Diplomarbeit - GSI

2.4.8 Micrococcus Nuklease Analyse
2.4.8.1 Micrococcus Nuklease Behandlung
Die Analyse erfolgte in Anlehnung an Lee et al. (2007) und Zaret (2005).
2.4 Biochemische Methoden
Die Zellen wurden in Petrischalen (∅ 32mm) angezogen. Für die Analyse wurde das
Medium dekantiert und der Zellrasen mit LPC-Puffer (Zusammensetzung siehe 2.5.1)
überschichtet, um die Zellmembranen anzudauen. Die Lyse der Zellmembranen dauerte
12 bis 15 Minuten und wurde währendessen unter dem Mikroskop kontrolliert. Anschlie-
ßend wurde der LPC-Puffer verworfen. Die Zellen wurden nun unterschiedlich lange (sie-
he Ergebnisse 3.4.2) in MNase Puffer (Zusammensetzung siehe 2.5.1) inkubiert. Nach
der Inkubation wurde der MNase Puffer verworfen. Die Zellen wurden durch die Zugabe
von 2x TNESK Puffer (siehe 2.5.1) lysiert. Nach Zugabe des Lyse-Verdünnungspuffers
(Zusammensetzung siehe 2.5.1) wurde das Zelllysat in ein 15 ml Röhrchen überführt.
Anschließend inkubierten die Lysate über Nacht bei 37 °C.
Im Folgenden wurde die im Lysat enthaltene DNA duch eine Phenol/Chloroform Extrak-
tion von Proteinen abgetrennt und durch eine Ethanolfällung aus der Lösung gewonnen.
2.4.8.2 DNA Isolation
Die Lysate aus 2.4.8.1 wurden mit einem Volumen TE-Puffer (Zusammensetzung siehe
2.5.1) verdünnt. Anschließend wurde ein Volumen neutrales Phenol hinzugegeben und
die Probe für 10 bis 20 Minuten stark geschüttelt. Dann erfolgte eine Zentrifugation bei
500 x g für 5 Minuten. Die wässrige Phase wurde in ein frisches Röhrchen überführt und
ein Volumen Chloroform hinzugegeben. Die Probe wurde 10 bis 20 Minuten stark ge-
schüttelt und bei 500 x g für 5 Minuten zentrifugiert. Der Chlorofomschritt wurde 2 bis 4
mal wiederholt. Anschließend wurde 1/10 Volumen 3M Natriumacetat (pH 5,3) hinzuge-
gen, invertiert und dann 2,5 Volumen eiskaltes Ethanol (95 %) hinzu pipettiert. Die Probe
wurde langsam invertiert bis keine Schlieren mehr in der Flüssigkeit zu sehen waren. Die
Ethanol-Fällung fand bei -20 °C für mindestens 2 h oder über Nacht statt. Die DNA wur-
de in einem Festwinkelrotor bei 9500 x g für 10 Minuten bei 4 °C abzentrifugiert und der
Überstand verworfen. Auf das DNA-Pellet wurde 70 % Ethanol gegeben und die Probe
einmal sanft invertiert. Anschließend wurde die DNA für 1 Minute abzentrifugiert und der
Überstand verworfen. Die DNA wurde 20 min im geöffneten Röhrchen getrocknet und
anschließend in 50 bis 70 µl TE-Puffer (Zusammensetzung siehe 2.5.1) aufgenommen.
Die DNA Konzentration wurde photometrisch bei 260 nm ermittelt. Die Lagerung der
DNA erfolgte bei 4 °C.
25