiły wrodzonej. Mimo że testy serologiczne 

odgrywają ważną rolę w diagnostyce wszystkich stadiów kiły, w tym miejscu 

zostanie omówione tylko badanie w ciemnym polu widzenia. Techniki i interpretacja 

testów serologicznych w diagnostyce kiły zostały szczegółowo przedstawione 

w innych opracowaniach 1 . 

Wrzód miękki jest główną postacią owrzodzeń narządów płciowych w wielu 

rozwijających się regionach. Objawy kliniczne obejmują bolesne, ropne owrzodzenie(a), 

z towarzyszącym bolesnym, często ropnym, zapalnym obrzękiem 

pachwinowych węzłów chłonnych. Nie obserwowano występowania późnych 

konsekwencji zakażenia. Kliniczne różnicowanie z innymi owrzodzeniami 

narządówpłciowych jest trudne. Wrzód miękki zwiększa ryzyko zakażenia HIV. 

Ziarniniak pachwiny charakteryzuje się żywoczerwonym, ziarniniakowym 

owrzodzeniem narządów płciowych. Obrzęk zapalny węzłów chłonnych jest 

rzadki. 

Chlamydiowy ziarniniak limfatyczny charakteryzuje się pachwinową i/lub udową 

limfadenopatią i rzadziej obecnością małych, samoistnie gojących się owrzodzeń. 

Diagnostyka oparta jest na testach serologicznych i izolacji C. trachomatis 

serotypów L 1 ,L 2 ,L 3 . 

Pobieranie próbek 

Treponema pallidum: Nałożyć rękawiczki chirurgiczne. Ścisnąć owrzodzenie 

między dwoma palcami i, używając gazików, oczyścić powierzchnię zmiany 

roztworem fizjologicznym soli. Obecne strupki usunąć. Zetrzeć pierwsze krople 

krwi (jeśli się pojawią) i dotykając czystym szkiełkiem podstawowym powierzchni 

zmiany pobrać próbkę surowiczego wysięku. Natychmiast nałożyć na kroplę 

1 

Van Dyck E., Meheus A.Z., Piot P.: Laboratory diagnosis of sexually transmitted disease. Geneva, 


96

CZE˛ŚĆ I 

wysięku czyste szkiełko nakrywkowe. Alternatywnie próbka może być pobrana ze 

zmiany lub powiększonego węzła chłonnego za pomocą sterylnej igły i strzykawki. 

Preparat powinien być niezwłocznie odczytany w ciemnym polu widzenia 

przez doświadczonego mikrobiologa. 

Haemophilus ducreyi: Próbkę należy pobrać wymazówką z podstawy owrzodzenia 

i posiać bezpośrednio na podłoże. Materiał można również uzyskać z powiększonych 

zapalnie węzłów chłonnych pachwinowych, lecz wyhodowanie 

H. ducreyi z takiego materiału jest mniej prawdopodobne. Przydatność podłoży 

transportowych dla H. ducreyi nie została dostatecznie oceniona. 

Przy podejrzeniu ziarniniaka pachwiny należy wykonać biopsję tkanki leżącej pod 

powierzchnią aktywnie ziarninującej zmiany. Przygotować świeże preparaty ze 

zmiażdżonych fragmentów materiału biopsyjnego. Alternatywnie jeden z preparatów 

może zawierać zeskrobiny z powierzchni zmiany. 

Badanie bezpośrednie 

Wykazanie krętków w materiale ze zmiany jest metodą z wyboru w diagnostyce 

kiły pierwotnej. Mimo iż T. pallidum można wybarwić (np. azotanem srebra), ze 

względu na większą czułość i swoistość zalecana jest mikroskopia w ciemnym 

polu widzenia. Do badania potrzebny jest mikroskop wyposażony w dobre źródło 

światła i kondensor. Kondensor ciemnego pola widzenia przesłania padające 

prosto promienie światła, przepuszczając jedynie promienie peryferyczne (odbijane 

przez takie obiekty, jak krętki). 

Należy umieścić kilka kropel olejku immersyjnego na kondensorze mikroskopu 

z ciemnym polem widzenia. Obniżyć nieco kondensor, tak by poziom olejku był 

poniżej podstawy. Umieścić szkiełko pod mikroskopem i podnosić kondensor do 

chwili uzyskania dobrego kontaktu między olejkiem i spodem szkiełka. Unikać 

utworzenia się pęcherzyków powietrza w olejku. 

Ryc. 9. Obraz T. pallidum pod mikroskopem w ciemnym polu widzenia. 

97


Do uzyskania obrazu użyć obiektywu o najmniejszym powiększeniu (× 10). 

Regulując pokrętłem kondensora, skierować światło centralnie na pole i ustawić 

ostrość podnosząc i obniżając kondensor do momentu uzyskania najmniejszej 

średnicy światła. Jeśli to konieczne, ponownie ustawić światło w centrum. 

Następnie, używając obiektywu × 40, ustawić ostrość i uważnie oglądać preparat. 

Kontrast będzie lepszy przy mikroskopowaniu w ciemności. Unikać jasnego 

światła dziennego. 

T. pallidum jest biały, świecący na ciemnym tle (ryc. 9). Jego identyfikacji 

dokonuje się na podstawie typowej morfologii, rozmiaru i ruchliwości. Jest 

cienkim (0,25 – 0,3 µm) mikroorganizmem, długości 6 – 16 µm, z 8 – 14 regularnymi, 

ściśle skręconymi, wyraźnymi spiralami. Wykazuje szybkie, raczej 

gwałtowne ruchy. Stosunkowo wolno obraca się wzdłuż długiej osi (jak 

korkociąg). Rotacji towarzyszy intensywne zginanie (skręcanie). Można zaobserwować 

wydłużanie i skracanie komórki (przypominającej elastyczną, rozprężającą 

się spiralę). W skomplikowanych skrętach mogą pojawiać się zniekształcenia. 

Jeżeli mikroorganizm przylega lub jest otoczony przez cięższy obiekt, w wyniku 

nasilonych ruchów dochodzi do odkształcenia zwojów. Inne niekiłowe krętki 

mogą być luźno skręcone, cienkie i nieregularne; poruszają się inaczej (nie jak 

korkociąg), ruchem bardziej wijącym, z zaznaczonym zgięciem i częstą relaksacją 

skrętów. 

Wykazanie krętków z charakterystyczną dla T. pallidum morfologią i ruchem 

stanowi potwierdzenie rozpoznania pierwszo- i drugorzędowej kiły. Pacjenci 

z pierwotną zmianą kiłową, z dodatnim wynikiem badania w ciemnym polu 

widzenia mogą być seronegatywni. Zwykle do serokonwersji dochodzi w ciągu 

kilku tygodni. 

Niepowodzenie w wykazaniu drobnoustrojów nie wyklucza kiły. Ujemne wyniki 

mogą świadczyć o tym, że: 

• Obecna była niewystarczająca liczba drobnoustrojów (pojedyncze badanie 

w ciemnym polu widzenia ma czułość nie większą niż 50%). 

• Pacjent otrzymał już antybiotyki. 

• Zmiana ulega naturalnemu wygojeniu. 

• Zmiana nie była owrzodzeniem kiłowym. 

Niezależnie od wyników badania w ciemnym polu widzenia zawsze należy pobrać 

krew do badań serologicznych. 

W diagnostyce ziarniniaka pachwiny w utrwalonych acetonem preparatach 

wybarwionych metodą Giemsy wewnątrz histiocytów widoczne są typowe, 

otoczkowe laseczki. Diagnostyka tej choroby opisana jest szczegółowo w innych 

źródłach 1 . 

W diagnostyce wrzodu miękkiego nie zaleca się barwienia rozmazów metodą 

Grama, ponieważ zarówno czułość, jak i specyficzność wynoszą mniej niż 50%. 

W diagnostyce chlamydiowego ziarniniaka limfatycznego nie zaleca się stosowania 

barwienia metodą Giemsy. Materiał z owrzodzenia powinien być także badany 

w ciemnym polu widzenia w kierunku T. pallidum. 

1 



98

CZE˛ŚĆ I 

Hodowla 

Z owrzodzeń narządów płciowych niekiedy izolowane są gonokoki, ale ich 

znaczenie w takich próbkach jest niejasne. Poza H. ducreyi nie udowodniono, aby 

inny gatunek bakterii — zarówno względnie tlenowy, jak i bezwzględnie 

beztlenowy — wywoływał owrzodzenia narządów płciowych. 

Próbki, które mają zostać zbadane w kierunku H. ducrei, należy posiać bezpośrednio 

na wybiórcze, wzbogacone podłoże agarowe 1 . Podłoże użyte do posiewu 

musi być świeże (do tygodnia od przygotowania). Płytki należy inkubować 

w33– 35°C w eksykatorze ze zwilżoną ligniną na dnie. Po 48 – 72 godzinach 

inkubacji pojawiają się małe, nieśluzowe, żółtoszare, półprzezroczyste lub 

przezroczyste kolonie, które nienaruszone można przesuwać po powierzchni 

płytki. Czułość pojedynczej hodowli w izolacji H. ducreyi wynosi 70 – 80%. 

Wstępna diagnoza H. ducreyi może być przeprowadzona na podstawie morfologii 

kolonii na podłożu selektywnym i wykazania małych, Gram-ujemnych pleomorficznych 

ziarenko-pałeczek, często w pojedynczych łańcuchach (paciorki), 

równoległych łańcuchach (,,ławica ryb’’) lub w skupiskach. Mimo że wzrost 

H. ducreyi jest zależny od heminy, większość klinicznych izolatów nie rośnie na 

podłożach wykrywających zależność wzrostu od czynników X i V. Obecnie 

prawie wszystkie szczepy izolowane w krajach rozwijających się wytwarzają 

β-laktamazy. 

1 

Agar Mueller-Hintona wzbogacony 5% sterylną krwią końską podgrzaną do 75°C, 1% IsoVitaleX 

i 3 g/ml wankomycyny. 

99

Ropne wydzieliny, rany i ropnie 

Wprowadzenie 

Jednym z najczęściej obserwowanych objawów chorób zakaźnych jest wytwarzanie 

ropnej (czasami surowiczo-ropnej) wydzieliny powstającej w wyniku 

inwazji bakterii do tkanki, narządu lub jamy ciała. Zakażenia te mogą być 

stosunkowo łagodne (nieszkodliwy ,,pryszcz’’) lub wywoływać liczne ropnie 

zlokalizowane w jednym lub wielu miejscach. Wysięk składa się z białych 

krwinek, głównie wielojądrzastych leukocytów, zakażających drobnoustrojów 

oraz mieszaniny płynu ustrojowego i fibryny. W niektórych sytuacjach wysięk 

może być widoczny jako warstwa na powierzchni narządu, na przykład na 

powierzchni mózgu w bakteryjnym zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych. 

W innych przypadkach wysięk może być otoczony warstwą włóknika i siecią 

komórek tkanki (np. czyrak mnogi lub podskórny ,,czyrak’’), a niekiedy związany 

jest z otwartą raną, z której wycieka gęsty płyn lub ropa. 

Zarówno anatomiczna lokalizacja wysięku, jak i mikroorganizmy związane 

z wymienionymi infekcjami mogą się znacznie różnić. Wpływ na tworzenie 

wysięku mogą mieć wszystkie bakterie wchodzące w skład flory fizjologicznej, 

a także grzyby, szczególnie te, które mają zdolność namnażania się w tkankach. 

W infekcjach wirusowych rzadko dochodzi do powstania ropnej wydzieliny. 

Mikrobiolog powinien, uwzględniając różnorodną lokalizację i etiologię ropnych 

zakażeń, przeprowadzić właściwe badania makroskopowe i mikroskopowe 

z posiewem na odpowiednie podłoża, które umożliwią izolację najważniejszych 

patogennych drobnoustrojów. Możliwie najszybciej po uzyskaniu czystych 

hodowli należy przeprowadzić identyfikację oraz określić wrażliwość na antybiotyki. 

Współpraca między klinicystą i mikrobiologiem ma zasadnicze znaczenie 

w diagnostyce i leczeniu pacjentów z ropnymi zakażeniami. Mikrobiolog musi 

współpracować z lekarzem, zapewniając właściwe pobieranie próbek i szybki 

transport do laboratorium w celu natychmiastowego i właściwego prowadzenia 

badań. 

Postacie kliniczne i najczęstsze czynniki 

etiologiczne 

Próbki chirurgiczne 

Próbki chirurgiczne mogą być uzyskane przez nakłucie zlokalizowanego ropnia 

lub w innej procedurze chirurgicznej. Chirurg powinien pobrać kilka małych 

reprezentatywnych próbek z tkanki i każdego ropnego wysięku. Jeśli to możliwe, 

należy unikać wymazów. Materiał powinien być pobrany za pomocą igły 

i strzykawki. Jeśli konieczne jest użycie wymazówki, należy pobrać możliwie 

dużo wysięku i w odpowiednich pojemnikach przesłać do laboratorium. W chwili 

otrzymania próbki laboratorium musi, uwzględniając dostarczone informacje, 

zaplanować hodowlę drobnoustrojów prawdopodobnie obecnych w danej próbce. 

100

CZE˛ŚĆ I 

Poniżej przedstawiono kilka przykładów stanów klinicznych i drobnoustrojów 

obecnych w różnych typach próbek chirurgicznych: 

• Jama otrzewnej zawiera prawdopodobnie Gram-ujemne bakterie jelitowe, 

Gram-ujemne pałeczki beztlenowe (Bacteroides fragilis) i laseczki. 

• Otorbiony ropień może zawierać każdy typ drobnoustrojów, jeden lub kilka 

gatunków: Gram-dodatnie ziarenkowce i Gram-ujemne laseczki są izolowane 

najczęściej. W zależności od lokalizacji należy również uwzględnić bakterie 

beztlenowe i pełzaki. 

• Węzły chłonne często włączone są w infekcje układowe. Są powiększone, 

często dość twarde i gromadzą ropny wysięk. Jeśli węzeł jest chełboczący, 

zawarty płyn może zostać zaaspirowany przez lekarza. Biopsje węzłów 

chłonnych i aspiraty pobrane od dzieci należy hodować w kierunku Mycobacterium 

tuberculosis i innych prątków. Poza hodowlą w kierunku gronkowców, 

ziarenkowców i Gram-ujemnych bakterii jelitowych węzły chłonne stanowią 

dobry materiał do diagnostyki układowych i podskórnych grzybic (histoplazmoza, 

sporotrychoza). 

• Skóra i tkanka podskórna są pierwotnym miejscem powstawania ropni 

i zakażeń ran. Zgodnie z ogólną zasadą, ropnie podskórne wywoływane są przez 

gronkowce. Otwarte, sączące się zmiany skórne często występują w zakażeniach 

β-hemolizującymi paciorkowcami i/lub gronkowcami, jak np. w liszajcu. 

Innym rodzajem zmian skórnych, powstających często w wyniku zakażeń 

szpitalnych, wymagających interwencji chirurgicznej, są owrzodzenia odleżynowe 

i odleżyny. Bakterie, które są komensalami skóry lub wchodzą 

w skład flory jelitowej, mogą namnażać się w zewnętrznych warstwach 

owrzodzenia i są odpowiedzialne za nieprzyjemny zapach i wygląd. Najczęściej 

izolowanymi drobnoustrojami z biopsji tkanki są laseczki; można je również 

obserwować w posiewach z powierzchownego wysięku. Nie zawsze możliwa 

jest ocena udziału tych drobnoustrojów w powstawaniu owrzodzenia odleżynowego, 

ale warunkiem zagojenia się rany jest utrzymywanie czystego 

i suchego owrzodzenia bez bakterii. Czasami drobnoustroje z odleżyny mogą 

przenikać do krwi, wywołując poważne powikłania. 

• Oparzenia, szczególnie drugiego i trzeciego stopnia, sprzyjają infekcjom 

wywołanym przez różne gatunki bakterii. Bardzo ważne jest dokładne 

chirurgiczne opracowanie rany przeprowadzone przed pobraniem materiału do 

hodowli. Najczęściej izolowane bakterie to gronkowce i Pseudomonas aeruginosa. 

• Wysięki. Czasami surowiczy lub ropny płyn może być pobrany z jamy ciała, 

która normalnie zawiera niewielką ilość sterylnego płynu, np. worek osierdziowy, 

jama opłucnej, kaletka lub staw. Aspiracja igłowa w aseptycznych 

warunkach dostarczy laboratorium materiału, z którego można wyizolować 

i zidentyfikować zakażający mikroorganizm. Zazwyczaj przyczyną zakażenia 

są bakterie, mogą występować również grzyby i wirusy. Infekcje wywołane są 

najczęściej przez jeden gatunek, ale pojawiają się także mieszane tlenowo- 

-beztlenowe zakażenia. Z aspiratów z jamy opłucnej można uzyskać pneumokoki, 

paciorkowce, H. influenzae, beztlenowe paciorkowce lub beztlenowe 

Gram-ujemne pałeczki (Prevotella i Porphyromonas) oraz M. tuberculosis. 

Rany penetruja˛ce 

Każde uszkodzenie spowodowane przedmiotem, który przebija skórę, zawiera 

prawdopodobnie mieszaninę mikroorganizmów; drobnoustroje należą głównie do 

flory skóry lub naturalnej flory mikrobiologicznej gleby i wody. Rany penetrujące 

101

ROPNE WYDZIELINY, RANY I ROPNIE 

z uszkodzeniem jelit stanowią jeszcze poważniejsze zagrożenie, ponieważ 

w infekcji może współuczestniczyć flora jelitowa. 

Rany penetruja˛ce i cięte mogą być spowodowane ostrymi i tępymi narzędziami. 

Powstają często z użyciem metalu, szkła, drewna itp., w sposób przypadkowy lub 

umyślny (np. dźgnięcie nożem lub rany postrzałowe). Tężec rozwijający się 

w wyniku rany penetrującej jest dla nieszczepionych osób chorobą zagrażającą 

życiu. Botulizm przyranny może pozostać nie rozpoznany, jeśli lekarz i mikrobiolog 

nie są świadomi takiej możliwości. Tężec i botulizm są rozpoznawane na 

podstawie objawów klinicznych, a laboratoryjne potwierdzenie powinno być 

przeprowadzone przez centralne laboratorium referencyjne. Ludzie pracujący ze 

zwierzętami lub produktami zwierzęcymi są narażeni na zakażenie sporami 

Bacillus anthracis, które mogą wniknąć przez małe rany lub uszkodzenia skóry, 

wytwarzając typową dla wąglika postać czarnej krosty. Występujący także 

w glebie Clostridium perfringens może wniknąć do rany penetrującej i wywołać 

zgorzel gazową. 

Zadrapania i ugryzienia przez zwierzęta występują często zarówno w obszarach 

miejskich, jak i wiejskich. Ugryzienia mogą pochodzić od domowych, hodowlanych 

lub dzikich zwierząt. W pierwszej kolejności i niezwłocznie należy 

rozpatrzyć wściekliznę. Po wykluczeniu tej możliwości należy rozważyć inne 

czynniki etiologiczne. Diagnostyka wścieklizny jest zbyt specjalistyczna, aby 

została omówiona w tym opracowaniu 1 . 

Jama ustna zwierząt zawiera heterogenną florę, wskład której wchodzą tlenowe 

i beztlenowe bakterie, grzyby, pierwotniaki i wirusy. Infekcje z powodu 

ugryzienia lub zadrapania wywołane są zwykle przez bakterie. Klasycznym 

przykładem jest zakażenie Pasteurella multocida, które często towarzyszy 

ugryzieniom przez psa lub kota, gdy rana nie została właściwie oczyszczona 

i leczona. Ugryzienia przez człowieka mogą niekiedy wywoływać poważne 

mieszane zakażenia tlenowymi i beztlenowymi bakteriami. 

Szpitalne zakażenia ran 

Jednym z głównych założeń w opiece i leczeniu hospitalizowanych pacjentów jest 

zasada nieszkodzenia (,,primum non nocere’’ — przyp. tłum.) w przebiegu 

diagnozowania i terapii. Niestety 5 – 10% hospitalizowanych pacjentów nabywa 

infekcje w szpitalu. Zakażenia szpitalne generują koszty, zwykle można ich 

uniknąć lub znacznie ograniczyć ich występowanie. Wiele nabytych w szpitalu 

infekcji pojawia się na oddziałach chirurgicznych. Współczynnik pooperacyjnych 

zakażeń ran różni się w zależności od szpitala, a w obrębie szpitala wydaje się 

wyższy u pacjentów poddanych operacjom jamy brzusznej, klatki piersiowej lub 

zabiegom ortopedycznym. Zakażenia ran chirurgicznych mogą pojawiać się 

krótko po zabiegu lub kilka dni później. Zakażenie może być ograniczone do 

miejsca przecięcia lub obejmować całe miejsce operowane. Głównym czynnikiem 

etiologicznym zakażeń jest Staphylococcus aureus (zwykle oporny na 

benzylopenicylinę, a obecnie również metycylinooporny), przed E. coli i innymi 

bakteriami jelitowymi. Beztlenowe bakterie z jelita grubego pacjenta mogą 

zakazić operowane miejsca, wywołując ciężką mieszaną infekcję, dość często 

występującą w szpitalach, w których opieka nad ranami pooperacyjnymi 

1 

Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H. (eds.): Laboratory techniques in rabies, 4th ed. Geneva, 


102

CZE˛ŚĆ I 

i programy profilaktyki zakażeń są słabo rozwinięte. Bacteroides fragilis 

i rzadziej Clostridium perfringens mogą przeniknąć do krwi, stając się przyczyną 

uogólnionego, często śmiertelnego zakażenia pooperacyjnego. 

Po zabiegu stomatologicznym lub chirurgicznym w obrębie jamy ustnej może 

rozwinąć się rzadka infekcja, w której kanał przetoki prowadzi od wewnątrz na 

powierzchnię skóry twarzy lub szyi, a wydzielina zawiera ,,siarkowe’’ ziarna 

promienicy. 


Nie jest możliwe w tym miejscu szczegółowe opisanie procedury pobierania 

próbek z każdego typu rany, ropnia itd. Wydaje się oczywiste, że to zadanie 

wymaga bliskiej współpracy między laboratorium i lekarzem. W wielu 

przypadkach istnieje tylko jedna możliwość pobrania próbki; zazwyczaj 

nie ma możliwości pobrania kolejnych. Z tego powodu pobieranie, 

transport i przechowywanie próbek mają największe znaczenie i wymagają 

ścisłego przestrzegania zaleceń. Możliwie najszybciej po pobraniu próbkę 

należy przesłać do laboratorium, gdzie powinna zostać natychmiast opracowana. 

Po wstępnym badaniu i założeniu hodowli pozostałą część materiału 

należy odpowiednio opisać i zachować w warunkach schłodzenia do chwili 

uzyskania pewności, że nie ma potrzeby wykonania dodatkowych testów 

laboratoryjnych. 

Ropień 

Jeśli zostanie wykryty ropień lub mnogie ropnie, lekarz prowadzący lub 

chirurg i mikrobiolog powinni skonsultować się w sprawie dalszego postępowania. 

Technika pobierania ropy i fragmentów ściany ropnia jest procedurą 

chirurgiczną. Do pobrania możliwie największej objętości materiału ropnego 

należyużyć igły i strzykawki, a następnie przenieść aseptycznie pobrany materiał 

do sterylnego pojemnika. Jeśli taki pojemnik nie jest dostępny, próbkę należy 

zatrzymać w strzykawce z zatkniętą igłą icałą strzykawkę przesłać do laboratorium 

(metoda ta nie jest obecnie polecana z powodu ryzyka ekspozycji na 

zakażenie — przyp. tłum.). Materiał powinien natychmiast zostać poddany 

obróbce w laboratorium; zarówno hodowle tlenowe jak i beztlenowe można 

założyć z jednej próbki. 

Ze względu na potencjalną konieczność śródoperacyjnego pobrania próbki 

w czasie zabiegów, w których przypadkowo stwierdza się obecność jednego lub 

więcej otorbionych ropni w narządach, klatce piersiowej, jamie brzusznej lub 

miednicy, w sterylnym chirurgicznym wyposażeniu powinny znaleźć się zestawy 

do pobierania materiału. Za dostarczenie odpowiednich zestawów odpowiedzialne 

jest laboratorium. W przypadku obecności obfitej ropy należy unikać 

pobierania próbek wymazówką.Użycie wymazówek uzasadnione jest do pobierania 

bardzo małych ilości ropy lub z miejsc wymagających zachowania ostrożności, 

np. z oka. Gdy dostarczone zostaną fragmenty tkanek ze ścian ropnia, technik 

laboratoryjny powinien zmiażdżyć tkankę, używając jako rozpuszczalnika niewielkiej 

ilość sterylnego bulionu lub rozdrobnić tkankę na bardzo małe kawałki 

używając sterylnych nożyczek. Należy przygotować hodowle tlenowe i beztlenowe 

w sposób opisany na str. 107. 

103


Zakażone skaleczenia, rany dra˛ża˛ce, 

rany pooperacyjne, oparzenia 

i owrzodzenia odleżynowe 

Nie można sformułować standardowej procedury pobierania próbek. Należy 

jednak przestrzegać pewnych podstawowych zasad otrzymywania możliwie 

najlepszych próbek do badań laboratoryjnych. Po starannym oczyszczeniu 

miejsca chirurg powinien odnaleźć zbiornik ropy, martwicze tkanki, rozpoznać 

obecność gazu (trzeszczenie) lub inne nieprawidłowe objawy. Fragmenty zajętych 

tkanek, które zostaną użyte do hodowli, powinny zostać pobrane na sterylną 

gazę. Ropę lub inny wysięk należy pobrać starannie i umieścić w sterylnej 

probówce. W razie potrzeby można użyć wymazówek. 

Kanały przetoki lub rany drenuja˛ce 

węzłów chłonnych 

Jeśli przetoki lub węzły chłonne wykazują objawy samoistnego drenowania, 

należy, używając sterylnej pipety Pasteura wyposażonej w gumowy balonik, 

starannie pobrać materiał i umieścić go w sterylnej probówce. Jeśli wydzielina nie 

jest widoczna, chirurg powinien pobrać ropny materiał za pomocą strzykawki 

iigły. Wymazówki należy stosować tylko wtedy, gdy nie są dostępne pipety 

Pasteura. 

Wysięki 

Nieprawidłowe zbieranie się płynu w jamie ciała, takiej jak jama opłucnej, staw 

lub przestrzeń otrzewnowa, wymaga interwencji chirurgicznej z aspiracją 

nagromadzonego materiału do sterylnego pojemnika, a następnie dostarczenia go 

do laboratorium w celu wykonania badania mikrobiologicznego i cytologicznego. 

W przypadku ciągłego gromadzenia się ropy należy założyć otwarty dren, 

konieczny do aseptycznego pobrania płynu, w celu wykonania posiewu i innych 

badań. 


Próbki ropy lub wydzieliny z rany pobrane na wymazówki są trudne do oceny 

makroskopowej, szczególnie gdy zostały zanurzone w podłożu transportowym. 

Kolor, konsystencja i zapach próbek ropy, otrzymanych w strzykawce lub 

w sterylnym pojemniku, powinny być oceniane uważnie przez doświadczonego 

mikrobiologa. 

Kolor 

Ropa może mieć kolor od zielonożółtego do brązowoczerwonego. Czerwony 

kolor spowodowany jest domieszką krwi lub hemoglobiny. Aspirat z pierwotnego 

ropnia wątroby wywołanego pełzakiem ma galaretowatą konsystencję i barwę od 

żółtobrązowej do ciemnobrązowej. Ropa z ran pooperacyjnych lub urazowych 

104

CZE˛ŚĆ I 

(oparzeń) może mieć zabarwienie niebieskozielone z powodu obecności piocyjaniny, 

wytwarzanej przez Pseudomonas aeruginosa. 

Konsystencja 

Konsystencja może być różna: od mętnego do bardzo gęstego i lepkiego 

płynu. Wysięki aspirowane ze stawów, jamy opłucnej lub worka osierdziowego 

są zwykle płynne, z możliwą gradacją od surowiczego wysięku do typowej 

ropy. 

Ropa organizująca się w drenowanym kanale przetoki na szyi powinna zostać 

zbadana w kierunku obecności małych żółtych ziaren ,,siarkowych’’, które są 

skupiskami promieniowców Actinomyces israelii. Obecność siarkowych ziaren 

wskazuje na promienicę szyjno-twarzową. Małe różnokolorowe ziarenka (białe, 

czarne, czerwone lub brązowe) są typowe dla mycetoma, ziarniniakowych guzów, 

które zwykle są zlokalizowane na kończynach dolnych (np. stopa madurska) 

i charakteryzują się licznymi ropniami i przetokami. Kolorowe ziarenka odpowiadają 

zarówno nitkowatym bakteriom, jak i grzybni. 

Ropa z gruźliczych ,,ropni zimnych’’ (ze skąpymi objawami zapalenia) porównywana 

jest z miękkim serem i nazywana ,,serowaciejącą’’ lub ,,serowatą ropą’’. 

Zapach 

Nieprzyjemny zapach jest jedną z cech charakterystycznych dla beztlenowych lub 

mieszanych tlenowo-beztlenowych zakażeń, ale w pewnych okolicznościach 

może nie występować. Wstępna ocena na podstawie zapachu i morfologii 

komórek w preparacie barwionym metodą Grama powinna być niezwłocznie 

przedstawiona klinicyście w celu ułatwienia empirycznego wyboru właściwego 

antybiotyku. Jest ona także pomocna w podjęciu decyzji o konieczności hodowli 

beztlenowej. 


Z każdej próbki należy wykonać i obejrzeć preparat barwiony metodą Grama. 

W niektórych przypadkach lub na polecenie lekarza należy przygotować preparat 

bezpośredni barwiony metodą Ziehl-Neelsena. 

Barwienie preparatów metoda˛ Grama 

Za pomocą ezy nanieść na czyste szkiełko podstawowe najbardziej ropną część 

próbki. Jeśli dostępny jest tylko wymaz, szkiełko należy najpierw wysterylizować 

w ogniu nad palnikiem Bunsena i pozostawić do wystygnięcia. Bawełnianą 

wymazówkę należy delikatnie przetoczyć po powierzchni szkiełka, bez pocierania 

lub nadmiernego wyciskania. Pozostawić szkiełko do wyschnięcia na 

powietrzu lub umieścić w cieplarce. Utrwalić przez ogrzanie, wybarwić i oglądać 

preparat w immersji (obiektyw × 100). Poszukiwać starannie i odnotować 

obecność i liczbę (używając znaków +): 

– wielojądrzastych granulocytów (komórki ropy); 

105


– Gram-dodatnich ziarenkowców ułożonych w skupiska, sugerujących gronkowce; 

– Gram-dodatnich ziarenkowców włańcuchach, sugerujących paciorkowce lub 

enterokoki; 

– Gram-ujemnych pałeczek podobnych do pałeczki okrężnicy (Escherichia coli, 

Klebsiella etc.), innych Enterobacteriaceae (Proteus, Serratia etc.), niefermentujących 

pałeczek (Pseudomonas spp.) lub bezwzględnych beztlenowców 

(Bacteroides spp.); 

– dużych prostych Gram-dodatnich pałeczek z kwadratowymi biegunami, sugerujących 

Clostridium perfringens, główną przyczynę zgorzeli gazowej lub 

Bacillus anthracis, przyczynę wąglika; 

– gęstej i wielokształtnej mieszaniny bakterii, zawierającej paciorkowce, Gram- 

-dodatnie i Gram-ujemne pałeczki o różnym kształcie, również wrzecionowce; 

taki obraz sugeruje ,,mieszaną florę beztlenową’’, którą tak należy opisać; 

– Candida lub innych komórek grzybów, które widoczne są jako owalne, Gram- 

-dodatnie, pączkujące komórki, często tworzące rozgałęzione pseudogrzybnie. 

Ziarenka siarki z promienicy (aktynomykozy) i ziarenka grzybni należy rozdrobnić, 

wybarwić metodą Grama i poszukiwać Gram-dodatnich cienkich rozgałęzień 

i fragmentów nici. 


Zgodnie z zaleceniem lub gdy prawdopodobne jest grzybicze lub pasożytnicze 

zakażenie, należy przygotować niebarwiony preparat. Jeśli ropa jest gęsta, oczko 

ezy zmieszać z fizjologicznym roztworem soli. Podczas badania w kierunku 

grzybów do rozjaśnienia próbki użyć kropli 10% wodorotlenku potasu. Nałożyć 

szkiełko nakrywkowe i w powiększeniu obiektywu × 10 – × 40 poszukiwać 

zwłaszcza: 

– aktywnie ruchomych pełzaków w aspiracie z ropnia wątroby; 

– komórek grzybów drożdżopodobnych Histoplasma capsulatum (łącznie z afrykańską 

odmianą var. duboisii), Blastomyces dermatitidis (w regionach 

endemicznych), Candida spp.; 

– grzybni i filamentacyjnych form bakterii w rozdrobnionych ziarenkach ze 

zmian w stopie madurskiej; 

– pasożytów, takich jak mikrofilarie, skoleksów i haczyków Echinococcus, jaj 

Schistosoma, Fasciola lub Paragonimus. 

Barwienie kwasooporne (Ziehl-Neelsena) 

Barwienie Ziehl-Neelsena powinno być wykonywane na zlecenie lekarza. 

Przygotowanie barwionego w ten sposób preparatu zaleca się także, gdy w ropie 

nie są widoczne bakterie lub gdy w barwieniu metodą Grama obserwuje się 

,,maczugowcowe’’,słabo Gram-dodatnie pałeczki. Obecność prątków gruźlicy 

należy podejrzewać zwłaszcza w ropnym wysięku z jamy opłucnej, stawów, ropni 

kości lub węzłów chłonnych. Niegruźlicze (tak zwane atypowe) kwasooporne 

prątki znajdowane są także w ropniach pośladków, w miejscu głębokiej iniekcji 

domięśniowej. Takie ropnie wywołane są często przez szybko rosnące prątki 

należące do grupy Mycobacterium fortuitum-chelonei. W tropikach wydzielina 

zeskrobana z podstawy martwiczego owrzodzenia skóry zlokalizowanego na 

nodze lub ramieniu może wykazywać obecność wolno rosnących prątków 

106

CZE˛ŚĆ I 

kwasoopornych M. ulcerans (owrzodzenie Buruli). M. marinum jest innym 

gruźliczopodobnym prątkiem, który może być izolowany z przewlekłych, 

wrzodziejących zmian guzkowych na rękach, ramionach i innych eksponowanych 

powierzchniach skóry u pływaków i rybaków. 

Hodowla 

Jeśli w badaniu mikroskopowym widoczne są bakterie lub grzyby, materiał należy 

posiać na odpowiednie podłoża. Niezależnie od wyników badania mikroskopowego, 

wszystkie próbki ropy lub wysięków powinny być posiewane na co 

najmniej trzy podłoża hodowlane: 

– agar z krwią do izolacji gronkowców i paciorkowców; 

– agar MacConkeya do izolacji Gram-ujemnych pałeczek; 

– podłoże płynne, które może posłużyć jako podłoże wzbogacone zarówno dla 

tlenowców, jak i beztlenowców, np. podłoże tioglikolanowe lub bulion 

z wyciągiem mięsnym. 

Objętość inoculum powinna być uzależniona od wyniku badania mikroskopowego 

i waha się od jednego oczka ezy do kilku kropel. Jeśli w barwieniu metodą Grama 

widoczne są liczne mikroorganizmy, próbka powinna przed posianiem zostać 

rozcieńczona w małej ilości sterylnego podłoża płynnego. Jeśli do posiewu 

używana jest wymazówka, materiał należy nanieść na niewielki obszar płytki, 

a następnie rozsiać ezą na pozostałej powierzchni. Jeśli wymazówka jest sucha 

należy jąnajpierw zwilżyć małą ilością sterylnego bulionu lub fizjologicznego 

roztworu soli. W każdym przypadku technika posiewu powinna umożliwić 

uzyskanie pojedynczych kolonii do identyfikacji i antybiogramu. 

Przed posiewem płytkę zawierającą agar z krwią należy suszyć w cieplarce przez 

20 minut, minimalizując w ten sposób ryzyko przerośnięcia przez rozprzestrzeniający 

się Proteus spp. Posiane płytki powinny być inkubowane w 35°C 

w eksykatorze. Rutynowo podłoża należy inkubować dwa dni i obserwować 

codziennie wzrost. Jeśli prowadzona jest hodowla mikroorganizmów o wysokich 

wymaganiach odżywczych, konieczna będzie dłuższa inkubacja (1 – 2 tygodnie 

lub więcej). Jeśli wzrost pojawia się na podłożu płynnym, należy wykonać 

preparat barwiony metodą Grama i hodowle przesiać na odpowiednie podłoża. Na 

zlecenie lub jeśli na taką konieczność wskazuje wynik badania mikroskopowego, 

można zastosować specjalne dodatkowe podłoża hodowlane: 

• Jeśli uwidoczniono gronkowce, pomocny w uzyskaniu czystego wzrostu 

i wstępnego rozróżnienia między S. aureus i innymi ziarenkowcami jest agar 

z mannitolem. 

• Jeśli zaobserwowano paciorkowce, ich identyfikacja może być przyspieszona 

przez umieszczenie na linii pierwszego posiewu różnicującego krążka z bacytracyną. 

• Jeśli zaobserwowano drożdże lub grzyby, próbka powinna być także wsiana do 

dwóch probówek z agarem Sabouraud, jedna do inkubacji w 35°C, druga 

w temperaturze pokojowej, obydwie obserwowane przez miesiąc (do izolacji 

Candida spp. wystarczy agar z krwią). 

• Jeśli w preparacie barwionym metodą Ziehl-Neelsena uwidoczniono kwasooporne 

prątki, materiał należy posiać do 3 probówek z podłożem Löwensteina- 

-Jensena. Próbkę zawierającą również niekwasooporne prątki przed posiewem 

należy dekontaminować. Szybko rosnące bakterie, takie jak M. fortuitum, 

mogą ginąć w procesie dekontaminacji; wyrastają one na agarze z krwią 

i agarze MacConkeya w ciągu 3 – 7 dni. Rozgałęzione, nitkowate, częściowo 

107


kwasooporne pałeczki w ropie z jamy opłucnej lub z ropnia mózgu, które 

wyrastają na agarze z krwią w ciągu kilku dni, to prawdopodobnie Nocardia 

asteroides. 

• Ropa od pacjentów z zapaleniem stawów, zapaleniem opłucnej, zapaleniem kości 

lub tkanki podskórnej, zwłaszcza od dzieci do 5 roku życia, powinna być także 

posiana na płytkę z agarem czekoladowym w celu wykrycia H. influenzae. 

• Hodowla w ściśle beztlenowych warunkach jest istotna, gdy w preparacie 

barwionym metodą Grama obecna jest mieszana flora beztlenowa lub gdy 

próbka charakteryzuje się typowym zgniłym zapachem. Hodowla na agarze 

z krwią w warunkach beztlenowych jest konieczna do uzyskania wzrostu 

Actinomyces. Posiew w kierunku beztlenowców prowadzony jest również na 

zlecenie klinicysty, który podejrzewa zgorzel gazową. Metody diagnostyki 

w zakażeniach bakteriami beztlenowymi opisano na str. 113 – 118. 

Identyfikacja 

Z wyjątkiem zanieczyszczeń ze środowiska lub ze skóry (takich jak Staphylococcus 

epidermidis) wszystkie drobnoustroje izolowane z ran, ropy lub wysięków 

powinny być traktowane jako znaczące i należy je zidentyfikować. Pełna 

identyfikacja nie zawsze jest konieczna, zwłaszcza w przypadku flory mieszanej. 

Bakterie i grzyby izolowane z ropy i wysięków mogą należeć do prawie każdej 

grupy lub gatunku. Zostaną tu podane tylko zasady identyfikacji gronkowców, 

często związanych z procesami ropnymi (ropotwórczych) i dwóch innych 

patogenów, Pasteurella multocida i Bacillus anthracis, rzadko izolowanych z ran 

lub zakażeń skóry, ale bardzo istotnych ze względu na sposób postępowania 

z pacjentem. W standardowych podręcznikach mikrobiologii klinicznej można 

znaleźć pełny opis metod identyfikacji. W każdym przypadku pierwszym etapem 

powinno być uważne badanie dobrze odgraniczonych kolonii, pobranie pojedynczej 

kolonii każdego typu, przygotowanie preparatu barwionego metodą Grama 

i obserwacja mikroorganizmów pod mikroskopem. 

Gronkowce 

Gronkowce są bakteriami najczęściej związanymi z wytwarzaniem ropy. Rosną 

dobrze w warunkach tlenowych na agarze z krwią ipocałonocnej inkubacji 

wytwarzają nieprzezroczyste białe lub kremowe kolonie o średnicy 1 – 2 mm. Jako 

jedyne rosną na podłożu z dużym stężeniem soli, takim jak MSA. Mogą być 

różnicowane z paciorkowcami na podstawie morfologii i zdolności wytwarzania 

katalazy. Wytwarzanie katalazy można wykazać przez dodanie kropli 3% 

nadtlenku wodoru do kolonii umieszczonych na czystym szkiełku. Pojawienie się 

pęcherzyków tlenu jest wskaźnikiem produkcji katalazy. 

Dla potrzeb klinicznych gronkowce można podzielić na takie, które wytwarzają 

koagulazę, i takie, które jej nie wytwarzają. Koagulazododatnie gronkowce należą 

do S. aureus, gatunku o największym znaczeniu klinicznym. Spośród wielu 

koagulazoujemnych szczepów zostaną tu omówione tylko dwa — S. epidermidis 

i S. saprophyticus. 

Mimo że S. aureus należy do komensalnej flory mikrobiologicznej nosa (40% 

zdrowych dorosłych to nosiciele), skóry i przewodu pokarmowego, szczepy tego 

108

CZE˛ŚĆ I 

gatunku są odpowiedzialne za liszajec, czyraki, ropnie, zakażenia ran, zakażenia 

owrzodzeń i oparzeń, zapalenie szpiku, zapalenie gruczołu sutkowego (ropień 

piersi), ropniak opłucnej, ropne zapalenie mięśnia, zespół szoku toksycznego 

i inne typy ropnych zakażeń. 

S. epidermidis jest również częstym komensalem skóry, nosa i innych błon 

śluzowych, wykazuje niską chorobotwórczość. Jednakże jego obecność w ropie 

nie zawsze powinna być lekceważona i uznawana za zanieczyszczenie ze skóry. 

Mimo niskiej infekcyjności S. epidermidis może wywoływać zakażenia skórne 

w miejscu wprowadzenia cewnika założonego na stałe, wenflonu lub innych ciał 

obcych. Zakażenia S. epidermidis, uciążliwe zwłaszcza w kardiochirurgii i w chirurgii 

ortopedycznej, związane są z wszczepianiem protez (sztuczne zastawki 

serca lub protezy bioder). 

S. saprophyticus jest częstą przyczyną zakażeń dróg moczowych u młodych 

kobiet, zajmując w niektórych populacjach drugą pozycję po E. coli. 

Cechy różnicujące trzy główne gatunki Staphylococcus podane są w tabeli 22. 

Schemat wstępnej identyfikacji gronkowców przedstawiono na rycinie 10. 

Gram-dodatnie ziarenkowce 

w nieregularnych skupiskach 

nie wykazuja˛ce ruchu, nie tworza˛ce spor, 

tlenowe lub względnie beztlenowe, 

katalazododatnie, zwykle oksydazoujemne, 

fermentuja˛ce cukry 

▼ 

Koagulaza 

+ – 

Staphylococcus 

aureus 

Kwas 

▼ 

Agar z trehaloza˛, 

mannitolem 

i fosfataza˛ 

▼ 

Fosfataza 

alkaliczna 

+ – 


schleiferi 

▼ 

Oporne na 

nowobiocynę 

Bez kwasu 


epidermidis 

+ – 


saprophyticus 

▼ 

Dekarboksylaza 

ornityny 

– + 

Ureaza 

– + 

Hemoliza 

– + 

▼ 


warneri/hominis 

▼ 


lugdunensis 


koagulazoujemne 


haemolyticus 

Ryc. 10. Schemat wstępnej identyfikacji gatunku Staphylococcus. 

109


Tabela 22. Różnicowanie klinicznie ważnych szczepów Staphylococcus 

S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus 

Wytwarzanie koagulazy Tak Nie Nie 

Rozkład mannitolu Kwaśny (żółty) Obojętny (czerwony) 

Kwaśny (żółty) 

Pigmentacja kolonii a Szare, kremowe Białe 

Białe 

lub żółte 

Wrażliwość in vitro na nowobiocynę 

Wrażliwy Wrażliwy Oporny b 

Agar z DNaza˛ Tak Nie Nie 

a 

Występuja˛ wyja˛tki. 

b 

Strefa zahamowania mniejsza niż 16 mm, w standaryzowanym teście dyfuzyjno-kra˛żkowym 

z 5-mikrogramowym kra˛żkiem. 

Ze względu na znaczenie testu koagulazowego w identyfikacji S. aureus, został on 

tutaj szczegółowo opisany. Koagulaza jest enzymem powodującym krzepnięcie 

osocza krwi. Gronkowcowa koagulaza występuje w dwóch formach: związanej 

koagulazy lub inaczej czynnika aglutynującego (clumping factor), który wykrywany 

jest w teście szkiełkowym, oraz wolnej koagulazy, wykrywanej w teście 

probówkowym. 

• Test szkiełkowy. Na czystym szkiełku utworzyć zawiesinę z jednej lub kilku 

kolonii gronkowców i kropli fizjologicznego roztworu soli. Zawiesina powinna 

być dość gęsta. Zanurzyć czystą ezę w osoczu i użyć jej do wymieszania osocza 

z zawiesiną bakterii. Obserwować tworzenie się kłaczków przez 10 sekund. 

Fałszywie ujemne wyniki testu szkiełkowego pojawiają się w przypadku około 

10% szczepów S. aureus. Jeśli test szkiełkowy jest ujemny dla izolatu, który 

wydaje się patogenny na innej podstawie (pigment, informacje kliniczne), 

należy zbadać szczep w teście probówkowym. 

• Test probówkowy. Umieścić kilka kropel (0,5 ml) osocza w sterylnej probówce 

12 × 75 mm i dodać dwie krople czystej hodowli w bulionie. Zawiesinę 

o porównywalnej gęstości można także przygotować bezpośrednio z kolonii 

pobranych z agaru z krwią. Inkubować probówki w 35°C przez 4 – 18 godzin, 

a następnie obserwować obecność skrzepu. 

Osocze używane w teście koagulazowym może być świeżym ludzkim lub 

króliczym osoczem z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Powinno 

być przechowywane w niewielkich porcjach (1 ml) w chłodziarce, a jego przydatność 

należy kontrolować równolegle z hodowlami S. aureus i S. epidermidis. 

Pasteurella multocida 

Pasteurella multocida to Gram-ujemne pałeczki najczęściej odpowiedzialne za 

ciężkie zakażenia u ludzi, występujące po ugryzieniach przez zwierzęta. Bakteria 

ta jest komensalem wchodzącym w skład normalnej flory jamy ustnej wielu 

zwierząt. Rany po ugryzieniach zakażone P. multocida mogą dawać objawy 

rozległego zapalenia tkanki podskórnej, które może przebiegać z zajęciem 

stawów. Opisywano także zapalenia szpiku, bakteriemie, a nawet zapalenia opon 

mózgowo-rdzeniowych. 

P. multocida powinna być poszukiwana zwłaszcza w wydzielinie z ran powstałych 

po ugryzieniu przez zwierzę. Jest bardzo małą, Gram-ujemną, nieruchliwą 

ziarenko-pałeczką. Rośnie dobrze na agarze z krwią w35°C, ale wzrost ulega 

całkowitemu zahamowaniu w obecności soli żółciowych, zawartych w podłożach 

110

CZE˛ŚĆ I 

selektywnych do hodowli bakterii jelitowych, np. agar MacConkeya. Po całonocnej 

inkubacji kolonie na agarze z krwią są małe, niehemolizujące, półprzezroczyste 

i śluzowe (dzięki obecności otoczki w formie wirulentnej). 

Biochemiczna identyfikacja oparta jest na następujących cechach: 

– fermentacja glukozy bez gazu; P. multocida rośnie na agarze Kliglera 

z zakwaszeniem słupka; 

– test oksydazowy jest słabo dodatni; 

– test na wytwarzanie katalazy dodatni; 

– redukcja azotanu do azotynu (0,1% azotan potasu w bulionie odżywczym); 

– test na wytwarzanie ureazy ujemny; 

– wytwarzanie indolu — test w bulionie tryptozowo-sojowym (TSB) lub MIU po 

48 godzinach inkubacji; 

– wysoka wrażliwość na benzylopenicylinę w krążkowym teście wrażliwości. 

Bacillus anthracis 

Do rodzaju Bacillus należą liczne gatunki tlenowych, tworzących spory, Gram- 

-dodatnich laseczek, powszechnie występujących w glebie. Gatunek B. anthracis 

wywołuje ważne dla zdrowia publicznego zakażenia skóry. Inne gatunki 

izolowane z ran lub ropy są zwykle zanieczyszczeniem lub w większości 

mikroorganizmami oportunistycznymi. 

B. anthracis jest znaczącym patogenem bydła, owiec, kóz i innych domowych 

zwierząt. Zakażenie występuje także u dzikich zwierząt. Wąglik może zakażać 

człowieka, a przypadki infekcji występują zwłaszcza w Afryce i Azji u osób 

pracujących i żyjących w bliskim kontakcie z żywym inwentarzem. Do zakażenia 

ludzi może dojść również przez produkty odzwierzęce, zawierające spory 

wąglika, takie jak: wełna, skóry, futro i kości. 

Najczęstszą postacią zakażenia ludzi jest wąglik skórny, z którego może rozwinąć 

się sepsa i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Spory przechodzą przez 

uszkodzoną skórę i wytwarzają zmianę pęcherzykową z martwiczym centrum, 

otoczoną przez rozległy obrzęk (,,czarna krosta’’). W preparatach sporządzonych 

zpłynu pęcherzykowego widoczne są duże Gram-dodatnie, kwadratowo zakończone, 

otoczkowe pałeczki bez spor. 

B. anthracis rośnie w warunkach tlenowych. Na agarze z krwią wytwarza duże, 

płaskie, szarawe kolonie, do 5 mm średnicy, o nieregularnych brzegach i szorstkiej, 

przypominającej kłębowisko nici strukturze powierzchni (głowa Meduzy). 

Na tym etapie ważne jest różnicowanie wysoce patogennych B. anthracis od 

ogólnie niechorobotwórczych gatunków saprofitycznych. 

Wstępne różnicowanie powinno być oparte na takich cechach, jak: brak hemolizy, 

wrażliwość na benzylopenicylinę oraz brak ruchu u B. anthracis. Saprofityczne 

gatunki Bacillus wykazują ruch i są silnie hemolityczne. Powyższe 

trzy cechy mogą stanowić podstawę wstępnej identyfikacji. W celu przeprowadzenia 

ostatecznej identyfikacji czyste hodowle izolatów należy przesłać 

niezwłocznie do centralnego laboratorium weterynaryjnego lub innego referencyjnego 

ośrodka. 

B. anthracis jest wysoce zakaźnym drobnoustrojem, z tego względu próbki 

i hodowle powinny być przesyłane ze szczególnym zachowaniem zasad ostrożności, 

aby uniknąć skażenia środowiska i zakażeń personelu laboratoryjnego. 

111



Zastosowanie antybiotyków w leczeniu pacjentów z ranami, ropniami lub 

wysiękami nie zawsze jest konieczne. Odpowiednie chirurgiczne nacięcie, drenaż 

i opracowanie rany są najczęściej ważniejsze niż antybiotykoterapia. 

Wynik antybiogramu powinien być dostępny w ciągu 48 godzin od otrzymania 

próbki. 

Rutynowo badanie lekowrażliwości nie powinno być wykonywane dla bakterii 

o znanej wrażliwości, takich jak paciorkowce, Pasteurella i Actinomyces, które 

w większości są wrażliwe na benzylopenicyliny. 

W przypadku Enterobacteriaceae, niefermentujących Gram-ujemnych pałeczek 

i gronkowców, lekowrażliwość należy określić z zastosowaniem testu dyfuzyjno- 

-krążkowego dla aktualnie zalecanych antybiotyków. Wrażliwość na nowe 

i drogie antybiotyki powinna być oznaczana (lub raportowana) tylko na specjalne 

zlecenie lub gdy szczep wykazuje oporność na inne leki przeciwbakteryjne. 

Problem stanowi lekooporność, zarówno S. aureus, jak i S. epidermidis. Ponad 

80% szczepów, także pozaszpitalnych, wytwarza β-laktamazy i wykazuje 

oporność na benzylopenicylinę i ampicylinę. Zakażenia wywołane przez szczepy 

oporne na benzylopenicylinę są często leczone stabilnymi wobec β-laktamaz 

penicylinami z grupy metycyliny (oksacylina, kloksacylina itp.). W antybiogramie 

zalecane jest użycie krążka z oksacyliną (1 µg). Krążki z oksacyliną są 

stabilne i skutecznie wykrywają oporność na całą grupę (szczepy oporne na 

wszystkie antybiotyki β-laktamowe określane są jako oksacylino- lub metycylinooporne, 

tzw. MR — przyp. tłum.). Oporność ma często charakter heterogenny, np. 

obejmuje tylko część populacji bakterii. Niejednorodna oporność gronkowców 

jest łatwiej identyfikowana w niskich temperaturach, z tego powodu temperatura 

inkubacji nie powinna przekraczać 35°C. Szczepy o heterogennej oporności 

w strefie zahamowania wzrostu wokół krążka, wykazują mgławicowy wzrost lub 

tworzą liczne drobne kolonie, które często bywają traktowane jako zanieczyszczenie. 

Jeśli pojawia się taki wzrost, konieczne jest przygotowanie preparatu 

barwionego metodą Grama w celu wykluczenia zanieczyszczenia. 

Heterooporne szczepy są klinicznie oporne na wszystkie antybiotyki β-laktamowe, 

w tym penicyliny, cefalosporyny i karbapenemy. Z tego powodu dla 

gronkowców nie należy oznaczać wrażliwości na cefalosporyny. Istnieje także 

pełna krzyżowa oporność między benzylopenicyliną i ampicyliną. Nie należy 

więc określać wrażliwości gronkowców na ampicylinę. 

112

Zakażenia bakteriami beztlenowymi 

Wprowadzenie 

W niniejszym opracowaniu opisane są bakterie beztlenowe i najczęściej wywoływane 

przez nie infekcje. Zakażenia beztlenowcami mogą dotyczyć praktycznie 

każdej tkanki i mogą być zlokalizowane w każdym miejscu, jeśli zaistnieją 

odpowiednie warunki. 

Większość zakażeń bakteriami beztlenowymi wywołana jest przez endogenne 

szczepy, które w stanie zdrowia wchodzą w skład normalnej flory ciała, 

wywołując infekcje w przypadku zakłócenia równowagi w ilościowym składzie 

flory fizjologicznej lub w wyniku przemieszczenia się bakterii do innego 

regionu anatomicznego. Egzogenne bakterie beztlenowe, najczęściej Clostridium 

tetani, C. botulinum, rzadziej C. perfringens oraz inne gatunki laseczek, 

mogą zakażać rany i są przyczyną odpowiednio tężca, botulizmu 

przyrannego lub zgorzeli gazowej. Ropień, który może być zlokalizowany 

praktycznie w każdym narządzie, bakteriemia, zapalenie jamy otrzewnej, ropniak 

opłucnej, zapalenie tkanki podskórnej i zapalenie wyrostka robaczkowego to 

tylko kilka przykładów chorób, w których bardzo ważną rolę odgrywają bakterie 

beztlenowe. W związku z powyższym, ważne jest, aby mikrobiolog wiedział, 

kiedy i jak należy prowadzić hodowle w kierunku bakterii beztlenowych 

z określonej próbki klinicznej. 

Podział bakterii ze względu na wymagania 

tlenowe 

Być może zbyt uproszczony, lecz dobrze funkcjonujący podział bakterii o znaczeniu 

klinicznym oparty jest na wymaganiach tlenowych i wyróżnia: 

• Bezwzględnie tlenowe bakterie wymagające do uzyskania energii tlenu gazowego; 

nie rosną przy braku tlenu. Przykładami bezwzględnych tlenowców są: 

Micrococcus spp. i Nocardia asteroides. 

• Bezwzględnie beztlenowe bakterie prowadzące przemiany metaboliczne 

bez udziału tlenu, który dla wielu z nich jest toksyczny. Energię uzyskują 

w reakcjach fermentacji, z wytworzeniem cuchnących produktów 

końcowych. Przykładami mikroorganizmów należących do tej grupy są 

takie bakterie beztlenowe, jak Bacteroides fragilis i Peptostreptococcus 

magnus. 

• Względnie beztlenowe bakterie, które do wzrostu i wytwarzania energii nie 

wymagają bezwzględnie tlenu; mogą zarówno wykorzystywać tlen, jak i rosnąć 

w warunkach beztlenowych. Są najbardziej rozpowszechnione, zwykle adaptują 

się do środowiska, uzyskując energię potrzebną do wzrostu i namnażania 

najbardziej efektywnym sposobem. Przykładami względnie beztlenowych 

bakterii są E. coli i S. aureus. 

Oprócz wyżej wymienionych istnieją bakterie mikroaerofilne, które najlepiej 

rosną w atmosferze z obniżonym stężeniem tlenu. Przykładem bakterii mikroaerofilnej 

jest Campylobacter jejuni. 

113

ZAKAŻENIA BAKTERIAMI BEZTLENOWYMI 

Diagnostyka zakażeń bakteriami 

beztlenowymi 

Za blisko 80% diagnozowanych zakażeń beztlenowych odpowiedzialne są cztery 

największe grupy beztlenowców. Należą do nich: Bacteroides, Prevotella 

i Porphyromonas spp., Peptostreptococcus spp. oraz Clostridium spp. Najczęściej 

spotykane gatunki z każdego rodzaju to: Bacteroides fragilis, Peptostreptococcus 

magnus i Clostridium perfringens. Specyficzne metody izolacji i identyfikacji 

tych trzech rodzajów i gatunków powinny służyć jako model izolacji i wstępnej 

identyfikacji innych klinicznie ważnych bakterii beztlenowych. 

Pobieranie próbek i transport do laboratorium 

Procedury pobierania materiału zostały opisane we wcześniejszych rozdziałach. 

Ponieważ beztlenowce są bardzo wrażliwe na tlen atmosferyczny i wysychanie, 

przy pobieraniu próbek należy unikać stosowania zwykłych wymazówek. Próbki 

do hodowli beztlenowców należy uważnie pobierać z miejsca aktywnej infekcji. 

W niektórych przypadkach może być konieczna pomoc chirurga. Dotyczy to 

szczególnie aspiracji ropy, pobierania tkanek i/lub próbek ropy z zakażonych ran, 

ropniaków lub drążących ropni. 

Próbkę należy umieścić w sterylnym, szczelnie zamkniętym pojemniku lub, jeśli 

to niemożliwe, niezwłocznie przesłać do laboratorium cały zaaspirowany materiał 

w strzykawce, z igłą osłoniętą zatyczką lub gumowym korkiem. 

Przygotowanie warunków beztlenowych 

do inkubacji hodowli 

Istnieją różne metody wytwarzania środowiska beztlenowego. Jedną z nich, prostą 

i niedrogą, jest użycie anaerostatu z cienkiego szkła lub poliwęglanu o objętości 

2,5 – 3,5 litrów, wyposażonego w nieprzepuszczającą powietrza pokrywę, którą 

można łatwo usunąć czy wymienić. Powłożeniu płytek Petriego w anaerostacie 

należy umieścić komercyjnie dostępne, jednorazowe saszetki wytwarzające 

beztlenową atmosferę i zamknąć pokrywę. Jednorazowe saszetki wytwarzające 

warunki beztlenowe mają formę płaskich, zapieczętowanych kopert, które po 

dodaniu wody (lub bez — przyp. tłum.) uwalniają wodór i dwutlenek węgla. 

Opisane zestawy wymagają katalizatora palladowego przytwierdzonego do spodu 

pokrywy słoja. Podczas używania katalizator ulega inaktywacji i wymaga 

wymiany w regularnych, zalecanych przez producenta odstępach czasu. Jednorazowe 

paski wskaźnikowe redox, które w warunkach beztlenowych zmieniają 

kolor z niebieskiego (lub czerwonego) na bezbarwny, są szeroko dostępne 

komercyjnie. 

Probówki z płynnym podłożem do hodowli bakterii beztlenowych, takim jak 

podłoże tioglikolanowe lub bulion z wyciągiem mięsnym, nie muszą być 

inkubowane w beztlenowych warunkach, ponieważ wchodzące w ich skład 

substancje wytwarzają środowisko beztlenowe. Jeśli objętość podłoża jest 

wystarczająca (10 – 12 ml w probówce o standardowej średnicy 15 mm) i jest ono 

świeżo przygotowane, warunki beztlenowe uzyskuje się w dolnej części probówki. 

Nie zużyte w dniu przygotowania podłoża powinny być zregenerowane przez 

114

CZE˛ŚĆ I 

15-minutowe ogrzewanie w łaźni wodnej probówek z poluzowaną zakrętką, 

w celu wyeliminowania rozpuszczonego tlenu; po ogrzaniu należy dokręcić 

nakrętkę i pozostawić do wystygnięcia. 

Podłoża do hodowli bakterii beztlenowych 

Hodowle w kierunku bakterii beztlenowych powinny być prowadzone na zlecenie 

lekarza, jeśli próbka ma cuchnący zapach lub jeśli wyniki barwienia metodą 

Grama sugerują obecność beztlenowych mikroorganizmów, np.: obecność mieszanej, 

polimorficznej flory Gram-dodatnich oraz Gram-ujemnych pałeczek 

i ziarenkowców, obecność Gram-ujemnych wrzecionowców lub kwadratowo 

zakończonych cienkich Gram-dodatnich laseczek, które mogą wskazywać na 

Clostridium. 

Badań w kierunku bakterii beztlenowych rutynowo nie należy wykonywać 

w przypadku próbek moczu, wydzielin z narządów płciowych, kału lub odkrztuszonej 

plwociny. Obecność bakterii beztlenowych w tych próbkach wskazuje 

na zanieczyszczenie komensalną florą fizjologiczną, właściwą dla miejsca 

pochodzenia próbki. Klinicyści powinni zostać poinformowani, że próbki 

zawierające florę fizjologiczną nie nadają się do hodowli beztlenowych, z wyjątkiem 

ważnych wskazań klinicznych. 

Zwykły agar z krwią jest dobrym podłożem stałym do izolacji najważniejszych 

patogenów beztlenowych. Dla bardziej wymagających gatunków zalecany jest 

agar z krwią wzbogacony w czynniki wzrostu (hemina i menadion). Takie podłoża 

są komercyjnie dostępne jako agar beztlenowy Wilkins-Chalgrena. 

Bakterie beztlenowe często są częścią złożonej mikroflory zawierającej także 

drobnoustroje tlenowe, stąd należy przygotować selektywny agar do hodowli 

beztlenowców, dodając jeden lub więcej specyficznych czynników hamujących 

wzrost bakterii tlenowych. Na przykład dodanie aminoglikozydu (neomycyna, 

kanamycyna) w końcowym stężeniu 50 µg/ml hamuje wzrost większości 

tlenowych i względnie beztlenowych bakterii. Roztwór aminoglikozydu przygotowywany 

jest przez rozpuszczenie 500 mg w 100 ml wody destylowanej. Na 

100 ml podłoża agarowego do hodowli beztlenowców, po ostudzeniu do 56°C, 

należy dodać aseptycznie 5 ml odwłóknionej krwi i 1 ml roztworu antybiotyku. 

Dobrze wymieszać i rozlać po 15 – 18 ml do sterylnych płytek Petriego. Płytki 

powinny zostać jak najszybciej zużyte lub przechowywane w chłodziarce, 

najlepiej w plastikowym woreczku lub rękawie. 

Procedury posiewu i izolacji 

Przy podejrzeniu zakażenia bakteriami beztlenowymi próbki należy niezwłocznie 

posiać na jedno z poniższych podłoży: 

– agar do hodowli beztlenowców do inkubacji w anaerostacie; 

– agar do hodowli beztlenowców do inkubacji w eksykatorze; 

– agar MacConkeya; 

– podłoże płynne do hodowli beztlenowców (z tioglikolanem lub wyciągiem 

mięsnym). 

Hodowle w kierunku bakterii tlenowych należy zakładać zgodnie z obowiązującą 

procedurą, arównoległe posiewy tlenowe materiału przeglądać po 24 i 48 godzi- 

115


nach inkubacji. Na niewielką powierzchnię płytki z podłożem dla bakterii 

beztlenowych nałożyć badany materiał i rozsiać go za pomocą ezy. Płytki należy 

umieścić w anaerostacie i odczytać po 48 godzinach inkubacji. Jeśli wzrost nie jest 

wystarczający, konieczna jest dalsza inkubacja przez 24 – 48 godzin. Hodowle na 

podłożach płynnych należy zakładać posiewając dużą objętość materiału za 

pomocą pipety Pasteura, tak by rozprowadzić inoculum wcałym podłożu. 

Po 48 godzinach należy skontrolować wzrost na agarze z krwią do hodowli 

beztlenowców i porównać ze wzrostem obserwowanym na podłożach do hodowli 

tlenowych. Z każdego typu kolonii należy wykonać preparat barwiony metodą 

Grama. Obserwowane w preparacie bakterie o tej samej morfologii, które rosną 

zarówno na agarze tlenowym, jak i beztlenowym, to prawdopodobnie względne 

beztlenowce. Kolonie, które pojawiają się na agarze tylko w warunkach 

beztlenowych, to przypuszczalnie beztlenowce, które należy przesiać na dwa 

podłoża agarowe z krwią, jedno do inkubacji w anaerostacie, drugie w eksykatorze. 

Jeżeli wzrost pojawi się tylko na podłożu inkubowanym w anaerostacie, 

prowadzić identyfikację czystej kolonii w kierunku bakterii beztlenowych. 

Jeśli obserwuje się wzrost w głębokich warstwach podłoża płynnego do hodowli 

beztlenowców, konieczny jest posiew na podłoża agarowe dla bakterii tlenowych 

i beztlenowych, z którymi należy postępować podobnie, jak w przypadku 

pierwszego posiewu. Jeżeli do podłoża płynnego wsiano dużą objętość ropy, 

wynik hodowli może być dodatni, przy jednoczesnym ujemnym wyniku posiewu 

na podłożach stałych. 

Identyfikacja klinicznie ważnych beztlenowców 

Grupa Bacteroides fragilis 

Grupa obejmuje kilka spokrewnionych gatunków należących do fizjologicznej 

flory jelit i pochwy. Często są one odpowiedzialne za mieszane zakażenia 

w obrębie jamy brzusznej i miednicy, mogą również wywoływać bakteriemię. 

B. fragilis jest nieruchliwą Gram-ujemną pałeczką, często wykazującą polimorfizm, 

która rośnie szybko na agarze do hodowli beztlenowców. Po 48 godzinach 

pojawiają się średniej wielkości (do 3 mm średnicy), półprzezroczyste, szarobiałe, 

niehemolizujące kolonie. Szybkiej identyfikacji można dokonać na podstawie 

testu z żółcią. Czysta kolonia badanego drobnoustroju posiewana jest głęboko do 

dwóch probówek z płynnym podłożem tioglikolanowym, z których jedna zawiera 

20% (2 ml w 10 ml) sterylnej żółci wołowej. Po 24 godzinach należy porównać 

wzrost w obu probówkach: wzrost B. fragilis jest wyraźnie stymulowany 

w bulionie z dodatkiem żółci. 


Rodzaj Clostridium obejmuje wiele gatunków Gram-dodatnich, wytwarzających 

spory laseczek; niektóre z nich należą do normalnej flory przewodu pokarmowego, 

inne występują w kurzu i glebie. Gatunkiem o największym znaczeniu 

klinicznym jest C. perfringens. Bakteria ta związana jest ze zgorzelą gazową, 

możerównież wywoływać bakteriemię lub inne poważne infekcje. W przeciwieństwie 

do pozostałych gatunków C. perfringens nie wykazuje zdolności ruchu i nie 

wytwarza spor w zakażonych tkankach lub młodych hodowlach. 

116

CZE˛ŚĆ I 

C. perfringens rośnie szybko na płynnym podłożu do hodowli beztlenowców, 

wytwarzając duże ilości gazu. Na agarze beztlenowym po 48 godzinach 

obserwowane są średniej wielkości (2 – 3 mm) kolonie. Większość szczepów 

wytwarza podwójną strefę hemolizy: wewnętrzną strefę całkowitej hemolizy 

i zewnętrzną strefę hemolizy częściowej. 

Szybka identyfikacja jest możliwa na podstawie wyniku odwrotnego testu 

CAMP 1 , który przeprowadza się w poniżej opisany sposób (patrz ryc. 11) 2 : 

1. Przygotować płytkę z podłożem agarowym z dodatkiem 5% przepłukanej 

trisem krwi baraniej. 

2. Nałożyć czystą hodowlę Streptococcus agalactiae wzdłuż średnicy płytki. 

Posiać badaną hodowlę Clostridium prostopadle do linii posiewu S. agalactiae, 

nie dotykając jej. 

3. Inkubować w anaerostacie przez 24 godziny. 

C. perfringens tworzy w miejscu skrzyżowania posiewów strefę widocznej 

hemolizy, kształtem przypominającą strzałę. Laseczki ujemne w odwrotnym 

teście CAMP mogą zostać opisane jako ,,Clostridium spp. nie-C. perfringens’’. 

Ryc. 11. Odwrotny test CAMP. 

Peptostreptococcus 

Niektóre gatunki bezwzględnie beztlenowych Gram-dodatnich ziarenkowców 

należą do komensalnej flory układu oddechowego, pokarmowego i moczowo- 

-płciowego. Wywołują, zwykle wraz z innymi tlenowymi i beztlenowymi 

bakteriami, ropnie, zakażenia ran, a nawet bakteriemię. Wzrost beztlenowych 

1 

Odwrotny test CAMP: nazwa pochodzi od nazwisk Christy, Adkins i Munch-Peterson, którzy 

pierwsi opisali tę reakcję u paciorkowców grupy B. 

2 

Hansen M.V., Elliot L.P.: New presumptive identification test for Clostridium perfringens: reverse 

CAMP test. Journal of Clinical Microbiology, 1980, 12: 617 – 619. 

117


ziarenkowców na podłożach laboratoryjnych zwykle jest wolniejszy niż wzrost 

Bacteroides i Clostridium, a kolonie na agarze z krwią pojawiają się nie wcześniej 

niż po 48 godzinach inkubacji. 

W rutynowej diagnostyce zakażeń beztlenowcami identyfikacja gatunków nie jest 

konieczna. Gram-dodatnie ziarenkowce, które nie rosną w warunkach tlenowych, 

a na agarze z krwią dla bakterii beztlenowych wytwarzają niewielkie, wypukłe, 

białe kolonie, mogą być z dużym prawdopodobieństwem uznane za Peptostreptococcus 

spp. 

Badanie wrażliwości na antybiotyki 

Antybiogram dla bakterii beztlenowych nie powinien być wykonywany rutynowo, 

ze względu na brak wiarygodności metody dyfuzyjno-krążkowej. 

Większość zakażeń wywołana jest przez wrażliwe na penicylinę bakterie, 

z wyjątkiem infekcji wywodzących się z przewodu pokarmowego lub pochwy. 

W zakażeniach takich zazwyczaj obecne są Bacteroides fragilis, które wytwarzając 

β-laktamazy są oporne na penicyliny i większość cefalosporyn. Lekiem 

z wyboru w tych infekcjach jest klindamycyna, metronidazol lub chloramfenikol. 

Aminoglikozydy i chinolony nie wykazują aktywności wobec beztlenowców, lecz 

mogą być stosowane z powodu aktywności wobec bakterii tlenowych, które 

często występują w zakażeniach mieszanych. 

118

Oznaczanie wrażliwości 

na antybiotyki 

Wprowadzenie 

W Genewie podczas spotkania zorganizowanego w 1977 r. przez WHO 1 

wyrażono niepokój dotyczący obserwowanego na świecie narastania oporności na 

antybiotyki, związanej z często nieograniczonym wzrostem stosowania antybiotyków 

zarówno u ludzi, jak i zwierząt. W ostatnich latach lekooporne bakterie 

były przyczyną kilku poważnych epidemii zakażeń o dużej śmiertelności. 

Doprowadziło to do potrzeby wprowadzenia krajowych i międzynarodowych 

programów kontroli monitorujących antybiotykooporność bakterii na podstawie 

oceny lekowrażliwości z zastosowaniem wiarygodnych metod, które pozwoliłyby 

uzyskać porównywalne dane. Dostępność mikrobiologicznych i epidemiologicznych 

danych ułatwi klinicyście wybór możliwie najlepszego preparatu przeciwbakteryjnego 

w leczeniu zakażeń. 

Aby założenia te były skuteczne, należy odpowiednią, powtarzalną metodą 

przeprowadzić oznaczenia lekowrażliwości, której wyniki powinny mieć bezpośrednie 

zastosowanie kliniczne. Najwyższym kryterium wiarygodności każdej 

metody oznaczania wrażliwości jest korelacja wyniku z odpowiedzią pacjenta na 

leczenie przeciwbakteryjne. 

Na spotkaniu WHO ustalono, że ze względu na prostotę i powtarzalność, zarówno 

dla celów klinicznych, jak i w monitorowaniu, zalecana jest zmodyfikowana 

metoda dyfuzyjno-krążkowa Kirby-Bauera 2 , dla której wymagania zostały ustalone 

przez WHO w 1976 r. Metoda jest szczególnie zalecana dla bakterii należących 

do rodziny Enterobacteriaceae, lecz może być stosowana również w przypadku 

wszystkich szybko rosnących patogenów. Metoda ta została także przystosowana 

dla najważniejszych klinicznie bakterii o wyższych wymaganiach odżywczych, 

z wyjątkiem ścisłych beztlenowców i mykobakterii. Jest rekomendowana, 

ponieważ poszczególne elementy testu są możliwe do wykonania przez pracowników 

laboratorium 3 . 

Podstawowe zasady oznaczania 

lekowrażliwości 

Testy wrażliwości na antybiotyki określają zdolność czynnika przeciwbakteryjnego 

do zahamowania wzrostu bakterii in vitro. Zdolność tę można oznaczyć 

zarówno metodą rozcieńczeń, jak i metodą dyfuzyjną. 

1 

Surveillance for the prevention and control of health hazards due to antibiotic-resistant 

enterobacteria. Geneva, World Health Organization, 1978 (WHO Technical Report Series, No. 624). 

2 

WHO Expert Committee on Biological Standardization. Twenty-eighth report. Geneva, World 

Health Organization, 1977 (WHO Technical Report Series, No. 610). 

3 

Metodą porównywalną do metody Kirby-Bauera, opartą na tych samych zasadach i wymaganiach 

kontroli jakości, jest metoda NEO-SENSITABS, produced ROSCO Diagnostica, Taastrup, Dania. 

W metodzie zamiast bibułowych krążków stosowane są 9-milimetrowe oznaczone kolorem tabletki 

przeciwbakteryjne. Forma tabletek gwarantuje wyjątkową stabilność antybiotyku z okresem przechowywania 

do czterech lat, nawet w temperaturze pokojowej. Zwiększona stabilność jest bardzo ważna 

dla laboratoriów w krajach tropikalnych. 

119

OZNACZANIE WRAŻLIWOŚCI NA ANTYBIOTYKI 

Test rozcieńczeń 

Rozcieńczenia antybiotyku do ilościowej oceny aktywności przeciwbakteryjnej 

można przygotować w bulionie lub podłożu agarowym, które następnie inkubuje 

się z badanym mikroorganizmem. Najniższe stężenie preparatu, które po 

całonocnej inkubacji hamuje wzrost szczepu, określa się jako minimalne stężenie 

hamujące (MIC — minimum inhibitory concentration). Wartość MIC porównuje 

się następnie ze znanym stężeniem leku, jakie osiągane jest w surowicy i innych 

płynach ustrojowych, aby ocenić przypuszczalną odpowiedź kliniczną. 

Test dyfuzji 

Bibułowe krążki nasączone określoną ilością antybiotyku umieszcza się na 

podłożu agarowym z równomiernie posianym badanym drobnoustrojem. Gradient 

stężenia antybiotyku tworzy się przez dyfuzję z krążka, a powstała strefa 

zahamowania wokół krążka koreluje, wśród innych czynników, z wrażliwością 

szczepu. 

Istnieje prawie liniowa zależność pomiędzy log MIC, mierzonym w teście 

rozcieńczeń, iśrednicą strefy zahamowania w teście dyfuzyjnym. Linię regresji 

wyrażającą tę zależność można uzyskać badając dużą liczbę szczepów równocześnie 

dwoma metodami (patrz ryc. 12 i 13). 

Kliniczna definicja terminów ,,oporny’’ 

i ,,wrażliwy’’ 

Wynik badania wrażliwości w formie przedstawianej lekarzowi kwalifikuje 

mikroorganizm do jednej z dwóch lub więcej kategorii wrażliwości. Najprostszy 

system składa się jedynie z dwóch kategorii: wrażliwy i oporny. Klasyfikacja, 

35 

30 

25 

• 

• 

• 

• 

• 

• 

• 

• 

• 

• 

20 

15 

10 

6 

• 

• 

• 

• 

• 

• 

•• 

0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 

MIC (µg/ml) 

WHO 90961 

Ryc. 12. Graficzna prezentacja korelacji między wartościa˛ log 2 MIC i strefa˛ zahamowania 

wzrostu uzyskiwana˛ w metodzie dyfuzyjnej z użyciem kra˛żków zawieraja˛cych jedno, 

określone stężenie antybiotyku. 

120

CZE˛ŚĆ I 

mimo że ze względów statystycznych i epidemiologicznych posiada wiele zalet, 

jest zbyt sztywna dla klinicysty. Dlatego często przyjmuje się klasyfikację trzech 

kategorii. Metoda Kirby-Bauera i jej modyfikacja uwzględniają trzy kategorie 

wrażliwości i ważne jest, aby zarówno lekarz, jak i pracownik laboratorium 

rozumieli ich dokładne definicje i znaczenie kliniczne. 

Średnice 

graniczne 

S 

I 

R 

1 

● 27 

● 14 

Średnica strefy 

(mm) 

1 

35 

30 

— — — — — — — — — — — — — 

25 

20 

15 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 

10 

6 

— — — — — — — — — — — — — — — — — — 

S – susceptible/wrażliwy 

I – intermediate/średnio wrażliwy 

R – resistant/oporny 

0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 

▲ 

▲ 

S I R MIC (µg/ml) 

— — — — — — — 

WHO 90962 

Ryc. 13. Interpretacja wielkości stref (wrażliwy, średnio wrażliwy, oporny) w odniesieniu 

do wartości MIC. 

• Wrażliwy. Mikroorganizm określany jest jako ,,wrażliwy’’ na antybiotyk, jeśli 

odpowiedź kliniczna na leczenie danym antybiotykiem, stosowanym w zalecanych 

dawkach, jest prawdopodobna. 

• Średnio wrażliwy dotyczy dwóch sytuacji. Określa szczepy o ,,umiarkowanej 

wrażliwości’’ na antybiotyk, który może być zastosowany w leczeniu w większej 

dawce (np. β-laktam) z powodu niskiej toksyczności lub koncentracji 

w ognisku zakażenia (np. mocz). Klasyfikacja odnosi się również do szczepów 

wykazujących ,,średnią wrażliwość’’ na bardziej toksyczne antybiotyki (np. 

aminoglikozydy), które nie mogą być zastosowane w wyższych dawkach. W tej 

sytuacji pośrednia kategoria stanowi strefę buforową między wrażliwością 

i opornością. 

Podobnie jak większość klinicystów nie jest świadoma, mimo klinicznego 

znaczenia, subtelnej różnicy między średnią i umiarkowaną wrażliwością, 

wiele laboratoriów w obydwu sytuacjach używa określenia ,,średnia’’. 

• Oporny. Ten termin wskazuje, że niezależnie od zastosowanej dawki i lokalizacji 

infekcji, oczekiwany jest brak odpowiedzi klinicznej na dany antybiotyk. 

W pewnych sytuacjach, na przykład w badaniu odpowiedzi gronkowców na 

benzylopenicylinę, istnieją tylko kategorie ,,wrażliwy’’ i ,,oporny’’ (odpowiadające 

zdolności do wytwarzania β-laktamaz). 

Najlepsza decyzja o użyciu określonego antybiotyku i stosowanego dawkowania 

zależy nie tylko od wyników antybiogramu, ale również od jego interpretacji 

przez lekarza. Należy wziąć pod uwagę także inne czynniki, takie jak właściwości 

chorobotwórcze mikroorganizmu, działania uboczne i farmakokinetyczne właściwości 

leku, jego przenikanie do różnych obszarów ciała oraz status immunologiczny 

pacjenta. 

121


Wskazania do rutynowego oznaczania 


Antybiogram w laboratorium klinicznym może zostać wykonany w dwóch celach: 

• aby ukierunkować lekarza w wyborze najlepszego leku przeciwbakteryjnego 

indywidualnie dla pacjenta; 

• aby gromadzić informacje epidemiologiczne o oporności mikroorganizmów 

o istotnym znaczeniu dla zdrowia publicznego. 

Antybiogram jako wskazówka 

do leczenia 

Antybiogramy nigdy nie powinny być wykonywane dla zanieczyszczających 

próbkę lub komensalnych mikroorganizmów, należących do flory fizjologicznej, 

oraz innych, nie mających związku z procesem zakażenia. Na przykład obecność 

Escherichia coli w moczu w liczbie mniejszej od znaczącej nie jest uważana za 

przyczynę infekcji i wykonanie antybiogramu byłoby bezcelowe lub wręcz 

mylące. 

Antybiogramy powinny być wykonywane tylko z czystych hodowli mikroorganizmów 

prawdopodobnie wywołujących zakażenie. 

Rutynowe badanie wrażliwości nie jest wskazane w następujących sytuacjach: 

• Jeśli drobnoustrój należy do gatunku z przewidywalną wrażliwością na 

określony lek. Tak jest w przypadku Streptococcus pyogenes i Neisseria 

meningitidis, które nadal wykazują wrażliwość na benzylopenicylinę. (Jakkolwiek 

ostatnio przedstawiono w raportach sporadyczne pojawianie się benzylopenicylinoopornych 

meningokoków.) Podobnie jest w przypadku paciorkowcówkałowych 

(enterokoków), które poza kilkoma wyjątkami (Enterococcus 

faecium — przyp. tłum.)sąwrażliwe na ampicylinę. Jeśli na podstawie cech 

klinicznych podejrzewa się oporność tych mikroorganizmów, szczepy należy 

przesłać do referencyjnego laboratorium. 

• Jeśli drobnoustrój wymaga wzbogaconego podłoża, np. Haemophilus influenzae 

i Neisseria gonorrhoeae. Przy braku ścisłego przestrzegania właściwej 

techniki wykonania antybiogramu test dyfuzyjno-krążkowy może dawać 

niewiarygodne rezultaty. Pojawienie się wytwarzających β-laktamazy wariantów 

wyżej wymienionych szczepów spowodowało konieczność wprowadzenia 

specjalnych testów, takich jak wykrywający β-laktamazy in vitro test opisany 

na stronie 92. Za monitorowanie wrażliwości pneumokoków, gonokoków 

i Haemophilus odpowiadają regionalne i centralne laboratoria. W razie 

wystąpienia problemu oporności szczepów należy ostrzec lokalne laboratoria 

i dostarczyć instrukcje dotyczące właściwych w tej sytuacji metod badania 

lekowrażliwości i alternatywnych schematów leczenia. 

• Niepowikłane zakażenia wywołane przez Salmonella (inne niż S. typhi lub 

S. paratyphi). Leczenie przeciwbakteryjne takich infekcji nie jest uzasadnione, 

nawet z zastosowaniem antybiotyków wykazujących aktywność in vitro. 

Istnieje wiele dowodów przemawiających za brakiem klinicznych korzyści 

leczenia niepowikłanego zapalenia żołądkowo-jelitowego wywołanego przez 

pałeczki Salmonella (a w praktyce większości chorób biegunkowych o niejasnej 

etiologii). Paradoksalnie, stosowanie antybiotyków może wydłużyć wydalanie 

i rozprzestrzenianie się tych bakterii, a także prowadzić do selekcji 

szczepów opornych. 

122

CZE˛ŚĆ I 

Antybiogram jako narzędzie badań 

epidemiologicznych 

Rutynowe określanie wrażliwości większości patogenów (S. typhi, pałeczki 

Shigella) jest istotnym elementem programu kontroli zakażeń układu pokarmowego. 

Badania te dostarczają lekarzowi informacji o pojawieniu się opornych 

szczepów (S. typhi oporna na chloramfenikol, pałeczki Shigella oporne na 

kotrimoksazol i ampicylinę) oraz o ewentualnej potrzebie modyfikacji schematu 

standardowego leczenia. Mimo że antybiogramy dla niedurowych serotypów 

pałeczek Salmonella, odpowiedzialnych za zakażenia jelitowe, nie mają znaczenia 

w leczeniu pacjenta, pojawienie się wielolekoopornych szczepów jest 

ostrzeżeniem dla lekarzy przed nadmiernym lub niewłaściwym stosowaniem 

leków przeciwbakteryjnych. Stała kontrola i analiza antybiogramów jest doskonałym 

źródłem informacji o występowaniu opornych gronkowców i Gram- 

-ujemnych pałeczek, które mogą być odpowiedzialne za krzyżowe zakażenia 

szpitalne. Okresowe raportowanie wzorów oporności izolowanych szczepów 

stanowi nieocenioną pomoc w prowadzeniu właściwej polityki antybiotykowej 

w szpitalu, opartej na ograniczeniu i/lub rotacji ratujących życie leków, takich jak 

aminoglikozydy i cefalosporyny. 

Wybór leków do oznaczania lekowrażliwości 

w laboratoriach klinicznych 

Wybór leków używanych w rutynowym antybiogramie dokonywany jest na 

podstawie spektrum przeciwbakteryjnego leku, jego właściwości farmakokinetycznych, 

toksyczności, skuteczności i dostępności, a także kosztów zarówno dla 

pacjenta, jak i dla społeczeństwa. Spośród wielu preparatów przeciwbakteryjnych 

stosowanych w leczeniu jedynie niewielka część starannie dobranych leków 

powinna być wykorzystywana w oznaczaniu wrażliwości. 

W tabeli 23 wymienione zostały antybiotyki stosowane w różnych sytuacjach 

klinicznych. Leki podzielono na dwie grupy. Grupa pierwsza to leki dostępne 

w większości szpitali, które powinny być uwzględnione w antybiogramie dla 

Tabela 23. Podstawowe zestawy antybiotyków do rutynowego oznaczania wrażliwości a 

Grupa 1 

Leki pierwszego rzutu 

Grupa 2 

Leki uzupełniaja˛ce 


Układ 

pokarmowy 


Mocz 

Krew i tkanki 

Pseudomonas 

aeruginosa 

Benzylopenicylina Ampicylina Sulfonamid Ampicylina Piperacylina 

Oksacylina Chloramfenikol Trimetoprim Chloramfenikol Gentamycyna 

Erytromycyna Kotrimoksazol Kotrimoksazol Kotrimoksazol Tobramycyna 

Tetracyklina Kwas nalidyksowy Ampicylina Tetracyklina 

Chloramfenikol Tetracyklina Nitrofurantoina Cefalotyna 

Kwas nalidyksowy Gentamycyna 

Tetracyklina Amoksycylina/ 

/kwas klawulanowy 

b 

Gentamycyna Norfloksacyna Norfloksacyna Cefuroksym Amikacyna 

Amikacyna Chloramfenikol Ceftriakson Ciprofloksacyna 

Kotrimoksazol Gentamycyna Ciprofloksacyna Ceftazydym 

Klindamycyna 

Amoksycylina/ Piperacylina 

Nitrofurantoina 

/kwas klawulanowy 

Amikacyna 

b 

a 

b 

Informacje o poszczególnych antybiotykach sa˛ umieszczone w tekście. 

Amoksycylina z kwasem klawulanowym (inhibitor β-laktamaz). 

123


każdego izolowanego szczepu 1 . Testy dla leków z drugiej grupy powinny być 

wykonywane jedynie na specjalne zlecenie lekarza, gdy izolowany patogen jest 

oporny na leki pierwszego rzutu lub gdy inne powody (alergia na lek lub jego 

niedostępność) uzasadniają takie badanie. Wiele antybiotyków o dobrej aktywności 

klinicznej zostało pominiętych w tabeli, lecz należy podkreślić, że ich 

zastosowanie jest rzadko konieczne w leczeniu zakażonych pacjentów. Wyjątkowo, 

jeśli istnieją szczególne wskazania znane lekarzowi lub jeśli dostępne są 

nowe i lepsze leki, do leczenia można włączyć jeden lub więcej leków 

dodatkowych. Wskazana jest aktualizacja informacji zawartych w tabeli we 

współpracy z personelem klinicznym. W antybiogramach wykorzystuje się 

niekiedy tylko jeden lek reprezentujący całą grupę, co może być przyczyną 

nieporozumień w sytuacji, gdy klinicyści nie są tego świadomi. Wynik antybiogramu 

dla reprezentatywnego antybiotyku można odnieść do wszystkich lub do 

większości przedstawicieli danej grupy. W niektórych krajach poważne utrudnienia 

wynikają z faktu, że lekarze znają tylko handlowe nazwy leków, bez nazw 

międzynarodowych. Należy położyć nacisk na informowanie personelu medycznego 

o nazwach niehandlowych antybiotyków i zachęcać do ich stosowania 2 . 

1. Krążek z benzylopenicylina˛ stosowany jest do określania wrażliwości na 

wszystkie β-laktamazowrażliwe penicyliny (takie jak doustna fenoksymetylopenicylina 

i fenetycylina). W zakażeniach wywołanych przez gronkowce 

wytwarzające β-laktamazy powinno się stosować β-laktamazooporne penicyliny 

lub inny antybiotyk, np. erytromycynę. 

2. Krążek z oksacylina˛ jest reprezentatywny dla całej grupy β-laktamazoopornych 

penicylin (wliczając metycylinę, nafcylinę, kloksacylinę, dikloksacylinę 

i flukloksacylinę). Istnieją dowody kliniczne na krzyżową oporność 

między metycyliną i grupą cefalosporyn. Dlatego niepotrzebne i mylące jest 

włączenie cefalotyny do antybiogramu dla gronkowców. Oporność na 

metycylinę i pozostałe leki tej grupy ma często heterogenny charakter, np. 

większość komórek może być wpełni wrażliwa i tworzyć szeroką strefę 

zahamowania, podczas gdy część populacji rośnie w strefie zahamowania 

w postaci drobnych kolonii. Ten typ oporności jest lepiej wykrywany 

w temperaturze 35°C 3 lub przy przedłużonym czasie inkubacji. Poważną 

wadą metycyliny, jako antybiotyku reprezentatywnego dla całej grupy, jest 

jej duża niestabilność, nawet w prawidłowych warunkach przechowywania. 

W standardowej metodzie dyfuzyjnej preferuje się stosowanie krążka 

z oksacyliną, która jest bardziej trwała. Krążki z kloksacyliną i dikloksacyliną 

nie są stosowane, ponieważ mogą nie wykrywać heteroopornych szczepów. 

3. Wynik badania wrażliwości na tetracyklinę można odnieść do chlorotetracykliny, 

oksytetracykliny oraz innych przedstawicieli tej grupy. Jednak większość 

opornych na tetracyklinę gronkowców zachowuje wrażliwość na 

minocyklinę. Krążki z minocykliną mogą więc być przydatne w oznaczaniu 

wrażliwości wieloopornych szczepów gronkowców. 

4. Wynik badania wrażliwości na chloramfenikol można odnieść do tiamfenikolu, 

pochodnego leku o porównywalnym spektrum przeciwbakteryjnym, 

ale bez znanego ryzyka niedokrwistości aplastycznej. 

1 

W Polsce dobór krążków do wykonania antybiogramu powinien być oparty na rekomendacjach 

opracowanych przez Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (przyp. 

tłum.). 

2 

International Nonproprietary Names (INN) for Pharmaceutical Substances. Cumulative list No. 9. 

Geneva, World Health Organization, 1996. 

3 

Sahm D.F. et al.: Current concepts and approaches to antimicrobial agent susceptibility testing. In: 

Cumitech 25, Washington, DC, American Society for Microbiology, 1988. 

124

CZE˛ŚĆ I 

5. W antybiogramie stosowany jest tylko jeden przedstawiciel sulfonamidów 

(sulfafurazol). 

6. Krążek z kotrimoksazolem zawiera kombinację trimetoprimu i sulfonamidu 

(sulfametoksazol). Dwa składniki tego synergistycznego połączenia mają 

podobne właściwości farmakokinetyczne i generalnie działają jak jeden lek. 

7. Ampicylina jest przedstawicielem grupy penicylin o szerokim spektrum 

działania, wykazujących aktywność wobec wielu Gram-ujemnych bakterii. 

Ponieważ jest wrażliwa na β-laktamazy, nie powinna być stosowana 

w określaniu lekowrażliwości gronkowców. Ogólnie, wynik wrażliwości na 

ampicylinę odnosi się również do innych przedstawicieli grupy: amoksycyliny, 

piwampicyliny, talampicyliny itp. (choć amoksycylina jest dwukrotnie 

bardziej aktywna wobec pałeczek Salmonella iopołowę mniej 

aktywna wobec pałeczek Shigella i H. influenzea). 

8. Rutynowo należy określać wrażliwość jedynie na cefalotynę, ponieważ 

wynik jest reprezentatywny dla innych cefalosporyn pierwszej generacji 

(cefaleksyna, cefradyna, cefalorydyna, cefazolina, cefapiryna). Ze względu 

na dostępność cefalosporyn drugiej i trzeciej generacji oraz ich pochodnych 

(cefamycyny) o rozszerzonym spektrum, w wybranych przypadkach może 

być uzasadnione użycie krążków z antybiotykami tej grupy (cefoksytyna, 

cefamandol, cefuroksym, cefotaksym, ceftriakson). Wrażliwość na cefalosporyny 

stosowane w ciężkich zakażeniach gronkowcowych można określić 

na podstawie wyników badania wrażliwości na oksacylinę, o czym wspomniano 

już powyżej w punkcie 2. 

9. Erytromycyna jest wykorzystywana do oceny wrażliwości także na inne 

makrolidy (oleandomycyna, spiramycyna). 

10. Aminoglikozydy tworzą grupę chemicznie podobnych leków obejmujących 

streptomycynę, gentamycynę, kanamycynę, netylmycynę i tobramycynę. Ich 

spektra przeciwbakteryjne nie zawsze są na tyle podobne, aby można było 

założyć istnienie krzyżowej oporności, ale wobec wrażliwych patogenów leki 

te wykazują identyczną skuteczność. W licznych badaniach porównywano 

nefrotoksyczność i ototoksyczność gentamycyny, netylmycyny i tobramycyny, 

ale nie uzyskano ostatecznych dowodów, świadczących o mniejszej 

toksyczności którejkolwiek z nich. Zaleca się, aby każde laboratorium 

wybrało jeden lek do podstawowego antybiogramu. Pozostałe antybiotyki 

należy zachować w rezerwie do leczenia pacjentów z zakażeniami wywołanymi 

przez oporne drobnoustroje. 

11. Stosowanie nitrofurantoiny ograniczone jest do leczenia zakażeń układu 

moczowego i wrażliwość na ten lek nie powinna być oznaczana dla szczepów 

pochodzących z innych materiałów niż mocz. 

Tabela 24 zawiera wartości graniczne średnic stref zahamowania wzrostu dla 

szczepów kontrolnych. 

Zmodyfikowana metoda Kirby-Bauera 

Metoda dyfuzyjno-krążkowa, po raz pierwszy opisana w 1966 r. 1 , jest dobrze 

wystandaryzowaną i wysoko cenioną metodą. Oficjalne instytucje zaleciły ją, 

z niewielkimi modyfikacjami, jako referencyjną metodę, która może być 

rutynowo stosowana w laboratoriach klinicznych. 

1 

Bauer A.W. et al.: Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disc method. American 

Journal of Clinical Pathology, 1966; 45: 493 – 496. 

125


Tabela 24. Strefy zahamowania wzrostu dla szczepów kontrolnych a 

a 

b 

c 

Antybiotyk 

Zawartość 

w kra˛żku 

Średnica strefy zahamowania (mm) 

S. aureus 

(ATCC 25923) 

E. coli 

(ATCC 25922) 

P. aeruginosa 

(ATCC 27853) 

Amikacyna 30 µg 20–26 19 –26 18 –26 

Amoksycylina/kwas 20/10 µg 28–36 19 –25 — 

klawulanowy b 

Ampicylina 10 µg 27–35 16 –22 — 

Benzylopenicylina 10 µg 26–37 — — 

Cefalotyna 30 µg 29–37 15 –21 — 

Cefalozyna 30 µg 29–35 23 –29 — 

Ceftazydym 30 µg 16–20 25 –32 22 –29 

Cefotaksym 30 µg 25–31 29 –35 18 –22 

Ceftriakson 30 µg 22–28 29 –35 17 –23 

Cefuroksym 30 µg 27–35 20 –26 — 

Chloramfenikol 30 µg 19–26 21 –27 — 

Ciprofloksacyna 5 µg 22–30 30 –40 25 –33 

Klindamycyna 2 µg 24–30 — — 

Kotrimoksazol 25 µg 24–32 24 –32 — 

Erytromycyna 15 µg 22–30 — — 

Gentamycyna 10 µg 19–27 19 –26 16 –21 

Kwas nalidyksowy 30 µg — 22 –28 — 

Nitrofurantoina 300 µg 18–22 20 –25 — 

Norfloksacyna 10 µg 17–28 28 –35 22 –29 

Oksacylina 1 µg 18–24 — — 

Piperacylina 100 µg — 24 –30 25 –33 

Sulfonamid c 300 µg 24–34 15 –23 — 

Tetracyklina 30 µg 24–30 18 –25 — 

Tobramycyna 10 µg 19–29 18 –26 19 –25 

Trimetoprim 5 µg 19–26 21 –28 — 

Wankomycyna 30 µg 17–21 — — 

National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial 

disc susceptibility tests. 6 th ed. Vol. 21 No 1 (M2-A7 i M7-A5) i 11 th informational 

supplement 2001 (M100-S11). 


Sulfizoksazol. 

Odczynniki 

Agar Mueller-Hintona 

1. Przygotować agar Mueller-Hintona z postaci sproszkowanej, zgodnie z zaleceniem 

producenta. Podłoża powinny być przygotowane w sposób, który 

umożliwi uzyskanie odpowiednich stref zahamowania dla szczepów kontrolnych 

(patrz tabela 24). Ważne jest, aby nie przegrzać podłoża. 

2. Schłodzić podłożedo45– 50°C i rozlać na płytki. Wypełnić do poziomu około 

4 mm. Płytka o średnicy 9 cm zawiera około 25 ml podłoża. 

3. Gdy agar stężeje, płytki do natychmiastowego użycia suszyć przez 10 – 30 minut 

w35°C, umieszczając jewcieplarcedogóry dnem, z uchylonymi wieczkami. 

4. Nie wykorzystane płytki można przechowywać wchłodziarce, w szczelnie 

zamkniętych plastikowych woreczkach. Płytki mogą być przechowywane 

w ten sposób przez 2 tygodnie. 

W celu uzyskania wiarygodnych stref zahamowania wzrostu, do badania lekowrażliwości 

na sulfonamidy i kotrimoksazol należy użyć agaru Mueller-Hintona, 

zawierającego niskie stężenia inhibitorów tymidyny i tyminy. Z tego względu 

każda nowa partia agaru Mueller-Hintona musi zostać przetestowana z użyciem 

126

CZE˛ŚĆ I 

szczepu kontrolnego Enterococcus faecalis (ATCC 29212 lub 33186) oraz krążka 

z kotrimoksazolem. O odpowiedniej jakości podłoży świadczy wyraźna, 20- 

-milimetrowa lub większa, strefa zahamowania, co ważne — bez mglistego 

wzrostu i drobnych kolonii. 

Kra˛żki z antybiotykami 

Można używać wszystkich dostępnych komercyjnie krążków o właściwej 

średnicy i stężeniu leku. Zapasy krążków należy przechowywać w –20°C; 

odpowiednia jest także zamrażarka chłodziarki. Mały podręczny zestaw krążków 

można przechowywać wchłodziarce do miesiąca. Po wyjęciu z chłodziarki 

pojemniki należy pozostawić w temperaturze pokojowej na około 1 godziny (do 

wyrównania temperatur). Taka procedura zmniejsza skraplanie pary, pojawiającej 

się w wyniku kontaktu ciepłego powietrza z powierzchnią zimnego pojemnika. 

Jeśli używa się dyspensera krążków, należy przechowywać go w chłodziarce ze 

szczelnie domkniętą pokrywą. Przed otwarciem dyspenser również powinien 

zostać ogrzany do temperatury pokojowej. 

Wzorzec zmętnienia 

Przygotować wzorzec zmętnienia (gęstości zawiesiny — przyp. tłum.) wlewając 

0,6 ml 1% (10 g/l) roztworu dwuwodzianu chlorku baru do 100-mililitrowego 

kalibrowanego cylindra i wypełnić do 100 ml 1% (10 ml/l) kwasem siarkowym. 

Roztwór wzorcowego zmętnienia należy umieścić w identycznej probówce, jak 

probówki z bulionem. Wzorzec może być przechowywany w ciemności, 

w temperaturze pokojowej przez 6 miesięcy, pod warunkiem, że jest zamknięty 

w sposób uniemożliwiający parowanie. 

Wymazówki 

Przygotowuje się zapas bawełnianych wymazówek na drewnianych patyczkach. 

Wymazówki sterylizuje się w autoklawie lub w sterylizatorach na suche gorące 

powietrze, umieszczając je w puszkach, probówkach lub opakowane w papier. 

Procedura 

Aby przygotować inoculum z hodowli na podłożu stałym, należy zebrać ezą 

3 – 5 kolonii badanego mikroorganizmu o tym samym wyglądzie. 

127


Przenieść do probówki z fizjologicznym roztworem soli. 

Jeśli inoculum przygotowywane jest z czystej hodowli, należy w ten sam sposób 

w roztworze fizjologicznym soli zawiesić ezą materiał pobrany ze zlewnego 

wzrostu. 

Porównać probówkę ze wzorcem zmętnienia i dostosować gęstość badanej 

zawiesiny do wzorca, dodając więcej bakterii lub więcej fizjologicznego roztworu 

soli. 

Właściwa gęstość inoculum jest konieczna do uzyskania zlewnej lub prawie 

zlewnej murawy wzrostu. 

Badany szczep posiać na płytki, zanurzając sterylną wymazówkę w inoculum. 

Usunąć nadmiar zawiesiny, obracając i przyciskając wymazówkę mocno do 

ścianki probówki powyżej poziomu płynu. 

128

CZE˛ŚĆ I 

Zawiesinę trzykrotnie rozprowadzić dokładnie na całej powierzchni podłoża, 

przekręcając płytkę za każdym razem o 60°. Na koniec przesunąć wymazówkę 

wzdłuż brzegów powierzchni agaru. Pozostawić na kilka minut do wyschnięcia 

w temperaturze pokojowej, z zamkniętym wieczkiem. 

Krążki z antybiotykami można umieścić na posianej płytce za pomocą sterylnej 

pęsety. Zastosowanie szablonu (ryc. 15) ułatwia równomierne rozmieszczenie 

krążków. 

Do umieszczenia krążków z antybiotykami na posianej płytce można również 

użyć sterylnej igły z zatyczką. 

129


Alternatywnie, do nałożenia na posianą płytkę krążków z antybiotykami można 

użyć dyspensera. 

Maksymalnie na płytce o średnicy 9 – 10 cm można umieścić siedem krążków. 

Sześć krążków można rozmieścić równomiernie w jednakowej odległości, około 

15 mm od brzegu płytki, a jeden krążek nałożyć w centrum płytki. Każdy krążek 

należy delikatnie przycisnąć, zapewniając równomierny kontakt z podłożem. 

Płytki powinny być w ciągu 30 minut umieszczone w cieplarce w 35°C. Temperatura 

powyżej 35°C zaburza wyniki wrażliwości na oksacylinę/metycylinę. 

Nie inkubować w atmosferze dwutlenku węgla. 

Po całonocnej inkubacji należy zmierzyć średnicę każdej strefy (wliczając 

średnicę krążka) i zanotować odczyt (w mm). Interpretować wyniki zgodnie 

z wartościami przedstawionymi w tabeli 25. 

Pomiar stref może być wykonany za pomocą linijki przyłożonej do dna płytki, bez 

jej otwierania. 

130

CZE˛ŚĆ I 

Jeśli płytka nie jest przezroczysta, pomiaru można dokonać za pomocą suwmiarki. 

Wyniki badania lekowrażliwości można odczytać posługując się szablonem 

(ryc. 14). 

131


Tabela 25. Interpretacja stref zahamowania wzrostu w zmodyfikowanej metodzie 

Kirby-Bauera a dla bakterii szybko rosna˛cych 

Antybiotyk 

Zawartość 

w kra˛żku 

Średnica strefy zahamowania (mm) 

Oporny 

Średnio 

wrażliwy 

Wrażliwy 

Amikacyna 30 µg < 14 15 –16 > 17 

Amoksycylina/kwas klawulanowy 

20/10 µg < 13 14 –17 > 18 

b 

Ampicylina dla: 

– Enterobacteriaceae 10 µg < 13 14 –16 > 17 

– enterokoki 10 µg < 16 — > 17 

Benzylopenicylina dla: 

– gronkowce 10 IU < 28 — > 29 

– enterokoki 10 IU < 14 — > 15 

Cefalotyna 30 µg < 14 15 –17 > 18 

Cefalozyna 30 µg < 14 15 –17 > 18 

Cefotaksym 30 µg < 14 15 –22 > 23 

Ceftazydym 30 µg < 14 15 –17 > 18 

Ceftriakson 30 µg < 13 14 –20 > 21 

Cefuroksym sodium, cefamandol 

30 µg < 14 15 –17 > 18 

Chloramfenikol 30 µg < 12 13 –17 > 18 

Ciprofloksacyna 5 µg < 15 16 –20 > 21 

Klindamycyna 2 µg < 14 15 –20 1 21 

Kotrimoksazol 25 µg < 10 11 –15 1 16 

Erytromycyna 15 µg < 13 14 –22 > 23 

Gentamycyna 10 µg < 12 13 –14 > 15 

Kwas nalidyksowy c 30 µg < 13 14 –18 1 19 

Nitrofurantoina c 300 µg < 14 15 –16 > 17 

Norfloksacyna c 10 µg < 12 13 –16 > 17 

Oksacylina 1 µg < 10 10 –12 > 13 

Piperacylina dla: 

– P. aeruginosa 100 µg < 17 — > 18 

– inne pałeczki Gram-ujemne 

100 µg < 17 18 –20 > 21 

Sulfonamid c, d 300 µg < 12 13 –16 > 17 

Tetracyklina 30 µg < 14 15 –18 > 19 

Tobramycyna 10 µg < 12 13 –14 > 15 

Trimetoprim c 5 µg < 10 11 –15 1 16 

Wankomycyna dla: 

– gronkowce 30 µg — — > 15 

– enterokoki 30 µg < 14 15 –16 > 17 

a 

National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial 

disc susceptibility tests.6 th ed., Vol. 21, No 1 (M2-A7 i M7-A5) Wayne, PA, NCCLS i 11 th 

informational supplement 2001 (M100-S11). 

b 


c 

Używane tylko do badania patogenów wyizolowanych z dróg moczowych i niektórych 

szczepów jelitowych. 

d 

Sulfizoksazol. 

132

CZE˛ŚĆ I 

Kra˛żek 

z antybiotykiem 

▲ 

▲ 

▲ 

Strefa wewnętrzna: 

szczep oporny 

Strefa czarna: 

średnia wrażliwość 

Ryc. 14. Szablon do określania wrażliwości. 

▼ 

Strefa zewnętrzna: 

szczep wrażliwy 

WHO 91127 

Granicę strefy zahamowania ustala się gołym okiem w miejscu, gdzie rozpoczyna 

się widoczny wzrost; istnieją jednak trzy wyjątki: 

• W przypadku sulfonamidów i kotrimoksazolu w strefie zahamowania pojawia 

się słaby wzrost; nie należy go brać pod uwagę. 

• W przypadku określania wrażliwości β-laktamazododatnich gronkowców na 

benzylopenicyliny brzegi strefy zahamowania są wyraźnie widoczne i uniesione; 

łatwo uznać je za dodatni wynik testu, podczas gdy niezależnie od 

rozmiaru strefy zahamowania szczep należy opisać jako oporny. 

• Pewne gatunki Proteus mogą wokół niektórych krążków z antybiotykami 

wytwarzać, w wyraźnie ograniczonej strefie zahamowania, cienką warstwę 

wzrostu mgławicowego, którego nie należy brać pod uwagę. 

Interpretacja wielkości stref zahamowania 

Stosowanie wzornika. Dla każdego antybiotyku należy przygotować oddzielny 

wzornik (patrz ryc. 14). Wynik można odczytać z jednoczesną interpretacją 

— wrażliwy, oporny lub średnio wrażliwy: ,,wrażliwy’’, jeśli granica strefy 

wykracza poza czarny pierścień; ,,oporny’’, jeśli nie obserwuje się strefy lub gdy 

jej granica mieści się w polu białego pierścienia; ,,średnio wrażliwy’’, jeśli granica 

strefy zahamowania leży w obrębie czarnego pierścienia. 

Stosowanie linijki. Wyniki pomiarów stref zahamowania w mm należy interpretować 

zgodnie z granicznymi średnicami przedstawionymi w tabeli 25. 

Bezpośrednie a pośrednie oznaczanie 


W opisanej powyżej metodzie inoculum przygotowywane jest z pierwotnej płytki 

hodowlanej lub z czystych hodowli. Jest to tak zwany pośredni test lekowrażliwości. 

W przypadkach, gdy niezbędny jest szybki wynik, zamiast standardowego 

inoculum można wykorzystać badany materiał, np. mocz, dodatnie posiewy z krwi 

lub wymazy ropy. W przypadku moczu należy najpierw zbadać pod mikroskopem 

osad, oceniając obecność dowodów infekcji, np. obecność granulocytów i/lub 

drobnoustrojów. Następnie można wykorzystać mocz jako inoculum w metodzie 

standardowej. Jeśli barwienie Grama inkubowanych hodowli z krwi, wykazujących 

wzrost bakterii, lub wymazów z ropy potwierdzi obecność dużej liczby 

mikroorganizmów jednego typu, materiały te mogą zostać użyte jako bezpośrednie 

inoculum.Jesttotzw.bezpośredni test lekowrażliwości; zaletą testu bezpośredniego 

jest szybsze o 24 godziny uzyskanie wyniku. Główną wadę stanowi brak 

właściwego przygotowania inoculum. Jeśli na płytkach pojawi się zbyt słaby lub 

zbyt intensywny wzrost lub gdy obecne są mieszane hodowle, należy bardzo 

uważnie interpretować wyniki i powtórzyć test używając czystych hodowli. 

133


Czynniki techniczne wpływaja˛ce na wielkość 

strefy zahamowania w metodzie 

dyfuzyjno-kra˛żkowej 

Gęstość inoculum 

W przypadku zbyt małej gęstości inoculum uzyskana strefa zahamowania, 

niezależnie od wrażliwości mikroorganizmu, będzie większa. Z tego powodu 

oporne szczepy mogą zostać opisane jako wrażliwe. W odwrotnej sytuacji, zbyt 

dużej gęstości inoculum, wielkość uzyskanej strefy będzie mniejsza i szczepy 

wrażliwe mogą zostać opisane jako oporne. Zwykle najlepsze wyniki uzyskuje się 

przygotowując inoculum warunkujące prawie zlewny wzrost. 

Czas nałożenia kra˛żków 

Na posianych płytkach, pozostawionych w temperaturze pokojowej dłużej niż 

podano w procedurze, przed nałożeniem krążków dochodzi do namnażania 

szczepów. W rezultacie średnica strefy zahamowania jest mniejsza i szczepy 

wrażliwe mogą zostać opisane jako oporne. 

Temperatura inkubacji 

W celu otrzymania optymalnego wzrostu podłoża z antybiogramem należy 

inkubować w35°C. Jeśli temperatura jest niższa, wydłuża się czas inkubacji, 

a uzyskane strefy są większe. W przypadku badania wrażliwości heterogennie 

opornych szczepów Staphylococcus aureus na metycylinę (oksacylinę) część 

oporną populacji wykrywa się w35°C. W wyższych temperaturach cała hodowla 

wykazuje wrażliwość. W temperaturze 35°C i niższej w strefie zahamowania 

rosną oporne kolonie. Opisane kolonie są lepiej widoczne, jeśli przed odczytem 

płytkę pozostawi się na kilka godzin w temperaturze pokojowej. Należy zawsze 

zidentyfikować ten typ kolonii, wykluczając zanieczyszczenie. 

Czas inkubacji 

Większość metod uwzględnia 16 – 18-godzinny okres inkubacji. Jakkolwiek 

w wyjątkowych sytuacjach wstępny wynik może zostać przygotowany po 

6 godzinach. Nie jest to metoda zalecana i w każdym przypadku wyniki należy 

potwierdzić po odpowiednim czasie inkubacji. 

Rozmiar płytek, grubość warstwy podłoża 

agarowego i rozmieszczenie kra˛żków 

z antybiotykami 

Testy wrażliwości przeprowadza się zwykle na płytkach o średnicy 9 – 10 cm, 

umieszczając nie więcej niż 6 – 7 krążków na każdej z nich. W przypadku badania 

wrażliwości na większą liczbę antybiotyków zaleca się użycie dwóch płytek lub 

134

CZE˛ŚĆ I 

jednej o średnicy 14 cm. Na bardzo cienkich podłożach może wytwarzać się 

większa strefa zahamowania; odwrotnie dzieje się w przypadku zbyt grubych 

podłoży. Właściwe rozmieszczenie krążków zapobiega nakładaniu się stref 

zahamowania lub powstawaniu zniekształceń przy brzegach płytki (patrz ryc. 15). 

WHO 86961 

Ryc. 15. Szablon do równomiernego nakładania kra˛żków napłytkę średnicy 90 mm. 

Stężenie antybiotyków w kra˛żkach 

Średnica strefy zahamowania zależy od zawartości antybiotyku w krążku. 

Zmniejszeniu aktywności leku w źle przechowywanym krążku towarzyszy 

odpowiednie zmniejszenie wielkości strefy zahamowania. 

Skład podłoża 

Podłożewpływa na wielkość strefy, decydując o stopniu wzrostu, współczynniku 

dyfuzji i aktywności leku. Ważne jest stosowanie podłoży odpowiednich dla danej 

metody. 

Możliwość uzyskania różnych warunków badania lekowrażliwości, wpływających 

na średnicę strefy, jasno przemawia za potrzebą standaryzacji metody 

dyfuzyjno-krążkowej. Jedynie przestrzeganie ustalonych parametrów metody 

umożliwia uzyskanie wartościowych wyników. Nieprawidłowości zaburzające 

przebieg badania mogą prowadzić do przedstawienia lekarzowi rażąco błędnych 

wyników. 

Precyzja i dokładność metody powinny być monitorowane za pomocą ustalonego, 

opisanego poniżej programu kontroli jakości. W ten sposób możliwa jest szybka 

identyfikacja i korekta błędów. 

135


Kontrola jakości 

Potrzeba kontroli jakości testu 


Na końcowy wynik testu dyfuzyjno-krążkowego wpływa duża liczba zmiennych. 

Niektóre z nich, takie jak gęstość inoculum i temperatura inkubacji, łatwo 

kontrolować, jednak laboratorium rzadko znany jest dokładny skład podłoża 

komercyjnego lub różnice w jakości kolejnych serii. Laboratorium nie może 

również odpowiadać za zawartość antybiotyków w krążkach. Wyniki testów 

muszą być ciągle monitorowane w programie kontroli jakości, który należy 

traktować jako element procedury. 

Precyzja i dokładność metody powinny być kontrolowane przez równoległe 

wykonywanie testów dla szczepu kontrolnego o znanej lekowrażliwości. Szczepy 

kontrolne i badane drobnoustroje podlegają tej samej procedurze. Uzyskane dla 

mikroorganizmów kontrolnych wielkości stref powinny odpowiadać wartościom 

przedstawionym w tabeli 24. Powtarzające się uzyskiwanie wyników, które nie 

mieszczą się w określonym zakresie, jest przypuszczalnie efektem błędu 

technicznego lub użycia niewłaściwych odczynników. Należy sprawdzić każdy 

odczynnik i etap testu, odnaleźć i wyeliminować błąd. 

Standardowa procedura kontroli jakości 

Program kontroli jakości polega na równoległym prowadzeniu oznaczania 

wrażliwości dla szczepów kontrolnych i badanych. Kontrole należy przeprowadzać 

co tydzień lub dla co piątej serii badań i — dodatkowo — przy każdej 

nowej partii agaru Mueller-Hintona lub krążków. 

Standardowe szczepy do kontroli jakości 

Staphylococcus aureus (ATCC 25923) 

Escherichia coli (ATCC 25922) 

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) 

Powyższe szczepy można uzyskać z państwowych kolekcji szczepów. Są także 

dostępne komercyjnie w formie liofilizowanej uzyskanej z czystych hodowli. 

Hodowle szczepów wzorcowych do codziennego użytku powinny być prowadzone 

na skosach lub agarze odżywczym (zalecany jest agar tryptozowo-sojowy) 

i przechowywane w chłodziarce. Co 2 tygodnie należy przesiewać hodowle na 

świeże skosy. 

Przygotowanie inoculum 

Hodowle można zakładać na każdym podłożu płynnym i inkubować do chwili 

zmętnienia bulionu. Z każdego podłożapłynnego należy przesiać szczep na płytkę 

agarową i inkubować przez noc. Następnie pobrać pojedyncze kolonie i przeprowadzić 

badanie wrażliwości w sposób opisany na stronach 127 – 130. 

136

CZE˛ŚĆ I 

25 

24 

23 

22 

21 

20 

19 

18 

17 

16 

15 

14 

13 

12 

11 

10 

Data 

X 

X X X X 

X X 

X 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819 202122232425262728293031 

Ryc. 16. Karta kontroli jakości antybiogramów. 

WHO 91093 

▲ 

Akceptowalna 

średnica 

▼ 

Nakładanie kra˛żków z antybiotykami 

Po posianiu inoculum na płytki, w sposób opisany na str. 129, nałożyć 

odpowiednie krążki na płytkę. Wybrane krążki dla każdego szczepu kontrolnego 

zostały wymienione w tabeli 24. 

Odczytywanie wyników 

Po 16 – 18 godzinach inkubacji należy zmierzyć linijką średnice stref zahamowania 

i zapisać, łącznie z datą badania, na specjalnej karcie kontroli jakości. Zapis 

powinien być prowadzony dla każdej kombinacji szczep-krążek. Karta zawiera 

diagram wielkości stref w milimetrach, z zaznaczonym zakresem wartości 

prawidłowych. Przykład takiej karty przedstawiono na ryc. 16. Jeśli wyniki 

systematycznie wykraczają poza dopuszczalne granice, należy podjąć działania, 

które poprawią jakość badania. 

Istotne odchylenia wyników, których nie można wyjaśnić technicznymi błędami 

w procedurze, mogą wskazywać na zanieczyszczenie, nagłą zmianę wrażliwości 

lub zmianę właściwości szczepu kontrolnego. Należy wówczas uzyskać z wiarygodnego 

źródła świeży szczep wzorcowy. 

137

Badania serologiczne 

Wprowadzenie 

Odczyny serologicznie, w przeciwieństwie do posiewów i badań mikrobiologicznych, 

wykrywając w próbkach klinicznych antygeny bakteryjne lub przeciwciała 

powstałe w odpowiedzi na nie, dostarczają jedynie pośrednich dowodów 

zakażenia. Testy te, ze względu na wysoką swoistość i czułość,sąobecnie szeroko 

stosowane w mikrobiologii. 

W odpowiedzi na pierwotne zakażenie patogennym drobnoustrojem większość 

pacjentów wytwarza zarówno przeciwciała IgM, jak i IgG. Po kilku tygodniach 

dominującą klasą przeciwciał stają się IgG i w konsekwencji tylko IgG pozostają 

w surowicy pacjenta. Kolejna infekcja wywołana przez ten sam patogen wywołuje 

odpowiedź z wytworzeniem przeciwciał IgG. Ponieważ komórki wytwarzające 

przeciwciała zachowują pamięć immunologiczną, odpowiedź taka, w porównaniu 

z odpowiedzią pierwotną, jest zwykle szybsza i bardziej nasilona; jest to tak zwana 

odpowiedź wtórna. 

Poziom przeciwciał najczęściej oznaczany jest przez ,,miareczkowanie’’. Diagnostyczne 

miano jest największym rozcieńczeniem surowicy pacjenta, przy 

którym wykrywalne są jeszcze przeciwciała. Na przykład, jeśli przeciwciała 

wykrywane są w rozcieńczeniu 1:1024 i nie wyższym, miano surowicy wynosi 

1024. Surowica pobrana w ostrym okresie infekcji, przy podejrzeniu pierwotnego 

zakażenia, nosi nazwę surowicy fazy ostrej; surowica pobrana w czasie rekonwalescencji, 

zwykle 2 tygodnie później, nosi nazwę surowicy ozdrowieńca. 

Reakcja na antygen pojawia się niezależnie od okresu zakażenia, choć jej typ 

może być różny. Obecność przeciwciał IgG w pojedynczej próbce surowicy może 

wskazywać na ekspozycję w przeszłości, nie pozwala więc na rozpoznanie 

świeżej infekcji. Niekiedy antygen stymuluje również powstawanie przeciwciał 

reagujących krzyżowo z innymi antygenami. Ze względu na brak swoistości 

takich przeciwciał, badanie jednej próbki surowicy może prowadzić do niewłaściwej 

interpretacji wyników. W większości testów serologicznych należy wykonać, 

najlepiej jednocześnie, badanie surowicy pobranej w ostrym okresie choroby 

i surowicy ozdrowieńca; zapobiega to ewentualnym różnicom wynikającym 

z warunków przeprowadzania badania. Wzrost miana przeciwciał o dwa dwukrotne 

rozcieńczenia (np. z rozcieńczenia 1:8 do 1:32) świadczy zwykle o świeżym 

zakażeniu. Jest to tak zwany czterokrotny wzrost miana. Badanie pojedynczej 

próbki surowicy może być przydatne tylko w niektórych przypadkach, np. 

w diagnostyce zakażenia Mycoplasma pneumoniae, gdy wysokie miana lub 

obecność przeciwciał IgM wskazują na świeżą infekcję. Typ reakcji antygen- 

-przeciwciało zależy od rodzaju antygenu. 

Metody kontroli jakości 

Wiarygodność i spójność wyników badań serologicznych całkowicie zależą od 

metod kontroli jakości, przeprowadzanej przed, podczas i po każdym teście. 

Środki kontroli jakości są niezmiernie istotne ze względu na fałszywie dodatnie 

ifałszywie ujemne wyniki, które mogą istotnie wpływać na decyzje lekarza, 

dotyczące leczenia pacjenta. Na jakość badań serologicznych wpływa wiele 

138

CZE˛ŚĆ I 

czynników, do których zaliczane są: doświadczenie personelu laboratoryjnego, 

jakość zestawów i wyposażenie, jakość próbek, kontrole stosowane w testach oraz 

interpretacja i wydawanie wyników. Po wykonaniu testu, należy wyrzucić zużyte 

materiały do pojemnika wypełnionego środkiem dezynfekującym, umyć i zdezynfekować 

ręce oraz powierzchnię blatu. 

Wyposażenie 

Do wyposażenia laboratorium serologicznego należą: łaźnie wodne, cieplarki, 

chłodziarki, zamrażarki, pH-metry, wagi, wirówki, mikroskopy i wytrząsarki. 

Monitoring i rutynowe przeglądy sprzętu są istotnym elementem programu 

zapewnienia jakości. Należy przestrzegać stałego serwisowania sprzętu z okresowymi 

przeglądami i ewentualną kalibracją lub naprawą. Dla każdego urządzenia 

należy prowadzić zapis dat przeglądu, serwisu i naprawy. 

Łaźnia wodna poza czasem jej wykorzystania powinna być pozostawiana pusta, 

co miesiąc suszona i czyszczona. Temperaturę łaźni wodnej należy starannie 

kontrolować, nie dopuszczając do zmian większych niż ± 1°C; konieczny jest 

codzienny pomiar i zapis temperatury, również w trakcie działania. Wskazane jest 

stosowanie pokrywy, która zapobiega chłodzeniu powierzchni wody. Mieszaninę 

antygenu i przeciwciał można inkubować dopiero po uzyskaniu wymaganej 

temperatury i utrzymaniu jej co najmniej przez godzinę. Poziom wody powinien 

odpowiadać poziomowi płynu w umieszczonych w łaźni probówkach lub kolbach. 

Mikroskopy mają największe znaczenie przy wykonywaniu testu VDRL (Venereal 

Disease Research Laboratory, VDRL) oraz testu immunofluorescencji krętków 

w modyfikacji absorpcyjnej (FTA-Abs) i muszą być utrzymywane w możliwie 

najlepszym stanie. Po użyciu okular, obiektyw i kondensator mikroskopu należy 

przetrzeć miękką szmatką, usuwając resztki olejku i zanieczyszczenia. Nieużywany 

mikroskop przechowuje się pod przykryciem, zabezpieczony przed wilgocią. 

Intensywność lampy rtęciowej w mikroskopie fluorescencyjnym należy sprawdzać 

regularnie z użyciem światłomierza. 

Należy kontrolować działanie wytrząsarek do testów VDRL oraz szybkiego testu 

do wykrywania reagin w osoczu (RPR) i korygować wszelkie zmiany, które mogą 

mieć niekorzystny wpływ na reakcję aglutynacji. Mechaniczna wytrząsarka 

powinna być regularnie oliwiona. 

Materiały 

Szklane naczynia i igły używane w testach serologicznych muszą spełniać 

określone parametry. 

Nie należy korzystać z uszczerbionych lub porysowanych naczyń, płytek 

i szkiełek. Użycie brudnych lub niewłaściwie oczyszczonych szklanych naczyń, 

które mogą zawierać organiczne zanieczyszczenia, jest główną przyczyną 

fałszywych wyników. Przy stanowisku przeznaczonym do mycia należy umieścić 

pisemne instrukcje. Główne etapy mycia powinny obejmować: wstępne płukanie, 

mycie właściwym detergentem laboratoryjnym, płukanie wodą z kranu, a następnie 

wodą destylowaną, suszenie; należy upewnić się,że detergent został usunięty. 

139

BADANIA SEROLOGICZNE 

Wszystkie pipety należy zanurzyć w detergencie tak, aby roztwór wniknął do 

wewnątrz. Płukać pod bieżącą wodą co najmniej 30 minut, a następnie w wodzie 

destylowanej. Szklane płytki używane do odczynów VDRL muszą zostać 

starannie oczyszczone z pozostałości detergentu i resztek olejku. Należy unikać 

przedłużonego moczenia w detergencie ze względu na możliwość uszkodzenia 

pierścieni ceramicznych na płytkach. Szklane płytki z pierścieniami z parafiny 

powinny być czyszczone z użyciem właściwych rozpuszczalników organicznych 

(np. benzyny). 

W odczynie RPR i VDRL do przygotowywania i rozcieńczania antygenu 

wykorzystuje się igły kalibrowane. W zestawie do odczynu RPR znajduje się 

igła, którą należy sprawdzić przed użyciem, określając liczbę kropli/ml. Prawidłowo 

funkcjonująca 20-podziałkowa igła powinna dozować 90 kropli/ml. Nie 

należy stosować igieł działających niewłaściwie. Po użyciu umyć wodą destylowaną. 

Do testu VDRL przygotować dwie igły, odłamując czubki za pomocą 

szczypiec. Sprawdzić igłę określając liczbę kropli/ml: 18-podziałkowa igła 

powinna dozować 60 kropli/ml, a 21 – 22-podziałkowa 100 kropli/ml. Każdą 

nieprawidłowo działającą igłę należy odrzucić lub wyregulować, dociskając lub 

zwalniając koniec. Po użyciu umyć w wodzie destylowanej, 70% etanolu 

i acetonie. 

Odczynniki 

Związki chemiczne stosowane w serologii muszą mieć jakość odczynników 

i spełniać kryteria określonej procedury. Muszą być przechowywane zgodnie 

z zaleceniami producenta. 

Do przygotowania odczynników powinna być używana wysokiej jakości woda 

destylowana o pH 7,0. Należy przechowywać ją w odpowiednio opisanym z datą, 

ciepłoodpornym szklanym naczyniu lub plastikowej butli ze szczelnie domkniętą 

zakrętką. 

Fizjologiczny roztwór soli jest używany sam lub jako roztwór buforowany, na 

przykład buforem fosforanowym. W wilgotnym klimacie, w celu usunięcia wody, 

chlorek sodu należy suszyć gorącym powietrzem w 160 – 180°C przez 30 minut. 

Sól rozpuścić w wodzie destylowanej lub demineralizowanej i przechowywać 

w ciepłoodpornym, odpowiednio opisanym z datą szklanym naczyniu lub 

plastikowej butli, ze szczelnie zamkniętą zakrętką. Przed użyciem buforu 

oznaczyć jego pH. 

Surowice zawierające makroskopowo widoczne cząsteczki należy odwirować 

w 3000 g przez 10 minut i do testów użyć supernatantu. Osocze z hemolizą lub 

zanieczyszczone nie powinno być użyte. Inaktywowaną surowicę do testów 

należy przygotować, ogrzewającw56°C przez 30 minut. Jeśli nie zostanie zużyta 

w ciągu 4 godzin od inaktywacji, należy jąponownie inaktywować, ogrzewając 

w 56°C przez 10 minut. Wszystkie surowice przed użyciem pozostawić 

w temperaturze pokojowej. 

W rozdziale zostaną szczegółowo omówione niektóre testy serologiczne najczęściej 

wykonywane w laboratoriach medycznych. Należą do nich testy do 

diagnostyki kiły, test Wrighta do diagnostyki brucelozy i test wykrywający 

antystreptolizynę O do diagnostyki późnych powikłań po zakażeniach paciorkowcowych. 

140

CZE˛ŚĆ I 

Każdy opis procedury odnosi się do badań wykonywanych z użyciem komercyjnych 

zestawów do przeprowadzania testów. Gotowe zestawy są wytwarzane przez 

wielu producentów, zawierają w opakowaniu szczegółowe instrukcje, które przed 

użyciem należy uważnie przeczytać. 

Reakcje serologiczne 

Odczyn kłaczkuja˛cy i precypitacji 

W odczynie kłaczkującym, w wyniku reakcji rozpuszczonego antygenu z przeciwciałami, 

powstaje precypitat, który można oglądać zarówno pod mikroskopem, 

jak i gołym okiem. Po zmieszaniu odczynników prawie natychmiast 

pojawia się wstępne wiązanie antygenu przez przeciwciała. Dalsze formowanie 

większych, widocznych kłaczków wymaga godziny lub dłuższego czasu i jest 

zależne od temperatury. Reakcja zachodzi szybciej w strefie ,,równoważnej’’, 

optymalnego stosunku antygen-przeciwciało. Probówka z najszybciej tworzącym 

się precypitatem jest dobrym wskaźnikiem równoważności. Najszerzej stosowanymi 

odczynami kłaczkującymi są testy VDRL i RPR. Obydwa wykorzystywane 

w diagnostyce kiły (wywołanej przez Treponema pallidum) i innych zakażeń 

krętkowych. 

Odczyn kłaczkujący dostarcza jakościowego dowodu reakcji antygen-przeciwciało, 

ale nie wskazuje, czy obecna jest jedna, czy kilka reakcji antygen- 

-przeciwciało. Jeśli jednak test przeprowadzany jest na półpłynnym żelu, ze 

względu na różną zdolność do dyfuzji i współczynniki migracji antygenów, 

można reakcje te rozróżnić. 

Odczyn aglutynacji 

W odczynie aglutynacji reagent, którym może być antygen lub przeciwciało, 

jest osadzony lub zaabsorbowany na mikrocząsteczce. Nośnikami reagentów 

mogą być różne cząsteczki, np. lateks, żelatyna, mikrogranulki, bakterie lub 

krwinki czerwone. Technika ta nosi również nazwę biernej aglutynacji. Jeśli 

nośnikiem są erytrocyty, technikę określa się mianem hemaglutynacji biernej, 

jeżeli są to komórki gronkowca, technika nosi nazwę koaglutynacji. Po dodaniu 

swoistej surowicy odpornościowej komórki lub inne cząstki tworzą sieć połączeń 

i w rezultacie aglutynat z wyraźnym supernatantem. Używając surowicy 

o znanej swoistości można przeprowadzać identyfikację nieznanych mikroorganizmów 

lub ich antygenów. Test można wykonać na szkiełku i odczytać 

wynik makroskopowo lub pod mikroskopem w małym powiększeniu. Odczyn 

aglutynacji wykorzystuje się także do oceny miana aglutynin przeciwbakteryjnych 

w surowicy pacjentów z nieznaną chorobą. Wzrost miana podczas 

trwania choroby przemawia jednoznacznie za związkiem przyczynowo- 

-skutkowym. 

Aglutynacja szybciej zachodzi w wyższych temperaturach (35 – 56°C) i przy 

ruchu (np. wstrząsanie, mieszanie lub wirowanie), które ułatwiają kontakt między 

antygenem i przeciwciałem. Proces aglutynacji wymaga obecności soli. Potencjalnie 

poważny problem stanowi prozona: zahamowanie reakcji serologicznej 

wskutek nadmiaru antygenu lub przeciwciał. Prozona daje fałszywie ujemny 

wynik testu; tego błędu można jednak uniknąć badając seryjne rozcieńczenia 

surowicy. 

141


Powszechnie stosowany test aglutynacji wykorzystuje Staphylococcus aureus, 

zawierający na swojej powierzchni białko A. Jest to białko wiążące fragment Fc 

przeciwciał IgG. Gronkowce opłaszczone przeciwciałami IgG w obecności 

swoistego antygenu dają wyraźnie widoczną aglutynację. Odczyn stosowany jest 

głównie do identyfikacji drobnoustrojów hodowanych z próbek klinicznych lub 

do wykrywania antygenów bakteryjnych w płynach ustrojowych zakażonych 

pacjentów (płyn mózgowo-rdzeniowy w przypadku zapalenia opon mózgowo- 

-rdzeniowych). 

Odczyny aglutynacji wykorzystywane są do wykrywania wirusa Epsteina-Barr 

(mononukleoza zakaźna), rotawirusów, różyczki oraz antygenów bakteryjnych 

(m.in. Haemophilus i Streptococcus A i B). 

Odczyn immunofluorescencji 

W odczynach immunofluorescencji immunoreagent (antygen lub przeciwciało) 

znakowany jest barwnikiem fluorescencyjnym, na przykład fluoresceiną lub 

rodaminą, a reakcja antygenu z przeciwciałem wykrywana jest w mikroskopie 

fluorescencyjnym. W odczynie immunofluorescencji bezpośredniej do wykrycia 

obecności specyficznego antygenu wykorzystuje się znaczone fluoresceiną 

przeciwciała. Odczyny są przydatne w szybkiej identyfikacji Chlamydia trachomatis, 

C. psittaci, Rickettsia spp., Streptococcus pyogenes, Bordetella pertussis, 

Corynebacterium diphtheriae, Legionella pneumophila i innych drobnoustrojów 

izolowanych z próbek klinicznych. 

W odczynie immunofluorescencji pośredniej (indirect fluorescent antibody 

— IFA) wykonuje się badania seryjnych rozcieńczeń surowicy pacjenta ze 

specyficznym antygenem, a dla uwidocznienia reakcji dodaje się znakowane 

fluoresceiną przeciwciała przeciw ludzkim immunoglobulinom IgG lub IgM. Na 

przykład, w serodiagnostyce kiły, szkiełko z adsorbowanym antygenem Treponema 

pallidum zanurza się w surowicy pacjenta i spłukuje. Następnie na szkiełku 

umieszcza się znakowane fluoresceiną przeciwciała przeciw ludzkim immunoglobulinom, 

spłukuje i preparat ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym. Jeśli 

surowica pacjenta zawiera specyficzne przeciwciała przeciw Treponema pallidum, 

widoczne są jasno fluoryzujące krętki. Przy braku specyficznych przeciwciał 

przeciwkrętkowych w surowicy pacjenta krętki nie świecą. Test IFA może 

być również wykorzystywany do identyfikacji innych bakterii, na przykład 

prątków gruźlicy, a z powodu większej liczby znakowanych fluoresceiną 

przeciwciał łączących się z antygenem stanowi często czulszą metodę niż test 

immunofluorescencji bezpośredniej. 

Odczyny serologiczne w diagnostyce kiły 

Odczyny serologiczne wykonywane w diagnostyce kiły to testy krętkowe 

i niekrętkowe. Do odczynów niekrętkowych należą: VDRL i RPR. Użyty w nich 

antygen przygotowywany jest z antygenów niekrętkowych, takich jak kardiolipina-lecytyna 

i wykrywa podobne do przeciwciał reaginy, które są obecne 

w surowicy wielu pacjentów zkiłą, ale mogą także występować w surowicy 

pacjentów z innymi ostrymi i przewlekłymi schorzeniami. Testy są praktyczne, 

niedrogie i powtarzalne, mimo że nie całkiem swoiste. Mogą potwierdzać 

rozpoznanie wczesno- lub późnoobjawowej kiły lub być podstawą rozpoznania 

142

CZE˛ŚĆ I 

kiły późnej. Są lepsze niż odczyny krętkowe w monitorowaniu pacjentów po 

leczeniu. VDRL jest skutecznym narzędziem w badaniach epidemiologicznych 

kiły i innych chorób krętkowych. 

Odczyny z antygenami Treponema pallidum wykrywają swoiste przeciwciała, 

powstające w odpowiedzi na zakażenie kiłą. Sąwykorzystywane do potwierdzenia 

dodatnich wyników testów niekrętkowych. Odczyn immunofluorescencji 

krętków w modyfikacji absorpcyjnej (FTA-Abs) i odczyn hemaglutynacji 

Treponema pallidum (TPHA) są wysoce swoiste i czułe, ale nie różnicują 

przebytych i aktywnych zakażeń kiły; nie można ich stosować w ocenie wyników 

leczenia. 

Odczyn VDRL 

W odczynie wykorzystuje się cząsteczki cholesterolu opłaszczone kompleksem 

kardiolipina-lecytyna. Inaktywowaną surowicę lub płyn mózgowo-rdzeniowy 

wytrząsa się na wytrząsarce z zawiesiną antygenu VDRL przez podany okres. Jeśli 

reaginy są obecne w badanym płynie, obserwuje się mikroflokulację. 

Odczyn VDRL jest wysoko dodatni we wczesnej kile. Po skutecznym leczeniu 

miano stopniowa spada i zwykle w ciągu 1 – 2 lat odczyn staje się ujemny. 

Wpóźnej fazie choroby przez wiele lat, nawet po skutecznym leczeniu, surowica 

może wykazywać dodatnie reakcje o niskim mianie (np. 1:8 lub mniejszym). 

Reaktywność może spontanicznie zanikać u20– 30% nieleczonych pacjentów 

w fazie latentnej choroby, a nawet częściej w późnej fazie kiły. 

Fałszywie dodatnie wyniki obserwuje się z powodu podobieństwa antygenu 

VDRL do tkanek gospodarza. Fałszywe wyniki mogą występować u osób 

zdrowych, jakkolwiek często związane są z określonymi chorobami lub przebytym 

szczepieniem. Fałszywie dodatnie reakcje, najczęściej o niskim mianie (1:8 

lub mniej), obserwowane są u osób z wirusowymi i bakteryjnymi zakażeniami 

(atypowe zapalenie płuc, choroba papuzia, mononukleoza zakaźna i zapalenie 

wątroby), podczas ciąży lub po niedawnym szczepieniu. Utrzymujące się 

fałszywie dodatnie wyniki, zwykle o dużym mianie, związane są z obecnością 

autoprzeciwciał (czynnik reumatoidalny), występują u pacjentów z trądem, 

gruźlicą, zaburzeniami odporności (np. toczeń rumieniowaty, kolagenozy, choroby 

reumatyczne, zespół Sjögrena, dysgammaglobulinemia), rzadziej u osób 

z malarią lub uzależnionych od heroiny. Dodatni i słabo dodatni wynik odczynu 

VDRL nie powinien być traktowany jako ostateczny dowód kiły, podobnie jak 

pojedynczy ujemny wynik nie wyklucza rozpoznania. Dla każdej słabo dodatniej 

i dodatniej próbki, przy braku klinicznych objawówkiły, należy wykonać badania 

zużyciem odczynów krętkowych FTA-Abs lub TPHA. 

Materiały i odczynniki zawarte w zestawie 

do odczynu VDRL 

Buforowany fizjologiczny roztwór soli 

Zestaw kontrolnych surowic (ujemna, słabo dodatnia, dodatnia) 

Antygen VDRL 

143


Dodatkowe materiały i odczynniki 

potrzebne do odczynu VDRL 

Alkohol absolutny i aceton 

Szkiełko do aglutynacji o wymiarach około5× 7,5 cm z zagłębieniami o średnicy 

16 mm i głębokości 1,75 mm do badania płynu mózgowo-rdzeniowego 

Odpowiednia liczba fiolek 

Woda destylowana lub dejonizowana 

Szklane płytki z 12 parafinowymi lub ceramicznymi pierścieniami o średnicy 

około 14 mm do badania surowicy 

Komora wilgotna 

Igły podskórne bez skosu: 18-podziałkowe do badań surowicy i 21- lub 

22-podziałkowe do badań płynu mózgowo-rdzeniowego 

Stoper 

Mikroskop świetlny o powiększeniu × 10 okular i × 10 obiektyw 

Wytrząsarka o ruchu kolistym o średnicy 2 cm, szybkości 180 obr./min, 

w ustawieniu poziomym, z automatycznym pomiarem czasu 

pH-metr 

Pipety serologiczne: 5,0 ml, 1,0 ml i 0,2 ml 

Sterylne roztwory soli (0,85% i 10%) 

Strzykawka typu Luer, 1 lub 2 ml 

Butelka z zawiesiną antygenu VDRL, 30-ml, okrągła, zamykana szklanym 

korkiem, z wąskim wlotem, o średnicy około 35 mm, z płaskim dnem 

Łaźnia wodna (56°C) 

Przygotowanie antygenu VDRL 

i surowicy kontrolnej 

Antygen VDRL jest alkoholowym roztworem lipidów (kardiolipiny i lecytyny) 

i cholesterolu. Są to substancje nierozpuszczalne w wodzie. Przygotować świeżą 

zawiesinę w dniu użycia, ponieważ antygen VDRL jest niestabilny. Zawartość 

ampułki z antygenem rozlać do fiolek do przechowywania. Upewnić się,że fiolki 

są szczelnie zamknięte i przechowywać w ciemności w 15 – 30°C. Wyjmować 

antygen według potrzeb. 

Po otwarciu butelkę z buforowanym roztworem soli przechowywać wchłodziarce. 

Nie używać, jeśli pojawi się zmętnienie. 

Do kontrolnej surowicy dolać 3 ml destylowanej lub dejonizowanej wody. 

Nadwyżkę przygotowanych na dany dzień rozpuszczonych surowic podzielić na 

odpowiednią liczbę porcji (dzienne zapotrzebowanie) i przechowywać w temperaturze 

–20°C do miesiąca. Nie zamrażać ponownie po rozmrożeniu. Surowice, 

przeznaczone do wykorzystania w ciągu dnia, przechowywać wchłodziarce 

w2– 8°C. 

Przygotowanie zawiesiny antygenu VDRL 

1. Ogrzać antygen i buforowany roztwór soli do temperatury pokojowej. 

Sprawdzić pH buforowanego roztworu soli, wartość nie powinna przekraczać 

pH 6,0 ± 0,1. 

2. Do butelki z zawiesiną antygenu dodać pipetą 0,4 ml buforowanego roztworu 

soli i delikatnie przechylić naczynie, rozprowadzając warstwę płynu na dnie. 

144

CZE˛ŚĆ I 

3. Za pomocą 1-mililitrowej kalibrowanej pipety odmierzyć 0,5 ml roztworu 

antygenu i dodać w opisany poniżej sposób: 

• Trzymać pipetę w 1 / 3 wysokości butelki. Nie dotykać roztworu soli. 

• Mieszając ręcznie ruchem kolistym o średnicy około 5 cm, dodawać po 

kropli antygenu. 

• Wkraplać antygen w ten sposób przez około 6 sekund, a następnie dodać 

pozostały antygen z pipety. 

• Mieszać jeszcze przez 10 sekund. 

4. Dodać 4,1 ml buforowanego roztworu soli, wlewając gopościankach butelki. 

5. Zamknąć butelkę szklanym korkiem i wstrząsać wgórę iwdół około 30 razy 

przez 10 sekund. 

6. Pozostawić zawiesinę antygenu na co najmniej 10 minut. Wstrząsnąć 

delikatnie przed użyciem. Zawiesinę należy wykorzystać w ciągu 8 godzin. 

7. W przypadku badania płynu mózgowo-rdzeniowego rozcieńczyć antygen 10% 

roztworem soli w stosunku 1:2. Wstrząsać butelkę delikatnie przez 10 sekund, 

pozostawić na co najmniej 5 minut i użyć najpóźniej w ciągu 2 godzin. 

Jakościowy odczyn VDRL 

1. Za pomocą 1,0-mililitrowej pipety kilkakrotnie wymieszać, a następnie 

umieścić 0,05 ml inaktywowanej surowicy we wgłębieniu szklanej płytki 

VDRL. 

2. Rozprowadzić surowicę okrężnymi ruchami końcówki pipety, tak by pokryła 

całą wewnętrzną powierzchnię parafinowego lub ceramicznego wgłębienia. 

Jedynie użycie czystych płytek umożliwia równomierne rozprowadzenie 

surowicy. 

3. Trzymając poziomo strzykawkę z 18-podziałkową igłą, do surowicy dodać 

uważnie 1 kroplę antygenu (1/60 ml). Nie dotykać surowicy igłą. 

4. Płytki w komorze wilgotnej wstawić na 4 minuty do wytrząsarki. Jeśli 

wytrząsarka nie jest dostępna, płytki kołysać ręcznie, ciągłym ruchem kolistym 

przez 4 minuty. 

5. Natychmiast po wymieszaniu ocenić preparat pod mikroskopem w powiększeniu 

× 10 okular i × 10 obiektyw. 

6. Odczytać reakcje w poniższy sposób: 

Średnie i duże grudki 

R — Reactive/Dodatnia 

Drobne grudki 

W — Weakly reactive/Słabo dodatnia 

Brak grudek lub bardzo słaby ślad N — Non-reactive/Ujemna 

Surowica słabo dodatnia lub wykazująca śladowy odczyn, ze względu na 

obserwowane niekiedy reakcje prozony, powinna zostać powtórnie zbadana 

w teście półilościowym. 

Półilościowy odczyn VDRL 

1. Przygotować serie podwójnych rozcieńczeń inaktywowanej surowicy w 0,85% 

NaCl (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). 

2. Dla każdego rozcieńczenia surowicy przeprowadzić badanie jakościowe. 

3. Zapisać wyniki i zgodnie z poniższymi przykładami określić najwyższe 

dodatnie rozcieńczenie surowicy (nie słabo dodatnie): 

4. W przypadku dodatnich wyników obserwowanych w rozcieńczeniu 1:32 

przygotować kolejne podwójne rozcieńczenia w 0,85% NaCl (1:64, 1:128 

i 1:256) i przeprowadzić ponownie badanie jakościowe. 

145


Surowica 

nierozcieńczona 

Rozcieńczenie 

1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 

Wynik 

W N N N N N Słabo dodatni, bez rozcieńczenia 

R W N N N N Dodatni, bez rozcieńczenia 

R R W N N N Dodatni, rozcieńczenie 1:2 

R R R W N N Dodatni, rozcieńczenie 1:4 

W W R R W N Dodatni, rozcieńczenie 1:8 

N (szorstki) W R R R N Dodatni, rozcieńczenie 1:16 

W — Weakly reactive/reakcja słabo dodatnia 

R — Reactive/reakcja dodatnia 

N — Non-reactive/reakcja ujemna 

Odczyn RPR 

Zawiesina antygenu w teście RPR zawiera cząsteczki węgla pozwalające na 

makroskopowe uwidocznienie odczynu kłaczkującego. Główne różnice w stosunku 

do odczynu VDRL dotyczą użycia utrwalonego antygenu, kartoników zamiast 

płytek, możliwości wykonania badania zarówno z surowicą, jak i z osoczem, bez 

konieczności inaktywacji surowicy. Potrzebna jest niewielka ilość próbki, można 

użyć również osocza z krwi włośniczkowej. Testu RPR nie stosuje się do badania 

płynu mózgowo-rdzeniowego. 

W odczynie RPR antygen jest gotowy do użycia. Nie wymaga wcześniejszego 

przygotowania czy rozcieńczenia. Termin ważności nieotwartego, przechowywanego 

w chłodziarce antygenu, wynosi jeden rok. Otwarty, przechowywany 

wchłodziarce w plastikowym dozowniku, utrzymuje swoją aktywność przez 

3 miesiące. Test RPR jest nieco bardziej czuły, prostszy i szybszy niż test VDRL. 

Fałszywie dodatnie wyniki uzyskuje się nieznacznie częściej niż w odczynie 

VDRL. Niektóre zestawy do testów wymagają użycia wytrząsarki do wymieszania 

reagentów, podczas gdy w innych można wymieszać je ręcznie. 


do odczynu RPR 

Igła dozująca 60 kropli/ml zawiesiny antygenu 

Surowice kontrolne, dodatnia i ujemna 

Jednorazowe zakraplacze do odmierzenia 50 µl surowicy lub osocza 

Kartoniki RPR pokryte warstwą plastiku, każdy z dwoma rzędami po pięć 

dołeczków 

Gotowa zawiesina antygenu RPR 

Mieszadełka 


potrzebne do odczynu RPR 

Jednorazowy zakraplacz 

Dermatograf 

Komora wilgotna 

Wytrząsarka o ruchach kolistych o średnicy 2 cm, szybkości 180 obr./min, 

w ustawieniu poziomym, z automatycznym pomiarem czasu 

Sterylny roztwór NaCl (0,85%) 

146

CZE˛ŚĆ I 

Jakościowy odczyn RPR 

1. Wyjąć zestaw odczynników z lodówki i pozostawić do ogrzania do temperatury 

pokojowej. 

2. Przygotować surowicę kontrolną, dodając wskazaną objętość wody destylowanej. 

3. Opisać każdy dołeczek na kartoniku RPR laboratoryjnym numerem badania, 

pozostawiając miejsce dla dodatniej, słabo dodatniej i ujemnej surowicy 

kontrolnej. 

4. Za pomocą jednorazowego zakraplacza umieścić 50 µl surowicy lub osocza 

w odpowiednim dołeczku. Dla każdej próbki użyć nowego zakraplacza. 

5. Delikatnie wstrząsnąć zawiesiną antygenu i do każdego dołeczka, dozującą 

igłą z zestawu, dodać bezkontaktowo kroplę antygenu. Ostrożnie wymieszać 

zawiesinę antygenu z surowicą. Dla każdej próbki użyć nowego mieszadełka. 

Dokładnie rozprowadzić. 

6. Kartoniki w komorze wilgotnej wstawić na 8 minut na wytrząsarkę. Jeśli 

wytrząsarka nie jest dostępna, kartoniki kołysać ręcznie, ciągłym ruchem 

kolistym przez 2 minuty, następnie umieścić na 6 minut w wilgotnej komorze 

zawierającej zwilżoną bibułę lub inny materiał. Wyjąć kartonik i obracać przez 

chwilę, do uzyskania końcowego wyniku. Uważać, aby nie zmieszać próbek ze 

sobą. 

7. Po zdjęciu z wytrząsarki obejrzeć kartoniki w dobrym świetle. Dodatnia 

surowica kontrolna powinna wykazywać wyraźnie widoczną reakcję. Ujemna 

surowica kontrolna nie wykazuje reakcji. Krótkie obracanie i przechylanie 

kartonika w rękach może pomóc w zróżnicowaniu słabo dodatnich i ujemnych 

próbek. 

8. Zapisać wynik badania: 

• Małe lub duże kłaczkowate skupiska: dodatni. 

• Jednolite zmętnienie zawiesiny cząsteczek: ujemny. 

9. Przygotować seryjne rozcieńczenia każdej dodatniej surowicy w celu oznaczenia 

miana. 

Półilościowy odczyn RPR 

1. Wyjąć zestaw odczynników z lodówki i pozostawić do ogrzania do 

temperatury pokojowej. 

2. Opisać rząd 5 dołeczków na kartoniku RPR laboratoryjnym numerem 

badania. 

3. Za pomocą jednorazowego zakraplacza dodać do każdego dołeczka po 

1 kropli roztworu NaCl (0,85%). Nie rozprowadzać. 

4. Za pomocą nowego zakraplacza nanieść 1 kroplę próbki surowicy do 

pierwszego dołeczka. Wymieszać zakraplaczem (zaciągając i wypuszczając 

zawartość 5 – 6-krotnie; unikać tworzenia się pęcherzyków). 

5. Przenieść 50 µl mieszaniny (rozcieńczenie 1:2) do następnego dołeczka. 

Wymieszać. Powtórzyć całą czynność do piątego dołeczka włącznie (rozcieńczenie 

1:32). Usunąć 50 µl mieszaniny z ostatniego rozcieńczenia. 

6. Rozprowadzić przygotowane próbki w dołeczkach, rozpoczynając 

od najwyższego rozcieńczenia. Dla każdej próbki użyć nowego mieszadełka. 

7. Za pomocą dozującej igły dodać bezkontaktowo do każdego dołeczka 

1 kroplę delikatnie wstrząśniętego antygenu. Ostrożnie wymieszać zawiesinę 

antygenu z surowicą. Dokładnie rozprowadzić. Do każdej próbki użyć 

nowego mieszadełka. 

147


8. Kartoniki w komorze wilgotnej wstawić na 8 minut na wytrząsarkę. Jeśli 

wytrząsarka nie jest dostępna, kartoniki kołysać ręcznie, ciągłym ruchem 

kolistym przez 2 minuty, następnie umieścić na 6 minut w wilgotnej komorze 

zawierającej mokrą bibułkę lub inny materiał. Wyjąć kartonik i obracać przez 

chwilę, do uzyskania końcowego wyniku. Uważać, aby nie zmieszać próbek 

ze sobą. 

9. Po zdjęciu z wytrząsarki obejrzeć kartoniki w dobrym świetle. Najwyższe 

rozcieńczenie z widoczną makroskopowo reakcją jest mianem próbki. 

10. Jeśli próbka jest dodatnia przy 1:32, należy wykonać dodatkowe serie 

rozcieńczeń. Przygotować roztwór 1:16 z NaCl (0,85%), a następnie 

w opisany wyżej sposób rozcieńczyć surowicę. 

Odczyn immunofluorescencji krętków 

w modyfikacji absorpcyjnej 

(FTA-Abs) 

W teście FTA-Abs wykorzystuje się utrwalony acetonem na szkiełku antygen 

Treponema pallidum (szczep Nicholsa). Można również użyć zawieszonych 

w roztworze soli liofilizowanych komórek T. pallidum. Inaktywowaną surowicę 

pacjenta inkubuje się z krętkami Reitera, wiążącymi niespecyficzne przeciwciała 

krętkowe. Po absorpcji surowicę umieszcza się na szkiełku. Specyficzne 

przeciwciała z surowicy wiążą się na powierzchni komórek krętków. Po spłukaniu 

dodaje się koniugatu znakowanych fluorescencyjnie (izotiocyjanian fluoresceiny) 

przeciwciał przeciw ludzkim immunoglobulinom. Koniugat zostanie związany 

przez przeciwciała obecne na powierzchni krętków i uwidoczniony w mikroskopie 

fluorescencyjnym. 

Dodatni odczyn pojawia się trzy tygodnie po zakażeniu i utrzymuje się 

u nieleczonych pacjentów Może być także obserwowany kilka lat po skutecznym 

leczeniu we wczesnej fazie i przetrwać u chorych, u których terapię wprowadzono 

dopiero w późnej fazie choroby. Dodatni wynik testu z dużym prawdopodobieństwem 

wskazuje na zakażenie kiłą. Fałszywie ujemne wyniki uzyskuje się 

wyjątkowo rzadko i związane są prawdopodobnie ze złą jakością antygenu. 

Fałszywie dodatnie wyniki mogą być efektem obniżonej jakości odczynników, 

a w rezultacie niedostatecznej eliminacji nieswoistych przeciwciał w procesie 

absorpcji. Fałszywie dodatnie wyniki obserwowano również u pacjentów z marskością 

wątroby, zapaleniem żołędzi, kolagenozą, opryszczką narządów płciowych, 

toczniem rumieniowatym i bardzo rzadko u kobiet w ciąży oraz u zdrowych 

osób z nieznanych przyczyn. 

Wykazano krzyżową reakcję między T. pallidum i Borrelia burgdorferi (choroba 

z Lyme). Próbki z nieproporcjonalnie wysokim mianem w teście FTA-Abs, 

w porównaniu z innymi serologicznymi testami kiłowymi, powinny zostać 

przebadane w kierunku obecności przeciwciał przeciw Borrelia. 

Główną zaletą odczynu FTA-Abs jest jego wysoka swoistość i czułość oraz 

wczesna reaktywność. Wyniki są wiarygodne i mogą być decydujące w wątpliwych 

przypadkach. Test FTA-Abs jest jednak czasochłonny i drogi; wymaga 

dobrego wyszkolenia personelu przeprowadzającego badanie i odczytującego 

wyniki. Powinien więc być traktowany jako test potwierdzenia w przypadkach 

niepewnej diagnozy. 

148

CZE˛ŚĆ I 


do odczynu FTA-Abs 

Roztwór buforu 

Surowice kontrolne, dodatnia i ujemna 

Przeciwciała przeciw ludzkim immunoglobulinom znakowane fluoresceiną (koniugat) 

Liofilizowany ekstrakt krętków Reitera (sorbent) 

T. pallidum utrwalone na szkiełkach 


potrzebne do odczynu FTA-Abs 

Szkiełka nakrywkowe 

Mikroskop fluorescencyjny z UV iluminacją (× 40 obiektyw) 

Podłoże utrwalające 

Buforowana sól, pH 7,2 (PBS) 

Tween 80 (2%)-PBS 

Odczyn FTA-Abs 

1. Wyjąć zestaw odczynników z lodówki i pozostawić do ogrzania do 


2. Pozostawić wymaganą liczbę szkiełek przez 15 minut do ogrzania do 


3. Zmieszać 50 µl surowicy badanej z 0,2 ml sorbentu. Równolegle rozcieńczyć 

dodatnią i ujemną surowicę kontrolną: 1:5 z roztworem buforu i 1:5 

z sorbentem. 

4. Na jedno szkiełko z krętkami nałożyć 10 µl roztworu buforu (kontrola 

koniugatu), na drugie 10 µl sorbentu (kontrola sorbentu). 

5. Na każde kolejne szkiełko nałożyć 10 µl odpowiedniego rozcieńczenia 

surowicy badanej lub kontrolnej. 

6. Umieścić szkiełka w wilgotnej komorze na 30 minut w 37°C. Zanurzyć 

preparaty na 5 minut w roztworze Tween-PBS. Czynność powtórzyć.Spłukać 

wodą destylowaną, odsączyć i zostawić do wyschnięcia w pojemniku na 

preparaty. 

7. Nałożyć na wszystkie szkiełka po 10 µl przeciwciał przeciw immunoglobulinom 

ludzkim rozcieńczonych zgodnie z zaleceniami producenta 

w buforze. 

8. Umieścić szkiełka w wilgotnej komorze na 30 minut w 37°C. Zanurzyć 

preparaty na 5 minut w roztworze Tween-PBS. Czynność powtórzyć.Spłukać 

wodą destylowaną, odsączyć i zostawić do wyschnięcia w pojemniku na 

preparaty. 

9. Na każde szkiełko nałożyć 2 krople podłoża utrwalającego i szkiełko 

nakrywkowe. 

10. Sprawdzić, czy koniugat, absorbent i ujemna surowica kontrolna nie 

wykazują fluorescencji: 

• Brak fluorescencji lub lekko zielonkawe krętki: reakcja ujemna. 

• Różny stopień zielonej fluorescencji: reakcja dodatnia. 

149


Fluorescencję można stopniować: 

Ujemna 0 

Graniczna 1+, 2+, 3+ 

Dodatnia 4+ 

Reakcja 2+ i większa wskazuje na zakażenie T. pallidum. 

Wykrywanie aglutynin w gora˛czce 

Lekarz, który leczy pacjenta z gorączką o nieustalonej przyczynie, często 

zleca wykonanie serii badań serologicznych, wspólnie określanych nazwą 

odczynów aglutynacyjnych w gorączce, w celu potwierdzenia zakażeń wywołanych 

przez Brucella (odczyn Wrighta), Salmonella typhi (odczyn Widala) 

i niektóre riketsje (odczyn Weila-Felixa). Odczyny wykrywają przeciwciała 

aglutynujące skierowane przeciw somatycznemu antygenowi O i/lub rzęskowemu 

antygenowi H poszukiwanych drobnoustrojów lub, w przypadku odczynu 

Weila-Felixa, krzyżowo reagujące z antygenem somatycznym dwóch szczepów 

Proteus vulgaris. 

Odczyny Widala i Weila-Felixa, ze względu na znaczną liczbę technicznych 

i interpretacyjnych problemów, nie są obecnie zalecane do badań przesiewowych. 

Ujemna reakcja nie wyklucza aktywnego zakażenia, ponieważ zakażenie może 

być w fazie inkubacji, w której pacjent nie wytwarza jeszcze wykrywalnej liczby 

przeciwciał. Zjawisko prozony także daje ujemne reakcje; zapobieganiu efektowi 

prozony służy stosowanie seryjnych rozcieńczeń surowicy. Dodatnia reakcja 

z danym antygenem może okazać się niediagnostyczna ze względu na wykazywany 

podczas choroby wzrost wytwarzania heterologicznych aglutynin. Takie 

reakcje noszą nazwę nieswoistej odpowiedzi wtórnej, w której w odpowiedzi na 

stymulację antygenową pacjent wytwarza nieswoiste aglutyniny. Diagnostyka 

serologiczna oparta jedynie na stwierdzeniu wysokiego miana przeciwciał nie jest 

pewna i tylko serokonwersja z czterokrotnym wzrostem miana przeciwciał 

w seryjnych rozcieńczeniach powinna być traktowana jako dowód świeżego 

zakażenia. 

Większość pacjentów z ostrą brucelozą pod koniec drugiego tygodnia zakażenia 

wykazuje miano aglutynin 1:320 i wyższe. Nawet rok po leczeniu u 20% 

pacjentów nadal występują znaczące miana aglutynin Brucella. Wysokie miana 

obserwowano są również u pacjentów zakażonych Francisella tularensis i Yersinia 

enterocolitica, u niedawno szczepionych na brucelozę i cholerę lub 

badanych testem skórnym z brucelerginą. Obserwowano je również u pracowników 

rzeźni. 

Ponieważ hodowle krwi przez wiele tygodni mogą nie wykazywać obecności 

drobnoustrojów, określenie miana aglutynin Brucella może stanowić 

wstępną diagnozę ostrej brucelozy. Izolacja bakterii, zazwyczaj z krwi, dostarcza 

ostatecznych dowodów zakażenia. Przy podejrzeniu choroby i ujemnym 

wyniku posiewu krwi, w celu potwierdzenia zakażenia, można 

przeprowadzić hodowlę szpiku kostnego pobranego z mostka. Pacjent ze 

zlokalizowaną brucelozą może nie gorączkować i nie wykazywać znaczącego 

miana aglutynin Brucella. W tych przypadkach chorobę podejrzewa się na 

podstawie danych epidemiologicznych i obecności zwapniałych węzłów chłonnych 

w badaniach radiologicznych. Diagnozę należy jednak potwierdzić w hodowli 

krwi. 

150

CZE˛ŚĆ I 

Szybki test szkiełkowy jest testem przesiewowym, przeznaczonym do wykrywania 

aglutynin, podczas gdy test probówkowy jest testem potwierdzającym, 

który służy do ilościowej oceny aglutynin. Każdy dodatni wynik otrzymany 

w teście szkiełkowym należy potwierdzić w teście probówkowym. 


do wykrywania aglutynin w brucelozie 

Zawiesina antygenu (B. abortus, B. melitensis) w butelce z zakraplaczem 

Ujemna surowica kontrolna 

Dodatnia surowica kontrolna 

Dodatkowe materiały i odczynniki potrzebne do wykrywania 

aglutynin w brucelozie 

Aplikator patyczków 

Szklana płytka 

Dermatograf 

Pipety, 50 – 1000 µl 

Linijka 

Sterylny roztwór NaCl (0,85%) 

Probówki i stojak na probówki 

Stoper 

Łaźnia wodna z kontrolowaną temperaturą 

Test szkiełkowy do wykrywania aglutynin w brucelozie 

Preferowany w porównaniu z testem probówkowym jako mniej skomplikowany. 

1. Próbka surowicy musi być czysta, bez widocznych resztek tłuszczowych. Nie 

powinna wykazywać hemolizy ani być zanieczyszczona przez bakterie. Nie 

może być inaktywowana przez podgrzewanie, ponieważ w ten sposób 

zniszczone zostałyby niektóre termolabilne aglutyniny. 

2. Przygotować szklaną płytkę, rysując za pomocą dermatografu i linijki dwa 

rzędy 2,5-centymetrowych kratek. Każdy rząd zawierający 5 kratek wystarcza 

na przeprowadzenie badania antygenu z rozcieńczeniami surowicy do 1:320. 

3. Za pomocą 0,2-mililitrowej pipety nanieść 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 i 0,005 ml 

surowicy w rzędzie kratek. 

4. Do każdej surowicy dodać 1 kroplę właściwej dla testu szkiełkowego 

zawiesiny dobrze wymieszanego antygenu. 

5. Zaczynając od najwyższego rozcieńczenia wymieszać patyczkiem mieszaninę 

surowica-antygen. Końcowe rozcieńczenia są zależne od rozcieńczeń w makroskopowym 

odczynie probówkowym i wynoszą odpowiednio 1:20, 1:40, 

1:80, 1:160 i 1:320. 

6. Trzymającpłytkęw obu dłoniach delikatnie wymieszać, wykonując15–20kolistych 

ruchów. Oglądać mieszaninę w dobrym świetle przez 1 minutę, 

poszukując śladów aglutynacji. Reakcje pojawiające się później mogą być 

związane z wysychaniem reagentów na szkiełku i powinny być potwierdzone 

wteście probówkowym. 

151


7. Odczytać wyniki w poniższy sposób: 

Całkowita aglutynacja 4+ 

Około 75% zaglutynowanych komórek 3+ 



Śladowa lub brak aglutynacji – 

Probówkowy test wykrywaja˛cy aglutyniny w brucelozie 

Przygotować seryjne rozcieńczenia surowicy i surowicę kontrolną w poniżej 

przedstawiony sposób: 

1. Dla każdej badanej surowicy umieścić po 8 probówek w stojaku. 

2. Do pierwszej probówki w każdym rzędzie dodać pipetą 1,9 ml NaCl (0,85%), 

do kolejnych po 0,5 ml. 

3. Do probówki z 1,9 ml NaCl dodać 0,1 ml surowicy. 

4. Dobrze wymieszać pipetą i przenieść 0,5 ml roztworu do probówki drugiej. 

Dokładnie wymieszać. 

5. Do kolejnych probówek w rzędzie, łącznie z siódmą, dodać 1 kroplę 

rozcieńczonej surowicy. Wymieszać dokładnie. Z probówki 7. po wymieszaniu 

usunąć 0,5 ml roztworu. Probówka 8. jest kontrolą antygenu. 

6. Do każdej z 8 probówek dodać 0,5 ml odpowiedniego antygenu. Wstrząsnąć 

statywem, mieszając antygen z surowicą. Kolejne rozcieńczenia wynoszą 

odpowiednio od 1:20 do 1:1280. 

7. Inkubować w łaźni wodnej w 37°C przez 48 godz., zgodnie z zaleceniami 

producenta. 

8. Oceniać makroskopowo obecność aglutynacji w probówkach przez 1 minutę 

w dobrym świetle na ciemnym tle. Przy odczycie nie wstrząsać probówek. 

Dodatnia reakcja wykazuje widoczną aglutynację (granulację); ujemna reakcja 

wykazuje zmętnienie zawiesiny bez aglutynacji. Najwyższe rozcieńczenie 

wykazujące aglutynację jest mianem surowicy. 

Odrzucić antygen, który nie aglutynuje z dodatnią surowicą kontrolną lub 

aglutynuje z ujemną surowicą kontrolną. 

Aglutynację można obserwować w surowicy zdrowych osób, stąd pojedyncze 

surowice o mianie niższym niż 1:80 mają nieznaczną wartość.Fałszywie dodatnie 

wyniki otrzymuje się także u pacjentów zakażonych Francisella tularensis lub 

u szczepionych przeciw Vibrio cholerae. Za pomocą tego testu nie można 

zróżnicować infekcji wywołanych B. abortus i B. melitensis. 

Odczyn ASO 

Zakażenia paciorkowcowe są częste i przeciwciała przeciw paciorkowcom 

występują w dużym odsetku populacji. β-hemolizujące paciorkowce grupy A 

wytwarzają dwie hemolizyny: wrażliwą na tlen streptolizynę O i tlenowo-stabilną 

streptolizynę S. Jedynie zredukowana (nieutleniona) streptolizyna O jest immunogenna 

i wykorzystywana w odczynie. Reakcja oparta jest na wytwarzaniu przez 

pacjenta zakażonego Streptococcus pyogenes (grupa paciorkowców A) przeciwciał 

hamujących aktywność hemolityczną streptolizyny O. Przeciwciała zwykle 

utrzymują się długo, stąd pojedyncze stwierdzenie podwyższonego miana nie 

świadczy o aktywnej infekcji. Jedynie w przypadku czterokrotnego wzrostu miana 

przeciwciał w kolejnych próbkach, pobranych w 10 – 14-dniowym odstępie, 

152

CZE˛ŚĆ I 

należy rozważyć obecność świeżego zakażenia. Test najczęściej wykorzystywany 

jest w diagnostyce gorączki reumatycznej, ostrego kłębuszkowego zapalenia 

nerek i innych chorób popaciorkowcowych. 

Dostępne są dwa typy komercyjnych zestawów do odczynu antystreptolizyny O: 

• Test lateksowej aglutynacji szkiełkowej ASO używany w badaniach przesiewowych 

do identyfikacji podwyższonych mian ASO (200 IU i wyższych) 

w surowicy. 

• Test probówkowy ASO jest odczynem zahamowania hemolizy, wykorzystywanym 

do określenia miana surowic dodatnich w teście lateksowo-szkiełkowym. 

Miano poniżej 50 IU nie potwierdza rozpoznania ostrej gorączki 

reumatycznej. 


do lateksowego testu szkiełkowego ASO 

Jednorazowe kartoniki, każdy z 6 dołeczkami 

Jednorazowy zakraplacz 


Uczulony odczynnik lateksowy (ze streptolizyną O) 

Dodatkowe materiały i odczynniki potrzebne do lateksowego 

testu szkiełkowego ASO 

Aplikator patyczków 

Lateksowy test aglutynacji szkiełkowej ASO 

1. Rozcieńczyć surowicę 1:20. 

2. Umieścić 1kroplęroztworu surowicy w dołeczku na jednorazowym kartoniku. 

3. Nowym zakraplaczem dodać 1 kroplę uczulonego odczynnika lateksowego. 

4. Patyczkiem wymieszać 2 krople i rozprowadzić je w dołeczku. 

5. Przez 2 minuty obserwować obecność aglutynacji. 

Dodatnia reakcja manifestuje się drobnym kłaczkowaniem (aglutynacją) w ciągu 

2 minut. 

Ujemna reakcja nie wykazuje aglutynacji. 

Jeśli aglutynacja pojawi się w ciągu 2 minut, miano surowicy należy określić 

w teście probówkowym antystreptolizyny O. 

Materiały i odczynniki zawarte w zestawie do testu 

probówkowego ASO 


Zredukowany antygen streptolizyny O (suchy preparat) 

Erytrocyty baranie 

Standardowe przeciwciała przeciw streptolizynie O (suchy preparat, 20 IU/butelka) 

Bufor do streptolizyny O (25 × koncentrat roztworu) 

153


Dodatkowe materiały i odczynniki potrzebne do testu 

probówkowego ASO 

Woda destylowana 

Pipety (1 ml, 2 ml) 

Probówki 

Łaźnia wodna 

Test probówkowy ASO 

1. Rozpuścić zredukowany antygen streptolizyny O (suchy preparat) w odpowiedniej 

objętości wody destylowanej (w opisanej butelce), przygotowując 

roztwór o stężeniu 2 IU w 1 ml. Roztwór nie zawiera konserwantów i musi 

zostać wykorzystany w ciągu 6 godzin. 

2. Rozpuścić standardową antystreptolizynę O (suchy preparat, 20 IU/butelka) 

w 10 ml buforu streptolizyny O. Roztwór można przechowywać przez 

6 miesięcy w 4°C, pod warunkiem, że nie uległ kontaminacji. 

3. Przed użyciem rozcieńczyć bufor streptolizyny O (25 × koncentrat) w 480 ml 

wody destylowanej. Rozcieńczony bufor nie wykorzystany w ciągu tygodnia 

należy wyrzucić. 

4. 1 ml erytrocytów baranich wypłukać trzykrotnie w buforze streptolizyny 

O i odwirować, zebrać pipetą supernatant. Dodając buforu streptolizyny O 

uzyskać 8% zawiesinę komórek. 

5. Odczynniki i surowicę pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej. 

6. Przygotować w probówce rozcieńczenie surowicy pacjenta 1:10 (0,1 ml 

surowicy + 0,9 ml buforu streptolizyny O). Przygotować dwa wyjściowe 

roztwory z rozcieńczenia 1:10 w poniżej przedstawiony sposób: 

Surowica Bufor Rozcieńczenie 

0,2 ml (1:10) 1,8 ml 1:100 

1,0 ml (1:100) 0,5 ml 1:150 

7. Przygotować następujące serie rozcieńczeń buforu streptolizyny O dla 

każdego z wyjściowych roztworów: 

Probówka Surowica Bufor Rozcieńczenie 

Zredukowana 

streptolizyna O 

1 0,2 ml (1:10) 0,8 ml 1:50 0,5 ml 

2 0,5 ml (1:100) 0,5 ml 1:200 0,5 ml 

3 0,5 ml (1:200) 0,5 ml 1:400 0,5 ml 

4 0,5 ml (1:400) 0,5 ml 1:800 0,5 ml 

5 0,5 ml (1:150) 0,5 ml 1:300 0,5 ml 

6 0,5 ml (1:300) 0,5 ml 1:600 0,5 ml 

7 0 1,5 ml — 0 

8 0 1,0 ml — 0,5 ml 

8. Uporządkować probówki według wzrastających rozcieńczeń: 1:50, 1:200, 

1:300, 1:400, 1:600, 1:800. 

9. Do probówki kontrolnej 7. dodać 1,5 ml buforu, do probówki kontrolnej 8. 

dodać 1 ml buforu. 

10. Do wszystkich probówek, z wyjątkiem kontrolnej 7., dodać 0,5 ml roztworu 

zredukowanej streptolizyny O. 

154

CZE˛ŚĆ I 

11. Wymieszać ichłodzić w4°C przez dwie godziny, umożliwiając przebieg 

reakcji antygen-przeciwciało. 

12. Do wszystkich probówek, włączając kontrolne probówki 7. i 8., dodać 0,5 ml 

8% zawiesiny erytrocytów, wymieszać i inkubować w łaźni wodnej w 37°C 

przez 30 minut. 

13. Odwirować probówki w 1000 g przez 2 minuty i obserwować hemolizę. 

W kontrolnej probówce 7. nie powinna zachodzić hemoliza, w kontrolnej 

probówce 8. powinna zajść całkowita hemoliza. 

14. Miano ASO to najwyższe rozcieńczenie nie wykazujące hemolizy: 

• Jeśli we wszystkich probówkach zachodzi hemoliza, wynik opisać ,,miano 

ASO poniżej 200 IU’’. 

• Jeśli w probówkach o wyższym rozcieńczeniu nie zachodzi hemoliza, 

zanotować wynik ,,ASO dodatnie z mianem’’. 

Wykrywanie antygenów bakteryjnych 

Lateksowy test aglutynacji i test koaglutynacji, wykrywające antygeny bakteryjne, 

stosowane są do identyfikacji mikroorganizmów i ich antygenów w hodowlach 

lub w próbkach klinicznych. W teście aglutynacji lateksowej 

cząsteczki polimerów wykorzystuje się jako nośnik fazy stałej; w teście 

koaglutynacji nośnikiem fazy stałej są erytrocyty. Za pomocą testu lateksowego 

można wykryć antygeny polisacharydowe bakterii wywołujących zapalenie opon 

mózgowo-rdzeniowych, w tym Haemophilus influenzae (tyb b), S. pneumoniae 

(omniwalentny), N. meningitidis (grupa A, B, C, Y i W135), E. coli (typ K1) 

i S. agalactiae (grupa B). Testy aglutynacji lateksowej są przydatne do 

identyfikacji paciorkowców z grup Lancefield A, B, C, D, F i G. Odczyny 

lateksowe można wykorzystać w jakościowym teście aglutynacji szkiełkowej 

i w ilościowym teście aglutynacji probówkowej oraz w typowaniu grup 

Streptococcus A-D, N. meningitidis, H. influenzae, Salmonella, Shigella, Vibrio 

cholerae itp. 

Do wykrycia antygenów polisacharydowych w próbkach klinicznych niezbędny 

jest progowy poziom antygenu. Jeśli w preparacie barwionym metodą Grama 

widoczne są drobnoustroje, zwykle, choć nie w każdym przypadku, przekroczony 

jest poziom progowy. W płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów z zakażeniem 

N. meningitidis wykrywana jest znacznie mniejsza liczba bakterii niż w zakażeniach 

wywołanych innymi typami Neisseria spp., dlatego rzadziej osiągany jest 

progowy poziom antygenów polisacharydowych. 

Kilka serogrup N. meningitidis może wywoływać zapalenie opon mózgowo- 

-rdzeniowych. Serogrupy A, C, Y i W135 mają stabilny antygen, który można 

wykazać za pomocą pojedynczego poliwalentnego odczynnika, podczas gdy 

antygen grupy B jest stosunkowo niestabilny i w związku z tym trudniej 

wykrywalny. Nie można go zróżnicować z polisacharydowym antygenem K1 

E. coli, która wśród E. coli jest głównym czynnikiem wywołującym zapalenie 

opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków. Wykazanie w preparatach barwionych 

metodą Grama obecności Gram-ujemnych dwoinek sugeruje N. meningitidis 

grupy B, obecność Gram-ujemnych pałeczek wskazuje na E. coli. 

W niektórych testach, polisacharydowe antygeny z drobnoustrojów uzyskiwane 

są przed badaniem. Pozyskiwanie antygenów przeprowadza się chemicznie lub 

enzymatycznie. 

155


Do wykrywania antygenów służą cztery różne testy: 

• W teście aglutynacji szkiełkowej antygen opłaszczony jest na cząsteczkach 

lateksu lub swoiste przeciwciała związane są na komórkach gronkowców. 

Reagenty miesza się ręcznie ciągłym ruchem kolistym przez 1 – 2 minuty 

i makroskopowo obserwuje reakcję aglutynacji. 

• W testach ELISA roztwór próbki i antygenu najpierw przepuszczany jest przez 

błonę opłaszczoną przeciwciałami (zwykle monoklonalnymi). Następnie błonę 

umieszcza się w roztworze zawierającym kolejne (monoklonalne) przeciwciała 

związane z enzymem. Obecność kompleksu antygen-przeciwciało z enzymem 

wykrywa się w reakcji z barwnym substratem dodanym do roztworu. 

• W ,,złotym’’ teście immunologicznym roztwór próbki i antygenu dyfunduje na 

błonie, którą następnie się ogląda. 

• W optycznym teście immunologicznym, przeciwciała związane są z silikonową 

płytką o odblaskowych właściwościach. Reakcja antygenu ze specyficznym 

przeciwciałem powoduje zmianę w warstwie powierzchownej płytki i widoczną 

różnicę refleksu światła. 

Procedury odczynów aglutynacji lateksowej 

i koaglutynacji 

1. Dla zwia˛zanych antygenów komórkowych: używając standardowej ezy przenieść 

czyste kolonie do kropli soli na szkiełku, uważnie wymieszać do 

uzyskania lekko opalizującej zawiesiny. Obecność aglutynacji zwykle wskazuje 

na szczepy szorstkie (R — ang. rough); szczepy gładkie (S — ang. 

smooth) nie wykazują aglutynacji w soli. W takim przypadku należy dodać 

odczynniki i przejść do punktu 4. 

Dla ekstrahowanych antygenów: używając standardowej ezy przenieść dobrze 

izolowane kolonie do probówki zawierającej roztwór ekstraktu, uzyskać 

zawiesinę. Inkubować zawiesinę w35°C lub zgodnie z zaleceniami producenta. 

Dla próbek klinicznych (płyn mózgowo-rdzeniowy, mocz): podgrzać próbkę do 

temperatury wrzenia lub według zaleceń producenta. Schłodzić i odwirować 

w 2000 g przez 5 – 10 minut. 

2. Umieścić na płytce 1 kroplę nośników opłaszczonych przeciwciałami. 

3. Umieścić obok 1 kroplę zawiesiny antygenu. 

4. Wymieszać 2 krople i rozprowadzić w kratce. 

5. Przechylać szkiełko ręcznie, wykonując ciągłe okrężne ruchy przez 1 minutę. 

Uważać, aby mieszanina nie rozlała się poza granicę kratki. 

6. Po określonym przez producenta czasie obejrzeć szkiełko i sprawdzić, czy 

obecna jest aglutynacja. Dla uzyskania lepszej widoczności trzymać szkiełko 

blisko źródła światła i oglądać na ciemnym tle. 

7. Jako wynik dodatni uznaje się obecność aglutynacji w mieszaninie antygenu 

i przeciwciał, np. zawiesina wykazuje aglutynację lub grudki. Aglutynacja jest 

najlepiej widoczna przy delikatnym przechylaniu szkiełka, tak aby płyn 

spływał wzdłuż dolnej granicy kratki. 

156

Część II 

Najważniejsze podłoża 

i odczynniki 

157

Wprowadzenie 

Laboratorium, wykorzystując zaledwie niewielką ilość materiału diagnostycznego, 

może zidentyfikować czynnik etiologiczny zakażenia, co ma istotny wpływ 

na leczenie pacjenta. W większości rozwijających się krajów działalność 

laboratorium bakteriologicznego jest ograniczona niedoborem podłoży hodowlanych 

i podstawowych odczynników, których import jest bardzo kosztowny. 

Podobnie jak w przypadku leków, przeprowadzając racjonalną selekcję, można 

zredukować liczbę koniecznych do zakupienia podłoży i odczynników. Dodatkowo, 

niektóre proste podłoża i odczynniki można wytwarzać lub przygotowywać 

na miejscu. Zastosowanie się do tych dwóch wskazówek pozwoli znacznie 

ograniczyć koszty, a także poprawi dostępność materiałów laboratoryjnych 

niezbędnych do diagnostyk i badań epidemiologicznych. 

Rozdział został przygotowany w taki sposób, aby umożliwić kierownikom 

laboratoriów podjęcie właściwych decyzji o przeznaczeniu środków finansowych 

na zakup najważniejszych podłoży i odczynników. Składa się z dwóch części, 

z których każda zawiera wiele zestawień. 

158

Patogeny, podłoża i odczynniki 

diagnostyczne 

Spodziewane patogeny 

Patogeny wymieniono uwzględniając: 

– częstość izolacji, 

– znaczenie kliniczne, 

– ciężkość choroby, 

– prawdopodobieństwo wywołania epidemii, 

– współczynnik koszt–korzyść dla izolacji i/lub identyfikacji. 

Wykaz nie jest przeznaczony do bezwarunkowego przestrzegania i może różnić 

się w różnych krajach czy laboratoriach, zależnie od charakteru lokalnie 

występujących chorób, kompetencji laboratorium oraz dostępnych środków. 

Podłoża i odczynniki diagnostyczne 

o nadrzędnym znaczeniu 

Uwzględniając pewien stopień elastyczności przyjęto poniższą gradację podłoży 

i odczynników diagnostycznych: 

Stopień 1: Wysoko priorytetowe 

Stopień 2: Średnio priorytetowe 

Stopień 3: Nisko priorytetowe 

Priorytet podłoży i odczynników zależy od znaczenia patogenów, do izolacji 

i identyfikacji których służą. Istnieją jednak wyjątki. Jeśli podłoże jest szeroko 

stosowane do hodowli wielu patogenów, może zostać ocenione wyżej niż podłoże 

przeznaczone do izolacji tylko jednego z nich. 

Stopień 1: Podłoża i odczynniki o wysokim priorytecie, które powinny być 

dostępne we wszystkich laboratoriach przeprowadzających ogólną diagnostykę 

bakteriologiczną. Najczęściej są przeznaczone do ogólnego użytku, proste do 

przygotowania i stanowią nieliczną grupę. 

Stopień 2: Podłoża i odczynniki o średnim priorytecie są stosowane dodatkowo, 

w uzupełniającej diagnostyce laboratoryjnej i przydatne w badaniach epidemiologicznych; 

mogą nie mieć istotnego bezpośredniego wpływu na leczenie pacjenta, 

np. surowice odpornościowe do identyfikacji serogrup meningokoków. 

Stopień 3: Podłoża i odczynniki o niskim priorytecie bardzo rzadko mają 

znaczenie w leczeniu pacjenta, natomiast są przydatne w edukacji, pracach 

naukowych i dodatkowych badaniach prowadzonych przez laboratoria referencyjne. 

Ta kategoria odnosi się do podłoży i odczynników diagnostycznych 

o niekorzystnym współczynniku koszt:efekt, które są zbyt drogie do stosowania 

ogólnego lub wykorzystywane do izolacji i identyfikacji rzadko pojawiających 

się, trudnych do izolacji drobnoustrojów. 

Poniżej wymieniono patogeny, podłoża i odczynniki diagnostyczne stosowane 

w diagnostyce laboratoryjnej z uwzględnieniem sugerowanego priorytetu. Sto- 

159

PATOGENY, PODŁOŻA I ODCZYNNIKI DIAGNOSTYCZNE 

pień ważności należy przystosować dla każdego laboratorium, uwzględniając 

warunki lokalne. 

Krew 



Brucella 

Burkholderia pseudomallei 

Candida albicans i Cryptococcus neoformans 



Pałeczki niefermentujące, inne niż Pseudomonas aeruginosa 

Inne Enterobacteriaceae 

Pseudomonas aeruginosa 

Salmonella typhi i nie-typhi 


Paciorkowce (S. pyogenes, S. pneumoniae, paciorkowce zieleniejące) 


Podłoża płynne do hodowli krwi 

Priorytet 

Bulion tryptozowo-sojowy (TSB) może zostać zastąpiony innym 

wzbogaconym bulionem, np. bulionem z wyciągiem mózgowo- 

-sercowym, każdy z dodatkiem polianetolosulfonianu sodu (SPS), 

0,25 g/l 1 

Bulion do hodowli beztlenowców z krwi: podłożepłynne tioglikolanowe, 

bulion Schaedlera lub bulion beztlenowy Wilkins-Chalgrena 2 

Podłoża do izolacji 

Przesiew na agar z krwią, agar czekoladowy i agar MacConkeya 1 

Odczynniki diagnostyczne 

Krążek z bacytracyną 1 

Plazma do koagulazy 1 

Odczynnik do wykrywania β-laktamazy 1 

Krążek z optochiną 1 

Odczynnik do wykrywania oksydazy 1 

Aglutynujące surowice odpornościowe Salmonella 1 

Czynniki V i XV 2 

Surowica odpornościowa Haemophilus influenzae typ b 3 

Surowica odpornościowa Neisseria meningitidis (poliwalentna i swoista 

dla grup A, B, C) 3 

160

CZE˛ŚĆ II 

Płyn mózgowo-rdzeniowy 


Cryptococcus neoformans 











Agar z krwią (z posianym Staphylococcus) 1 

Agar czekoladowy 1 

Agar MacConkeya 1 

Podłoże Löwensteina-Jensena 2 

Agar Sabouraud 2 


Tusz chiński 1 

Odczynnik do wykrywania β-laktamazy 1 




Surowica odpornościowa Haemophilus influenzae typ b 3 

Surowica odpornościowa Neisseria meningitidis (poliwalentna i swoista 

dla grup A, B, C) 3 

Szybkie testy diagnostyczne 

Zestaw testów do szybkiego wykrywania bakterii wywołujących 

zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych 3 

Mocz 



Enterokoki 



161


Inne Enterobacteriaceae 

Inne gronkowce 

Pseudomonas i inne niefermentujące pałeczki 

Staphylococcus saprophyticus 


Podłoża do izolacji i podłoża ilościowe 


Agar z krwią 1 

Agar brolacynowy (może być zastąpiony agarem z fioletem krystalicznym 

i laktozą, agarem MacConkeya, agarem bez fioletu krystalicznego 

lub agarem eozynowym z błękitem metylenowym) 1 

Agar CLED 1 

Podłoża do identyfikacji 

i odczynniki diagnostyczne 

β-glukuronidaza (PGUA) do identyfikacji E. coli 1 

Dla Gram-ujemnych pałeczek: 

agar Kliglera (KIA) 1 

odczynnik Kovacsa do wykrywania indolu 1 

podłoże ruch-indol-ureaza (MIU) 1 

odczynnik do wykrywania oksydazy 1 

podłoże płynne z lizyną (Möller) 2 

test ONPG 2 

podłoże Simmonsa z cytrynianem 2 

Dla gronkowców i enterokoków: 

test na obecność katalazy (H 2 O 2 ) 1 

plazma do wykrywania koagulazy 1 

agar z żółcią i eskuliną (dla enterokoków) 2 

krążek z nowobiocyną (5 µg) różnicujący koagulazo-ujemne gronkowce 

3 

Kał 


Aeromonas i Plesiomonas 

Campylobacter spp. 

Escherichia coli (enteropatogenne, enterotoksyczne, enteroinwazyjne i enterokrwotoczne) 

Salmonellae spp. nie-typhi i Edwardsiella 

Salmonella typhi i S. paratyphi 

Shigella 

Vibrio cholerae serogrupa O1, przecinkowce nie wywołujące cholery 


162

CZE˛ŚĆ II 


Podłoża transportowe 


Podłoże Cary’ego-Blaira (dla wszystkich patogenów) 1 

Buforowany roztwór soli i glicerolu (nie dla Vibrio lub Campylobacter) 2 

Podłoża selektywne 

Bulion seleninowy F 1 

Zasadowa woda peptonowa 2 


Agar cytrynianowo-deoksycholowy (może być zastąpiony agarem 

Salmonella-Shigella, agarem ksylozo-lizyno-deoksycholanowym 

(XLD)) 1 

Agar MacConkeya (z fioletem krystalicznym) 1 

Agar TCBS 1 

Podłoże Campylobacter: podstawowy agar Columbia lub inny agar 

z krwią zawierający lizat krwi i dodatek antybiotyku lub podłoże 

podstawowe na bazie aktywnego węgla 2 

Podłoża do wstępnej hodowli 

i odczynniki diagnostyczne 

Agar Kliglera (KIA) (dla patogenów jelitowych może być zastąpiony 

trójcukrowym agarem żelazowym, TSI) 1 

Odczynnik Kovacsa do wykrywania indolu 1 

Podłoże ruch-indol-ureaza (MIU) (można zastąpić podłożem do wykrywania 

ruchu + bulion peptonowy z mocznikiem) 1 


Podłoża selektywne i odczynniki diagnostyczne 

Woda peptonowa (lub podstawowy bulion z czerwienią fenolową) 2 

Podłoże płynne z lizyną (Möller) 2 

Test ONPG 2 

Podłoże Simmonsa z cytrynianem 2 

Krążek z czynnikiem wibriostatycznym O:129 2 

Surowice do aglutynacji 


Salmonella: poliwalentna surowica anty-O (A-I i Vi) 1 

surowice anty-O: O:2 (A), O:4 (B), O:9 (D), Vi 2 

surowiceanty-H:H:a,H:b,H:d,H:i,H:m,H:2 3 

surowice anty-H fazy inwersji: H:b, H:i, H:1,2 3 

163


Shigella: 

poliwalentne surowice: anty-dysenteriae, anty-flexneri, 

anty-boydii, anty-sonnei 1 

surowica anty-dysenteriae typ 1 (Shiga) 1 

Vibrio cholerae: poliwalentna surowica anty-O1 1 

surowica anty-B (Ogawa), anty-C (Inaba), 

anty-O:139 3 

Haemophilus influenzae surowica typowa anty-b 3 

Neisseria meningitidis poliwalentna 3 

surowice grupowe anty-A, anty-B, anty-C 3 

Górne drogi oddechowe 


Candida albicans (jama ustna) 

Corynebacterium diphtheriae (gardło i nos) 

Haemophilus influenzae (ucho i zatoki) 

Moraxella catarrhalis (ucho i zatoki) 


Pseudomonas 

Staphyloccoccus aureus (ucho i zatoki) 

Streptococcus pneumoniae (ucho i zatoki) 

Streptococcus pyogenes (grupa A, gardło) 




Agar z krwią (przygotowany na bazie bez glukozy) 1 


Podłoże Löfflera z surowicą lub podłoże jajeczne Dorseta 2 

Agar z krwią i tellurynem 2 

Zmodyfikowane podłoże Thayer-Martina dla gonokoków i meningokoków 

3 



Odczynniki do katalazy i koagulazy 1 


Podłoża do rozkładu cukrów dla Neisseria spp. 2 


Czynniki X i XV (krążek lub pasek) 2 

Trójmaślan glicerylu (trójbutyryna) 3 

Szybkie testy diagnostyczne 

Zestawy do identyfikacji serogrup paciorkowców β-hemolizujących 3 

164

CZE˛ŚĆ II 

Dolne drogi oddechowe 






Moraxella catarrhalis 











Agar Sabouraud 3 

Selektywny agar z krwią dla Haemophilus (bacytracyna lub wankomycyna) 

3 




Czynniki X i XV (krążek lub pasek) 2 


Próbki z układu moczowo-płciowego 

do diagnostyki chorób przenoszonych droga˛ 

kontaktów seksualnych 


Candida albicans (badanie mikroskopowe) 


Gardnerella vaginalis (badanie mikroskopowe) 1 

Haemophilus ducreyi 


Treponema pallidum (mikroskopia w ciemnym polu) 

1 

Gardnerella vaginalis nie jest patogenem, lecz drobnoustrojem wskaźnikowym bakteryjnej 

waginozy. 

165



Podłoża transportowe 


Podłoża transportowe Amiesa lub Stuarta 1 


Zmodyfikowane podłoże Thayer-Martina (MTM) lub podłoże New 

York City (NYC) 1 

czekoladowy agar Mueller-Hintona z krwią końską + wankomycyna 

+ IsoVitaleX dla H. ducreyi 3 

Odczynniki do identyfikacji 

Test nitrocefinowy lub inne testy do wykrywania β-laktamaz 1 


Ropa i wysięki 


Bacillus anthracis 

Bacteroides i inne bezwzględne beztlenowce 



Mycobacterium tuberculosis, M. ulcerans 

Inne Mycobacterium spp. 

Pasteurella multocida 

Pseudomonas i inne pałeczki niefermentujące 


Streptococcus pyogenes 

Streptococcus (inne gatunki) 






Agar z mannitolem 2 

Płynne podłoże tioglikolanowe (z indykatorem) (może być zastąpione 

podłożem z wyciągiem mięsnym, bulionem Schaedlera lub bulionem 

Wilkins-Chalgrena) 2 

Bulion tryptozowo-sojowy (TSB) 2 

166

CZE˛ŚĆ II 


Test na katalazę (H 2 O 2 ) 1 

Osocze do wykrywania koagulazy 1 


Generator wodoru do anaerostatu 2 

Lista rekomendowanych podłoży 

i odczynników diagnostycznych 

dla laboratoriów mikrobiologicznych 

ośrednim poziomie referencyjności 

Podłoża hodowlane 

Podłoże rekomendowane 

Alternatywne 

Stopień 

referencyjności 

Agar z żółcia˛ i eskulina˛ 1 

Agar z krwia˛(patrz agar tryptozowo- 

-sojowy) 1 

Agar z brolacyna˛ 

Agar z laktoza˛i fioletem krystalicznym, 

agar CLED 1 

Żelazowy agar Kliglera (KIA) 1 

Podłoże Löfflera z surowica˛ Podłoże jajeczne Dorseta 1 


Agar MacConkeya (z fioletem krystalicznym) 

Eozynowy agar z błękitem metylenowym 

1 

Agar MacConkeya (bez fioletu krystalicznego) 

1 

Podłoże ruch-indol-ureaza (MIU) Podłoże do wykrywania ruchu 

+ bulion ureazowy + woda peptonowa 

(tryptonowa) 1 

Agar Mueller-Hintona 1 

Dekstrozowy agar Sabouraud 1 

Deoksycholanowy agar cytrynianowy Agar Salmonella-Shigella (SS) 1 

Agar tryptozowo-sojowy (TSA) Agar Columbia 1 

Bulion tryptozowo-sojowy (TSB) Bulion mózgowo-sercowy 1 

TCBS 1 

Podłoże transportowe (Amies) Podłoże transportowe (Stuarta lub 

Cary’ego-Blaira) 1 

Woda peptonowa Andrade Czerwony bulion fenolowy 2 

Bulion z dekarboksylaza˛ (Möller) 2 

Agar z mannitolem (MSA) 2 

Bulion z selenitem F 2 

Agar cytrynianowy Simmonsa 2 

Podłoże tioglikolanowe 

Bulion Schaedlera, bulion do hodowli 

beztlenowców Wilkensa- 

-Chalgrena, podłoże z wycia˛giem 

mięsnym 2 

Agar z DNaza˛ 3 

167


Inhibitory i antybiotyki 

stosowane jako dodatek do podłoży 

lub odczynnik 

Chloramfenikol (do izolacji grzybów) 1 

Antybiotyki dodawane do podłoża dla gonokoków: wankomycyna, 

kolistyna, nystatyna (trimetoprim): VCN (VCNT) 1 

Dodatek antybiotyków do podłoża dla Campylobacter 2 

Roztwór tellurynu (do izolacji Corynebacterium diphtheriae) 2 

Bacytracyna (do izolacji Haemophilus spp.) 3 

Wankomycyna (do izolacji Haemophilus ducreyi lub H. influenzae) 3 

Dodatki wzbogacaja˛ce podłoża 

IsoVitaleX (Polyvitex, Vitox, suplement B, suplement VX, suplement 

CVA) 2 

Polianetosulfonian sodu (SPS) 3 

Kra˛żki, tabletki lub paski 


Krążek z nitrocefiną (Cefinaza) lub odczynnik 1 

Test ONPG 1 



PGUA (β-glukuronidaza) 1 


Krążek z nowobiocyną (5 µg) 3 

Test PYR 3 


Krążek z czynnikiem wibriostatycznym O:129 3 

Zestawy diagnostyczne 

Zastaw do szybkiej serodiagnostyki bakterii wywołujących zapalenie 

opon mózgowo-rdzeniowych 3 

Zestaw do identyfikacji serogrup paciorkowców hemolizujących 3 

Inne odczynniki diagnostyczne 

Skala z siarczanem baru (dla metody Kirby-Bauera) (skala MacFarlanda 

— przyp. tłum.) 1 

Zestaw do barwienia metodą Grama 1 

Nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) (katalaza) 1 

Odczynnik Kovacsa (do indolu) 1 

Odczynnik do wykrywania oksydazy (dimetyl-p-fenylenodiamina) 1 

Osocze (do testu na koagulazę i testu filamentacji) 1 

Zestaw do barwienia metodą Ziehl-Neelsena 1 

168

CZE˛ŚĆ II 

Buforowany fizjologiczny roztwór soli z glicerolem (do transportu 

kału) 2 

Węglowodany: glukoza, laktoza, maltoza, mannitol, sacharoza 2 

Generator wodoru do anaerostatu 2 

Tusz chiński (do wykrywania otoczek) 2 

Lizyna (do wykrywania dekarboksylazy) 2 

Kra˛żki do oznaczania lekowrażliwości 

Lista ważnych antybiotyków wg WHO (2002) 

amoksycylina 

ampicylina 

benzylopenicylina 

chloramfenikol 

ciprofloksacyna 

kotrimoksazol (sulfametoksazol-trimetoprim) 

kloksacylina 

erytromycyna 

gentamycyna 

kanamycyna 

kwas nalidyksowy 

nitrofurantoina 

sulfonamid 

tetracyklina (lub doksycyklina) 

trimetoprim 

Lista antybiotyków rezerwowych 

amoksycylina/kwas klawulanowy 

amikacyna 

cefalotyna 

cefazolina 

cefotaksym 

ceftazydym 

ceftriakson 

cefuroksym 

ciprofloksacyna i inne fluorochinolony 

klindamycyna 

piperacylina 

wankomycyna 

Surowice do aglutynacji 


Salmonella: poliwalentna surowica anty-O (A-I i Vi) 1 

surowice anty-O: O:2 (A), O:4 (B), O:9 (D), Vi 2 

surowice anty-H: H:a, H:b, H:d, H:i, H:m, H:2 3 

surowice anty-H fazy inwersji: H:b, H:i, H:1,2 3 

169


Shigella: 

poliwalentne surowice anty-dysenteriae, anty-flexneri, 

anty-boydii, anty-sonnei 1 

surowica anty-dysenteriae typ 1 (Shiga) 1 

Vibrio cholerae: poliwalentna surowica anty-Ol 1 

surowica anty-B (Ogawa), anty-C (Inaba), 

anty-O:139 3 

Haemophilus influenzae: surowica typowa anty-b 3 

Neisseria meningitidis: poliwalentna 3 

surowice grupowe anty-A, anty-B, anty-C 3 

170

Wybrana literatura uzupełniaja˛ca 

August M.J. et al.: Quality control and quality assurance practices in clinical microbiology. 

Cumitech, 1990, 3A: 1– 14. 

Basics of quality assurance for intermediate and peripheral laboratories, 2nd ed. 

Alexandria, WHO Regional Office for the Eastern Mediterranean, 2000. 

Baron E.J., Finegold S.M.: Diagnostic microbiology, 8th ed. St Louis, MO, The C.V. 

Mosby Company, 1990. 

Blazevic D.J. et al.: Practical quality control procedures for the clinical microbiology 

laboratory. Cumitech, 1976, 3: 1– 12. 

Cheesbrough M.: Medical laboratory manual for tropical countries. Vol. II: Microbiology. 

London, Tropical Health Technology/Butterworths, 1989. 

Collins C.H., Lyne P.M.: Microbiological methods, 5th ed. London, Butterworths, 1985. 

Gillies R.P., Paul J.: Bacteriology illustrated. Edinburgh, Churchill Livingstone, 1983. 

Howard B.J. et al.: Clinical and pathogenic microbiology. St Louis, MO, The C.V. Mosby 

Company, 1987. 

Koneman E.W.: Color atlas and textbook of diagnostic microbiology, 5th ed. Philadelphia, 

Lippincott, 1997. 

Miller J.M.: Quality control in microbiology. Atlanta, GA, Centers for Disease Control and 

Prevention, 1987. 

Miller J.M., Wentworth B.B.: Methods for quality control in diagnostic microbiology. 

Washington, DC, American Public Health Association, 1985. 

Montefiore D.G. et al.: Tropical microbiology. Edinburgh, Churchill Livingstone, 1984. 

Murray P. et al.: Manual of clinical microbiology, 8th ed. Washington, DC, American 

Society for Microbiology, 2003. 

Stokes E.J. et al.: Quality control. In: Clinical bacteriology, 7th ed. London, Edward 

Arnold, 1993. 

Turk D.C. et al.: A short textbook of medical microbiology. London, Hodder & Stoughton, 

1983. 

Summanen P. et al.: Wadsworth anaerobic bacteriology manual. Belmont, CA, Star 

Publishing Company, 1993. 

171

Skorowidz 

Acinetobacter lwofii 20 – 22 

– spp., obraz hodowli 83 

– w wydzielinie z cewki moczowej u mężczyzn 

90 

Actinomyces israelii 105 

Aerobacter butzleri, identyfikacja biochemiczna 

67 

Aeromonas 162 

– caviae, biochemiczne reakcje 65 

––wywoływane zakażenia 49 

– hydrophila, biochemiczne reakcje 65 


– sobria, wywoływane zakażenia 49 

– veroni, biochemiczne reakcje 65 

– wstępna identyfikacja 61 

Agar cefoksytyno-cykloseryno-fruktozowy 

(CCFA), podłoże do hodowli patogenów 

jelitowych 54 

– cysteinowo-tryptozowy (CTA), przechowywanie 

szczepów długoterminowe 26 

– cytrynianowy Simmonsa 21 

– czekoladowy 21 

––podłoże dla płynu mózgowo-rdzeniowego 

38 

– deoksycholanowo-cytrynianowy (DCA), 

podłoże do hodowli patogenów jelitowych 

53 

– Hektoen (HEA), podłoże do hodowli 

patogenów jelitowych 53 

– Kliglera (KIA) 22 

––procedura posiewu i odczytu 56 – 58 

––reakcje typowe Enterobacteriaceae 61 

– ksylozo-lizyno-deoksycholanowy 

(XLD), podłoże do hodowli patogenów 

jelitowych 53 

– MacConkeya, podłoże do hodowli patogenów 

jelitowych 53 


38 

––z fioletem krystalicznym 21 

– Mueller-Hintona 21, 126 

– Salmonella-Shigella (SS agar) 21 

––podłoże do hodowli patogenów jelitowych 

53 

– siarczanowo-bizmutowy, podłoże do hodowli 


– Tayer-Martina 21, 90, 91 

– tellurynowy z krwią selektywny 77 

– z cytrynianem deoksycholanu 21 

––tiosiarczanowym, solami żółci i sacharozą 

(TCBS), podłoże do hodowli patogenów 

jelitowych 53 

– z krwią 21 


38 

Agar, z mannitolem 21 

– z solami żółci (BSA), podłoże do hodowli 


––i cytrynianem tiosiarczanowym 21 

– z zasadowym ekstraktem mięsnym 

(MEA), podłoże do hodowli patogenów 

jelitowych 54 

– zżółcią i eskuliną 21 

– żelazowy trójcukrowy – patrz Agar Kliglera 

Aglutynacja lateksowa, procedury 

156 

– surowice 169 

Aglutyniny, wykrywanie w gorączce 150 

AIDS – patrz Zespół nabytego niedoboru 

odporności 

Ameby, poszukiwanie w płynie mózgowo- 

-rdzeniowym 37 

Amikacyna 123, 126, 169 

– strefy zahamowania wzrostu 132 

Aminoglikozydy 125 

Amoksycylina 92, 123, 125, 126, 169 


Ampicylina 92, 123, 125, 126, 169 


Anaerostat, kontrola jakości 18 

Angina Vincenta 74 

Antybiogram – patrz też Lekowrażliwość 

– jako narzędzie badań epidemiologicznych 

123 

– jako wskazówka do leczenia 122 

– karta kontroli jakości 137 

– w hodowli z krwi 34 

Antybiotyki do rutynowego oznaczania 

wrażliwości 123 

– jako dodatek do podłoży 168 

– krążki 127 

– lista rezerwowych 169 

– określanie wrażliwości, szablon 133 

– oznaczanie lekowrażliwości 24, 118, 

119, 127, 133 

– stężenie w krążkach 135 

– strefy zahamowania wzrostu 126, 132, 

133 

– ważne wg WHO 169 

Antygen(y) bakteryjne, wykrywanie 155 

– do diagnostyki 23 

– H, procedura identyfikacji 70 

– somatyczny O, procedura identyfikacji 

68 

– VDRL, przygotowanie 144, 145 

Antykoagulant 32 

Arcobacter butzleri, wywoływane zakażenia 

50 

Autoklaw, kontrola jakości 18 

172

SKOROWIDZ 

Bacillus anthracis 102, 111, 166 

Bacteroides 166 

– fragilis 20, 21, 101, 113, 160 

––a bakteriemia i fungemia 31 

––a zakażenia szpitalne 103 

––identyfikacja 116, 118 

– melaninogenicus – patrz Prevotella melaninogenica 

Bacytracyna 168 

Badanie(a) bakteriologiczne 29 

––rodzaje gwarancji jakości 13 

––zapewnienie jakości 12 

– mikrobiologiczne 14, 15 

– serologiczne 138 

––metody kontroli jakości 138 

––wyposażenie laboratorium 139 

Bakterie beztlenowe 20 

––diagnostyka zakażeń 114 

––identyfikacja 116 

––podłoża do hodowli 115 

––posiew i izolacja 115 

––przechowywanie długoterminowe 26 

––wrażliwość na antybiotyki 118 

––zakażenia 113 

– Gram-ujemne kwasooporne 20 

– jelitowe, morfologia kolonii 60 

––wstępna identyfikacja izolowanych 

szczepów 56 

– kwasooporne, barwienie metodą Ziehl- 

-Neelsena 38 

– mikroaerofilne 113 

– podział ze względu na wymagania tlenowe 

113 

Bakteriemia 30, 113 

– przyczyny 31 

Barwienie kwasooporne (Ziehl-Neelsena) 

106 

––test jakości 23 

– metodą Grama 105 

–––test jakości 23 

Barwniki 22 

Benzylopenicylina 84, 123, 124, 126, 169 

– działanie na Neisseria gonorrhoeae 92 

– stefy zahamowania wzrostu 132, 133 

Białko, stężenie w poszczególnych typach 

zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych 

38 

Biegunki, czynniki etiologiczne 48 

– w zakażeniach HIV/AIDS 48 

Błonica 74 

Bordetella pertussis 142 

Borrelia burgdorferi 148 

Botulizm przyranny 102, 113 

Brucella 160 

– spp. a bakteriemia i fungemia 31 

– wykrywanie aglutynin 150 

Bruceloza, miano aglutynin 150 

– wykrywanie aglutynin, test probówkowy 

152 

Bruceloza, miano aglutynin, test szkiełkowy 

151 

– zestaw do wykrywania aglutynin 151 

BSA – patrz Agar z solami żółci 

Bulion azotanowy 21 

– do posiewu z krwi 32 

– malonianowy 21 

– Schaedlera 160 

– seleninowy 21 

– tioglikolanowy 21 

– tryptozowo-sojowy (TSB), 32, 160 

––wybór podłoża dla płynu mózgowo- 

-rdzeniowego 38 

– Wilkins-Chalgrena 160 

– z mocznikiem, lekko buforowany 

(UREA), procedura posiewu i odczytu 56 

– z wyciągiem mózgowo-sercowym 160 

Burkholderia pseudomallei 160 

––jako przyczyna bakteriemii i fungemii 

31 

Butelki z podłożem do posiewu krwi 32 

Calymmatobacterium granulomatis 96 

––objawy zakażenia 89 

Campylobacter coli, identyfikacja biochemiczna 

67 

––identyfikacja końcowa 66 

–––wstępna 61 


– fetus, identyfikacja biochemiczna 67 

– hyointestinalis, identyfikacja biochemiczna 

67 

– jejuni 113 

––identyfikacja biochemiczna 67 

–––końcowa 66 



– lari, identyfikacja biochemiczna 67 

– spp. 162 

––badanie wizualne próbek kału 52 

––wybór podłoża 18 

– upsaliensis, identyfikacja biochemiczna 

67 

– warunki inkubacji 54 

Candida albicans 20, 21, 95, 160, 161, 165 


––a zapalenie pochwy 93 

––lekowrażliwość 85 


––obraz hodowli 83 

– a zapalenie gardła 75 

CCFA – patrz Agar cefoksytyno-cykloseryno-fruktozowy 

Cefaleksyna 125 

Cefalorydyna 125 

Cefalotyna 123 – 126, 169 


Cefalozyna 126 


173

SKOROWIDZ 

Cefamandol 125 


Cefamycyna 125 

Cefapiryna 125 

Cefazolina 125, 169 

Cefoksytyna 125 

Cefotaksym 125, 126, 169 


Cefradyna 125 

Ceftazydym 123, 126, 169 


Ceftriakson 123, 125, 126, 169 


Cefuroksym 123, 125, 126, 169 

– sodium, strefy zahamowania wzrostu 132 

Cewka moczowa u mężczyzn, zapalenie 90 

Chlamydia psittaci 142 

– trachomatis 89, 96, 165 

––a odczyn immunofluorescencji 142 

––a zapalenie cewki moczowej u mężczyzn 

90 

–––pochwy u dziewczynek 93 

–––szyjki macicy 93, 95 

––zakażenie w ciąży 93 

–––objawy 89 

– wykrywanie 90 

Chloramfenikol 84, 118, 123, 124, 126, 

168, 169 


Chlorek sodu 140 

– żelaza/deaminaza fenyloalaniny 21 

Chłodziarka, kontrola jakości 18 

Cholera 49 

– badanie wizualne próbek kału 52 

Choroba(y) legionistów 79 

– z Lyme 148 

– przenoszone drogą kontaktów seksualnych, 

89 

––próbki do diagnostyki 165 

––spodziewane patogeny 165 

Cieplarka, kontrola jakości 18 

Ciprofloksacyna 123, 126, 169 


Citrobacter freundi 22 

––biochemiczne reakcje 63 

– spp. a zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych 

36 

Clostridium botulinum 113 

– difficile, wstępna identyfikacja 61 


– perfringens 20, 102, 113, 166 



––identyfikacja 116 

– spp. 93 

– tetani 113 

Corynebacterium diphtheriae 74, 142 

––hodowla 77 

––nosicielstwo 75 

Cryptococcus neoformans 160, 161 


––a zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych 

36 

––posiew 39 

––poszukiwanie w płynie mózgowo- 

-rdzeniowym 37 

CTA – patrz Agar cysteinowo-tryptozowy 

Czas inkubacji a wielkość strefy zahamowania 

134 

Czerwień metylowa/Voges-Proskauer 21 

Czerwonka pełzakowa, badanie wizualne 

próbek kału 52 

Czynnik V, test jakości 23 

– XV, test jakości 23 

DCA – patrz Agar deoksycholanowo-cytrynianowy 

Deaminaza fenyloalaniny/chlorek żelaza 21 

Dekarboksylaza lizyny 21 

– ornityny 21 

Dezynfekcja skóry w miejscu wkłucia 31 

Diagnostyka mikrobiologiczna, etapy 14 

Dihydrolaza argininy 21 

Dikloksacylina 124 

Doksycyklina 169 

Drogi oddechowe dolne, spodziewane patogeny 

165 

––górne, spodziewane patogeny 164 

–––zakażenia 73 

Edwardsiella tarda, biochemiczne reakcje 

63 

Enterobacter cloacae 20 


– morfologia kolonii 60 


Enterobacteriaceae 20, 160, 161, 162, 166 

– lekowrażliwość 84, 123 

– na agarze żelazowym Kliglera (KIA) 60, 

61 

– obraz hodowli 84 

– przechowywanie długoterminowe 25 

– wstępna identyfikacja 39, 57, 59 

– wybór podłoża 17 


90 

– zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych 

36 

Enterococcus faecalis 20, 21 


––szczep kontrolny 127 

– faecium 122 

– spp., morfologia kolonii 60 

Enterokoki 161 

Erytromycyna 84, 123, 124 – 126, 169 


Escherichia coli 20 – 22, 113, 161, 162 


174

SKOROWIDZ 

Escherichia coli, a zakażenia szpitalne 102 

––a zapalenie oskrzeli 80 

–––opon mózgowo-rdzeniowych 36 

––badanie wizualne próbek kału 52 


––morfologia kolonii 60 

––strefy zahamowania wzrostu 126 

––szczepy standardowe do kontroli jakości 

136 

––test β-glukuronidazowy do szybkiej 

identyfikacji 47 

––w moczu 122 

––wstępna identyfikacja 56 

––wykrywanie antygenów 155 


Fenetycylina 124 

Fenoksymetylopenicylina 124 

Fermentacja dekstrozy bez oleju 21 

Flukloksacylina 124 

Francisella tularensis 152 

––miano aglutynin 150 

Fungemia 30 

– przyczyny 31 

Gardło, flora fizjologiczna 73 

– pobieranie materiału do badań 75 

– przesyłanie materiału do badań 75 

– zapalenie, czynniki bakteryjne 74 

Gardnerella vaginalis 95, 165 


––zapalenie pochwy 93 

Gentamycyna 123, 125, 126, 169 


Glicerol, przechowywanie szczepów długoterminowe 

25 

Glukoza, stężenie w poszczególnych typach 


38 

β-Glukuronidaza (PGUA), test jakości 23 

Gonokoki, przechowywanie szczepówkrótkoterminowe 

26 

– zapalenie gardła 74 

Gorączka, wykrywanie aglutynin 150 

Gronkowce 101 

– identyfikacja 108 

– przechowywanie długoterminowe 25 

– wrażliwość na benzylopenicyliny 133 


90 

Gruźlica płuc 79, 80 

Grzyby 20 

Haemophilus 142 

– ducreyi 96, 165 

––hodowla 98, 99 


––pobieranie próbki 97 

Haemophilus influenzae 21, 108, 122, 160, 

161 



36 

–––oskrzeli 79, 80 

–––płuc 80 



––surowice do aglutynacji 164, 170 

––typ b 20 

––w aspiratach z jamy opłucnej 101 



– parainfluenzae 20 

– przechowywanie szczepów krótkoterminowe 

26 

Hafnia alvei, biochemiczne reakcje 63 

HBV – patrz Wirus zapalenia wątroby 

typu B 

HEA – patrz Agar Hektoen 

Herpesvirus 96 

– a zapalenie cewki moczowej u mężczyzn 

90 

HIV/AIDS – patrz Zespół nabytego niedoboru 


Hodowla(e) 28 

– Corynebacterium diphtheriae 77 

– Mycobacterium tuberculosis 85, 87 

– Neisseria gonorrhoeae 91, 92, 95 

– patogenów jelitowych, podłoża 53 

– płynu mózgowo-rdzeniowego, wybór 

podłoża 38 

– podłoża 17, 159 

– Streptococcus pyogenes 76 

– warunki beztlenowe 114 

– z krwi 31, 33 

Identyfikacja antygenu H 70 

––somatycznego O 68 

– Neisseria gonorrhoeae 92 

– serologiczna Yersinia enterocolitica 72 

––Salmonella 67, 69 

–––paratyphi A 70 

–––typhi 70 

––Shigella 71 

Indol (woda peptonowa) 21 

Inhibitory jako dodatek do podłoży 168 

Inoculum, gęstość a wielkość strefy zahamowania 

134 

– przygotowanie 137 

Interpretacja wyników badań, jakość 13 

Jama otrzewnej, drobnoustroje 101 

– zapalenie 113 

Kał 48 

– badanie wizualne próbek 52 

––wstępna izolacja 54 

175

SKOROWIDZ 

Kał, identyfikacja biochemiczna gatunków 

Campylobacter 67 

––końcowa mikrobiologiczna izolowanych 

szczepów 62 

–––serologiczna izolowanych szczepów 

67 

––wstępna izolowanych szczepów 56 

– izolacja bakterii wstępna 54 

– pobieranie próbek do badania 51 

– podłoża transportowo-wzbogacające 53 

– posiew próbek 53 

– przesyłanie próbek do badania 51 

– spodziewane patogeny 162 

Kanamycyna 125, 169 

Kandydiaza pochwy 95 

Katalaza, test jakości 23 

KIA – patrz Agar Kliglera 

Kiła 96 

– diagnostyka, odczyny serologiczne 142 

– odczyn VDRL 143 

Klebsiella pneumoniae 20, 21 


––a zapalenie płuc 80 




Klindamycyna 118, 123, 126, 169 


Kloksacylina 124, 169 

Koaglutynacja, procedury 156 

Kolistyna 168 

Kontakty seksualne, przenoszone choroby 

89 

Kontrola jakości sprzętu 18 

––standardowa procedura 136 

––standardowe szczepy 136 

––wewnętrzna 16 

––zestaw szczepów 20 

––zewnętrzna 27 

Kotrimoksazol 84, 123, 125, 126, 169 


Krążek z bacytracyną, test jakości 23 

– z optochiną, test jakości 23 

– z tellurydem, test jakości 23 

Krążki 168 

– czas nałożenia a wielkość strefy zahamowania 

134 

– do oznaczania lekowrażliwości 169 

– z antybiotykami 127, 135 

––nakładanie na płytkę 137 

Krew 30 

– antybiogram 34 

– butelki z podłożem do posiewu 32 

– objętość próbki 31 

– pobieranie próbek 31 

– podłoża do posiewu 32 

––płynne do hodowli 160 

– prowadzenie hodowli 33 


Krew, zakażenie a wrażliwość antybiotyków 

123 

Krętki Reitera 148 

– odczyn immunofluorescencji w modyfikacji 

absorpcyjnej (FTA-Abs) 148 

Kryteria jakości w mikrobiologii 14 

Kwas klawulanowy 123, 126, 169 


– nalidyksowy 123, 126, 169 


Laboratoria referencyjne 27 

Laboratorium mikrobiologiczne, zapewnienie 

jakości badań 13 

– wyposażenie do badań serologicznych 

139 

Legionella pneumophila 142 

––metody badań 79 

Lekowrażliwość bakterii wyhodowanych 

z plwociny 84 

– krążki do oznaczania 169 

– oznaczanie na antybiotyki 133 

––w moczu 47 

––wpłynie mózgowo-rdzeniowym 40 

– szczepów izolowanych z gardła 78 

Leukocytoza w poszczególnych typach 


38 

Listeria monocytogenes 93, 161 



36 


Łaźnia wodna 139 

––kontrola jakości 18 

MEA – patrz Agar z zasadowym ekstraktem 

mięsnym 

Meningokoki, przechowywanie szczepów 

krótkoterminowe 26 

Metoda dyfuzyjno-krążkowa – patrz Metoda 

Kirby-Bauera 

Metoda Grama, test jakości barwienia 23 

Metoda Kirby-Bauera 119, 120 

––czynniki techniczne 134 

––zmodyfikowana 125 

–––interpretacja stref zahamowania 

wzrostu 132 

– NEO-SENSITABS 119 

Metronidazol 118 

Metycylina 124 

– badanie wrażliwości Staphylococcus aureus 

134 

Micrococcus spp. 113 

Mikrobiologia, kryteria jakości 14 

Mikroorganizmy Gram-dodatnie jako przyczyna 

bakteriemii 31 

––––fungemii 31 

176

SKOROWIDZ 

Mikroorganizmy Gram-ujemne jako przyczyna 

bakteriemii 31 

––––fungemii 31 

Mikroskop, kontrola jakości 18 

Mikroskopy 139 

MIL – patrz Podłoże ruch-indol-lizyna 

Minocyklina 124 

Mobiluncus spp. a zapalenie pochwy 93 


Mocz, badanie przesiewowe 43 

––zużyciem kalibrowanej ezy 44 

–––pasków bibułowych 44 

– hodowla i interpretacja 43 

– identyfikacja drobnoustrojów 47 

– metody badań przesiewowych 43 

– oznaczanie lekowrażliwości 47 

– pobieranie materiału do badania, 41, 42 

––u niemowląt i dzieci 43 

– posiew ilościowy i wstępna identyfikacja 

44 

–––interpretacja wyników 46 


– zakażenie a wrażliwość antybiotyków 

123 

Mononukleoza zakaźna 142 

Moraxella catarrhalis 20 



––zapalenie oskrzeli 79 

Morganella, biochemiczne reakcje 63 

Mycobacterium fortuitum 107 

– fortuitum-chelonei 106 

– marinum 107 

– spp. 166 

– tuberculosis 101, 161, 166 

––jako przyczyna zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych 

36 

––hodowla 85, 87 

–––interpretacja 88 

–––zasady bezpieczeństwa 88 

– ulcerans 107, 166 

Mycoplasma pneumoniae 138 

––metody badań 79 

Naegleria fowleri, poszukiwanie w płynie 

mózgowo-rdzeniowym 37 

Nafcylina 124 

Narządy płciowe żeńskie, pobieranie próbek 

93 

–––transport próbek 93 

––owrzodzenia 96 

–––pobieranie próbek 96 

Neisseria gonorrhoeae 20, 21, 122, 165 


90 

–––pochwy u dziewczynek 93, 95 

–––szyjki macicy 93 

––badanie wrażliwości na antybiotyki 92 

––hodowla 91, 92, 95 

Neisseria gonorrhoeae, identyfikacja 92 

––zakażenia, objawy 89 

–––w ciąży 93 

– meningitidis 20, 21, 122, 160, 161 


––przyczyną bakteriemii i fungemii 31 

–––zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych 

36 




– przechowywanie szczepów długoterminowe 

26 

Netylmycyna 125 

Niemowlęta, zapalenie opon mózgowo- 

-rdzeniowych, przyczyny 36 

o-Nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd 23 

Nitrofurantoina 123, 125, 126, 169 


Nocardia asteroides 108, 113 

Norfloksacyna 123 


NYC – patrz Podłoże New York City 

Nystatyna 168 

Odczyn aglutynacji 141 

– ASO 152 

– FTA-Abs 149 

– immunofluorescencji 142 

––krętków w modyfikacji absorpcyjnej 

(FTA-Abs) 148 

– kłaczkujący 141 

– precypitacji 141 

– RPR 142, 146 – 148 

––jakościowy 147 

––półilościowy 147 

Odczyn VDRL 142 – 146 

––półilościowy 145 

– Weila-Felixa 150 

– Widala 150 

– Wrighta 150 

Odczynnik Nitrocefin 92 

Odczynniki 22, 126 

– diagnostyczne 159, 168 

––do hodowli płynu mózgowo-rdzeniowego 

161, 162 

–––próbek z układu moczowo-płciowego 

166 

–––z dolnych dróg oddechowych 165 

–––zgórnych dróg oddechowych 164 

––do kału 163 

––w hodowli krwi 160 

–––ropy 167 

– do badań serologicznych 140 

– testy jakości 23 

Odczyny aglutynacji lateksowej, procedury 

156 

– serologiczne 138 

––w diagnostyce kiły 142 

177

SKOROWIDZ 

Odleżyny, owrzodzenia, pobieranie próbek 

104 

Oksacylina 84, 123, 124, 126 

– badanie wrażliwości Staphylococcus aureus 

134 


Oksydaza, test jakości 23 

Oleandomycyna 125 

Olej mineralny, przechowywanie szczepów 

długoterminowe 25 

ONPG – patrz o-Nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd 

Oparzenia, drobnoustroje 101 


Opony mózgowo-rdzeniowe, przyczyny 

zapalenia 36 

Oskrzela, zapalenie 80 

Osocze do koagulazy, test jakości 23 

Owrzodzenia narządówpłciowych, badanie 

bezpośrednie próbki 97 

–––hodowla 98 

–––pobieranie próbek 96 

– odleżynowe, pobieranie próbek 104 

– Buruli 107 

Paciorkowce 160 

– α-hemolizujące jako przyczyna bakteriemii 

i fungemii 31 

– β-hemolizujące, różnicowanie 77 

– przechowywanie szczepów 26 

– w aspiratach z jamy opłucnej 101 

– zieleniejące 160 


Pałeczki beztlenowe Gram-dodatnie, wstępna 

identyfikacja 58 

––Gram-ujemne, wstępna identyfikacja 

59 

– Gram-ujemne 20 

Papilomavirus, objawy zakażenia 89 

Paski 168 

– bibułowe do badania moczu 44 

Pasteurella multocida 102, 110, 166 

Patogeny 159 

– jelitowe, podłoża do hodowli 53 

Peptostreptococcus, identyfikacja 117 

– magnus 113 

– spp. a ropień płuca 80 

––jako przyczyna bakteriemii i fungemii 

31 

PGUA – patrz β-Glukuronidaza 

Piperacylina 123, 126, 169 


Piwampicylina 125 

Plesiomonas 162 

– shigelloides, biochemiczne reakcje 63, 

65 

Plwocina, badanie mikroskopowe 82 

– hodowla i interpretacja 82 

– ocena makroskopowa 81 

Plwocina, pobieranie próbek 81 

– podłoża do hodowli 83 

– ropna, badania 79 

Płuca, gruźlica 80 

– zapalenie 80 

Płyn mózgowo-rdzeniowy, badanie mikroskopowe 

37 

––barwienie preparatów metodą Grama 

37 

––cechy w zapaleniu opon 38 

––ocena makroskopowa 37 

––oznaczanie lekowrażliwości 40 

––pobieranie 36 

––spodziewane patogeny 161 

––transport próbek 36 

Płytka hodowlana, sposób posiewu bakterii 

45 

Pneumokoki w aspiratach z jamy opłucnej 

101 

Podłoża do hodowli 17, 159 

––bakterii beztlenowych 115 

––kału 163 

––płynu mózgowo-rdzeniowego 161 

––z plwociny 83 

– do identyfikacji w hodowli płynu mózgowo-rdzeniowego 

162 

– do izolacji w hodowli krwi 160 

–––płynu mózgowo-rdzeniowego 162 

–––próbek z układu moczowo-płciowego 

166 

–––ropy 166 

–––z dolnych dróg oddechowych 165 


– do posiewu krwi 32 

– gotowe, przechowywanie 20 

– hodowlane, dodatki wzbogacające 168 

––rekomendowane 167 

– płynne do hodowli krwi 160 

– przygotowywane, kontrola jakości 20 

– testy kontrolne 21 

– z wyciągiem mięsnym, przechowywanie 

długoterminowe bakterii beztlenowych 

26 

Podłoże agarowe Thayer-Martina modyfikowane 

21, 90, 91 

– jajeczne Dorseta 77 

– New York City 91 

– ruch-indol-lizyna, procedura posiewu 

i odczytu 56, 57 

– suche, zamawianie i przechowywanie 18 

– tioglikolonowe płynne 160 

– z mocznikiem 22 

– z tellurynem, taurocholanem i żelatyną 

(TTG) dla patogenów jelitowych 54 

– przygotowanie 20 

– skład a wielkość strefy zahamowania 

134, 135 

Porphromonas w aspiratach z jamy opłucnej 

101 

178

SKOROWIDZ 

Prevotella melaninogenica a ropień płuca 

80 

– w aspiratach z jamy opłucnej 101 

Proteus mirabilis 20 – 22 




Proteus, morfologia kolonii 60 


– vulgaris 150 

Providencia, biochemiczne reakcje 63 

– spp. 60 

Przecinkowce w kale, reakcje biochemiczne 

65 

Przeciwciała, oznaczanie 138 

Przetoki, pobiernie próbek 104 

Pseudobakteriemia, przyczyny 32 

Pseudomonas 162, 166 

– aeruginosa 20, 21, 101, 160 


–––płuc 80 


––stefy zahamowania wzrostu 126 


136 

––wrażliwość na antybiotyki 123 

– jako przyczyna bakteriemii i fungemii 31 

– obraz hodowli 83 

– spp. w wydzielinie z cewki moczowej 

umężczyzn 90 

Rany 100 

– cięte 102 

– drążące, pobieranie próbek 104 

– drenujące węzłówchłonnych, pobieranie 

próbek 104 

– penetrujące 101, 102 

– pooperacyjne, pobieranie próbek 104 

– próbki chirurgiczne 100 

– zakażenia szpitalne 102 

Reakcje serologiczne 141 

Rickettsia spp. 142 

Riketsje, wykrywanie aglutynin 150 

Ropa, odczynniki diagnostyczne 167 

– podłoża do izolacji 166 


Ropień(nie) 100, 113 

– otorbiony, drobnoustroje 101 

– płuca 80 

– próbki chirurgiczne 100 

– pobieranie i transport próbek 103 

Ropniak opłucnej 113 

Rotawirusy 142 

– wywoływane zakażenia 50 

Salmonella 122, 160, 162 

– arizonae, biochemiczne reakcje 63 

– biochemiczne reakcje 63 

– choleraesuis, biochemiczne reakcje 63 

Salmonella, identyfikacja końcowa 62 

––serologiczna 67, 68 


– paratyphi A, biochemiczne reakcje 63 

––identyfikacja serologiczna 71 

– spp., identyfikacja 56 




36 

– surowice do aglutynacji 163, 169 

– typhi, biochemiczne reakcje 63 

––identyfikacja serologiczna 70 



––wykrywanie aglutynin 150 

– typhimurium 20 

– wykrywanie antygenów 155 


Salmonelozy, badanie wizualne próbek kału 

52 

Schemat Kauffmanna-White’a 68 

Sepsa 30 

Serratia marcescens 20, 21 


Shigella 162 

– badanie wizualne próbek kału 52 

– boydii 72 

––biochemiczne reakcje 63, 64 

– dysenteriae 71 


– flexneri 20 – 22, 72 


– identyfikacja końcowa 65 

––serologiczna 71 

––wstępna 58 

– paratyphi 162 

– reakcje biochemiczne 63 

– sonnei 72 


– spp., morfologia kolonii 60 


– surowice do aglutynacji 164, 170 

– typhi 162 

– typhimurium 21, 22 

– wykrywanie antygenów 155 


Skaleczenia zakażone, pobieranie próbek 

104 

Skóra, drobnoustroje 101 

Spiramycyna 125 

Sprzęt laboratoryjny, dbałość 17 


SS agar – patrz Agar Salmonella-Shigella 

Staphylococcus agalactiae 20, 93 

– aureus 20, 21, 93, 107 – 110, 113, 142, 

160, 166 



179

SKOROWIDZ 

Staphylococcus aureus, a zapalenie oskrzeli 

80 

–––płuc 80 

––badanie wrażliwości na metycylinę 

134 

––––na oksacylinę 134 

––lekooporność 112 



––stefy zahamowania wzrostu 126 


136 

– epidermidis 20, 21, 108 – 110 

––lekooporność 112 


– mitis 20 

– pneumoniae 20 

– pyogenes 20 

– różnicowanie szczepów 110 

– saprophyticus 108 – 110, 162 

––spp. przyczyną zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych 

36 

– wrażliwość na antybiotyki 123 


Sterylizator szkła, kontrola jakości 18 

Strefy zahamowania wzrostu, odczytywanie 

wyników 137 

Streptococcus 142, 166 

– agalactiae 161 



36 



– α-hemolizujący 21 

– pneumoniae 21, 160, 161 



–––opon mózgowo-rdzeniowych 36 

–––płuc 80 

––lekowrażliwość 84, 85 




– pyogenes 21, 122, 142, 160, 166 



––odczyn ASO 152 


–––zapalenia gardła 74 

Streptomycyna 125 

Sulfafurazol 125 

Sulfametoksazol 125, 169 

Sulfizoksazol 126 


Sulfonamidy 123, 125, 126, 169 

– strefy zahamowania wzrostu 132, 133 

Surowica(e) 28, 140 

– do aglutynacji 169 

Surowica(e), do aglutynacji w kale 163 

– Loefflera 77 

– odpornościowe do diagnostyki 23 

Szczepy izolowane z gardła, badanie lekowrażliwości 

78 

– kontrolne, pozyskiwanie 24 

––przechowywanie długoterminowe 25 

–––krótkoterminowe 26 

– standardowe do kontroli jakości 136 

Szyjka macicy, zapalenie 93 

Tabletki 168 

Talampicylina 125 

TCBS – patrz Agar z cytrynianem tiosiarczanowym, 

solami żółci i sacharozą 

Temperatura inkubacji a wielkość strefy 

zahamowania 134 

Termin ,,oporny’’, definicja 120 

– ,,wrażliwy’’, definicja 120 

Test(y) aglutyncji lateksowy ASO, probówkowy 

153, 154 

––––szkiełkowy 153, 156 

––szkiełkowej 155 

–––bezpośredni 68 

– CAMP odwrotny 117 

– czułość diagnostyczna 16 

– dyfuzji 120 

– ELISA 155, 156 

– FTA-Abs – patrz Odczyn immunofluorescencji 

krętków w modyfikacji absorpcyjnej 

– β-glukuronidazowy do identyfikacji 

E. coli 47 

– hemaglutynacji pośredniej 66 

– IFA (indirect fluorescent antibody) 

– patrz Odczyn immunofluorescencji 

– kontrolne dla podłoży 21 

– laboratoryjne, gwarancja jakości 13 


––ocena jakości 14 

––wiarygodność 12 

– lekowrażliwości, kontrola jakości 136 

– na oksydazę, procedura 60 

– optyczny immunologiczny 156 

– probówkowy do wykrywania aglutynin 

w brucelozie 152 

– rozcieńczeń 120 

– RPR 141 

– szkiełkowy do wykrywania aglutynin 

w brucelozie 151 

– szybkie do hodowli płynu mózgowo- 

-rdzeniowego 161 


– śluzowy, procedura 61 

– VDRL 141 

– wrażliwości na polimiksynę B66 

– z nitrocefiną 92 

– z surowicami odpornościowymi Shigella 

71 

180

SKOROWIDZ 

Test(y), swoistość diagnostyczna 16 

– ,,złoty’’ immunologiczny 156 

Tetracyklina 84, 123, 124, 126, 169 


Tężec 113 

– a rana penetrująca 102 

Tiamfenikol 124 

Tkanka(i) podskórna, drobnoustroje 101 

––zapalenie 113 

– zakażenie a wrażliwość antybiotyków 

123 

Tobramycyna 123, 125, 126 


Treponema pallidum 96, 141, 142, 148, 165 

––badanie bezpośrednie 97, 98 



Trichomonas vaginalis a zapalenie cewki 

moczowej u mężczyzn 90 

Trimetoprim 123, 125, 126, 168, 169 


Trypanosoma, poszukiwanie w płynie mózgowo-rdzeniowym 

37 

TSB – patrz Bulion tryptozowo-sojowy 

TTG – patrz Podłoże z tellurynem, taurocholanem 

i żelatyną 

Ugryzienia przez zwierzęta 102 

Układ moczowo-płciowy, próbki do diagnostyki 

chorób przenoszonych drogą 

kontaktów seksualnych 165 

– pokarmowy, zakażenie a wrażliwość antybiotyków 

123 

UREA – patrz Bulion z mocznikiem, lekko 

buforowany 

Ureaplasma urealyticum a zapalenie cewki 

moczowej u mężczyzn 90 

Utlenianie dekstrozy bez oleju 21 

Vibrio cholerae 20, 162 


––biotypy, różnice 65 


–––wstępna 59, 61 

––posiew kału 53 




– fluvialis, biochemiczne reakcje 65 


– furnissii, biochemiczne reakcje 65 

– hollisae, biochemiczne reakcje 65 


– mimicus, biochemiczne reakcje 65 


– parahaemolyticus, wstępna identyfikacja 

59 


– spp. 21 

Vibrioparahaemolyticus, biochemiczne reakcje 

65 

Voges-Proskauer – patrz Czerwień metylowa/Voges-Proskauer 

Waginoza bakteryjna 93 

Wankomycyna 126, 168, 169 


Węzły chłonne, drobnoustroje 101 

Wirówka, kontrola jakości 18 

Wirus cytomegalii, objawy zakażenia 

89 

– Epsteina-Barr 142 

– HIV – patrz Wirus nabytego niedoboru 


– nabytego niedoboru odporności, objawy 

zakażenia 89 

– opryszczki 96 


90 


– różyczki 142 

– zapalenia wątroby typu B, objawy zakażenia 

89 

Woda peptonowa (indol) 21 

Wrzód miękki 96 

Wstrząsarki 139 

Wścieklizna 102 

Wydzielina(y) ropne 100 

––badanie lekowrażliwości 112 

–––mikroskopowe105 


––identyfikacja drobnoustrojów 108 

––ocena makroskopowa 104, 105 

– z cewki moczowej u mężczyzn, transport 

próbek 90 

––badanie bezpośrednie i interpretacja 

91 

––pobieranie 90 

– z pochwy, badanie bezpośrednie i interpretacja 

94 


––nieprawidłowa, przyczyny 93 

Wykrywanie antygenów bakteryjnych 

155 

Wymaz z odbytu, pobieranie 52 

Wymazówki 127 

Wyrostek robaczkowy, zapalenie 113 

Wysięk(i), drobnoustroje 101 

– komórkowy biegunkowego kału, badanie 

52 


– ropny 100 

––próbki chirurgiczne 100 


Wzorzec zmętnienia 127 

XLD – patrz Agar ksylozo-lizyno-deoksycholanowy 

181

SKOROWIDZ 

Yersinia enterocolitica 20, 21, 162 



–––serologiczna 72 

–––wstępna 56, 58 

––miano aglutynin 150 


– wywoływane zakażenia 50, 51 

– frederiksenii, biochemiczne reakcje 64 

– intermedia, biochemiczne reakcje 64 

– kristensenii, biochemiczne reakcje 64 

– pseudotuberculosis, biochemiczne reakcje 

64 

Zadrapania przez zwierzęta 102 

Zakażenia bakteriami beztlenowymi 113, 

114 

– dróg oddechowych dolnych 79 

–––górnych 73 

––––hodowla i identyfikacja 76 

––––mikroskopia bezpośrednia 76 

– ran szpitalne 102 

Zapalenie cewki moczowej u kobiet 93 

–––umężczyzn 90 

– gardła, czynniki bakteryjne 74 

––gonokokowe 74 

––martwicze, wrzodziejące 74 

Zapalenie, jamy otrzewnej 113 

– narządów miednicy u kobiet 93, 94 

– opon mózgowo-rdzeniowych, cechy płynu 

38 

–––gruźlicze, posiew 38 

––przyczyny 36 

––typy 38 

– oskrzeli i płuc 80 

––ostre 79 

––przewlekłe 79 

– płuc 80 

––pierwotne atypowe 79 

––wywołane przez chlamydie 79 

– pochwy 93 

––niespecyficzne – patrz Waginoza 

– szyjki macicy 93 

– tkanki podskórnej 113 

– wyrostka robaczkowego 113 

Zespół nabytego niedoboru odporności, 

biegunki 48 

Zestawy diagnostyczne 168 

Zgorzel gazowa 113 

Ziarenkowce Gram-dodatnie 20 

Ziarniniak pachwiny 96 


Żelatynaza 21 

182

Podstawowe procedury laboratoryjne w ... - digicollection.or..

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?