Podstawowe procedury laboratoryjne w ... - digicollection.or..

CZE˛ŚĆ I
zakrętkę, odwrócić probówkę i wstrząsać delikatnie, nie dłużej niż 30
sekund.
5. Pozostawić na 15 minut w temperaturze pokojowej (20 – 25°C).
6. Uzupełnić mieszaninę do 50 ml wodą destylowaną lub 67 mmol/l buforem
fosforanowym (pH 6,8) w celu zahamowania działania NaOH. Ostrożnie zlać
supernatant do pojemnika wypełnionego odpowiednim środkiem dezynfekującym
(na bazie fenolu lub aldehydu glutarowego).
7. Jeśli posiew na podłoże będzie wykonywany natychmiast, zawiesić osad
w1– 2 ml sterylnego 0,85% NaCl lub sterylnej wody destylowanej. W innym
przypadku zawiesić osad w 1 – 2 ml sterylnej frakcji V albumin bydlęcych.
Procedura z użyciem fosforanu trójsodowego
Prątki mogą przeżyć mimo przedłużonego poddawania ich tej łagodnej procedurze.
Dlatego czas inkubacji i temperatura nie są restrykcyjne.
1. Przygotować roztwór 1 kg trójfosforanu sodu (Na 3 PO 4·12H 2 O) w 4 litrach
gorącej wody destylowanej, dodać 7,5 ml 17% chlorku benzylidenu (Zephiran),
dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Wymieszać równe objętości plwociny (do 10 ml) z roztworem Zephiranu
i fosforanu trójsodowego w 50-mililitrowej, sterylnej, szczelnej, szklanej
probówce wirówkowej. Dokręcić zakrętkę i wytrząsać energicznie przez
30 minut.
3. Odstawić mieszaninę na dodatkowe 30 minut.
4. Odwirować w 3000 g przez 15 minut. Ostrożnie zlać supernatant do pojemnika
wypełnionego odpowiednim środkiem dezynfekującym (na bazie fenolu lub
aldehydu glutarowego) i ponownie zawiesić osad w 20 ml neutralizującego
buforu fosforanowego, pH 6,6 1 .
5. Odwirować ponownie w 3000 g przez 15 minut. Zlać supernatant, a osad posiać
na podłoże.
Hodowla
1. Posiać 3 krople (około 0,1 ml) osadu na co najmniej trzy probówki z podłożem
Löwensteina-Jensena lub inne.
2. Sprawdzać regularnie wskaźnik zanieczyszczenia inkubowanych podłoży
i notować liczbę zanieczyszczonych płytek.
Wskaźnik zanieczyszczenia powinien wynosić 3 – 5%. Wyższy wskaźnik (ponad
5%) zanieczyszczonych hodowli na podłożu Löwensteina-Jensena zwykle wskazuje
na niewystarczającą skuteczność procedury dekontaminacji. Wskaźnik
zanieczyszczenia < 3% sugeruje, że procedura dekontaminacji została przeprowadzona
zbyt intensywnie i obecne w próbce prątki mogą nie wyrosnąć.
1
Przygotowanie neutralizującego buforu fosforanowego 67 mmol/l.
Roztwór podstawowy:
A. Rozpuścić 9,47 g nieuwodnionego fosforanu sodu w 1 litrze wody destylowanej.
B. Rozpuścić 9,07 g nieuwodnionego fosforanu potasu w 1 litrze wody destylowanej.
Dla buforu o pH 6,8: zmieszać 50 ml roztworu podstawowego A z 50 ml roztworu podstawowego
B.
Dla buforu o pH 6,6: zmieszać 37,5 ml roztworu podstawowego A z 62,5 ml roztworu
podstawowego B.
Sprawdzić pH. Jeśli potrzeba, dodać roztworu A, aby podnieść pH, lub roztworu B, aby
obniżyć pH.
87