Podstawowe procedury laboratoryjne w ... - digicollection.or..

ZAKAŻENIA DOLNYCH DRÓG ODDECHOWYCH
sodu jest toksyczny również dla prątków, dlatego w trakcie wykonywania metody
należy upewnić się, że:
– końcowe stężenie NaOH nie przekracza 2%;
– prątki gruźlicze nie są eksponowane na wodorotlenek sodu dłużej niż przez
30 minut, wliczając czas wirowania.
1. Wymieszać równe objętości plwociny i 4% wodorotlenku sodu 40 g/l
(uprzednio poddanego sterylizacji w autoklawie) w sterylnej, szczelnej,
50-mililitrowej szklanej butelce lub plastikowej stożkowatej probówce wirówkowej.
2. Inkubować w temperaturze pokojowej (25 – 30°C) przez 15 minut, delikatnie
wstrząsać mieszaninę w mechanicznym mieszadle przez 5 minut. W gorącym
klimacie potrzebne może być schłodzenie lub skrócenie czasu reakcji do
10 – 15 minut.
3. Odwirować lub uzupełnić mieszaninę do 50 ml destylowaną wodą lub buforem
fosforanowym (pH 6,8), hamując działanie NaOH.
4. Po 15 minutach odwirować w 3000 g przez 15 minut. Ostrożnie zlać
supernatant do pojemnika wypełnionego odpowiednim środkiem dezynfekującym
(na bazie fenolu lub aldehydu glutarowego). Zneutralizować osad
wkraplając 2 mol/l roztworu HCl zawierającego 2% czerwień fenolową,
połączyć, wstrząsając do chwili, gdy kolor zmieni się trwale z czerwonego na
żółty. Alternatywnie: dodać kroplę roztworu wskaźnikowego, a następnie
dodawać po kropli HCl ciągle mieszając.
5. Jeśli posiew na podłoże będzie wykonywany natychmiast, zawiesić zneutralizowany
osad w 1 – 2 ml sterylnego 0,85% NaCl lub sterylnej wody
destylowanej. W innym przypadku zawiesić osad w 1 – 2 ml sterylnej frakcji
V albumin bydlęcych.
Procedura z użyciem wodorotlenku sodu
N-acetyl-L-cysteiny
Niższe stężenie NaOH w obecności czynników mukolitycznych, takich jak
N-acetyl-L-cysteina (NALC), jest mniej agresywne wobec prątków gruźlicy.
Zarówno czas inkubacji, jak i temperatura nie mają tak kluczowego znaczenia, jak
w przypadku procedury z NaOH. Krótki, nie przekraczający 24 godzin, czas
przechowywania aktywnego roztworu NALC-NaOH wymaga przeprowadzenia
procedury w ciągu jednego dnia.
1. Połączyć równe objętości roztworu cytrynianu sodu (29 g dwuwodzianu
cytrynianu sodu na litr wody destylowanej) oraz 4% wodorotlenku sodu
(40 g/l) i autoklawować mieszaninę. Roztwór może być przechowywany
w temperaturze pokojowej.
2. Tuż przed użyciem dodać 0,5 g NALC do 100 ml roztworu zawierającego
NaOH i cytrynian sodu.
3. W zależności od liczby próbek przeznaczonych do dekontaminacji przygotować
2,5 g NALC w 500 ml roztworu NaOH i cytrynianu sodu lub 5 g NALC
w 1000 ml roztworu NaOH i cytrynianu sodu. Odczynniki są przydatne do
badania przez 24 godziny.
4. Do próbki umieszczonej w sterylnej, szczelnej, 50-mililitrowej szklanej
butelce lub plastikowej stożkowej probówce wirówkowej dodać
równą objętość aktywnego roztworu NALC-NaOH. Ostrożnie dokręcić
86