Podstawowe procedury laboratoryjne w ... - digicollection.or..

CZE˛ŚĆ I
50 ml podłoża odkręcić nakrętkę opół obrotu. Nakryć zamknięcie kwadratowym
fragmentem folii aluminiowej i umieścić butelkę w autoklawie w 120°C na
20 minut. Natychmiast po autoklawowaniu, gdy butelka i podłoże sąjeszcze
gorące, delikatnie dokręcić nakrętkę, bez usuwania folii aluminiowej (w innym
przypadku nakrętka nie będzie sterylna). Podczas stygnięcia podłoża wytwarza się
częściowa próżnia, która ułatwi wprowadzenie próbki krwi przez gumową
warstwę.
Tuż przed wprowadzeniem materiału do butelki należy starannie zdezynfekować
gumową część nakrętki.
Przed wydaniem gotowej butelki z podłożem i przed jej użyciem powinno się
sprawdzić przejrzystość zawartości. Podłoże, które wykazuje zmętnienie, nie
powinno zostać użyte.
Jeśli podejrzewa się obecność bakterii tlenowych (Pseudomonas, Neisseria) lub
drożdży, w laboratorium po otrzymaniu próbki należy zdezynfekować gumową
część nakrętki i przekłuć ją sterylną igłą z bawełnianą zatyczką. Igła może zostać
usunięta w chwili, gdy ciśnienie wewnątrz butelki osiągnie wartość ciśnienia
atmosferycznego. Komercyjne butelki do posiewu krwi zawierają dwutlenek
węgla stymulujący wzrost. W krajach, gdzie powszechnie występuje bruceloza,
zalecane jest stosowanie, umożliwiającego wzrost Brucella spp., dwufazowego
podłoża, złożonego z bulionu oraz stałej warstwy agaru na jednej z gładkich
powierzchni naczynia (Castaneda bottle). Do hodowli większości szczepów
B. abortus wymagana jest obecność dwutlenku węgla.
Prowadzenie hodowli z krwi
Czas inkubacji
Butelki do posiewu krwi powinny być inkubowane w 35 – 37°C i kontrolowane
dwukrotnie w ciągu dnia (co najmniej przez pierwsze 3 dni) w celu oceny cech
mikrobiologicznych wzrostu. Jałowe posiewy zwykle zawierają warstwę osadu
krwi, pokrytą jasnożółtym przezroczystym bulionem. Dowodem wzrostu są:
– kłaczkowaty osad na powierzchni warstwy krwi,
– jednolite lub podpowierzchniowe zmętnienie,
– hemoliza,
– koagulacja bulionu,
– kożuszek na powierzchni,
– wytwarzanie gazu,
– białe ziarna na powierzchni lub w głębszej warstwie krwi.
Kiedy tylko pojawi się wzrost, butelkę należy otworzyć w warunkach aseptycznych,
pobrać sterylną ezą lub pipetą Pasteura niewielką ilość bulionu i przygotować
rozmaz barwiony metodą Grama w celu oceny obecności mikroorganizmów.
Jednocześnie należy wykonać przesiew ezą na odpowiednie podłoża:
– dla Gram-ujemnych pałeczek: agar MacConkeya, agar Kliglera, podłoże
ruch-indol-ureaza (MIU), cytrynianowy agar Simmonsa;
– dla małych Gram-ujemnych pałeczek: agar z krwią;
– dla gronkowców: agar z krwią, agar z mannitolem;
– dla paciorkowców: agar z krwią, z krążkiem z optochiną, bacytracyną
i telurynem, agar z krwią baranią do testu CAMP, agar z żółcią i eskuliną.
33