Diplomarbeit - GSI

2.1 Verwendete Zelllinien und deren Kultur
diese in einem Isopropanol Behälter (Nalgene Cryo 1 °C Freezing Container) kontrolliert,
mit einer durchschnittlichen Temperaturabnahme von 1 °C/min, auf eine Temperatur von
-80 °C gebracht. Nach 24 Stunden wurden sie zur Langzeitlagerung in einen Tank mit
flüssigem Stickstoff überführt, in dem eine Temperatur von -196 °C herrscht.
Zum Auftauen wurden die Kryoröhrchen aus dem flüssigen Stickstoff geholt und in ei-
nem Wasserbad bei 37 °C schnell aufgetaut, bis nur noch ein kleiner Eisklumpen zu sehen
war. Die Zellsuspension wurde in 20 ml vorgekühltes Medium gegeben und bei 107 x g
10 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet im vorgewärm-
ten Kulturmedium resuspendiert und in eine 75 cm 2 oder 25 cm 2 Kulturflasche überführt.
24 Stunden nach dem Auftauen wurde das Medium gewechselt, um nicht angewachsene
Zellen zu entfernen.
2.1.4 Behandlung von Zellen mit Trichostatin A
Bei Trichostatin A (TSA) handelt es sich um einen Histondeacteylase (HDAC) Inhibitor.
TSA bewirkt eine Hyperacetylierung.
Trichostatin A wurde 24 Stunden vor Bestrahlung dem Medium zugesetzt (Endkonzen-
tration 1 µM). Auch während und nach der Bestrahlung war TSA im Medium vorhanden.
Von TSA wurde eine 1,1 mM Stocklösung in DMSO bereitet und bei -20 °C gelagert.
Als Kontrolle wurde das gleiche Volumen an DMSO, das von der Inhibitor-Stocklösung
verwendet wurde, ebenfalls in Kulturmedium verdünnt und auf die Zellen gegeben.
2.1.5 Behandlung von Zellen mit einem spezifischen ATM Kinase Inhibitor (KU55933)
Die ATM Kinase wurde in Fibroblasten spezifisch mit dem Inhibitor KU55933 (Calbio-
chem, USA) inhibiert, der die ATP-Bindestelle von ATM blockiert. KU55933 wurde
1,5 Stunden vor Bestrahlung dem Medium zugesetzt (Endkonzentration 10 µM). Auch
während und nach der Bestrahlung war der Inhibitor im Medium vorhanden. Von KU55933
wurde eine 10 mM Stocklösung in DMSO angesetzt und bei -20 °C gelagert.
Als Kontrolle wurde das gleiche Volumen an DMSO, das von der Inhibitor-Stocklösung
verwendet wurde, ebenfalls in Kulturmedium verdünnt und auf die Zellen gegeben.
2.1.6 Behandlung von Zellen mit Anacardsäure
Anacardsäure (Calbiochem, USA) inhibiert spezifisch die Histonacetyltransferase (HAT)
Tip60. Dieser Inhibitor verhindert die Bindung von Acetyl-CoA an die aktive Bindestelle
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