Diplomarbeit - GSI

2.4.6 Western Blot
2.4 Biochemische Methoden
Nachdem die Proteine in einer SDS-PAGE der Größe nach aufgetrennt waren, wurden
sie auf eine Polyvinylidenfluorid- (PVDF-) Membran (Millipore, USA) mit Hilfe einer
SemiDry Apparatur Hoefer SemiPhor (GE HealthCare, UK) transferiert. Hierzu wurde
die Membran zunächst in Methanol und dann in Transferpuffer (Zusammensetzung siehe
2.5.1) äquilibriert. Das Trenngel wurde auf die äquilibrierte Membran zwischen vier mit
Transferpuffer getränkten Filterpapieren (Zwei über und zwei unter dem Gel/Membran
Stapel) unter Ausschluss von Luftblasen gelegt (siehe Abb. 2.1). Der Transfer erfolgte bei
65 mA/Gel für 45 Minuten. Nach der Übertragung auf die PVDF-Membran konnte die
Immundetektion individueller Proteine erfolgen.
Abbildung 2.1: Schematische Darstellung des Western Blots
2.4.7 Immundetektion des Western Blots
Nach dem Western Blot wurden die freien Bindungsstellen der Membran mit einer Blo-
ckierlösung (Zusammensetzung siehe 2.5.1) unter Schütteln für 40 min inkubiert. In die-
ser Blockierlösung wurde auch der primäre Antikörper (siehe Tab. 2.4) verdünnt. Die
Membran inkubierte unter Schütteln 1,5 h bei RT mit dem primären Antikörper. Anschlie-
ßend wurde die Membran dreimal mit 1x TBST für 5 min unter Schütteln gewaschen. Der
sekundäre Antikörper (siehe Tab. 2.5), mit einer Meerrettich-Peroxidase (HRP) gekop-
pelt, wurde in 1x TBST verdünnt und inkubierte für eine Stunde bei RT unter Schütteln.
Die Membran wurde in 1x TBST viermal gewaschen und für 5 min mit dem Enzymsub-
strat Lumigen PS-3 (GE HealthCare, UK) im Dunkeln inkubiert. Die Chemolumineszenz-
detektion erfolgte anschließend mit einem Röntgenfilm (Amersham Hyperfilm ECL, GE
HealthCare Limited, UK). Dabei betrugen die Expositionszeiten zwischen 2 Sekunden
und einer Stunde.
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