Podstawowe procedury laboratoryjne w ... - digicollection.or..

KAŁ
Procedura identyfikacji antygenu H
Wstępna identyfikacja antygenu rzęskowego H może być przeprowadzona
w teście bezpośredniej aglutynacji, jak opisano powyżej dla antygenu somatycznego
O. Niekiedy konieczne jest zwiększenie ekspresji ruchu badanych szczepów
przez kilkakrotne kolejne przesiewy na półpłynne podłoża odżywcze (,,swarm
agar’’, patrz niżej). Surowice odpornościowe do wykonania testu z tymi
antygenami są dostępne komercyjnie. Mimo to, jeśli identyfikacja obu faz
rzęskowych jest niezbędna do klasyfikacji, wymagana jest faza zahamowania.
Często konieczna jest także inwersja faz z użyciem przeznaczonych do tego celu
surowic 1 .
1. Przygotować półpłynne podłoża odżywcze zawierające 0,2 – 0,4% agaru.
Umieścić po 1 ml podłoża w probówkach.
2. Zastąpić korki probówek korkami z waty.
3. Upłynnić agar w gotującej się wodzie i umieścić probówki z płynnym agarem
w łaźni wodnej w temperaturze 45°C na 30 minut.
4. Opisać każdą probówkę numerem próbki i surowicy anty-H (H:b, H:i i H:1,2).
Również probówkę kontrolną.
5. Dodać 10 µl heterogennej surowicy H każdej fazy inwersji do odpowiednich
agarów, delikatnie wstrząsnąć probówki i pozostawić agar do skrzepnięcia
w skosie.
6. Sporządzić gęstą zawiesinę izolowanych kolonii w roztworze fizjologicznym
soli, posiać ezą, nakłuwając skos, i inkubować przez noc.
7. Z hodowli uzyskanej na skosie pobrać ezą materiał i rozprowadzić równomiernie
w kropli roztworu fizjologicznego soli.
8. Ezą o objętości 10 µl pobrać kroplę jednej z heterogennych surowic
odpornościowych H i umieścić ją na szkiełku, tuż obok zawiesiny
bakterii.
9. Wymieszać surowicę z zawiesiną bakterii, przechylając szkiełko do przodu
idotyłu przez 1 minutę. Obserwować tworzenie się grudek, oglądając
szkiełko w dobrym świetle. Pojawienie się w tym czasie wyraźnych grudek
świadczy o dodatnim wyniku.
10. Jeśli to konieczne, należy powtórzyć test aglutynacji z innymi heterogennymi
surowicami i zidentyfikować serotyp, wykorzystując schemat przedstawiony
na str. 69.
Salmonella typhi
Dla potwierdzenia identyfikacji biochemicznej należy przeprowadzić testy
z surowicami odpornościowymi Vi, O grupy D (O:D) i H:d. Z powodu obecności
antygenu Vi hodowle aglutynujące w surowicy Vi mogą nie aglutynować
w surowicy O:D. Należy usunąć antygen Vi, podgrzewając zawiesinę w temperaturze
100°C przez 20 minut, i powtórnie przeprowadzić test z surowicą O:D.
Po uzyskaniu aglutynacji w surowicach Vi, O:D i H:d zanotować: ,,Salmonella
typhi’’. Jeśli wynik jest dodatni jedynie w surowicy O:D, zanotować:,,Salmonella,
grupa D’’.
1
Dostępne w Statens Serum Institut, 5 Artillerivej, 2300 Copenhagen S, Denmark.
70