Diplomarbeit - GSI

GSI Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung GmbH 

Technische Universität Darmstadt 

Fachbereich Biologie 

Diplomarbeit 

Modulation der Chromatinzugänglichkeit 

nach Bestrahlung 

von 

Kerstin Knoop 

unter Anleitung von: 

Prof. Dr. Paul Layer 

Dr. Gisela Taucher-Scholz 

März, 2009

Zusammenfassung 

Im Laufe der Evolution entwickelten sich unterschiedliche DNA-Reparaturmechanismen 

um die genetische Integrität der DNA in den Zellen zu erhalten. Eine zentrale Rolle in 

der frühen DSB-Schadensantwort spielt bei der DSB-Reparatur die Proteinkinase ATM 

(Ataxia telangietactica mutated). Die Aktivierung des inaktiven ATM-Dimers wird von 

der Histonacetyltransferase Tip60 übernommen. Das Zusammenspiel von Tip60 und ATM 

in der DNA-Reparatur ist noch nicht vollständig geklärt. Es ist jedoch bekannt, dass durch 

eine Acetylierung am Lysin 3016 ATM in der Lage ist, sich am Serin 1981 zu autophos- 

phorylieren, so dass ATM in zwei aktive Monomere dissoziiert. 

In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals unter physiologischen Bedingungen die Ko- 

lokalisation von Tip60 und ATMpS1981 an DNA-Schäden nach Bestrahlung mit Schwe- 

rionen nachgewiesen werden. Diese Kolokalisation wurde nicht nur in humanen Fibro- 

blasten, sondern auch in der humanen Tumorzelllinie U2-OS mit Hilfe der Immunfluo- 

reszenz gezeigt. Des Weiteren wurde die Rekrutierung von Tip60 und autophosphory- 

lierten ATM (ATMpS1981) an DNA-Schäden in Abhängigkeit voneinander untersucht. 

Dabei konnte festgestellt werden, dass die Tip60 DNA-Schadensrekrutierung teilweise 

von ATM abhängt. Autophosphoryliertes ATM scheint hingegen nicht unbedingt not- 

wendig für die DNA-Rekrutierung von Tip60 an DNA-Schäden zu sein. Im Gegensatz 

dazu zeigte ATM eine Abhängigkeit bei der DNA-Schadensrekrutierung von der Tip60- 

Acetylierungsaktivität. 

Damit Reparaturproteine an DNA binden können, muss diese zunächst zugänglich ge- 

macht werden. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde deshalb die Chromatinzugäng- 

lichkeit nach Bestrahlung mit Schwerionen und Röntgenstrahlen näher untersucht, be- 

sonders ob die Chromatinzugänglichkeit Tip60- bzw. ATM-abhängig ist. In Western Ana- 

lysen wurde der Acetylierungszustand von Histon H4 nach Bestrahlung untersucht, da 

diese Acetylierung durch Tip60 induziert wird. Nach Bestrahlung mit 12 C-Ionen wurde 

eine erhöhte Acetylierung von Histon H4 detektiert, was einer erhöhten Chromatinzu- 

gänglichkeit entspricht. Dieses Ergebnis konnte jedoch weder mit 64 Ni-Ionen noch Rönt- 

genstrahlen reproduziert werden. Die unklaren Ergebnisse der Western Analyse machten 

es nötig, die Chromatinauflockerung zusätzlich mit einer anderen Methode, der Micrococ- 

cus Nuklease Analyse, zu untersuchen. Mit Hilfe dieser Methode, die zunächst etabliert 

werden musste, kann anhand der Größe der durch Micrococcus Nuklease (MNase) Be- 

handlung entstandenen DNA-Fragmente eine Aussage über den Auflockerungsgrad des 

Chromatins gemacht werden. Dabei konnte strahlungsabhängig, aber unabhängig von der 

III

Strahlenqualität, eine deutliche Chromatinauflockerung gezeigt werden. In Abhängigkeit 

von Tip60 bzw. ATM war eine strahlungsunabhängige Chromatinauflockerung zu ver- 

zeichnen.

Inhaltsverzeichnis 

Zusammenfassung III 

Abbildungsverzeichnis IX 

Tabellenverzeichnis XI 

Abkürzungsverzeichnis XIII 

1 Einleitung 1 

1.1 Biologische Grundlagen Strahlen-induzierter Schäden . . . . . . . . . . . 1 

1.1.1 Aufbau des Chromatins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 

1.1.2 Reparatur von DNA-Schäden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 

1.1.3 Die Proteinkinase ATM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 

1.1.4 Die Histonacetyltransferase Tip60 . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 

1.1.5 Interaktion von Tip60 und ATM in der Schadensantwort . . . . . 5 

1.2 Physikalische Grundlagen ionisierender Strahlung . . . . . . . . . . . . . 7 

1.2.1 Kenngrößen der ionisierenden Strahlung . . . . . . . . . . . . . . 8 

1.2.2 Biologische Wirkung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 

1.3 Ziel dieser Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 

2 Methoden und Material 11 

2.1 Verwendete Zelllinien und deren Kultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 

2.1.1 Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 

2.1.2 Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 

2.1.3 Langzeitlagerung der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 

2.1.4 Behandlung von Zellen mit Trichostatin A . . . . . . . . . . . . . 13 

2.1.5 Behandlung von Zellen mit einem spezifischen ATM Kinase In- 

hibitor (KU55933) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 

2.1.6 Behandlung von Zellen mit Anacardsäure . . . . . . . . . . . . . 13 

2.1.7 Überlebenskurve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 

2.2 Bestrahlung der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 

2.2.1 Bestrahlung mit Röntgenstrahlen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 

2.2.2 Bestrahlung mit Schwerionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 

2.2.3 Bestrahlung mit der Schwerionen Mikrosonde . . . . . . . . . . . 16 

2.3 Immunzytochemische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 

V


2.3.1 Fixierung von Zellen ohne Extraktion . . . . . . . . . . . . . . . 17 

2.3.2 Antikörperfärbung der fixierten Zellen . . . . . . . . . . . . . . . 17 

2.3.3 Konfokale Laser-Mikroskopie und Auswertung . . . . . . . . . . 19 

2.4 Biochemische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 

2.4.1 Herstellung von Gesamtzelllysaten . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 

2.4.2 Fraktionierte Proteinisolation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 

2.4.3 Koimmunpräzipitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 

2.4.4 Proteinbestimmung nach Lowry . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 

2.4.5 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese . . . . . 22 

2.4.6 Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 

2.4.7 Immundetektion des Western Blots . . . . . . . . . . . . . . . . 23 

2.4.8 Micrococcus Nuklease Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 

2.4.8.1 Micrococcus Nuklease Behandlung . . . . . . . . . . . 25 

2.4.8.2 DNA Isolation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 

2.4.8.3 Agarosegelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . 26 

2.5 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 

2.5.1 Verwendete Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 

2.5.2 Verwendete Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 

3 Ergebnisse 31 

VI 

3.1 Unterschiede in der Strahlungsempfindlichkeit ATM-defizienter Zelllinien 31 

3.2 Tip60 DNA-Schadensrekrutierung ist ATM abhängig . . . . . . . . . . . 32 

3.2.1 Tip60 und ATMpS1981 an DNA-Doppelstrangbrüchen nach In- 

hibition der ATM-Autophosphorylierung . . . . . . . . . . . . . 36 

3.3 Interaktionen von Tip60 und ATM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 

3.3.1 Kolokalisation von Tip60 und ATMpS1981 an DNA-Doppelstrang- 

brüchen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 

3.3.2 Inhibition der Tip60-Acetylierungsreaktion beeinflusst die ATM- 

Rekrutierung an DNA-Doppelstrangbrüche . . . . . . . . . . . . 40 

3.3.3 Suche nach direkter Interaktion von Tip60 und aktiven ATM . . . 41 

3.4 Der Einfluss von Bestrahlung auf die Chromatinzugänglichkeit . . . . . . 43 

3.4.1 Die Histon H4 Acetylierung (AcH4) nach Bestrahlung . . . . . . 44 

3.4.1.1 Hyperacetylierung von Histon H4 nach Trichostatin A 

Behandlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 

3.4.1.2 Bestrahlung mit 12 C-Ionen erhöht die Histon H4 Ace- 

tylierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 

3.4.1.3 Kein Einfluss auf die Histon H4 Acetylierung durch 

Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen . . . . . . . . . . . . . . . 46


3.4.1.4 Kein Einfluss auf die Histon H4 Acetylierung durch 

Röntgenbestrahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 

3.4.2 Untersuchung der Chromatinauflockerung in Abhängigkeit von 

Bestrahlung mit Hilfe der Micrococcus Nuklease Analyse . . . . 48 

3.4.2.1 Röntgenbestrahlung führt zu einer Chromatinauflocke- 

rung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 

3.4.2.2 Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen führt zu einer Chromatin- 

auflockerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 

3.4.2.3 Die strahlungsbedingte Chromatinauflockerung ist ATM 

abhängig . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 

3.4.2.4 Die strahlungsbedingte Chromatinauflockerung ist Tip60 

abhängig . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 

3.5 Nachweis von Tip60 an DNA-Doppelstrangbrüchen in anderen Zellsys- 

temen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 

3.5.1 Embryonale Mausfibroblasten: Kein eindeutiger Nachweis von 

Tip60 an DNA-Doppelstrangbrüchen . . . . . . . . . . . . . . . 58 

3.5.2 Tip60 kann in der humanen Tumorzelllinie U2-OS an DNA-Dop- 

pelstrangbrüchen nachgewiesen werden . . . . . . . . . . . . . . 59 

3.5.3 Humane U2-OS Tumorzellen: Kolokalisation von Tip60 und phos- 

phoryliertem ATM an DNA-Doppelstrangbrüchen . . . . . . . . 60 

4 Diskussion 63 

4.1 Tip60 und ATM sind bei der DNA-Schadensrekrutierung voneinander ab- 

hängig . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 

4.2 Unterschiede in der Chromatinauflockerung nach Röntgen- und Schwe- 

rionenbestrahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 

4.2.1 Indirekter Nachweis der Chromatinauflockerung durch die Ace- 

tylierung von Histon H4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 

4.2.2 Direkter Nachweis der Chromatinauflockerung durch die Mikro- 

coccus Nuklease Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 

4.2.3 Vergleich der verwendeten Analysen zur Untersuchung der Chro- 

matinauflockerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 

5 Ausblick 73 

Literaturverzeichnis 75 

Danksagung 81 

VII

Abbildungsverzeichnis 

1.1 Aufbau des Chromatins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 

1.2 Interaktion von Tip60 und ATM in der DNA-Schadensantwort . . . . . . 6 

1.3 Dosisverteilung nach Schwerionen- und Photonenbestrahlung auf einer 

Fläche von 10 µm x 10 µm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 

1.4 Tiefendosis-Profil von Photonen (Röntgenstrahlen), Protonen und 12 C- 

Ionen in Wasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 

1.5 Die relative biologische Wirksamkeit von Röntgenstrahlen und Schwerio- 

nen in Abhängigkeit der Dosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 

2.1 Schematische Darstellung des Western Blots . . . . . . . . . . . . . . . . 23 

3.1 Überlebenskurve humaner AG 1522 D Fibroblasten und ATM-defizienter 

AT5 Fibroblasten nach Röntgenbestrahlung . . . . . . . . . . . . . . . . 32 

3.2 γH2AX und Tip60 Foci pro Zellkern 1, 5, 8 und 24 Stunden nach Bestrah- 

lung mit 124 Xe-Ionen in AG 1522 D Zellen ohne und mit ATM Inhibitor 

(KU55933) sowie in ATM-defizienten humanen Fibroblasten . . . . . . . 35 

3.3 Mittelwerte der maximalen Intensitätsprofile der Tip60- und ATMpS1981- 

Foci nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen und vorheriger Inhibition von ATM 

mit KU55933 in humanen Fibroblasten . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 

3.4 Kolokalisation von Tip60 und ATMpS1981 nach der Schrägbestrahlung 

mit 124 Xe-Ionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 

3.5 Kolokalisation von Tip60 und ATMpS1981 nach der Bestrahlung mit 197 Au- 

Ionen der Mikrosonde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 

3.6 Mittelwerte der maximalen Intensitätsprofile der Tip60- und ATMpS1981- 

Foci nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen und vorheriger Inhibition von Tip60 

mit Anakardsäure in AG 1522 D Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 

3.7 Western Analyse der fraktionierten Proteinisolation 1 h nach Bestrahlung 

mit 124 Xe-Ionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 

3.8 Hyperacetylierung von Histon H4 nach TSA-Behandlung . . . . . . . . . 45 

3.9 Erhöhte Acetylierung von Histon H4 nach Bestrahlung mit 12 C-Ionen . . 46 

3.10 Die Histon H4 Acetylierung ist nach 64 Ni-Ionen weder strahlungsabhän- 

gig noch dosisabhängig . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 

3.11 AcH4-Signal nach Röntgenbestrahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 

IX

Abbildungsverzeichnis 

X 

3.12 Chromatinauflockerung mit Hilfe der Micrococcus Nuclease Analyse nach 

Röntgenbestrahlung in AG 1522 D Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 

3.13 Chromatinauflockerung nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen . . . . . . . . . 51 

3.14 Die strahlungsbedingte Chromatinauflockerung nach Röntgenbestrahlung 

ist ATM abhängig . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 

3.15 Die strahlungsbedingte Chromatinauflockerung nach Bestrahlung mit 64 Ni- 

Ionen ist ATM abhängig . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 

3.16 Die strahlungsbedingte Chromatinauflockerung nach Bestrahlung mit Rönt- 

gen ist Tip60 abhängig . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 

3.17 Die strahlungsbedingte Chromatinauflockerung nach Bestrahlung mit 64 Ni- 

Ionen ist Tip60 abhängig . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 

3.18 Kolokalisation von Tip60 und RPA nach der Bestrahlung von embryona- 

len Mausfibroblasten mit 124 Xe-Ionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 

3.19 Kolokalisation von Tip60 und γH2AX nach der Bestrahlung von U2-OS 

Zellen mit 124 Xe-Ionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 

3.20 Tip60 und ATMpS1981 kolokalisieren in U2-OS Zellen an DNA-Doppel- 

strangbrüchen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

Tabellenverzeichnis 

2.1 In der Bestrahlung eingesetzte Ionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 

2.2 Verwendete primäre Antikörper für die Immunfluoreszenz . . . . . . . . 18 

2.3 Verwendete sekundäre Antikörper für die Immunfluoreszenz . . . . . . . 19 

2.4 Primäre Antikörper für die Western Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . 24 

2.5 Sekundäre Antikörper für die Western Analyse . . . . . . . . . . . . . . 24 

XI

Abkürzungsverzeichnis 

AcH4 . . . . . . . . . . Acetyliertes Histon H4 

AEBSF . . . . . . . . . 4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid 

ATM . . . . . . . . . . . Ataxia telangiectasia mutated 

ATR . . . . . . . . . . . . Ataxia telangiectasia and Rad3 related Kinase 

BSA . . . . . . . . . . . bovine serum albumin / Rinderserumalbumin 

CHO . . . . . . . . . . . Chinese hamster ovary cells 

DMEM . . . . . . . . . Dulbecco´s modified Eagle Medium 

DMSO . . . . . . . . . Dimethylsulfoxid 

DNA-PKcs . . . . . . DNA-dependent Proteinkinase catalytic subunit / 

DSB . . . . . . . . . . . Doppelstrangbruch 

DTT . . . . . . . . . . . Dithiothreitol 

DNA-abhängige Proteinkinase katalytische Untereinheit 

EBSS . . . . . . . . . . Earle‘s balanced salt solution 

EDTA . . . . . . . . . . Ethylendiamintetraethansäure 

EMEM . . . . . . . . . Eagle´s Minimum Essential medium 

ESB . . . . . . . . . . . . Einzelstrangbruch 

FCS . . . . . . . . . . . . fetal calf serum / fötales Kälberserum 

H4 . . . . . . . . . . . . . Histon H4 

HAT . . . . . . . . . . . Histonacetyltransferase 

HDAC . . . . . . . . . . Histondeacetylasen 

HRP . . . . . . . . . . . horseradish peroxidase 

IR . . . . . . . . . . . . . . ionizing radiation / Ionisierende Strahlung 

KU55933 . . . . . . . Morpholin-4-yl-6-thianthren-1-yl-pyran-4-on 

LET . . . . . . . . . . . . linearer Energietransfer 

LPC . . . . . . . . . . . . Lysophosphatidylcholin 

MEF . . . . . . . . . . . mouse embrionic fibroblast / embryonale Mausfibroblasten 

XIII

Tabellenverzeichnis 

MNase . . . . . . . . . Micrococcus Nuklease 

MYST . . . . . . . . . . MOZ, Ybf2/Sas3, Sas2 und Tip60 

NHEJ . . . . . . . . . . non-homologous end joining / Nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung 

NuA4-Komplex . Nukleosomale Acetyltransferase von Histon H4 

PBS . . . . . . . . . . . . Phosphat-gepufferte Salzlösung 

PFA . . . . . . . . . . . . Paraformaldehyd 

PIKK . . . . . . . . . . . Phosphatidylinositol-3-Kinase(PI3K)-verwandte Kinase 

PVDF . . . . . . . . . . Polyvinylidenfluorid 

RBW . . . . . . . . . . . relative biologische Wirksamkeit 

RPA . . . . . . . . . . . . Replication Protein A / Replikationsprotein A 

RT . . . . . . . . . . . . . Raumtemperatur 

SDS . . . . . . . . . . . . Sodium Dodecyl Sulfate 

SE . . . . . . . . . . . . . Standard Error / Standardfehler 

Tip60 . . . . . . . . . . . HIV-1-Tat-interactive Protein 60 kDa; KAT5 

TRRAP . . . . . . . . . Transformation/Transkription Domäne-assoziiertes Protein 

TSA . . . . . . . . . . . . Trichostatin A 

XIV

1 Einleitung 

Durch natürliche Strahlung, mutagene Substanzen oder auch endogene Vorgänge entste- 

hen in Zellen DNA-Schäden, die eine Reparatur zwingend erfordern. Dabei haben sich 

die unterschiedlichsten Reparaturmechanismen entwickelt. Ein nicht vollständig funktio- 

nierendes Reparatursystem kann zu schweren Krankheiten wie Fanconi Anemia (FA), 

Nijmengen-Breakage-Syndrom (NBS), Xeroderma pigmentosum (XP) oder Ataxia te- 

langietactica (AT) führen. Diese vier Krankheiten, bei denen die Reparaturmechanismen 

gestört sind, zeigen alle gemeinsame Symptome. Dazu zählen eine erhöhte Strahlenemp- 

findlichkeit, frühes Auftreten von Krebserkrankungen, Immundefekte sowie Wachstums- 

und Entwicklungsverzögerungen. 

Eine übergeordnete Rolle bei der DNA-Reparatur spielt die Proteinkinase ATM (Ataxia 

telangietactica mutated), welche bei der AT-Krankheit einen Gen-Defekt im AT-Gen be- 

sitzt. ATM ist selbst an der DNA-Reparatur beteiligt und aktiviert durch Phosphorylierung 

viele Reparaturproteine, die DNA-Reparatur, Apoptose oder Zellzykluskontrolle beein- 

flussen. Die Aktivierung von ATM nach einem DNA-Schaden wird durch eine Acetylie- 

rung von ATM durch die Histonacetyltransferase (HAT) Tip60 induziert. 

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das Zusammenspiel von Tip60 und autophos- 

phoryliertem ATM in der DNA-Reparatur, die durch Bestrahlung induziert wird, näher 

untersucht. Die biologischen und physikalischen Grundlagen für diese Arbeit sollen in 

diesem Kapitel zunächst näher erläutert werden. 

1.1 Biologische Grundlagen Strahlen-induzierter Schäden 

1.1.1 Aufbau des Chromatins 

Das Chromatin ist im Zellkern lokalisiert und besteht aus der DNA, die um Histone gewi- 

ckelt ist, sowie aus weiteren Proteinen die sich an die DNA anlagern. Es kann aufgrund 

seiner dynamischen Struktur in Hetero- (kondensiertes Chromatin) und Euchromatin (de- 

kondensiertes Chromatin) unterteilt werden. 

Die Histone H2A, H2B, H3 und H4 bilden ein Histon-Oktamer, dass jeweils aus zwei H3- 

H4 und zwei H2A-H2B Dimeren besteht. Die Kern-Partikel, auch Nukleosomen genannt, 

setzen sich wiederum aus 147 bp DNA (beim Menschen) und einem Histon-Oktamer 

zusammen. Die einzelnen Nukleosomen sind über die Linker-Region miteinander ver- 

bunden. Die Linker-Region ist ein DNA-Stück das in seiner Länge variabel ist und immer 

1

1 Einleitung 

zwei Nukleosomen verbindet. In dieser Linker-Region sitzt das Histon H1 und fördert den 

Aufbau höherer Strukturen. Aus Nukleosomenketten bilden sich die Chromatinfäden, die 

stark ineinander verdreht sind (siehe Abbildung 1.1). 

Die einzelnen Histone zeichnen sich durch eine konservierte zentrale Domäne aus, wäh- 

rend der N-terminale Teil eines jeden Histons viele basische Aminosäuren enthält und 

auch stärker variabel ist. Die Basizität sorgt für eine starke Bindung der DNA an die 

Histone. Histone können auch posttranslational durch Methylierung, Acetylierung, Phos- 

phorylierung oder Ubiquitinylierung modifiziert werden. Diese Modifikationen haben un- 

ter anderem einen Einfluss bei der Transkription, DNA-Reparatur und auch auf die Chro- 

matindichte. Bei der Acetylierung der vier Lysinreste von Histon H4 durch Histonacetyl- 

transferasen, während der Transkription, kommt es beispielsweise zu einer Auflockerung 

der Chromatinstruktur, da die positive Ladungen der Lysine neutralisiert werden und so 

nicht mehr fest an das negativ geladene Rückgrat der DNA binden können. Eine zentra- 

le Rolle bei der DNA-Reparatur nimmt die Histonvariante H2AX des Histons H2A ein. 

Der Anteil von H2AX an H2A beträgt 10 - 15 % in humanen Zellen (Mannironi et al., 

1989). H2AX wird unmittelbar nach der Schädigung der DNA zu γH2AX phosphory- 

liert. Dieses Signal breitet sich nun über 2 Megabasen um den Schaden aus und markiert 

die Schadensstelle, so dass andere Reparaturproteine rekrutiert werden können. 

Abbildung 1.1: Aufbau des Chromatins. Je zwei Kern Histone H2A, H2B, H3 und H4 bilden ein 

Histon Oktamer um das sich 147 bp DNA schlingt. Es wird ein Nukleosom gebildet. Dieses Nukleosom 

bindet über Linker-DNA an das nächste Nukleosom und bildet eine Nukleosomenkette, 

die sich zu einem Chromatin-Faden aufwickelt. [Abbildung in Anlehnung an Morgan (2007)] 

1.1.2 Reparatur von DNA-Schäden 

DNA-Schäden können spontan bei endogenen Vorgängen, wie z. B der Replikation oder 

auch durch Einwirkung mutagener Substanzen, UV-Strahlung oder ionisierender Strah- 

lung verursacht werden. Durch ionisierende Strahlen (ionizing radiation: IR) entstehen 

sowohl direkt (Ionisationsereignisse) als auch indirekt (freie Radikale) unterschiedliche 

DNA-Schäden. Bei der Bestrahlung mit einem Gray entstehen in einem Zellkern ca. 2000 

2


bis 3000 Basenschäden, 500 bis 1000 Einzelstrangbrüche (ESB) und 30 bis 40 Dop- 

pelstrangbrüche (DSB) (Schmidt und Aichinger). Basenschäden sowie Einzelstrangbrü- 

che werden effizient durch Exzisionsreparatur-Mechanismen repariert, wobei der kom- 

plementäre ungeschädigte DNA-Strang als Matrize dient. Der schwerwiegenste DNA- 

Schaden ist der DNA-Doppelstrangbruch, da hierbei beide Stränge der DNA durchtrennt 

werden, und es so zu Fehlern bei der Reparatur und zu Deletionen kommen kann. Die 

Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSB) ist erschwert, wenn mehr als ein DSB vor- 

handen ist, da hierbei die verschiedenen DNA-Enden falsch verknüpft werden könnten. 

Fehlerhafte Reparaturen können zu Mutationen und dadurch zu strukturellen Chromoso- 

menaberrationen führen. Im Folgenden sollen nun die Reparaturmechanismen von DNA- 

Doppelstrangbrüchen näher erläutert werden. 

Die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen kann zum Einen über die homologe Re- 

kombination (HR) und zum Anderen über Nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung (non 

homologous end joining: NHEJ) erfolgen (Übersicht Kanaar et al. (1998)). Damit es über- 

haupt zur Reparatur von DNA-Schäden kommen kann, muss zunächst die Chromatin- 

struktur um den Schaden aufgelockert werden, so dass Reparaturproteine binden kön- 

nen. Die Zugänglichkeit des Chromatins ist ATP-abhängig und wird durch verschiedene 

posttranslationale Histonmodifikationen gewährleistet (Übersicht Pandita und Richardson 

(2009)). Die frühste bekannte Histon-Modifikation ist die Phosphorylierung des Histons 

H2AX durch ATM zu γH2AX (Rogakou et al., 1998), wodurch der DNA-Schaden mar- 

kiert wird und Reparaturproteine an Doppelstrangbrüche rekrutiert werden. Nun kommt 

es abhängig vom Zellzyklus zu HR oder NHEJ. 

Die homologe Rekombination ist in der späten S- und G2-Phase der dominante Re- 

paraturweg (Rothkamm et al., 2003), da das homologe Schwesterchromatid als Vorla- 

ge verwendet werden kann und so eine fehlerfreie Reparatur ermöglicht. Dabei wer- 

den zunächst durch die Proteinkinase ATM Exonukleasen aktiviert, die an den DNA- 

Bruchenden die Nukleotide so abbauen, dass an den 3´-Enden überhängende Einzelsträn- 

ge entstehen. Rad51, gestützt durch den MRN-Komplex, sowie RPA binden an den DNA- 

Einzelstrang und bildeen ein Nukleoprotein-Filament das sich mit dem komplementären 

Einzelstrang des Schwesterchromatids paart (Shinohara und Ogawa, 1998). Die beiden 

gepaarten 3´OH Enden dienen als Startpunkte für die Auffüllsynthese der einzelsträngi- 

gen Lücken. Abschließend werden die Zuckerphosphatketten durch Ligation verschlos- 

sen. 

NHEJ tritt hauptsächlich in der G0/G1 bzw. frühen S-Phase auf, kann jedoch in allen Zell- 

zyklusphasen aktiv sein (Rothkamm et al., 2001, 2003). Die Reparatur durch NHEJ ver- 

läuft nicht fehlerfrei, da es durch die End-zu-End Verknüpfung der Bruchenden zum Ver- 

lust einiger Basenpaare (Mikrodeletionen) kommen kann. Beim NHEJ binden Ku70/Ku80- 

3

1 Einleitung 

Heterodimere vorzugsweise an DNA-Bruchenden. Im Anschluss wird DNA-PKcs (DNA- 

dependent Proteinkinase catalytic subunit) und weitere Reparaturproteine an die Scha- 

densstelle rekrutiert. Durch die Bildung der DNA-PK Holoenzyme aus den Ku70/Ku80- 

Heterodimeren und DNA-PKcs wird sowohl der Abbau der DNA-Enden durch Nukleasen 

als auch die Transkription und Replikation verhindert. Die DNA-PK sind außerdem für 

die räumliche Fixierung der freien DNA-Enden zuständig, so dass es zur Ligation duch 

den XRCC4-LigaseIV-Komplex kommen kann, bei der beide Bruchenden wieder kova- 

lent miteinander verknüpft werden (Christmann et al., 2003). 

1.1.3 Die Proteinkinase ATM 

Die Proteinkinase ATM gehört zu der Familie der PIKK (Phosphatidylinositol-3-Kinase- 

like protein Kinasen), zu der auch ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related) und 

DNA-PKcs zählen. ATM liegt als inaktives Dimer vor. Erst durch die Acetylierung am 

Lysin 3016 der HAT Tip60 (Sun et al., 2007) und die anschließende Autophosphorylie- 

rung an den Serinen 367, 1893 und 1981 zerfällt es in zwei aktive Monomere (Bakkenist 

und Kastan, 2003). Aktives ATM spielt eine wichtige Rolle bei der frühen zellulären Ant- 

wort auf DNA-Schäden und bei der Zellzyklusprogression. Es phosphoryliert und damit 

aktiviert eine Vielzahl von Effektorproteinen, die nun ihrerseits unterschiedliche Signal- 

wege, wie Reparatur, Apoptose oder Zellzyklusarrest regulieren. 

In der DNA-Reparatur phospohryliert ATM , und auch DNA-PK, die Histonvariante H2AX 

am Serin 139 zu γH2AX. Dieses Signal breitet sich innerhalb kürzester Zeit in einem Be- 

reich von 2 Megabasen um den DSB aus (Rogakou et al., 1998), so dass Reparaturproteine 

rekrutiert werden können. 

ATM wird auch speziell für die Reparatur von DNA-DSB im Heterochromatin gebraucht. 

Es besteht das Modell, dass durch eine KAP-1-Phosphorylierung durch ATM die Interak- 

tion von KAP-1 und dem Heterochromatin geschwächt und so der Zugang für Reparatur- 

proteine erleichtert wird (Goodarzi et al., 2008). 

1.1.4 Die Histonacetyltransferase Tip60 

Die HAT Tip60 (HIV-1-Tat-interactive Protein 60 kDa; KAT5), die zu der MYST-Familie 

(MOZ, Ybf2/Sas3, Sas2 und Tip60) zählt, katalysiert den Transfer von Acetyl-Gruppen 

des acetlyierten Coenzym A auf die Aminogruppe der Aminosäure Lysin. Tip60 acety- 

liert das Histon H2A am Lysin 5, Histon H3 am Lysin 14 und Histon H4 an den Lysinen 

5, 8, 12 und 16 in vitro (Kimura und Horikoshi, 1998). In vivo acetyliert Tip60 hingegen 

nur Histon H2A und die phosphorylierte Form γH2AX sowie Histon H4 (Sapountzi et al., 

4


2006). Durch die Acetylierung wird die positive Ladung der Lysine neutralisiert und die 

Chromatinsturktur kann sich auflockern, so dass Transkriptionsfaktoren oder Reparatur- 

proteine an die DNA binden können. Dabei ist Tip60 über das Protein TRRAP mit dem 

NuA4-Komplex assoziiert (Sun et al., 2005; Jiang et al., 2006). Dieser NuA4-Komplex 

besteht aus 12 Untereinheiten, besitzt unter anderem Helikasefunktionen und sorgt wäh- 

rend der Transkription für eine Auflockerung der DNA (Doyon et al., 2004). 

Tip60 ist auch mit Reparaturproteinen assoziiert. Über die FATC-Domäne ist Tip60 an 

ATM gebunden und sorgt durch eine Acetylierung am Lysin 3016 von ATM (Sun et al., 

2007) für die anschließende Autophosphorylierung an den Serinen 367, 1893 sowie 1981 

und die Dissoziation in zwei aktive Monomere (Bakkenist und Kastan, 2003). Über die 

FATC-Domäne ist Tip60 auch mit der Proteinkinase DNA-PK assoziiert und aktiviert 

diese wahrscheinlich ebenfalls in der DNA-Schadensantwort (Jiang et al., 2006). 

1.1.5 Interaktion von Tip60 und ATM in der Schadensantwort 

Abbildung 1.2 zeigt, dass sich Tip60 und ATM in der DNA-Schadensantwort gegensei- 

tig beeinflussen. Tip60 liegt mit der inaktiven Proteinkinase ATM in einem Komplex vor 

(Sun et al., 2005). Die Interaktion von Tip60 und ATM erfolgt über die FATC-Domäne 

am C-Terminus von ATM (Jiang et al., 2006). Ob die Interaktion direkt ist, ist nicht völlig 

geklärt, da Sun et al. (2005) keine direkte Interaktion zwischen Tip60 und der FATC- 

Domäne finden konnten. 

Entsteht ein Doppelstrangbruch, aktiviert Tip60 das inaktive ATM-Dimer durch eine Ace- 

tylierung am Lysin 3016 (Sun et al., 2007), wodurch sich ATM an den Serinen 367, 

1893 und 1981 autophosphorylieren kann (Bakkenist und Kastan, 2003; Kozlov et al., 

2006) und zu zwei aktiven Monomeren dissoziiert. Das aktive ATM kann nun das Histon 

H2AX am Serin 139 phosphorylieren, so dass sich das Signal von γH2AX über einen 

Bereich von 2 Megabasen um den Schaden ausbreitet und die DNA-Schadensstelle mar- 

kiert (Rogakou et al., 1998). Im Zuge der Reparatur übernimmt ATM noch eine große 

Anzahl weiterer Phosphorylierungen an Proteinen, die ihrerseits einen Einfluss auf die 

DNA-Reparatur (z. B. Rad51), Zellzykluskontrolle (z. B. Chk2) oder Apoptose (z. B. 

p53) haben (Kurz und Lees-Miller, 2004). 

5

1 Einleitung 

Abbildung 1.2: Interaktion von Tip60 und ATM in der DNA-Schadensantwort. Wird ein Doppelstrangbruch 

durch ionisierende Strahlung induziert, acetyliert Tip60 zunächst das inaktive Dimer 

ATM. Daraufhin kann sich ATM autophosphorylieren, dissoziiert in zwei aktive Monomere und 

kann nun andere Reparaturproteine phosphorylieren. Tip60 spielt zusätzlich eine Rolle im NuA4- 

Komplex. Der NuA4-Komplex ist einerseits während der Transkription für die Acetylierung von 

Histon H4 zuständig und sorgt anderseits auch während der DNA-Reparatur für eine Acetylierung 

von Histon H4 und γH2AX (Murr et al., 2006). Die Acetylierung von Histon H4 dient der Chromatinauflockerung, 

sodass entweder Transkriptionsfaktoren oder Reparaturproteine an die DNA 

binden können. Die Acetylierung von γH2AX durch Tip60 im NuA4-Komplex sorgt für den Abbau 

der H2AX-Phosphorylierung. [Abbildung nach Squatrito et al. (2006)] 

6

1.2 Physikalische Grundlagen ionisierender Strahlung 


Ionisierende Strahlung sind Teilchen oder Photonen die genug Kraft besitzen, ein Elek- 

tron aus seinem Atomverband herauszuschlagen und somit ein Atom ionisieren können. 

Die Absorption von ionisierender Strahlung erfolgt über Anregungs- und Ionisationser- 

eignisse. In Abhängigkeit der räumlichen Verteilung und Dichte dieser Ionisationsereig- 

nisse kann zwischen locker und dicht ionisierender Strahlung unterschieden werden. Zu 

der locker ionisierenden Strahlung zählen Röntgen- und γ-Strahlung (Photonen), wäh- 

rend Protonen, α-Teilchen und Schwerionen (geladene Teilchen) zu der Gruppe der dicht 

ionisierenden Strahlung zusammengefasst werden. Geladene Teilchen geben ihre Energie 

entlang ihrer Bahn ab (siehe Abbildung 1.3a). Im Gegensatz dazu wird die Energie bei 

locker ionisierender Strahlung homogen verteilt (siehe Abbildung 1.3b). Bei Photonen, 

zu denen auch Röntgenstrahlen zählen, nimmt die deponierte Energie exponentiell mit 

der Eindringtiefe ab. Bei der Bestrahlung mit Schwerionen kommt es zu einem invertier- 

ten Tiefendosis-Profil (siehe Abbildung 1.4; 12 C-Ionen). Dabei treten im Eingangsbereich 

aufgrund der hohen Geschwindigkeit sehr wenige Ionisationsereignisse auf, so dass die 

Ionen hier nur wenig Energie abgeben. Am Ende der Wegstrecke geben Ionen ihre Rest- 

energie räumlich stark begrenzt ab, da durch das Abbremsen an einer Stelle verstärkt 

Ionisationsereignisse auftreten. Der sogenannte Bragg-Peak ist charakteristisch für die 

Bestrahlung mit Schwerionen. Der dahinter liegende Bereich wird daher so gut wie nicht 

belastet. 

Da im Rahmen dieser Arbeit ausschließlich Proben mit einer Zellschicht von wenigen µm 

Dicke bestrahlt wurden, können Tiefendosis-Effekte unberücksichtigt bleiben. 

(a) Schwerionen (b) Röntgen 

Abbildung 1.3: Dosisverteilung nach Schwerionen- (a) und Photonen- (b) Bestrahlung auf einer 

Fläche von 10 µm x 10 µm. In (b) ist die homogene Dosisverteilung nach Bestrahlung mit Röntgenstrahlen 

gezeigt. In (a) sieht man nach Bestrahlung mit C-Ionen, dass lokal sehr hohe Energien 

appliziert werden, in umliegenden Bereichen praktisch keine. Die Fläche von 10 µm x 10 µm 

entspricht ungefähr der Fläche eines Zellkernes. [Abbildung in Anlehnung an (Scholz, 2003)] 

7

1 Einleitung 

1.2.1 Kenngrößen der ionisierenden Strahlung 

Dosis 

Abbildung 1.4: Tiefendosis-Profil von Photonen 

(Röntgenstrahlen), Protonen und 12 C-Ionen 

in Wasser. Photonen mit hohen Energien deponieren 

die maximale Energie kurz nach dem Eindringen 

und geben die restliche Energie kontinuierlich 

ab. 12 C-Ionen deponieren nur eine geringe 

Energie im Eingangskanal und das Energiemaximum 

wird räumlich stark begrenzt am Ende 

der Strecke abgegeben. Es entsteht der sogenannte 

Bragg-Peak. Protonen verhalten sich ähnlich 

der Ionen, deponieren jedoch eine geringere Dosis 

am Endpunkt. [Abbildung in Anlehnung an 

Scholz (2003)] 

Der Begriff der Dosis ist als die absorbierte Energie pro Masse verstanden und in Gray 

(Gy) angegeben: 

D[Gy] = E 

 

J 

m kg 

(1.1) 

Diese Formel kann für die homogene Energieverteilung bei Bestrahlung mit Röntgen- 

strahlen angewandt werden. Bei Bestrahlung mit Schwerionen besteht jedoch eine in- 

homogene Energieverteilung, für die diese Formel unpraktikabel ist. Aus diesem Grund 

wird die mittlere Dosis der Bestrahlung mit Schwerionen über den LET bestimmt (siehe 

unten). 

Linearer Energietransfer (LET) 

Der LET beschreibt wieviel Energie pro Wegstrecke längs der Bahn eines Ions abgegeben 

wird und wird in keV 

µm 

angegeben. Der LET ist abhängig von der Ordnungszahl. Wegen sei- 

ner Abhängigkeit von der Teilchenenergie verändert sich der LET mit der Eindringtiefe. 

Da im Rahmen dieser Arbeit jedoch nur dünne Zellschichten bestrahlt wurden, konnte 

mit einem konstanten LET gerechnet werden. 

Bei einem hohen LET, wie ihn Schwerionen besitzen, entstehen entlang eines Ionen- 

durchgangs Ionisationsereignisse in denen viele Sekundärelektronen ausgelöst werden, 

die wiederum andere Moleküle ionisieren können. So kann lokal sehr viel Energie abge- 

geben werden, während andere Bereiche praktisch nicht belastet werden (siehe Abbildung 

1.3a). 

In die Berechnung der mittleren Dosis, die ein Ion auf seinem Weg appliziert, geht der 

LET, die Fluenz (F) der Bestrahlungsteilchen und die Dichte des Zielvolumens (meistens 

8

von Wasser) ein: 


D[Gy] = 1, 602 · 10 −9 

 

µm · g · J 

keV 1 

· LET · F 

keV · cm · kg µm cm2 

· 1 

ρ 

1.2.2 Biologische Wirkung 

3 cm 

g 

(1.2) 

Die biologische Wirkung einer Strahlung ist zum einen von der Dosis und zum Ande- 

ren vom linearen Energietransfer (LET) abhängig. Sie wird auf Grundlage des Zellüber- 

lebens nach Bestrahlung bewertet. Je höher die Bestrahlungsdosis, desto weniger Zellen 

überleben. Diese Dosisabhängigkeit des Zellüberlebens ist abhängig von der verwendeten 

Strahlenqualität. Für die quantitative Beschreibung des Effekts wurde daher die relative 

biologische Wirksamkeit (RBW) eingeführt: 

RBW = DRef 

DT est 

 

 

 

 

Isoeffekt 

(1.3) 

Sie ist durch das Verhältnis der Dosis einer Bezugsstrahlung (DRef), meistens 250 kV 

Röntgenstrahlen, zu der Dosis einer vergleichenden Strahlung (DTest) angegeben. Der Iso- 

effekt beschreibt dabei meist ein Zellüberleben von 10 %. 

In Abbildung 1.5 ist das Zellüberleben für verschiedene Strahlenqualitäten gezeigt. Es 

wird deutlich, dass die gleiche Dosis bei verschiedenen Strahlenarten unterschiedliche 

biologische Wirksamkeiten entfaltet. Für geringere Energien von 12 C-Ionen, also langsa- 

mere Ionen, ist ein verstärktes Zellsterben, im Vergleich zur Referenzstrahlung, zu ver- 

zeichnen. Die Anwendung der Formel 1.3 ordnet daher 12 C-Ionen einen Zahlenwert der 

RBW größer 1 zu. 

9

1 Einleitung 

Abbildung 1.5: Die relative biologische Wirksamkeit von Röntgenstrahlen und Schwerionen in 

Abhängigkeit der Dosis. Bestrahlt wurde eine Hamster-Zelllinie (CHO) entweder mit 12 C-Ionen 

unterschiedlicher Energien oder Röntgenstrahlen. Je höher die Dosis, desto mehr Zellen sterben. 

Bei gleicher Dosis sterben mehr Zellen nach Bestrahlung mit 12 C-Ionen als mit Röntgenstrahlen. 

Je kleiner die Energie der 12 C-Ionen, d. h. je langsamer sie sind, desto höher das Zellsterben. 

[Abbildung in Anlehnung an Weyrather et al. (1999)] 

1.3 Ziel dieser Arbeit 

Um die Reparatur von DNA-Schäden zu gewährleisten, müssen Reparaturproteine an die 

DNA binden können. Dazu ist die Chromatinzugänglichkeit unbedingt notwendig. Ei- 

ne Chromatinauflockerung nach DNA-Schädigung wurde in der vorliegenden Arbeit mit 

zwei unterschiedlichen Analysen nach DSB-Induktion durch Schwerionen bzw. Röntgen- 

strahlen untersucht. Dazu wurde zum Einen der Acetylierungszustand von Histon H4 und 

zum Anderen die MNase-Zugänglichkeit der DNA im Chromatin untersucht. Das Ziel 

dieser Arbeit war, den Einfluss von Tip60 und ATM auf die Chromatindichte zu analysie- 

ren, da Tip60 zum Einen im Rahmen der Transkription Histon H4 acetyliert und so für 

eine Chromatinauflockerung sorgt, und zum Anderen ATM nach DNA-Schädigung durch 

eine Acetylierung zur Autophosphorylierung aktiviert und somit ATM eventuell einen in- 

direkten Einfluss auf die Chromatinzugänglichkeit hat. 

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war, die Frage zu klären, ob Tip60 ATM-abhängig an 

DNA-Schäden rekrutiert wird und umgekehrt die ATM-Schadensrekrutierung von Tip60 

abhängig ist. Dazu wurden Tip60 und autophosphoryliertes ATM (ATMpS1981) auf ei- 

ne mögliche Komplexbildung an DNA-Schadensstellen näher untersucht. Im weiteren 

Verlauf wurde zusätzlich die Tip60-Acetylierungsaktivität bzw. die ATM-Kinasefunktion 

inhibiert, um die Schadensrekrutierung des möglichen Partners näher zu prüfen. 

10

2 Methoden und Material 

2.1 Verwendete Zelllinien und deren Kultur 

2.1.1 Zelllinien 

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Säugerzelllinien eingesetzt: 

AG 1522 D 

Hierbei handelt es sich um humane Vorhautfibroblasten von Coriell Cell Repositories aus 

Camden, USA. Die Zellen wachsen als geschlossener Zellrasen und sind kontaktinhibiert. 

Ihre Kultur erfolgte in EMEM Medium mit EBSS (BioWhittaker, Verviers, Belgien) mit 

1 % L-alanyl-L-Glutamine und 15 % FCS sowie 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml 

Streptomycin (alle Biochrom AG, Berlin, Deutschland). Für Experimente wurden die Fi- 

broblasten entweder zwei Tage, für Immunfluoreszenz-Experimente oder zehn Tage zu- 

vor, mit einer Zelldichte von 25000 Zellen/cm 2 oder 12500 Zellen/cm 2 , ausgesät. 

ATM-defiziente Fibroblasten-Zelllinie AT1BR 

Bei dieser Zelllinie handelt es sich um Fibroblasten von einem Ataxia telangiectasia (AT)- 

Patienten. Diese Zellen sind Ataxia telangiectasia mutated (ATM)-defizient. Die homozy- 

gote Mutation besteht aus einer Insertion von 9 Nukleotiden im ATM-Gen. Dadurch kann 

kein funktionsfähiges ATM gebildet werden, da die Transkription nach 753 aa abgebro- 

chen wird (Stankovic et al., 1998). Die Zellen stammen von der "European Collection of 

Animal Cell Cultures" aus Großbritannien. 

Die Kultivierung fand in HAM´s Medium (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) mit 

20 % FCS statt. Für Experimente wurden fünf Tage voher Zellen mit einer Dichte von 

22500/cm 2 ausgesät. 

ATM-defiziente Fibroblasten-Zelllinie AT5 

Diese Zelllinie stammte ebenfalls von einem AT-Patienten. Die Zellen sind ATM-defizient 

und zusätzlich spontan immortalisiert. Jedoch liegt eine Verunreinigung mit einer un- 

bekannten Zellsorte vor (siehe Abbildung 3.1). Sie wurden freundlicherweise von Nuri 

Gueven (Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Australien) zur Verfügung 

gestellt. 

Die Zellen wurden in RPMI Medium (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) und 20 % FCS 

kultiviert. Für Experimente wurden sie 5 Tage zuvor mit einer Dichte von 4000 Zellen/cm 2 

ausgesät. 

11


U2-OS 

Bei dieser Zelllinie handelt es sich um humane Osteosarkomazellen (ATCC, Manas- 

sas, USA). Die Kultivierung dieser Zellen fand in Dulbecco´s MEM Medium mit 10 % 

FCS sowie 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (alle Biochrom AG, Berlin, 

Deutschland) statt. Die U2-OS Zellen wurden 1 bis 2 Tage vor einem Experiment mit 

einer Dichte von 7500 Zellen/cm 2 ausgesät. 

Embryonale Mausfibroblasten (MEF) 

Hierbei handelt es sich um embryonale Mausfibroblasten . Diese Zelllinie wurde freund- 

licherweise von Markus Löbrich (TU Darmstadt) zur Verfügung gestellt. 

Die Kultivierung erfolgte in Dulbecco´s MEM Medium mit 10 % FCS sowie 100 U/ml 

Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (alle Biochrom AG, Berlin, Deutschland). Die 

Zellen wurden 2 Tage vorher mit einer Dichte von 7500 Zellen/cm 2 ausgesät. 

2.1.2 Zellkultur 

Die verwendeten Zelllinien wurden bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % relativer Luftfeuchtig- 

keit in 25 cm 2 und 75 cm 2 Flaschen (BD Biosience, USA) kultiviert. Montags und frei- 

tags wurde jeweils ein Mediumwechsel durchgeführt. Sobald die Zellen konfluent waren, 

wurden sie passagiert. Dazu wurde zunächst der Zellrasen mit 1 ml einer Trypsin-EDTA- 

Lösung (0,05 % Trypsin, 0,1 % EDTA; PAN, Aidenbach) gewaschen und anschließend 

im Brutschrank mit 3 ml Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 °C für 5 min inkubiert. Die abge- 

lösten Zellen wurden mit einer 2 ml Glaspipette vereinzelt und das Trypsin durch Zugabe 

der dreifachen Menge des jeweiligen Kulturmediums inaktiviert. Die Zellzahl der Sus- 

pension wurde anschließend mit einem elektronischen Partikelzähler Z2 Coulter Counter 

(Beckmann Coulter, Krefeld) bestimmt. Dazu wurde von der vorliegenden Zellsuspension 

eine 1:50 Verdünnung in Isoton angesetzt. Im Anschluss konnte die gewünschte Zellzahl 

entweder für Experimente oder für die einfache Weiterkultivierung ausgesät werden. 

2.1.3 Langzeitlagerung der Zellen 

Die Zellen wurden bei -196 °C gelagert. Dazu wurden sie zunächst abtrypsiniert, gezählt 

und bei 107 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. AG 1522 

D Fibroblasten wurden in ihrem Kulturmedium mit 10 % Glycerin (Applichem, Darm- 

stadt) resuspendiert, während die restlichen Zelllinien in ihrem jeweiligen Kulturmedium 

mit 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) (Applichem, Darmstadt) aufgenommen wurden. 

Zwei bis drei Millionen Zellen wurden in Kryoröhrchen überführt. Anschließend wurden 

12

2.1 Verwendete Zelllinien und deren Kultur 

diese in einem Isopropanol Behälter (Nalgene Cryo 1 °C Freezing Container) kontrolliert, 

mit einer durchschnittlichen Temperaturabnahme von 1 °C/min, auf eine Temperatur von 

-80 °C gebracht. Nach 24 Stunden wurden sie zur Langzeitlagerung in einen Tank mit 

flüssigem Stickstoff überführt, in dem eine Temperatur von -196 °C herrscht. 

Zum Auftauen wurden die Kryoröhrchen aus dem flüssigen Stickstoff geholt und in ei- 

nem Wasserbad bei 37 °C schnell aufgetaut, bis nur noch ein kleiner Eisklumpen zu sehen 

war. Die Zellsuspension wurde in 20 ml vorgekühltes Medium gegeben und bei 107 x g 

10 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet im vorgewärm- 

ten Kulturmedium resuspendiert und in eine 75 cm 2 oder 25 cm 2 Kulturflasche überführt. 

24 Stunden nach dem Auftauen wurde das Medium gewechselt, um nicht angewachsene 

Zellen zu entfernen. 

2.1.4 Behandlung von Zellen mit Trichostatin A 

Bei Trichostatin A (TSA) handelt es sich um einen Histondeacteylase (HDAC) Inhibitor. 

TSA bewirkt eine Hyperacetylierung. 

Trichostatin A wurde 24 Stunden vor Bestrahlung dem Medium zugesetzt (Endkonzen- 

tration 1 µM). Auch während und nach der Bestrahlung war TSA im Medium vorhanden. 

Von TSA wurde eine 1,1 mM Stocklösung in DMSO bereitet und bei -20 °C gelagert. 

Als Kontrolle wurde das gleiche Volumen an DMSO, das von der Inhibitor-Stocklösung 

verwendet wurde, ebenfalls in Kulturmedium verdünnt und auf die Zellen gegeben. 

2.1.5 Behandlung von Zellen mit einem spezifischen ATM Kinase Inhibitor (KU55933) 

Die ATM Kinase wurde in Fibroblasten spezifisch mit dem Inhibitor KU55933 (Calbio- 

chem, USA) inhibiert, der die ATP-Bindestelle von ATM blockiert. KU55933 wurde 

1,5 Stunden vor Bestrahlung dem Medium zugesetzt (Endkonzentration 10 µM). Auch 

während und nach der Bestrahlung war der Inhibitor im Medium vorhanden. Von KU55933 

wurde eine 10 mM Stocklösung in DMSO angesetzt und bei -20 °C gelagert. 



2.1.6 Behandlung von Zellen mit Anacardsäure 

Anacardsäure (Calbiochem, USA) inhibiert spezifisch die Histonacetyltransferase (HAT) 

Tip60. Dieser Inhibitor verhindert die Bindung von Acetyl-CoA an die aktive Bindestelle 

13


von Tip60. 

Von der Anacardsäure wurde eine 15 mM Stocklösung in DMSO bereitet und bei -20 °C 

gelagert. Der Inhibitor wurde 30 Minuten vor Bestrahlung dem Kulturmedium zugesetzt 

(Endkonzentration 30 µM). Während und nach der Bestrahlung waren die Zellen ebenfalls 

dem Inhibitor ausgesetzt. 



2.1.7 Überlebenskurve 

Von humanen Fibroblasten, AG 1522 D, und ATM-defizienten humanen Fibroblasten, 

AT5, wurde das Überleben durch einen Klonogenitätstest nach Röntgenbestrahlung er- 

mittelt. AT5 Zellen wurden 4 Tage vor Bestrahlung und AG 1522 D Zellen 6 Tage vor 

Bestrahlung mit je 1*10 5 Zellen in eine 25 cm 2 Kulturflasche pro zu bestrahlende Do- 

sis ausgesät. Die Zellen wurden nach der Bestrahlung vom Flaschenboden abgelöst, ver- 

einzelt, gezählt und dreifach in 75 cm 2 Kulturflaschen ausgesät. Das auszuplattierende 

Volumen I [ml] 

I[ml] = 

100 

ZZ/ml · S · P E 

(2.1) 

ist von der Zellzahl/ml in der abtrypsinierten Zellsupsension (ZZ/ml), dem erwarteten 

verminderten Überleben (S) 

S = 

Anzahl gezählter Kolonien 

ZZ/ml · I[ml] 

(2.2) 

und der angenommenen Plating Efficiency (PE) abhängig. Die PE beschreibt den Prozent- 

satz an Zellen, die nach einer Passage proliferieren und in der Lage sind Kolonien (≥ 50 

Zellen) zu bilden. Bei AG 1522 D Zellen wurde eine PE von 25 % und bei AT5 Zellen 

von 40 % angenommen. 

Die Inkubationsdauer wurde so gewählt, dass 14 Verdoppelungen möglich waren. Nach 

einer Inkubation von 9 Tagen der AT5 Zellen und 14 Tagen der AG 1522 D Zellen wur- 

den die Zellen zunächst mit 70 % Ethanol für 15 Minuten bei RT fixiert. Anschließend 

wurden die AT5 Zellen mit 1x Methylenblau (Zusammensetzung siehe 2.5.1) 3 Minuten 

gefärbt, die AG 1522 D Zellen mit 3x Methylenblau (Zusammensetzung siehe 2.5.1) für 

30 Minuten. Die Flaschen wurden mit VE-Wasser gespült und offen getrocknet. Für die 

Auswertung wurden alle Kolonien ab 50 Zellen (6 Verdoppelungen) gewertet, diese wur- 

den unter einem Stereomikroskop (Zeiss, Deutschland) gezählt. 

14

2.2 Bestrahlung der Zellen 

2.2.1 Bestrahlung mit Röntgenstrahlen 

2.2 Bestrahlung der Zellen 

Die Zellen wurden in einer IV320-13 Röntgenröhre (Seifert, Deutschland) mit Dosen 

zwischen 5 und 50 Gy bestrahlt. Die Spannung betrug 250 kV und der Strom 16 mA. 

Die Dosimetrie erfolgte mit einem SN4 Dosimeter (PTW Freiburg, Deutschland). Die 

Kalibrierung erfolgte nach Fricke (Barr, 1961). Es wurde durchschnittlich mit ein bis 

zwei Gray pro Minute bestrahlt, wobei die Zellen in ihrem Kulturmedium verblieben. 

Es wurden immer unbestrahlte Kontrollen mitgeführt, die den gleichen Bedingungen wie 

die bestrahlten Proben ausgesetzt waren. 

2.2.2 Bestrahlung mit Schwerionen 

Die Bestrahlung mit Xenon-, Kohlenstoff- und Nickel-Ionen erfolgte mit dem Linearbe- 

schleuniger UNILAC bzw. dem Synchrotron SIS der GSI Helmholtzzentrum für Schwe- 

rionenforschung GmbH. Die ausführlichen Bestrahlungsdaten sind in Tabelle 2.1 aufge- 

führt. 

Für eine vertikale Bestrahlung wurden die Zellen in Petrischalen (∅ 32 mm) kultiviert. 

Für die Bestrahlung wurde zunächst das konditionierte Medium gesammelt und anschlie- 

ßend wurden die Petrischalen in ein Bestrahlungsmagazin mit Kulturmedium (RT) ohne 

Zusätze vertikal eingesetzt. 

Für die fast horizontale Schrägbestrahlung wurden Zellen auf 24 x 24 mm Glasplättchen 

ausgesät und in Petrischalen kultiviert. Die Bestrahlung erfolgte in speziellen Plexiglas- 

blöcken, sodass der Zellrasen unter einem Winkel von 4° bestrahlt wurde. Maximal 9 

Blöcke wurden in ein spezielles Magazin eingesetzt und mit Kulturmedium ohne Zusätze 

aufgefüllt. Durch die Schrägbestrahlung konnten Proteinakkumulationen entlang des Io- 

nenstrahls untersucht werden. 

Nachdem die Proben in die Kammern eingesetzt waren, wurden sie zur biologischen Be- 

strahlungsanlage gebracht und eingesetzt. Ein computergesteuerter Roboterarm hob je- 

weils eine Probe vertikal aus dem Magazin heraus, hielt die Probe für einige Sekunden 

in den Strahl, bis die gewünschte Dosis erreicht war und setzte die Probe anschließend 

wieder in das Magazin. Während die Proben bestrahlt wurden, waren die Zellen für einen 

kurzen Zeitraum nur mit einem dünnen Mediumfilm bedeckt. Danach wurden die Pro- 

ben mit konditionierten Medium, bis zu ihrer Aufarbeitung, überschichtet. Der Zeitraum 

zwischen Einladen der Proben in ein Magazin, der Bestrahlung selbst und dem anschlie- 

ßenden Ausladen betrug ca. 20 Minuten. 

15


Es wurden immer unbestrahlte Kontrollen mitgeführt, die den gleichen Bedingungen aus- 

gesetzt waren. Bei den schräg bestrahlten Proben war dies nicht nötig, da die Zellen an 

den äußernen Bereichen des Glasplättchens nicht bestrahlt wurden und so als unbestrahlte 

Kontrollen verwendet werden konnten. 

Ion Beschleuniger Energie 

auf Target 

[MeV/u] 

Tabelle 2.1: In der Bestrahlung eingesetzte Ionen 

LET 

[keV/µm] 

Fluenz 

[Teilchen/cm2 Dosis [Gy] 

] 

124 Xe Unilac 4,5 8800 3,0*10 6 42,3 

124 Xe SIS 500,0 800 3,0*10 6 3,8 

2,0*10 7 20,0 

12 C Unilac 9,8 120 5,0*10 7 13,7 

3,0*10 6 14,9 

64 Ni Unilac 7,5 3100 1,0*10 7 49,7 

5,0*10 7 248,3 

197 Au Mikrosonde 4,8 12000 4,7*10 6 90,4 

2,0*10 6 38,5 

2.2.3 Bestrahlung mit der Schwerionen Mikrosonde 

Mit Hilfe der Mikrosonde konnten ausgewählte Zellkerne mit einer definierten Anzahl an 

Ionen bestrahlt werden. Der Ionenstrahl konnte dabei bis auf einige Mikrometer genau 

auf den Nukleus einzelner Zellen gerichtet werden. Zellen können mit Ionen, angeordnet 

in Form eines Kreuz oder einer Linie, bestrahlt werden (Heiss et al., 2006). 

In dieser Arbeit wurden AG 1522 D Fibroblasten und U2-OS Tumorzellen mit 197 Au- 

Ionen (Daten siehe Tabelle 2.1) bestrahlt. Die Zellen wurden zwei bzw. einen Tag zuvor 

mit einer Dichte von 7000 Zellen/Kammer auf eine speziellen Polypropylenfolie, die mit 

Cell-Tak (BD Biosience, USA) beschichtet war, ausgesät. Für die automatische Erken- 

nung der Zellen wurden diese vor Bestrahlung mit 100 nM Hoechst-Farbstoff (33342) für 

45 min gefärbt, ohne die Zellen abzutöten. Anschließend wurde der Farbstoff entfernt und 

wieder Kulturmedium auf die Zellen gegeben. Kurz vor der Bestrahlung wurde das Kul- 

turmedium gegen Medium mit 20 mM Hepes ausgetauscht, ein Deckglas auf die Zellen 

gelegt, das überschüssige Medium abgezogen und die Kammer mit einem Dichtungsring 

luftdicht verschlossen. Die Kammer wurde in der Bestrahlungsvorrichtung direkt vor ein 

schmales Vakuumfenster mit minimaler Streuung gesetzt. Nun wurden in 6 Feldern al- 

le erkannten Zellkerne mit der gewünschten Geometrie bestrahlt. Nach der Bestrahlung 

16

2.3 Immunzytochemische Methoden 

wurden die Zellen wieder mit ihrem normalen Kulturmedium überschichtet und bis zu 

ihrer Fixierung im Brutschrank inkubiert. 


2.3.1 Fixierung von Zellen ohne Extraktion 

Die Zell-Fixierung mit Paraformaldehyd ist eine schonende Methode, um die native Form 

von Zellen zu erhalten. Dabei wurde zunächst das Medium abgezogen und mit PBS Me- 

diumreste entfernt. Die Zellen wurden dann für 15 Minuten bei RT mit 2 % Paraformal- 

dehyd in PBS fixiert. Anschließend wurden die Zellen mit 0,1 % Triton X-100 in PBS für 

10 Minuten bei RT für die kommende Antikörperfärbung permeabilisiert. Die Zellen wur- 

den zweimal für 3 Minuten mit PBS gewaschen und im Anschluss wurden Antikörperbin- 

destellen mit 0,4 % BSA in PBS für mindestens 20 Minuten abgesättigt, dies verhinderte 

eine unspezifische Bindung der Antikörper. In 0,4 % BSA in PBS konnten die Proben für 

einige Tage bis zur Antikörperfärbung bei 4 °C gelagert werden. 

2.3.2 Antikörperfärbung der fixierten Zellen 

Zunächst wurde die BSA-Lösung abgezogen und 50 µl des primären Antikörpers, wel- 

cher spezifisch an das gesuchte Protein bindet, in die Mitte der Petrischale pipetiert. Die 

Verdünnungen der verwendeten Antikörper (siehe Tab. 2.2) wurden in 0,4 % BSA in PBS 

angesetzt. Die Inkubation dauerte eine Stunde bei RT. Danach wurde dreimal für 5 Minu- 

ten mit PBS gewaschen, um den nicht gebundenen Antiköper zu entfernen. Nun wurden 

50 µl des fluoreszenzgekoppelten sekundären Antikörpers (siehe Tab. 2.3) in 0,4 % BSA 

in PBS auf die Probe gegeben und 30 bis 45 Minuten im Dunkeln inkubiert. 

Die Proben wurden bei der Inkubation mit den primären und sekundären Antikörpern mit 

Mylar-Folie abgedeckt, um sie vor dem Austrocknen zu schützen. Bei sich leicht ablö- 

senden Tumorzelllinien wurden die Zellen nicht mit einer Folie, sondern die Petrischale 

mit einem feuchten Tuch abgedeckt. Außerdem wurden in diesem Fall vom jeweiligen 

Antikörper 100 µl Antikörperlösung verwendet. 

Nach der Inkubation mit sekundärem Antikörper wurde zweimal für 5 Minuten mit PBS 

gewaschen. Anschließend wurde 1 µM ToPro3 (Invitrogen, USA) in PBS für 20 min bei 

RT auf die Zellen gegeben, um die DNA zu färben. Auch diese Inkubation fand im Dun- 

keln statt. Im Anschluss wurde die ToPro3-Lösung abgezogen. Die Proben wurden bei 

17


38 °C getrocknet und mit Vectrashield Mounting Medium (Vector Laboratiroes, Kanada) 

und einem Deckglas für das Mikroskopieren vorbereitet. 

Tabelle 2.2: Verwendete primäre Antikörper für die Immunfluoreszenz 

Antigen Antikörper Bezugsquelle 

53BP1 53BP1 Oncogene Kaninchen, 

polyklonal 

ATMpS1981 ATM Protein 

Kinase 

pS1981 

γH2AX γH2AX 

(Ser139) 

clone 

JBW301 

Tip60 Tip60 

(ab23886) 

RPA RPA/p34 

(Ab-1) 

18 

Spezies Konzentration 

[mg/ml] 

Rockland Maus, 

monoklonal 

Upstate Maus, 

monoklonal 

Abcam Kaninchen, 

polyclonal 

Lab Vision Maus, 

monoklonal 

2,0 1:500 

1,0 1:200 

1,0 1:500 

0,5 1:50 

0,2 1:300 

verwendete 

Verdünnung


Tabelle 2.3: Verwendete sekundäre Antikörper für die Immunfluoreszenz 

Antigen Antikörper Firma Spezies Konzentration 

[mg/ml] 

Maus Alexa Fluor 

488 

anti-Maus 

Kaninchen Alexa Fluor 

488 

anti- 

Kaninchen 

Maus Alexa Fluor 

568 

anti-Maus 

Kaninchen Alexa Fluor 

568 

anti- 

Kaninchen 

Molecular 

Probes 

Molecular 

Probes 

Molecular 

Probes 

Molecular 

Probes 

2.3.3 Konfokale Laser-Mikroskopie und Auswertung 

Ziege 2 1:400 

Ziege 2 1:400 

Ziege 2 1:400 

Ziege 2 1:400 

verwendete 

Verdünnung 

Die Proben wurden mit dem konfokalen Laserscanning System Leica TCS, das mit in- 

versem Mikroskop (DM IRBE), Argon-Krypton Laser und einem computergesteuerten 

Kreuztisch (Märzhäuser SCAN 100x100) ausgestattet ist, analysiert. Mit dem Argon- 

Krypton Laser lassen sich Fluoreszenzfarbstoffe im blauen (488 nm), grüngelben (568 

nm) und dunkelroten (647 nm) Bereich anregen. Für die Aufnahmen der Zellen wurden 

konstante Einstellungen des Photomultipliers, der Lochblende und der Leistung des La- 

sers gewählt. 

Für die mikroskopischen Aufnahmen wurde das erste Bildfeld zufällig angefahren. Zu- 

nächst wurde ein Übersichtsbild mit dem Vergrößerungsfaktor 1 (Bildfläche 158,7 µm 

x 158,7 µm) gemacht, welches die gesamte Probe repräsentierte. Von diesem Bildfeld 

aus wurden nun in verschiedene Richtungen Aufnahmen mit dem Vergrößerungsfaktor 2 

(Bildfläche 79,4 µm x 79,4 µm) gemacht. Diese Aufnahmen wurden für die quantitati- 

ven Auswertungen verwendet. Um die Kolokalisation von Proteinen zu zeigen, wurden 

außerdem einzelne Zellkerne mit dem Vergrößerungsfaktor 4 (Bildfläche 39,7 µm x 39,7 

µm) aufgenommen. Die Schichtdicke bei den Aufnahmen variierte zwischen 0,234 µm 

und 0,5 µm. 

Für die quantitative Auswertung wurde das semiautomatische PC-Programm Image Pro 

19


Plus (Media Cybernetics, Inc., USA) verwendet. Mit Hilfe des Programms ImageJ (Na- 

tional Institutes of Health, USA) wurden die Intensitäten der Fluoreszenzsignale ausge- 

wertet. 

Studenten T-Test 

Mit Hilfe des Studenten T-Tests werden die Mittelwerte x und y zweier Stichproben X 

und Y auf ihre Signifikanz getestet. Die Voraussetzung ist die Normalverteilung der bei- 

den Gesamtheiten mit gleichen unbekannten Varianzen. In die Berechnung der Standard- 

abweichung SD gehen zusätzlich der Umfang der Stichproben X (n1) und Y (n2) sowie die 

Standardabweichungen der Mittelwerte (sx und sy) ein: 

SD = 

 

(n1 − 1) · s 2 x + (n1 − 1) · s 2 y 

n1 + n2 − 2 

Mit Hilfe von SD kann nun die t-Verteilung für den Versuch (tVers) berechnet werden: 

tV ers = 

 

|x − y| n1 · n2 

· 

SD 

n1 + n2 

(2.3) 

(2.4) 

Nun wird in der t-Tabelle der Wert tTab(FG; α) abgelesen, wobei α das Signifikanzniveau 

und FG = n1 + n2 - 2 der Freiheitsgrad ist. Abschließend werden tVers und tTab verglichen. 

Bei tVers > tTab sind die Mittelwerte der beiden Stichproben signifikant verschieden. 

2.4 Biochemische Methoden 

2.4.1 Herstellung von Gesamtzelllysaten 

Die Gesamtzelllysate wurden mit Hilfe von Schockgefieren und anschließendem Auftau- 

en auf Eis hergestellt. Bei dieser Methode wurden besonders hochkonzentrierte Protein- 

extrakte gewonnen. 

Zunächst wurde das Medium von den Zellen abgezogen, einmal mit eiskaltem PBS ge- 

waschen und mit 700 µl eiskaltem PBS überschichtet. Anschließend wurden die Zellen 

mit einem Zellschaber mechanisch abgelöst, mit einer 1 ml Pipette vereinzelt und in ein 

1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Proben wurden bei 15500 x g 1 Minute bei 4 °C 

zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellsediment in 40 µl Lysepuffer 

(Zusammensetzung siehe 2.5.1) resuspendiert. Anschließend wurden die Proben in flüs- 

sigem Stickstoff gefroren, auf Eis aufgetaut und kurz gevortext. Dieser Einfier-Auftau- 

Zyklus wurde zweimal wiederholt. Danach wurden die Proben mit 250 U Benzonase 

20


(Merck, Darmstadt, Deutschland) bei RT für 45 Minuten inkubiert und anschließend die 

Proteinkonzentration nach Lowry (siehe 2.4.4) bestimmt. Zu den Lysaten wurde 35 µl 2x 

Ladepuffer (Zusammensetzung siehe 2.5.1) gegeben, für 5 Minuten bei 95 °C inkubiert 

und bis zur Gelelektrophorese bei -20 °C gelagert. 

2.4.2 Fraktionierte Proteinisolation 

Diese Proteinisolation beruht auf einem Protokoll nach Arva et al. (Arva et al., 2005); 

hierbei werden das Chromatin, das Nukleoplasma und die cytosolischen Proteine vonein- 

ander getrennt. 

Zuerst wurde der Zellrasen mit PBS gewaschen und mit einer Trypsin-EDTA-Lösung 

(0,05 % Trypsin, 0,1 % EDTA; PAN, Aidenbach) überschichtet. Die Zellen wurden mit 

einem Zellschaber von der Unterlage gelöst, durch pipettieren vereinzelt und ihre Anzahl 

bestimmt. Die Zellen wurden bei 107 x g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert und in 

PBS gewaschen. Danach wurden die Zellen in hypotonischem Lysepuffer A (Zusammen- 

setzung siehe 2.5.1) resuspendiert und auf Eis 5 Minuten lysiert. Nach einer erneuten 

Zentrifugation enthielt der Überstand die löslichen Proteine aus dem Cytoplasma, wäh- 

rend das Pellet aus den Zellnuklei und Membranen bestand. Das Pellet wurde im stärker 

hypotonischen Lysepuffer C (Zusammensetzung siehe 2.5.1) aufgenommen und mit ei- 

ner 20G Kanüle mechanisch lysiert. Die Suspension wurde unter Schütteln bei 4 °C für 

30 min inkubiert. Das Nukleoplasma wurde durch Zentrifugation (15500 x g, 30 min, 

4 °C) vom Chromatin getrennt. Das Pellet wurde in Puffer A mit Benzonase Endonuklea- 

se (125 U/10 7 Zellen; Merck, Darmstadt) resupendiert und für eine Stunde bei 4 °C unter 

starkem Schütteln inkubiert. Die anschließende Zentrifugation (15500 x g, 3 min, 4 °C) 

trennte die chromatingebundenen Proteine (Überstand) von der DNA im Pellet. Abschlie- 

ßend wurde von allen Fraktionen die Proteinkonzentrationen nach Lowry (siehe 2.4.4) 

bestimmt. Die Fraktionen wurden in 2x Ladepuffer (Zusammensetzung siehe 2.5.1) auf- 

genommen, für 5 Minuten bei 95°C inkubiert und bis zur Gelelektrophorese bei -80 °C 

gelagert. 

2.4.3 Koimmunpräzipitation 

Um eine mögliche Interaktion von Tip60 und aktivem ATM am Chromatin nachzuwei- 

sen, wurde eine Immunpräzipitierung aus der Chromatinfraktion durchgeführt. Ultralink 

Protein A/G Beads (Firma Pierce, USA) wurden zunächst mit dem hypotonischen Lyse- 

puffer A (Zusammensetzung siehe 2.5.1) dreimal gewaschen. Anschließend wurde eine 

definierte Proteinmenge der Chromatinfraktion und 2 µg des spezifischen Antikörpers 

21


auf die Ultralink Protein A/G Beads gegeben und über Nacht bei 4 °C im Überkopf- 

schüttler langsam invertiert. Zu jedem eingesetzten Antikörper wurde auch eine passende 

Globulin-Kontrolle mitgeführt. Anschließend wurden die Beads kurz abzentrifugiert und 

der Überstand aufbewahrt. Die Beads wurden dreimal mit hypotonischem Lysepuffer A 

(Zusammensetzung siehe 2.5.1) gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurden die 

Beads in 30 µl 2x Ladepuffer (Zusammensetzung siehe 2.5.1) aufgenommen und für 

3 min bei 95 °C gekocht. Anschließend wurde die Probe abzentrifugiert (10000 x g, 

1 Minute, RT) und bis zur Auftragung auf ein Gel bei -20 °C gelagert. 

2.4.4 Proteinbestimmung nach Lowry 

Der Proteingehalt der verschiedenen Proteinextrakte wurde mit Hilfe der modifizierten 

Lowry-Methode (Lowry et al., 1951) bestimmt. Dazu wurde das DC Assay von BioRad 

(Kanada) nach Anweisung des Herstellers verwendet. 

2.4.5 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 

Die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) wurde nach Laemm- 

li (Laemmli, 1970) durchgeführt. 

Die verwendeten Trenngele [1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 10% SDS, 10% APS, 1 % TE- 

MED] hatten einen Konzentrationsgradienten von 4% bis 20% Acrylamid/Bisacrylamid 

(30% Stocklösung; Acrylamid:Bisacrylamid 29:1, RotiQuant, Deutschland). Die einfach 

konzentrierten Gele hatten einen 5 %, 8 %, 10 % oder 13,5 % Acrylamid/Bisacrylamid 

Anteil. Sie wurden mit Hilfe des BIORAD Mini-PROTEAN3 Gelsystem und "Gradi- 

entenmacher" gegossen und anschließend mit 70 % Methanol überdeckt um eine plane 

Oberfläche zu gewährleisten. Das Auspolymerisieren dauerte ca. 2 Stunden und fand bei 

Raumtemperatur statt. Anschließend wurde ein 3,2 % Acrylamid-Sammelgel [0,5 M Tris- 

HCl (pH 6,8), 10 % SDS, 10 % APS, 1 % TEMED] auf das Trenngel gegossen. Die Gele 

wurden in der Apparatur mit Kamm in feuchten Tüchern bei 4°C für bis zu zwei Tagen 

gelagert. Vor Gebrauch wurde der Kamm entfernt und die Ladekammern mit 1x SDS- 

Laufpuffer ausgespült. 

Vor dem Auftragen wurden die Proben bei 91 °C für 3 min denaturiert, kurz zentrifugiert 

und anschließend sofort auf das Gel aufgetragen. Zur Kontrolle des Molekulargewichtes 

wurde ein Marker (Fermentas Page Ruler Prestained Protein Ladder, Kanada) mitgeführt. 

Die Elektrophorese erfolgte in 1x SDS-Laufpuffer (Zusammensetzung siehe 2.5.1) bei 

45 mA/Gel. 

22

2.4.6 Western Blot 


Nachdem die Proteine in einer SDS-PAGE der Größe nach aufgetrennt waren, wurden 

sie auf eine Polyvinylidenfluorid- (PVDF-) Membran (Millipore, USA) mit Hilfe einer 

SemiDry Apparatur Hoefer SemiPhor (GE HealthCare, UK) transferiert. Hierzu wurde 

die Membran zunächst in Methanol und dann in Transferpuffer (Zusammensetzung siehe 

2.5.1) äquilibriert. Das Trenngel wurde auf die äquilibrierte Membran zwischen vier mit 

Transferpuffer getränkten Filterpapieren (Zwei über und zwei unter dem Gel/Membran 

Stapel) unter Ausschluss von Luftblasen gelegt (siehe Abb. 2.1). Der Transfer erfolgte bei 

65 mA/Gel für 45 Minuten. Nach der Übertragung auf die PVDF-Membran konnte die 

Immundetektion individueller Proteine erfolgen. 

Abbildung 2.1: Schematische Darstellung des Western Blots 

2.4.7 Immundetektion des Western Blots 

Nach dem Western Blot wurden die freien Bindungsstellen der Membran mit einer Blo- 

ckierlösung (Zusammensetzung siehe 2.5.1) unter Schütteln für 40 min inkubiert. In die- 

ser Blockierlösung wurde auch der primäre Antikörper (siehe Tab. 2.4) verdünnt. Die 

Membran inkubierte unter Schütteln 1,5 h bei RT mit dem primären Antikörper. Anschlie- 

ßend wurde die Membran dreimal mit 1x TBST für 5 min unter Schütteln gewaschen. Der 

sekundäre Antikörper (siehe Tab. 2.5), mit einer Meerrettich-Peroxidase (HRP) gekop- 

pelt, wurde in 1x TBST verdünnt und inkubierte für eine Stunde bei RT unter Schütteln. 

Die Membran wurde in 1x TBST viermal gewaschen und für 5 min mit dem Enzymsub- 

strat Lumigen PS-3 (GE HealthCare, UK) im Dunkeln inkubiert. Die Chemolumineszenz- 

detektion erfolgte anschließend mit einem Röntgenfilm (Amersham Hyperfilm ECL, GE 

HealthCare Limited, UK). Dabei betrugen die Expositionszeiten zwischen 2 Sekunden 

und einer Stunde. 

23


Tabelle 2.4: Primäre Antikörper für die Western Analyse 


Aktin Aktin Sigma Kaninchen, 

polyklonal 

ATMpS1981 ATM Protein 

Kinase 

pS1981 

ATM ATM 

(Ab-3) 

γH2AX γH2AX 

(Ser139) 

clone 

JBW301 

AcH4 Acetyliertes 

Histon H4 

Histon H4 Histon H4 

(ab31830) 


[mg/ml] 

Rockland Maus, 

monoklonal 

Oncogene Kaninchen, 

polyklonal 

Upstate Maus, 

monoklonal 

Upstate Kaninchen, 

polyklonal 

abcam Maus, 

monoklonal 

Tip60 Tip60 Calbiochem Kaninchen, 

polyklonal 

Tip60 Tip60 Bruno 

Amati, 

Mailand 

Kaninchen, 

ployklonal 

verwendete 

Verdünnung 

– 1:5000 

1,0 1:500 

0,1 1:1000 

1,0 1:1000 

1,0 1:1000 

1,0 1:1000 

– 1:6000 

– 1:6000 

Tabelle 2.5: Sekundäre Antikörper für die Western Analyse 


Maus-IgG Maus-IgG GE Health- 

Care UK 

Kaninchen-IgG Kanninchen- 

IgG 

24 

GE Health- 

Care UK 


[mg/ml] 

verwendete 

Verdünnung 

Schaf 1,0 1:10000 

Schaf 1,0 1:10000

2.4.8 Micrococcus Nuklease Analyse 

2.4.8.1 Micrococcus Nuklease Behandlung 

Die Analyse erfolgte in Anlehnung an Lee et al. (2007) und Zaret (2005). 


Die Zellen wurden in Petrischalen (∅ 32mm) angezogen. Für die Analyse wurde das 

Medium dekantiert und der Zellrasen mit LPC-Puffer (Zusammensetzung siehe 2.5.1) 

überschichtet, um die Zellmembranen anzudauen. Die Lyse der Zellmembranen dauerte 

12 bis 15 Minuten und wurde währendessen unter dem Mikroskop kontrolliert. Anschlie- 

ßend wurde der LPC-Puffer verworfen. Die Zellen wurden nun unterschiedlich lange (sie- 

he Ergebnisse 3.4.2) in MNase Puffer (Zusammensetzung siehe 2.5.1) inkubiert. Nach 

der Inkubation wurde der MNase Puffer verworfen. Die Zellen wurden durch die Zugabe 

von 2x TNESK Puffer (siehe 2.5.1) lysiert. Nach Zugabe des Lyse-Verdünnungspuffers 

(Zusammensetzung siehe 2.5.1) wurde das Zelllysat in ein 15 ml Röhrchen überführt. 

Anschließend inkubierten die Lysate über Nacht bei 37 °C. 

Im Folgenden wurde die im Lysat enthaltene DNA duch eine Phenol/Chloroform Extrak- 

tion von Proteinen abgetrennt und durch eine Ethanolfällung aus der Lösung gewonnen. 

2.4.8.2 DNA Isolation 

Die Lysate aus 2.4.8.1 wurden mit einem Volumen TE-Puffer (Zusammensetzung siehe 

2.5.1) verdünnt. Anschließend wurde ein Volumen neutrales Phenol hinzugegeben und 

die Probe für 10 bis 20 Minuten stark geschüttelt. Dann erfolgte eine Zentrifugation bei 

500 x g für 5 Minuten. Die wässrige Phase wurde in ein frisches Röhrchen überführt und 

ein Volumen Chloroform hinzugegeben. Die Probe wurde 10 bis 20 Minuten stark ge- 

schüttelt und bei 500 x g für 5 Minuten zentrifugiert. Der Chlorofomschritt wurde 2 bis 4 

mal wiederholt. Anschließend wurde 1/10 Volumen 3M Natriumacetat (pH 5,3) hinzuge- 

gen, invertiert und dann 2,5 Volumen eiskaltes Ethanol (95 %) hinzu pipettiert. Die Probe 

wurde langsam invertiert bis keine Schlieren mehr in der Flüssigkeit zu sehen waren. Die 

Ethanol-Fällung fand bei -20 °C für mindestens 2 h oder über Nacht statt. Die DNA wur- 

de in einem Festwinkelrotor bei 9500 x g für 10 Minuten bei 4 °C abzentrifugiert und der 

Überstand verworfen. Auf das DNA-Pellet wurde 70 % Ethanol gegeben und die Probe 

einmal sanft invertiert. Anschließend wurde die DNA für 1 Minute abzentrifugiert und der 

Überstand verworfen. Die DNA wurde 20 min im geöffneten Röhrchen getrocknet und 

anschließend in 50 bis 70 µl TE-Puffer (Zusammensetzung siehe 2.5.1) aufgenommen. 

Die DNA Konzentration wurde photometrisch bei 260 nm ermittelt. Die Lagerung der 

DNA erfolgte bei 4 °C. 

25


2.4.8.3 Agarosegelelektrophorese 

Die isolierte DNA aus der Micrococcus Nuklease Analyse wurde in 1,2 % Agarosegele 

aufgetrennt und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Agarosegele wurden in 1x 

TAE-Puffer (Zusammensetzung siehe 2.5.1) angesetzt und liefen bei einer Spannung von 

70 V für 1,5 h in 1x TAE-Puffer. Es wurden 500 ng DNA aufgetragen. Zur Kontrolle der 

Fragmentgrößen der DNA wurde ein Marker (GeneRuler TM 1kb DNA Ladder, Kanada) 

mit aufgetragen. Anschließend wurden die Gele in einer Ethidiumbromidlösung (2 µg/ml) 

für 20 Minuten inkubiert, um die DNA zu färben. Um überschüssiges Ethidiumbromid zu 

entfernen wurden die Gele in Wasser für 20 min entfärbt. 

2.5 Material 

2.5.1 Verwendete Lösungen 

Blockierlösung 

➢ 5 % fettfreies Milchpulver in 1x TBST 

Hypotonischer Lysepuffer A 

26 

➢ 10 mM Hepes (pH 7,9) 

➢ 1,5 mM MgCl2 

➢ 10 mM KCl 

➢ 500 µM AEBSF 

➢ 500 µM DTT 

➢ 1x Proteinase Cocktail Complete (Roche, Mannheim, Deutschland) 

➢ 10 mM NaF 

➢ 200 µM Na-o-Vanadat

Hypotonischer Lysepuffer C 

➢ 10 mM Hepes (pH 7,9) 

➢ 1,5 mM MgCl2 

➢ 420 mM NaCl 

➢ 25 % Glycerin 

➢ 500 µM AEBSF 

➢ 500 µM DTT 


➢ 10 mM NaF 

➢ 200 µM Na-o-Vanadat 

2x Ladepuffer 

➢ 100 mM Tris-HCl (pH 6,7) 


➢ 4,3 % SDS 

➢ 0,02 mg/ml Bromphenolblau 

➢ 10 % β-Mercaptoethanol 

LPC Puffer 

➢ 0,1 % LPC 

➢ 150 mM Saccharose 

➢ 80 mM KCl 

➢ 35 mM Hepes (pH 7,4) 

➢ 500 µM 5mM K2HPO4 

➢ 5 mM MgCl2 

➢ 500 µM CaCl2 

Lysepuffer für Gesamtzelllysate 




➢ 1 mM AEBSF 


➢ 1 µM TSA 

2.5 Material 

27


Lyse-Verdünnungspuffer 


➢ 5 mM EDTA 

1x Methylenblau 

➢ 10 % Löfflers Methylenblaulösung 

➢ 0,009 % Kaliumhydroxid 

➢ 5 % Methanol pro Anlayse 

3x Methylenblau 

➢ 30 % Löfflers Methylenblaulösung 

➢ 0,009 % Kaliumhydroxid 

➢ 5 % Methanol pro Anlayse 

MNase Puffer 

➢ 20 mM Saccharose 



➢ 2 mM CaCl2 

➢ (300 U/ml Micrococcus Nuklease) 

1x SDS-Laufpuffer 

➢ 25 mM Tris Base 

➢ 192 mM Glycin 

➢ 0,1 % SDS 

1x TAE-Puffer 


➢ 5 mM Na-Acetat 

➢ 1 mM EDTA 

10x TBST 

28 


➢ 1,5 M NaCl 

➢ 1 % Tween20

TE Puffer 


➢ 1 mM EDTA 

2x TNESK Puffer 


➢ 200 µM NaCl 

➢ 2 mM EDTA 

➢ 2 % SDS 

➢ 0,2 mg/ml Proteinase K 

1x Western Transferpuffer 

➢ 192 mM Glycin 


➢ 0,037 % SDS 

2.5.2 Verwendete Chemikalien 

2.5 Material 

Die verwendeten Chemikalien wurden von den Firmen Merck und Applichem ( beide 

Darmstadt, Deutschland), Sigma Aldrich (USA) und Roth (Karlsruhe, Deutschland) be- 

zogen. 

29

3 Ergebnisse 

3.1 Unterschiede in der Strahlungsempfindlichkeit ATM-defizienter 

Zelllinien 

ATM spielt eine wichtige Rolle in der Reparatur von DNA-Schäden. Es phosphoryliert 

das Histon H2AX zu γH2AX und aktiviert verschiedene Reparaturproteine. Damit ATM 

dieser Aufgabe nachgehen kann, muss es zunächst durch Tip60 aktiviert werden. Durch 

die anschließende Autophosphorylierung spaltet es sich aus einem inaktiven Dimer in 

seine aktive monomere Form. Aufgrund der Tatsache, dass Tip60 ATM aktiviert, wurde 

während dieser Arbeit zur Charakterisierung der Aufgabe von Tip60 in der Reparatur von 

DNA-Doppelstrangbrüchen auch mit ATM-defizienten Zellen gearbeitet. 

Nach Bestrahlung mit Schwerionen wurde an einigen DNA-Schadensstellen in der ATM- 

defizienten Zelllinie AT5 die Rekrutierung von ATM nachgewiesen (persönliche Mittei- 

lung von B. Jakob; GSI). Auch in einer Western Analyse konnte ATM in den AT5-Zellen 

detektiert werden, während in einer anderen ATM-defizienten Fibroblastenlinie, AT1BR, 

kein ATM nachgewiesen werden konnte (Daten nicht gezeigt). Da nun nicht klar war, 

ob die AT5-Zellen durch eine Zellsorte verunreinigt sind, die ATM exprimieren oder ob 

alle Zellen noch ein wenig ATM exprimieren, sollten die AT5 Zellen auf ihre Strahlungs- 

empfindlichkeit hin untersucht werden. ATM-defiziente Zellen können strahleninduzierte 

Schäden wesentlich schlechter reparieren als humane AG 1522 D Fibroblasten; dies kann 

man mit Hilfe eines Überlebensexperiments nachweisen. Dazu wurde eine Überlebens- 

kurve der AT5 Zellen nach Röntgenbestrahlung (0 - 6 Gy) erstellt. Als Kontrolle wurde 

von humanen AG 1522 D Fibroblasten ebenfalls eine Überlebenskurve (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 

6 Gy und 8 Gy) angefertigt. 

In Abbildung 3.1 ist die Überlebenskurve für die humanen Fibroblasten AG 1522 D und 

die ATM-Mutante AT5 logarithmisch aufgetragen. Bei den AG 1522 D Zellen ist eine ty- 

pische Schulterkurve zu sehen. Die ATM-Mutante AT5 ist wesentlich strahlenempfindli- 

cher, da das Überleben der Zellen schon bei Dosen von ein bis zwei Gray stark abnimmt. 

Nach Bestrahlung mit 3 Gy ist eine Schulter zu sehen und die Strahlenresistenz nimmt 

wieder leicht zu. Dies deutet darauf hin, dass die AT5 Zellen mit einer unbekannten Zell- 

sorte verunreinigt sind, auch wenn der Anteil sehr gering ist. 

Aufgrund dieser Erkenntnis wurden einige Experimente aus einer vorangegangenen Di- 

plomarbeit (Knauf, 2007), die mit AT5 Zellen durchgeführt wurden, mit einer anderen 

31

3 Ergebnisse 

ATM-defizienten Fibroblasten-Zelllinie, AT1BR, wiederholt. Dabei sollte geklärt werden, 

ob die Tip60 Rekrutierung an DNA-Doppelstrangbrüche ATM abhängig erfolgt. 

Abbildung 3.1: Überlebenskurve humaner Fibroblasten AG 1522 D und ATM-defizienter Fibroblasten 

AT5 nach Röntgenbestrahlung. Die Fibroblasten AG 1522 D (rot) wurden für das Experiment 

mit 0, 2, 4, 6 und 8 Gy bestrahlt, während die ATM-defizienten Fibroblasten AT5 (blau) mit 

0, 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Gy bestrahlt wurden. Die Überlebensdaten wurden logarithmisch aufgetragen. 

3.2 Tip60 DNA-Schadensrekrutierung ist ATM abhängig 

In einer vorangegangenen Arbeit wurde gezeigt, dass nach Bestrahlung mit Schwerionen 

in der ATM-defizienten Zelllinie AT5 Tip60 deutlich verzögert an DNA-Schadensstellen 

rekrutiert wird (Knauf, 2007). ATM wird von Tip60 acetyliert, so dass es zu einer Au- 

tophosphorylierung an Serin 1981 kommen kann und ATM seine aktive Form einnimmt 

(Sun et al., 2007), an DNA-Schäden rekrutiert wird und andere Reparaturproteine akti- 

viert. 

Im Folgenden wurde die Rekrutierung von Tip60 an DNA-Schäden in Abhängigkeit von 

ATM und der Zeit nach Bestrahlung mit Schwerionen in der ATM-defizienten Zelllinie, 

AT1BR, erneut untersucht. Zusätzlich wurden humane Fibroblasten (AG 1522 D) mit 

und ohne ATM-Inhibitor (KU55933) verwendet (siehe 2.1.5). Der angewandte spezifi- 

sche ATM Kinase Inhibitor bindet an die ATP-Bindestelle, um so die Autophosphorylie- 

32


rung an Serin 1981 zu verhindern. Die Zellen wurden mit 124 Xe-Ionen bestrahlt (LET: 

8800 keV/µm; Fluenz: 3*10 6 Teilchen/cm 2 ), 1, 5, 8 und 24 Stunden nach Bestrahlung 

mit Paraformaldehyd fixiert und immunzytochemisch gegen Tip60 und γH2AX (DNA- 

DSB-Schadensmarker) gefärbt. Die DNA wurde mit ToPro3 gefärbt. Zusätzlich wurden 

noch unbestrahlte aber gleichbehandelte Kontrollen mitgeführt. Die Proben wurden mi- 

kroskopiert und anschließend 60 bis 80 Zellkerne mit Hilfe des Programms Image Pro 

Plus ausgewertet. 

Wie bereits von Knauf (2007) gezeigt, kolokalisieren in den humanen ohne und mit ATM 

Inhibitor-behandelten sowie ATM-defizienten Fibroblasten alle beobachteten Tip60-Foci 

mit dem Schadensmarker γH2AX. Betrachtet man in Abbildung 3.2a die durchschnittli- 

che Anzahl der Tip60-Foci, so sind vor der Bestrahlung in den unbehandelten Fibroblas- 

ten kaum Foci vorhanden. Nach Bestrahlung wurde in den Zellkernen der unbehandelten 

Fibroblasten eine deutlich erhöhte Anzahl von im Mittel 2 (SE ± 0,5) Foci/Kern bzw. 

ca. 0,5 (SE ± 0,15) in ATM-defizienten und mit ATM Inhibitor-behandelten Fibroblasten 

gezählt. Die jeweilige Anzahl an Tip60-Foci bleibt auch bis mindestens 8 Stunden nach 

Bestrahlung nahezu gleichbleibend erhöht. Nach 24 Stunden ist in den unbehandelten Fi- 

broblasten die Tip60-Focianzahl wieder fast auf den Ausgangswert vor der Bestrahlung 

zurückgekehrt, während die Tip60-Foci in den ATM-defizienten Fibroblasten persistieren. 

In denen mit ATM Inhibitor-behandelten Fibroblasten konnten 24 Stunden später keine 

Tip60-Foci detektiert werden, was vermutlich auf ein Färbungsproblem zurückzuführen 

ist. In den unbestrahlten Kontrollen ist kein Unterschied in der Tip60-Focianzahl feststell- 

bar. 

Obgleich nach Bestrahlung eine erhöhte Anzahl von Tip60-Foci zu zählen ist, entspricht 

diese Zahl nie der des Schadensmarkers γH2AX (Vergleich Abbildungen 3.2a und 3.2b). 

Nur ca. 50 % aller γH2AX-Foci zeigen in unbehandelten Fibroblasten auch einen Tip60- 

Focus. Diese Beobachtung wurde bereits von Knauf (2007) gemacht. Zellen, bei denen 

ATM defizient ist (AG 1522 D mit ATM Inhibitor behandelt bzw. AT1BR Zellen), zei- 

gen nach Bestrahlung wesentlich weniger Tip60-Foci als ATM-intakte Zellen, obgleich 

sie nicht weniger DNA-Schäden aufweisen (Vergleich Abbildung 3.2a und 3.2b). In den 

ATM-defizienten bzw. mit ATM Inhibitor-behandelten Zellen persitieren die γH2AX- 

Foci über 24 Stunden. Einzig in den unbehandelten Fibroblasten ist 24 Stunden nach 

Bestrahlung ein deutlicher Rückgang der γH2AX-Foci zu sehen. In den unbestrahlten 

Kontrollen zeigen die unbehandelten Fibroblasten ca. 2/3 weniger γH2AX-Foci als die 

ATM-defizienten bzw. mit ATM Inhibitor-behandelten Fibroblasten. Dies deutet darauf 

hin, dass die Inhibition bzw. das Fehlen von ATM zu vermehrten DNA-Schäden, also 

sogenannte Kontroll-Foci, führt. 

Es zeigt sich, dass ATM einen Einfluss auf die Tip60 DNA-Schadensrekrutierung hat. 

33

3 Ergebnisse 

Es kommt aber zu keiner verzögerten Tip60 Rekrutierung, wie es in einer vorherigen 

Arbeit beschrieben wurde (Knauf, 2007). Die Signifikanz einer Erhöhung des 8 Stunden- 

Wertes der AT1BR Zellen konnte durch den Studenten T Test (siehe 2.3.3) nicht bestätigt 

werden. Die ATM Inhibitor-behandelten Zellen zeigen hingegen einen signifikanten Un- 

terschied (p < 0,02) zu den humanen unbehandelten Fibroblasten, nicht nur 8 Stunden, 

sondern auch 1 und 5 Stunden nach Bestrahlung. Zu allen Zeitpunkten werden ohne oder 

bei inhibiertem ATM weniger Ti60 Foci gebildet. Die Tip60 Foci sind außerdem wesent- 

lich schwächer als die γH2AX Foci, die die Treffer markieren. Dadurch ergibt sich die 

Vermutung, dass nicht an allen Schäden Tip60 detektierbar, aber sehr wahrscheinlich in 

kleiner Menge vorhanden war. 

Im Folgenden wurden nach Bestrahlung die Fluoreszenzintensitäten von Tip60 und auto- 

phosphorylierten ATM an DNA-Schäden gemessen. 

34


(a) Tip60 Foci/Kern 

(b) γH2AX Foci/Kern 

Abbildung 3.2: γH2AX und Tip60 Foci pro Zellkern 1, 5, 8 und 24 Stunden nach Bestrahlung 

mit 124 Xe-Ionen (LET: 8800 keV/µm; Fluenz: 3,0*10 6 Teilchen/cm 2 ) in AG 1522 D Zellen ohne 

und mit ATM Inhibitor (KU55933) sowie in ATM-defizienten humanen Fibroblasten (AT1BR). 

Die Zellen wurden bestrahlt, fixiert und immunzytochemisch gegen Tip60 und γH2AX (Schadensmarker) 

gefärbt. Die Auswertung erfolgte mit dem Programm Image Pro Plus. (a) Tip60 Foci 

pro Zellkern (b) γH2AX Foci pro Zellkern 

35

3 Ergebnisse 

3.2.1 Tip60 und ATMpS1981 an DNA-Doppelstrangbrüchen nach Inhibition der 

ATM-Autophosphorylierung 

Im Folgenden sollte geklärt werden, ob sich die Intensität des Fluoreszenzsignals der 

Tip60-Foci nach Bestrahlung an DNA-Schäden in Abhängigkeit von aktiven ATM (ATMp- 

S1981) ändert. Die Autophsophorylierung von ATM wurde durch den ATM Kinase Inhi- 

bitor KU55933 inhibiert und die Rekrutierung von Tip60 und ATMpS1981, als Kontrolle 

für die Wirkung des Inhibitors, an DNA-Schäden untersucht. 

Humane Fibroblasten wurden ohne und mit ATM Inhibitor inkubiert (siehe 2.1.5), ei- 

ne Stunde nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen (Fluenz: 3,0*10 6 Teilchen/cm 2 ; LET: 3100 

keV/µm) mit Paraformaldehyd fixiert und zum Einen gegen Tip60 und γH2AX und 

zum Anderen gegen ATMpS1981 und 53BP1 immunzytochemisch gefärbt. Der Inhibi- 

tor zeigte keinen Einfluss auf die Anzahl der erwarteten Treffer, die durch den jeweili- 

gen Schadensmarker markiert wurden. Insgesamt wurden je 100 Foci, in ca. 40 Zellker- 

nen, ausgewertet und die Mittelwerte der maximalen Fluoreszenzsignale der Tip60- und 

ATMpS1981-Foci bestimmt. 

In Abbildung 3.3 zeigt sich, dass die Inhibition der Autophosphorylierung von ATM we- 

der einen Einfluss auf die Schadensrekrutierung von Tip60 noch auf die Schadensrekru- 

tierung von ATMpS1981 hat. Die Tip60-Fluoreszenzsignale zeigen die gleiche Intensität 

in den ohne und mit ATM Inhibitor-behandelten AG 1522 D Zellen (rote Histogramm- 

Balken). Die Intensität der ATMpS1981 Fluoreszenzsignale der ohne und mit ATM Inhi- 

bitor-behandelten AG 1522 D Zellen unterschied sich nur wenig, wobei die der Inhibitor- 

behandelten Zellen sogar über denen der unbehandelten Zellen liegt (grüne Histogramm- 

Balken). Die Funktion des ATM Inhibitors konnte während des Experiments nicht ne- 

benher durch ein Röntgenversuch bestätigt werden, dabei wäre in Inhibitor-behandelten 

Zellen kein Signal von ATMpS1981 an DNA-Schäden zu erwarten gewesen. Da der Ein- 

satz des ATM Inhibitors KU55933 in einem vorangegangenen Experiment mit 12 C-Ionen 

dazu führte, dass in bestrahlten AG 1522 D Zellen weniger ATMpS1981 Foci sichtbar 

waren und diese eine geringere Fluoreszenzintensität als die unbehandelten Kontrollzel- 

len aufwiesen (Tobias, 2008), muss davon ausgegangen werden, dass der Inhibitor in dem 

hier durchgeführten Experiment nicht wirkte. 

36

3.3 Interaktionen von Tip60 und ATM 

Abbildung 3.3: Mittelwerte der maximalen Intensitätsprofile der Tip60- und ATMpS1981-Foci 

nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen (LET: 3100 keV/µm ; Fluenz: 3,0*10 6 Teilchen/cm 2 ) und vorheriger 

Inhibition von ATM mit KU55933 in humanen Fibroblasten. Die Zellen wurden ohne (Ko) 

und mit ATM Inhibitor inkubiert (1,5 h; 10 µM), bestrahlt, 1 h danach fixiert und immunzytochemisch 

gefärbt. 

Abschließend kann in diesem Experiment keine Aussage über den Einfluss der Inhibtion 

der ATM Autophosphorylierung auf die Tip60 DSB-Rekrutierung gemacht werden. Das 

Experiment muss mit einem funktionierenden Inhibitor wiederholt werden. 


In der Literatur ist die Interaktion von Tip60 und ATM (Sun et al., 2005) beschrieben. 

Dieser Komplex ist im Nukleoplasma zu finden. Es sollte nun geklärt werden, ob Tip60 

und die aktive Form von ATM (ATMpS1981) auch in einem Komplex vorliegen und ob 

dieser Komplex am Chromatin nachweisbar ist. 

Um herauszufinden, ob Tip60 und ATMpS1981 an DNA-Schadensstellen interagieren, 

wurde zunächst mit Hilfe der Immunfluoreszenz untersucht, ob diese beiden Proteine 

gemeinsam an DNA-Schadensstellen nachweisbar sind. 

37

3 Ergebnisse 

3.3.1 Kolokalisation von Tip60 und ATMpS1981 an DNA-Doppelstrangbrüchen 

Zur Untersuchung einer möglichen Kolokalisiation von Tip60 und ATMpS1981 an DNA- 

Schäden wurden AG 1522 D Zellen schräg bestrahlt. Dazu wurde zunächst Xenon als 

Ionenquelle gewählt. Der Vorteil der 124 Xe-Ionen ist die relativ große Ladung, wodurch 

sich ein hoher LET ergibt und somit ein hohes Maß an DNA-Schäden induziert wird. Das 

Risiko einer zu schwachen Akkumulation von Tip60 oder Phosphorylierung von ATM 

aufgrund einer zu gering lokalisierten Schadensinduktion kann so verkleinert werden. 

Die Zellen wurden mit 124 Xe-Ionen (LET: 8800 keV/µm; Fluenz: 3,0*10 6 Teilchen/cm 2 ) 

bestrahlt und eine Stunde nach Bestrahlung mit Paraformaldehyd fixiert. Anschließend 

wurden sie immunzytochemisch gegen Tip60 und ATMpS1981 gefärbt. Die DNA wurde 

zusätzlich mit ToPro3 angefärbt. 

In Abbildung 3.4 kann man die deutliche Kolokalisation vom Tip60 (grün) und ATMpS1981 

(rot), das auch als etablierter DNA-Doppelstrangbruch-Marker dient, entlang des Strah- 

lengangs beobachten. Dies weist darauf hin, dass beide Proteine an DNA-Doppelstrang- 

brüche rekrutiert werden. 

(a) Überlagerung aus (b) und (c) (b) Tip60 (c) ATMpS1981 

Abbildung 3.4: Kolokalisation von Tip60 und ATMpS1981 nach der Schrägbestrahlung mit 

124 Xe-Ionen (LET: 8800 keV/µm; Fluenz: 3,0*10 6 Teilchen/cm 2 ). Die Zellen wurden 1 Stunde 

nach Bestrahlung mit Paraformaldehyd fixiert und immunzytochemisch gegen Tip60 (grün) und 

ATMpS1981 (rot) gefärbt. In (a) ist die Überlagerung aus dem grünen (b) und roten (c) Kanal zu 

sehen, zusätzlich ist die DNA mit ToPro3 (blau) gefärbt. 

Um die nach Bestrahlung mit 124 Xe-Ionen beobachtete Kolokalisation von Tip60 und 

ATMpS1981 zu erhärten, wurde in einem nächsten Schritt versucht das Ergebnis in ei- 

ner 197 Au-Ionen-Mikrosonden-Bestrahlung zu reproduzieren. Mit Hilfe der Mikrosonde 

können ausgewählte Zellkerne mit einer definierten Anzahl an Ionen beschossen werden. 

Es wurde mit fünf 197 Au-Ionen (LET: 12000 keV/µm ; Fluenz: 4,7*10 6 Teilchen/cm 2 ) 

ein Kreuz-Muster in die Zellkerne geschossen. Eine Stunde nach Bestrahlung wurden 

die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und immunzytochemisch gegen Tip60 (grün) und 

ATMpS1981 (rot) gefärbt. Man sieht in den einzelnen Kanälen in Abbildung 3.5 (a-c) 

38


eine deutliche Kolokalisation von Tip60 und ATMpS1981-Foci. Des Weiteren wurde ein 

Intensitätsprofil 3.5d entlang der Linie in 3.5a erstellt, das zeigt, dass die Intensitäten der 

Foci jeweils an der gleichen Stelle ihr Maximum besitzen. Dies deutet deutlich darauf hin, 

dass Tip60 und ATMpS1981 zu den selben Schadensstellen rekrutiert werden. 


(d) Intensitätsprofil 

Abbildung 3.5: Kolokalisation von Tip60 und ATMpS1981 nach der Bestrahlung mit 197 Au-Ionen 

(LET: 12000 keV/µm ; Fluenz: 4,7*10 6 Teilchen/cm 2 ) der Mikrosonde. Die Zellen wurden mit einer 

Kreuzgeometrie (5 Treffer/Kern) bestrahlt, 1 Stunde nach Bestrahlung mit Paraformaldehyd 

fixiert und immunzytochemisch gegen Tip60 (grüner Kanal) und ATMpS1981 (roter Kanal) gefärbt. 

In (a) ist die Überlagerung aus dem grünen (b) und roten (c) Kanal zu sehen, zusätzlich ist 

die DNA mit ToPro3 gefärbt. Die Intensitätsprofile (d) von Tip60 (grün) und ATMpS1981 (rot) 

folgen dem Verlauf der schwarzen Linie in (a). 

Die Kolokalisation von Tip60 und ATMpS1981 konnte nach Bestrahlung mit Schwerio- 

nen ( 124 Xe und 197 Au) an DNA Schäden nachgewiesen werden. Im Folgenden sollte nun 

geklärt werden, ob Tip60 und ATMpS1981 an Doppelstrangbrüchen miteinander intera- 

gieren. 

Um eine mögliche Interaktion an DNA Schäden der beiden Proteine näher zu untersu- 

chen, wurde die Tip60-Acetylierungsaktivität inhibiert und die Schadensrekrutierung von 

ATM untersucht. Die ATM-abhängige Schadensrekrutierung von Tip60 konnte schon in 

einem vorrangegangenen Experiment gezeigt werden (siehe 3.2). 

39

3 Ergebnisse 

3.3.2 Inhibition der Tip60-Acetylierungsreaktion beeinflusst die ATM-Rekrutierung 

an DNA-Doppelstrangbrüche 

Durch die Acetylierungsreaktion von Tip60 wird ATM zunächst aktiviert, so dass es im 

Anschluss zur Autophosphorylierung an Serin1981 kommen kann. Um eine mögliche 

Interaktion von Tip60 und ATMpS1981 an DNA-Schäden näher zu untersuchen, wurde 

zunächst die Acetylierungsaktivität von Tip60 inhibiert und die Schadensrekrutierung von 

ATMpS1981 nach Bestrahlung untersucht. 

Mit Hilfe des Tip60 Inhibitors Anakardsäure (Sun et al., 2006) wurde die Acetylierungs- 

aktivität von Tip60 inhibiert. Die Anakardsäure verhindert die Bindung von Acetyl-CoA 

an die aktive Bindestelle der HAT Tip60 (siehe 2.1.6). Der Inhibitor wurde 30 Minuten 

vor Bestrahlung mit einer Konzentration von 30 µM auf AG 1522 D Zellen gegeben. Dann 

wurden die Zellen mit 64 Ni-Ionen (LET: 3100 keV/µm ; Fluenz: 3,0*10 6 Teilchen/cm 2 ) 

bestrahlt, eine Stunde danach mit Paraformaldehyd fixiert und immunzytochemisch gegen 

Tip60 und γH2AX zum Einen und gegen ATMpS1981 und 53BP1 zum Anderen gefärbt. 

Der Inhibitor zeigte keinen Einfluss auf die Anzahl der Foci, sondern nur auf die Foci- 

Intensität. In beiden Fällen wurden deshalb die Werte der maximalen Fluorezenzsignale 

von Tip60 und ATMpS1981 innerhalb eines Focus ermittelt. Es wurden insgesamt 100 

Foci, in ca. 40 Zellkernen, ausgewertet und die Mittelwerte bestimmt. 

In Abbildung 3.6 (links) ist die Intensität des mittleren Tip60-Fluoreszenzsignals nach 

Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen in der Kontrolle ohne Anakardsäure ähnlich der mit Tip60 

Inhibitor behandelten Probe. Die Inhibition der Acetylierungsreaktion von Tip60 hat an- 

scheinend keinen detektierbaren Einfluss auf die Rekrutierung von Tip60 an die Scha- 

densstelle. Das Nicht-Funktionieren des Inhibitors kann ausgeschlossen werden, da er 

im Folgenden (siehe unten) die Rekrutierung von ATMpS1981 an DNA-Schäden beein- 

flusst. Die Intensität des ATMpS1981-Fluoreszenzsignals ist nach Bestrahlung mit 64 Ni- 

Ionen in der Anakardsäure-unbehandelten Probe wesentlich höher als in der mit Tip60 

Inhibitor-behandelten Probe. Die Menge an rekrutierten ATMpS1981 an der Schadens- 

stelle ist also durch den Tip60 Inhibitor beeinträchtigt. Aller Wahrscheinlichkeit nach ist 

die ATMpS1981-Rekrutierung dadurch reduziert, dass die Aktivierung von ATM durch 

Tip60 inhibiert wurde und somit ATM am Ser1981 nicht autophosphoryliert werden konn- 

te. Die Aktivierung von ATM durch Tip60 scheint also für die Assoziierung von ATMpS1981 

an DNA-Schäden nötig zu sein. Die Acetylierung von ATM ist anscheinend nicht unbe- 

dingt notwendig für die Rekrutierung von Tip60 an DNA-Schadensstellen. Eventuell wird 

Tip60 mit inaktiven ATM an die DNA-Schadensstelle rekrutiert und erst am Schaden ace- 

tyliert Tip60 ATM, so dass eine Autophosphorylierung folgen kann. 

40


Abbildung 3.6: Mittelwerte der maximalen Intensitätsprofile der Tip60- und ATMpS1981-Foci 

nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen (LET: 3100 keV/µm ; Fluenz: 3,0*10 6 Teilchen/cm 2 ) und vorheriger 

Inhibition von Tip60 mit Anakardsäure in AG 1522 D Zellen. Die Zellen wurden ohne 

(Ko) und mit Tip60 Inhibitor inkubiert (30 min; 30 µM), bestrahlt, 1 h danach fixiert und immunzytochemisch 

gefärbt. 

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Inhibition der Tip60 Acetylierungsreak- 

tion die Rekrutierung von ATMpS1981 an Schadensstellen beeinflusst. Die Rekrutierung 

von Tip60 an DNA-Schäden scheint jedoch nicht von seiner Acetylierungsaktivität an 

ATM abhängig zu sein. 

3.3.3 Suche nach direkter Interaktion von Tip60 und aktiven ATM 

Eine mögliche Interaktion von Tip60 und ATMpS1981 wurde nun biochemisch näher un- 

tersucht, da die Ergebnisse der Immunfluoreszenz zeigten, dass Tip60 und ATMpS1981 

an DNA-Schadensstellen kolokalisieren. Durch die Inhibition von Tip60 konnte eine ver- 

ringerte Rekrutierung von ATMpS1981 an DNA-Schadensstellen gezeigt werden. Auf- 

grund dieser Ergebnisse sollte eine direkte Interaktion von Tip60 und ATMpS1981 am 

Chromatin biochemisch untersucht werden. In Gesamtzelllysaten konnte bereits der Tip60- 

ATM-Komplex durch eine Immunpräzipitation nachgewiesen werden (Sun et al., 2005). 

Die direkte Interaktion von Tip60 und aktiven ATM (ATMpS1981) sowie die eventu- 

elle Chromatinbindung sollte biochemisch mit Hilfe einer Koimmunpräzipitation unter- 

sucht werden. Hierzu wurde zunächst in einer Western Analyse untersucht, ob Tip60 und 

41

3 Ergebnisse 

ATMpS1981 nach Bestrahlung gemeinsam in verschiedenen Zellkompartimenten vor- 

kommen. AG 1522 D Zellen wurden eine Stunde nach Röntgenbestrahlung (30 Gy) bzw. 

1 Stunde nach 124 Xe-Ionenbestrahlung (LET: 800 keV/µm; Fluenz: 2,0*10 7 Teilchen/cm 2 ) 

einer fraktionierten Proteinisolation unterzogen. Hierbei wurden die Proteine aus Cyto- 

plasma, Nukleoplasma und Chromatin getrennt isoliert. 

Während Tip60 nach Röntgenbestrahlung in allen untersuchten Zellkompartimenten strah- 

lungsunabhängig nachgewiesen werden konnte (Daten nicht gezeigt), konnte ATMpS1981 

in keinem Zellkompartiment detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Eventuell unter- 

schritt die vorliegende ATMpS1981 Konzentration die Detektionsgrenze. Eine Immun- 

präzipitation von ATMpS1981, um es anzureichern, führte jedoch auch nicht zu einem 

detektierbaren ATMpS1981 Western Signal nach Röntgenbestrahlung (Daten nicht ge- 

zeigt). 

Nach Bestrahlung mit 124 Xe-Ionen konnte sowohl Tip60 als auch ATMpS1981 detektiert 

werden. Tip60 war erneut in allen untersuchten Zellkompartimenten strahlungsunabhän- 

gig vorzufinden. ATMpS1981 war allerdings strahlungsabhängig nur in der Nukleoplas- 

mafraktion nachzuweisen (siehe Abbildung 3.7). Die Detektion von Aktin diente dazu, 

zu zeigen, dass in allen Gelspuren gleich viel Protein geladen wurde. Die Expression des 

Aktingens ist unter verschiedensten Bedingungen gleichbleibend, weshalb Aktin häufig 

als Proteinladekontrolle in Western Analysen verwendet wird. 

Da in einer Immunfluoreszenz-Analyse ATMpS1981 an DNA-Schäden und damit am 

Chromatin nachweisbar war (siehe Abbildung 3.4 und 3.5), muss davon ausgegangen 

werden, dass ATMpS1981 in der Chromatinfraktion vorliegt, aber in einer Konzentration, 

die in einer Western Analyse nicht oder fast nicht nachweisbar ist (siehe Aktin-Bande in 

Abbildung 3.7). 

42

3.4 Der Einfluss von Bestrahlung auf die Chromatinzugänglichkeit 

Abbildung 3.7: Western Analyse der fraktionierten Proteinisolation 1 h nach Bestrahlung mit 

124 Xe-Ionen (LET: 800 keV/µm; Fluenz: 2,0*10 7 Teilchen/cm 2 ). Es wurde ATMpS1981, Tip60 

und Aktin als Ladekontrolle detektiert. Strahlungsabhängig konnte ATMpS1981 nur im Nukleoplasma 

nachgewiesen werden. Tip60 zeigt keine Strahlungsabhängigkeit. 

Aufgrund dieser Ergebnisse und der Tatsache, dass ATMpS1981 ein relativ großes Protein 

ist (370 kDa) und zusätzlich der Größenunterschied zu Tip60 ca. das Sechsfache beträgt, 

würde ein Koimmunpräzipitationsexperiment von ATMpS1981 und Tip60 sich als sehr 

kompliziert erweisen. 


Damit die Reparaturproteine an DNA-Schadensstellen binden können, muss die Zugäng- 

lichkeit der DNA gewährleistet sein. Dafür ist die Auflockerung des Chromatins notwen- 

dig. Während der Transkription ist die Histonacetyltransferase Tip60 für die Acetylierung 

von Histon H4 zuständig, dabei wird die positive Ladung der Lysinreste (K5, K8, K12 und 

K16) neutralisiert und die Chromatinstruktur kann sich auflockern, so dass Transkripti- 

onsfaktoren an die DNA binden können. Nun stellte sich die Frage, ob auch bei einem 

DNA-Schaden die Chromatinstruktur durch Tip60 aufgelockert wird. Die Chromatinauf- 

lockerung nach Bestrahlung soll mit zwei unterschiedlichen Methoden näher untersucht 

werden. Zum Einen durch Western Analysen von Gesamtzelllysaten, bei denen die Acety- 

lierung von Histon H4 nach Bestrahlung mit Schwerionen und Röntgen untersucht wird. 

Zum Anderen mit Hilfe einer Microccocus Nuklease Analyse, bei der die Auflockerung 

der gesamten Chromatinstruktur nach Röntgenbestrahlung und Bestrahlung mit Schwe- 

rionen analysiert werden soll. 

43

3 Ergebnisse 

3.4.1 Die Histon H4 Acetylierung (AcH4) nach Bestrahlung 

Die Histonacetyltransferase Tip60 im NuA4-Komplex acetyliert im Rahmen der Tran- 

skription verschiedene Histone und führt so zu einer Chromatinauflockerung, die es er- 

laubt, dass Transkriptionsfaktoren die DNA binden (Sapountzi et al., 2006). Insbesondere 

Histon H4 wird von Tip60 im NuA4-Komplex während der Transkription spezifisch ace- 

tyliert (Squatrito et al., 2006). Tip60 und inaktives ATM liegen in einem Komplex vor 

(Sun et al., 2005). Für die DNA Reparatur wird ATM durch Tip60 aktiviert und dann zum 

Schaden rekrutiert. Dadurch wäre Tip60, falls es auch einen Komplex mit ATM bildet, 

bereits in der räumlichen Nähe zum Schaden und könnte so Histone acetylieren, um die 

Chromatinstruktur aufzulockern, damit Reparaturproteine an die DNA binden können. 

Aufgrund dieser Hypothese sollte nun mit Hilfe von Western Analysen geklärt werden, 

ob die Acetylierung von Histon H4 auch strahlungsabhängig, das heißt DNA-Schadens- 

abhängig, erfolgt. Dazu wurden AG 1522 D Zellen sowohl mit Schwerionen als auch mit 

Röntgenstrahlen bestrahlt. 

3.4.1.1 Hyperacetylierung von Histon H4 nach Trichostatin A Behandlung 

In einem Vorversuch sollte geklärt werden, ob die Acetylierung von Histon H4 in einer 

Western Analyse nachweisbar ist. Bei Trichostatin A (TSA) handelt es sich um einen 

Histondeacetylase-Hemmer, der eine Hyperacetylierung der Histone bewirkt. 

AG 1522 D Zellen wurden 24 Stunden ohne und mit TSA behandelt. Anschließend wur- 

den Gesamtzelllysate hergestellt (siehe 2.4.1) und eine Western Analyse durchgeführt bei 

der AcH4, Histon H4 und Aktin detektiert wurden. Um zu zeigen, dass in allen Gelspuren 

gleich viel Protein geladen wurde, und daher eine Schwankung in der AcH4 oder Histon 

H4 Signalstärke nicht auf einem Ladefehler beruhte, diente die Detektion von Aktin. 

In Abbildung 3.8 ist ein deutlich stärkeres AcH4 Signal in der TSA-behandelten Probe als 

in der unbehandelten Kontrolle zu beobachten. Das erhöhte Signal nach TSA-Behandlung 

beruht nicht auf einer ungleichmäßigen Probenladung, was dem Aktin Signal zu entneh- 

men ist. Auch beruht der Anstieg nicht auf einem vermehrten Auftreten von Histon H4. 

Es kann also daraus geschlossen werden, dass die TSA-Behandlung wie erwartet zu einer 

verstärkten Histon H4 Acetylierung führte. 

Da eine Histon H4 Acetylierung nachweisbar war, wurde nun die Acetylierung von Histon 

H4 nach Bestrahlung näher untersucht. 

44


Abbildung 3.8: Hyperacetylierung von Histon H4 nach 

TSA-Behandlung. Humane AG 1522 D Fibroblasten wurden 

24 Stunden ohne und mit TSA (1 µM) inkubiert. Für 

die Western Analyse wurde jeweils 10 µg Gesamtprotein 

pro Spur auf ein 13,5 % PAGE aufgetragen. Auf dem 

anschließenden Blot wurden Aktin, AcH4 und Histon H4 

immunochemisch detektiert. 

3.4.1.2 Bestrahlung mit 12 C-Ionen erhöht die Histon H4 Acetylierung 

Im Folgenden wurde in einer Western Analyse untersucht, ob die Acetylierung von Histon 

H4 durch 12 C-Ionen beeinflusst wird. 

Zunächst wurden AG 1522 D Zellen mit 12 C-Ionen (LET: 120 keV/µm; Fluenz: 5*10 7 

Teilchen/cm 2 ) bestrahlt. 15 Minuten und eine Stunde nach Bestrahlung wurden die Zellen 

zu Gesamtzellysaten (siehe 2.4.1) verarbeitet und in einer Western Anlayse untersucht. 

In Abbildung 3.9 ist 15 Minuten nach Bestrahlung ein erhöhtes AcH4 Signal zu sehen, 

während eine Stunde nach Bestrahlung die Stärke des AcH4-Signals fast wieder dem der 

unbestrahlten Kontrolle entspricht. Die beobachtete Änderung des AcH4 Signals beruht 

weder auf einer ungleichmäßigen Ladung der Proben noch auf einem Anstieg der Histon 

H4 Konzentration, wie den Aktin und Histon H4 Signalen zu entnehmen ist. Man kann 

daher schließen, dass eine 12 C-Ionen-Bestrahlung abhängige Acetylierung von Histon H4 

stattgefunden hat. 

Da die Histon H4 Acetylierung hauptsächlich durch Tip60 katalysiert wird (Sapountzi 

et al., 2006), deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Tip60 Histon H4 strahlungs- und 

damit DNA-schadensabhängig acetyliert. Tip60 scheint also auch bei der DNA-Reparatur 

an einer Chromatinauflockerung beteiligt. 

45

3 Ergebnisse 

Abbildung 3.9: Erhöhte Acetylierung von Histon H4 nach 

Bestrahlung mit 12 C-Ionen (LET: 120 keV/µm, Fluenz: 

5*10 7 Teilchen/cm 2 ). In Spur 1 ist die unbestrahlte Kontrolle 

zu sehen. In Spur 2 und 3 sind Proben, die 15 Minuten 

bzw. 1 Stunde nach Bestrahlung aufgearbeitet wurden, 

aufgetragen. Detektiert wurde AcH4, H4 und Aktin. 

Es wurden 10 µg Probe auf ein 13,5 % PAGE aufgetragen. 

3.4.1.3 Kein Einfluss auf die Histon H4 Acetylierung durch Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen 

Da nach Bestrahlung mit 12 C-Ionen ein erhöhtes Signal von acetylierten Histon H4 de- 

tektiert werden konnte, wurde das Experiment mit 64 Ni-Ionen wiederholt. Im Rahmen 

dieses zweiten Experiments sollte des Weiteren untersucht werden, ob die Histon H4 

Acetylierung LET- bzw. dosisabhängig ist. Der LET der 64 Ni-Bestrahlung liegt mit 3100 

keV/µm über dem der 12 C-Strahlung (120 keV/µm); eine mögliche Dosisabhängigkeit 

wurde durch Einsatz verschiedener Fluenzen geklärt. 

Zusätzlich wurde durch Einsatz des Tip60-Inhibitors Anakardsäure untersucht, ob die in 

Abschnitt 3.4.1.2 beobachtete strahlungsabhängige Histon H4 Acetylierung tatsächlich 

Tip60 abhängig ist. Durch den Einsatz des ATM-Inhibitors KU55399 wurde zusätzlich 

ein möglicher Einfluss von ATM auf die Histon H4 Acetylierung untersucht. 

Zur Untersuchung der Dosisabhängigkeit der Histon H4 Acetylierung wurden humane 

AG 1522 D Fibroblasten mit einer höheren und geringeren Fluenz der 64 Ni-Ionen (5*10 7 

Teilchen/cm 2 bzw. 3*10 6 Teilchen/cm 2 ) bestrahlt und 15 Minuten und eine Stunde nach 

Bestrahlung zu Gesamtzelllysaten (siehe 2.4.1) verarbeitet. In der anschließenden Wes- 

tern Analyse konnte weder eine Strahlungsabhängigkeit noch eine Dosisabhängigkeit der 

Histon H4 Acetylierung beobachtet werden (siehe 3.10a). 

Im nächsten Schritt wurden AG 1522 D Zellen mit Inhibitoren gegen Tip60 (siehe 2.1.6) 

bzw. die ATM Kinase (siehe 2.1.5) behandelt. 15 Minuten und eine Stunde nach Bestrah- 

lung mit 64 Ni-Ionen (Fluenz: 1*10 7 Teilchen/cm 2 ) wurden die Zellen zu Gesamtzellysa- 

ten (siehe 2.4.1) verarbeitet. In einer anschließenden Western Analyse konnte weder eine 

strahlungsabhängige noch inhibitorabhängige Änderung der Histon H4 Acetylierung be- 

obachtet werden (siehe 3.10b). 

46


(a) Dosisabhängigkeit (b) ATM- und Tip60-Abhängigkeit 

Abbildung 3.10: Die Histon H4 Acetylierung ist nach 64 Ni-Ionen (LET: 3100 keV/µm ; Fluenz: 

1,0*10 7 Teilchen/cm 2 ) weder strahlungsabhängig noch dosisabhängig. Auch scheint sie nicht 

ATM- oder Tip60-abhängig. (a) Dosisabhängigkeit: Humane Fibroblasten wurden mit 2 verschiedenen 

Fluenzen bestrahlt. (b) ATM- und Tip60-Abhängigkeit: Die Zellen wurden mit DMSO 

(Kontrollen), ATM-Inhibitor und Tip60-Inhibitor behandelt. Alle Proben wurden 15 Minuten und 

eine Stunde nach Bestrahlung aufgearbeitet, zu jeder Probe wurde eine unbestrahlte Kontrolle mitgeführt. 

Detektiert wurden AcH4, H4 und Aktin. Es wurden je 10 µg Gesamtprotein auf ein 13,5 

% PAGE aufgetragen. 

Somit konnte die strahlungsabhängige Histon H4 Acetylierung, wie sie nach 12 C-Ionen 

Bestrahlung beobachtet wurde, nicht reproduziert werden. Aufgrund dieser Ergebnisse ist 

eine Wiederholung der beiden Experimente unbedingt nötig. 

3.4.1.4 Kein Einfluss auf die Histon H4 Acetylierung durch Röntgenbestrahlung 

Da nur nach Bestrahlung mit 12 C-Ionen ein erhöhtes Signal von acetylierten Histon H4 

detektiert werden konnte, wurde für das folgenden Experiment die Strahlenqualität geän- 

dert und mit Röntgestrahlung bestrahlt. 

Die Fluenz der 12 C-Ionen entsprach einer Dosis von 14 Gy, deshalb wurden AG 1522 D 

Zellen mit 2 unterschiedlichen Dosen von Röntgenstrahlen (10 Gy und 30 Gy) bestrahlt 

um eine eventuelle Dosisabhängigkeit näher zu untersuchen. 15 Minuten, eine und 24 

Stunden nach Bestrahlung wurden die Zellen zu Gesamtzelllysaten (siehe 2.4.1) verar- 

beitet und in einer Western Analyse die Acetylierung von Histon H4 untersucht. Es war 

keine strahlungsabhängige Acetylierung von Histon H4 zu beobachten (siehe Abbildung 

3.11). Das AcH4 Signal der unbestrahlten Kontrollen unterscheidet sich nicht von dem 

der bestrahlten Proben. 

Da das Ergebnis von der Bestrahlung mit 12 C-Ionen nicht reproduziert werden konnte, ist 

47

3 Ergebnisse 

es nicht auszuschließen, dass sich nach Bestrahlung mit Röntgen um eine lokal begrenzte 

Histon H4 Acetylierung handelt, die in einer Western Analyse nicht detektiert werden 

kann. 

Abbildung 3.11: AcH4-Signal nach Röntgenbestrahlung. Humane AG 1522 D Fibroblasten wurden 

mit 10 und 30 Gy bestrahlt sowie 15 Minuten, 1 Stunde und 24 Stunden nach Röntgenbestrahlung 

zu Gesamtzelllysaten aufgearbeitet. Es wurden 10 µg Gesamtprotein auf ein 13,5 % PAGE 

aufgetragen. Detektiert wurde AcH4, H4 und Aktin. 

Die Untersuchung der Histon H4 Acetylierung in Abhängigkeit von 12 C-, 64 Ni-Ionen und 

Röntgenstrahlung ergab keinen klaren Hinweis auf eine strahlungsinduzierte Histon H4 

Acetylierung. Daher wurde im Folgenden eine strahlungsbedingte Chromatinauflocke- 

rung mit einer anderen Methode - der Micrococcus-Nuklease-Analyse - untersucht. 

3.4.2 Untersuchung der Chromatinauflockerung in Abhängigkeit von Bestrahlung 

mit Hilfe der Micrococcus Nuklease Analyse 

Die Inkubation von Chromatin mit diesem Enzym (MNase) kann Aufschluss darüber ge- 

ben, wie aufgelockert die Chromatinstruktur ist. Je aufgelockerter diese Struktur, desto 

besser gelangt die MNase an die DNA und kann diese verdauen. Wie gut die DNA in- 

nerhalb des Chromatins von der MNase verdaut wurde, kann mit Hilfe einer Agarosegel- 

elektrophorese geklärt werden; je mehr die DNA der MNase ausgesetzt ist, umso kleine- 

re DNA-Fragmente liegen nach einem MNase-Verdau vor. Die Fragmentgröße ist nicht 

willkürlich, sondern entspricht der Größe eines DNA-Strangs, bzw. einem Vielfachen da- 

von, der um ein Nukleosom gewunden ist. Dies beruht darauf, dass unter physiologischen 

Bedingungen in aufgelockertem Chromatin die DNA nur im Bereich zwischen den Nu- 

kleosomen von MNase angreifbar ist. 

Im Folgenden wurde eine MNase-Analyse mit humanen Fibroblasten nach Röntgen- oder 

48


64 Ni-Ionen-Bestrahlung durchgeführt, um eine mögliche strahlungsabhängige Chromatin- 

auflockerung zu untersuchen. 

3.4.2.1 Röntgenbestrahlung führt zu einer Chromatinauflockerung 

Zunächst wurde die Chromatinauflockerung nach Bestrahlung mit Röntgenstrahlen näher 

untersucht. 

Dazu wurden AG 1522 D Zellen mit 50 Gy bestrahlt. 15 Minuten bzw. eine Stunde nach 

Bestrahlung wurde eine MNase Analyse durchgeführt; hierzu wurde die Zellmembran 

lysiert, die Zellen 15 Minuten ohne und mit MNase (300 U/ml) behandelt und die dann 

isolierte genomische DNA auf einem Agarosegel analysiert. 

Zelllysate, die keinen MNase-Verdau ausgesetzt waren, zeigen eine klare Bande von ge- 

nomischer DNA im Bereich über 10 kb (Spuren 1, 2, 5 und 6 in Abbildung 3.12). Es sind 

keine kleineren DNA-Fragmente in Form eines "Schmiers" sichtbar, was auf eine DNA- 

Degradation schon ohne MNase-Behandlung hindeuten würde. Hervorzuheben ist auch, 

dass Röntgenbestrahlung in diesem Größenbereich nicht zu einer Fragmentierung der 

DNA führt (Spuren 2 und 6 in Abbildung 3.12). Das heißt, die DNA-Fragmentierung in 

den Spuren 3, 4, 7 und 8 (Abbildung 3.12) beruht auf der MNase-Behandlung. Es ist deut- 

lich zu sehen, dass sowohl 15 Minuten als auch 1 Stunde nach Bestrahlung ein höherer 

Anteil an kleinen DNA-Fragmenten vorliegt als in den unbestrahlten Proben (Vergleich 

Spuren 3 und 4 bzw. 7 und 8 in Abbildung 3.12). Der Anteil an kleinen DNA-Fragmenten 

ist eventuell 15 Minuten nach Bestrahlung höher als 1 Stunde nach Bestrahlung. 

Dieses Ergebnis der MNase Analyse zeigt eindeutig, dass es nach 50 Gy Röntgenbe- 

strahlung zu einer Chromatinauflockerung kommt; diese liegt schon 15 Minuten nach 

Bestrahlung vor und ist noch 1 Stunde nach Bestrahlung, eventuell etwas abgeschwächt, 

vorhanden. 

Diese Ergebnisse decken sich mit der erhöhten Histon H4 Acetylierung nach Bestrahlung 

mit 12 C-Ionen (siehe Abschnitt 3.4.1.2). 

49

3 Ergebnisse 

Abbildung 3.12: Chromatinauflockerung mit Hilfe der Micrococcus Nuclease Analyse nach Röntgenbestrahlung 

in AG 1522 D Zellen. Die Zellen wurden Röntgenstrahlung von 50 Gy ausgesetzt. 

15 Minuten und 1 Stunde nach Bestrahlung wurde eine Micrococcus Nuklease (MNase) Analyse 

durchgeführt, wobei Zelllysate ohne und mit MNase (300 U/ml; 15 min) behandelt wurden. 

3.4.2.2 Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen führt zu einer Chromatinauflockerung 

In einem nächsten Schritt wurde nun untersucht, ob mit der MNase Analyse auch nach 

Schwerionenbestrahlung eine Chromatinauflockerung zu beobachten ist. 

Dazu wurden AG 1522 D Zellen mit 64 Ni-Ionen (LET: 3100 keV/µm; Fluenz: 1*10 7 

Teilchen/cm 2 ) bestrahlt und 15 Minuten bzw. eine Stunde nach Bestrahlung einer MNa- 

se Analyse durchgeführt. Hierbei wurden unterschiedliche Inkubationszeiten der MNase 

verwendet (0, 6, 15 und 30 min). 

Zelllysate, die keinem MNase-Verdau ausgesetzt waren, zeigen eine klare Bande von 

genomischer DNA im Bereich über 10 kb (Spuren 1, 5 und 9 in Abbildung 3.13). Es 

sind keine kleineren DNA-Fragmente in Form eines "Schmiers" sichtbar, die auf eine 

DNA-Degratation schon ohne MNase-Behandlung hinweisen würden. Auch die 64 Ni- 

Bestrahlung führt nicht zu einer Fragmentierung der DNA (Spuren 5 und 9 in Abbildung 

3.13). Die DNA-Fragmentierung in den Spuren 2, 3, 4; 6, 7, 8 bzw. 10, 11, 12 (Abbildung 

3.13) beruht also allein auf der MNase-Behandlung. Es liegt 15 Minuten nach Bestrah- 

lung mit 64 Ni-Ionen ein deutlich höherer Anteil an kleineren DNA-Fragmenten vor als in 

den unbestrahlten Proben (Vergleich Spuren 6, 7, 8 mit 2, 3, 4 in Abbildung 3.13). 1 Stun- 

de nach Bestrahlung liegt kein erhöhter Anteil an kleinen DNA-Fragementen vor und die 

Spuren 10, 11, 12 sind mit den Spuren der unbestrahlten Kotrolle 2, 3, 4 (siehe Abbildung 

50

3.13) vergleichbar. 


Die unterschiedlichen Inkubationszeiten der MNase zeigen praktisch keinen Einfluss auf 

den Verdau der DNA. Eventuell kommt es durch die hohe MNase-Konzentration zu einer 

Sättigung, so dass kein Unterschied zwischen den unterschiedlichen Inkubationszeiten zu 

sehen ist. 

Die beobachtete Chromatinauflockerung 15 Minuten nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen 

deckt sich mit dem Ergebnis aus der Western Analyse nach Bestrahlung mit 12 C-Ionen 

(3.4.1.2). Die Acetylierung von Histon H4 sorgt für eine Chromatinauflockerung. In der 

Western Analyse konnte eine Erhöhung des AcH4-Signals 15 Minuten nach Bestrahlung 

mit 12 C-Ionen nachgewiesen werden und somit auch eine erhöhte Auflockerung des Chro- 

matins. Eine Stunde nach Bestrahlung war die Stärke des AcH4-Signals ähnlich dem der 

unbestrahlten Kontrolle. Dies konnte auch mit der MNase Analyse nach Bestrahlung mit 

64 Ni-Ionen gezeigt werden. 

Abbildung 3.13: Chromatinauflockerung nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen (LET: 3100 keV/µm; 

Fluenz: 1,0*10 7 Teilchen/cm 2 ). Mit AG 1522 D Zellen wurde 15 Minuten bzw. 1 Stunde nach 

Bestrahlung eine MNase Analyse durchgeführt, wobei Zelllysate ohne und mit MNase (0, 6, 15 

und 30 min; 300 U/ml) behandelt wurden. 

3.4.2.3 Die strahlungsbedingte Chromatinauflockerung ist ATM abhängig 

ATM spielt eine wichtige Rolle bei der DNA-Schadensantwort, da es viele DNA Repa- 

raturproteine phosphoryliert. Dies ist für die korrekte Aktivierung der Reparatur wichtig 

(Sun et al., 2007). Des weiteren ist ATM indirekt nach Bestrahlung an der Auflockerung 

des Heterochromatin für die DNA-Reparatur beteiligt (Goodarzi et al., 2008). Nun wurde 

der Einfluss von ATM auf die gesamte Auflockerung des Chromatins durch die Inhibition 

von ATM näher untersucht. 

51

3 Ergebnisse 

Dazu wurden AG 1522 D Zellen mit 10 µM ATM Kinase Inhibitor 1,5 Stunden vor Be- 

strahlung inkubiert (siehe 2.1.6) und anschließend mit Röntgenstrahlung 50 Gy bestrahlt. 

Zusätzlich wurde die ATM-defiziente Zelllinie AT1BR ebenfalls mit 50 Gy bestrahlt. 15 

Minuten bzw. eine Stunde nach Bestrahlung wurde jeweils eine MNase Analyse durchge- 

führt; hierzu wurde die Zellmembran lysiert, die Zellen ohne und mit MNase (300 U/ml; 

15 min) behandelt und die dann isolierte genomische DNA auf einem Agarosegel analy- 

siert. 

Zelllysate der mit ATM Inhibitor-behandelten Fibroblasten sowie die ATM-defizienten 

Fibroblasten, die keinem MNase-Verdau ausgesetzt waren, zeigen eine klare Bande von 

genomischer DNA im Bereich über 10 kb (Spuren 1, 2, 5 und 6 je in Abbildung 3.14a 

und 3.14b). Eine DNA-Degradation schon ohne MNase-Behandlung konnte nicht durch 

kleinere DNA-Fragmente in Form eines "Schmiers" gezeigt werden. Auch die Röntgen- 

bestrahlung führte nicht zu einer Fragmentierung der DNA (Spuren 2 und 6 in Abbildung 

3.14a und 3.14b). Das heißt, die DNA-Fragmentierung in den Spuren 3, 4, 7 und 8 (Ab- 

bildung 3.14a und 3.14b) wird einzig durch die MNase-Behandlung ausgelöst. Es zeigt 

sich ein deutlich höherer Anteil an kleinen DNA-Fragmenten sowohl in den bestrahlten 

Proben als auch in den unbestrahlten Kontrollen (Vergleich Spuren 3 und 4 bzw. 7 und 8 

in Abbildung 3.14a und 3.14b). Es kann kein strahlungsabhängiger Effekt auf die Chro- 

matinauflockerung gezeigt werden. 

Die ATM-defiziente Zelllinie (AT1BR) wurde in einem weiteren Experiment mit 64 Ni- 

Ionen (LET: 3100 keV/µm; Fluenz: 1,0*10 7 Teilchen/cm 2 ) bestrahlt. 15 Minuten bzw. 

eine Stunde nach Bestrahlung wurde jeweils eine MNase Analyse durchgeführt; hierzu 

wurde die Zellmembran lysiert, die Zellen ohne und mit MNase (300 U/ml; 15 min) be- 

handelt und die dann isolierte genomische DNA auf einem Agarosegel analysiert. 

Zelllysate, die keinem MNase-Verdau ausgesetzt waren, zeigen eine klare Bande von 

genomischer DNA im Bereich über 10 kb (Spuren 1, 5 und 9 in Abbildung 3.15a). Es 

sind keine kleineren DNA-Fragmente in Form eines "Schmiers" sichtbar, die auf eine 

DNA-Degradation schon ohne MNase-Behandlung hinweisen würden. Auch die 64 Ni- 

Bestrahlung führte nicht zu einer sichtbaren DNA-Fragmentierung (Spuren 5 und 9 in 

Abbildung 3.15a). Die DNA-Fragmentierung in den Spuren 6, 7, 8 und 10, 11, 12 (Abbil- 

dung 3.15a) beruht allein auf der MNase-Behandlung. Es zeigt sich im Bestrahlungsex- 

periment mit AT-Zellen ein deutlich höherer Anteil an kleinen DNA-Fragmenten sowohl 

in den unbestrahlten Kontrollen als auch in bestrahlten Proben (Vergleich Spuren 2, 3, 4 

und 6, 7, 8 und 10, 11, 12 in Abbildung 3.15a) im Gegensatz zu humanen unbehandelten 

Fibroblasten. Es zeigt sich kein strahlungsabhängiger Effekt auf die Chromatinauflocke- 

rung. 

Auch im Falle der ATM-defizienten Fibroblasten zeigen die unterschiedlichen Inkubati- 

52


onszeiten der MNase keinen Einfluss auf den Verdau der DNA, wie es auch schon bei den 

humanen Fibroblasten nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen zu sehen war. 

Aufgrund dieser Ergebnisse, wäre es möglich, dass ATM normalerweise die Auflockerung 

des Chromatins inhibiert und dass die strahlungsabhängige Chromatinauflockerung auch 

von ATM abhängt. 

(a) Mit ATM Inhibitor-behandelte humane 

Fibroblasten AG 1522 D 

(c) Humane Fibroblasten AG 1522 D 

(b) ATM-defiziente Fibroblasten AT1BR 

Abbildung 3.14: Die strahlungsbedingte Chromatinauflockerung nach Röntgenbestrahlung ist 

ATM abhängig. (a) AG 1522 D Zellen wurden 1,5 h vor Röntgenbestrahlung (50 Gy) mit 10 

µM KU55933 behandelt. (b) Humane ATM-defiziente Fibroblasten, AT1BR, wurden mit Röntgenstrahlung 

(50 Gy) bestrahlt. In (a) und (b) wurde 15 min und 1 h nach Bestrahlung eine MNase 

Analyse durchgeführt, wobei Zelllysate ohne und mit MNase (300 U/ml; 15 min) behandelt wurden. 

(b) Humane AG 1522 D Fibroblasten zum Vergleich ebenfalls nach Röntgenbestrahlung und 

nur mit DMSO behandelt. 

53

3 Ergebnisse 

(a) Humane ATM-defiziente Fibroblasten AT1BR nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen 

(b) Humane Fibroblasten AG 1522 D nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen 

Abbildung 3.15: Die strahlungsbedingte Chromatinauflockerung nach Bestrahlung mit 64 Ni- 

Ionen ist ATM abhängig. (a) Die strahlungsbedingte Chromatinauflockerung nach Bestrahlung 

mit 64 Ni-Ionen (LET: 3100 keV/µm; Fluenz: 1,0*10 7 Teilchen/cm 2 ) in ATM-defizienten Fibroblasten 

AT1BR. Mit den Zellen wurden 15 Minuten bzw. 1 Stunde nach Bestrahlung eine MNase 

Analyse durchgeführt, wobei Zelllysate ohne und mit MNase (0, 6, 15 und 30 min; 300 U/ml) behandelt 

wurden. (b) Humane AG 1522 D Fibroblasten zum Vergleich ebenfalls nach Bestrahlung 

mit 64 Ni-Ionen und nur mit DMSO behandelt. 

54


3.4.2.4 Die strahlungsbedingte Chromatinauflockerung ist Tip60 abhängig 

Die Histonacetyltransferase Tip60 acetyliert über den NuA4-Komplex während der Tran- 

skription verschiedene Histone. Dadurch wird das Chromatin aufgelockert und die Tran- 

skriptionsfaktoren können an die DNA binden. Das Chromatin in ATM-defizienten bzw. 

mit ATM Inhibitor-behandelten Fibroblasten scheint generell aufgelockerter, so dass even- 

tuell die strahlungsabhängige Chromatinauflockerung auch von ATM abhängig ist. Da 

ATM und Tip60 einen Komplex bilden, stellt sich die Frage, ob auch Tip60 bei der Repa- 

ratur nach Bestrahlung eine Rolle bei der Chromatinauflockerung spielt, da die Repartur- 

proteine an die DNA binden müssen. 

Humane AG 1522 D Fibroblasten wurden zunächst 30 Minuten vor Bestrahlung mit Rönt- 

genstrahlen oder 64 Ni-Ionen mit dem Tip60 Inhibitor (Anakardsäure), der die Acetylie- 

rungsaktivität von Tip60 hemmt, inkubiert (siehe 2.1.6). Anschließend wurden sie entwe- 

der mit Röntgestrahlung (50 Gy) oder 64 Ni-Ionen (LET: 3100 keV/µm; Fluenz: 1,0*10 7 

Teilchen/cm 2 ) bestrahlt und 15 Minuten bzw. 1 Stunde nach Bestrahlung eine MNase 

Analyse durchgeführt. Nach Röntgenbestrahlung wurden die Proben 15 Minuten ohne 

und mit MNase (300 U/ml) behandelt. Während nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen die 

MNase (300 U/ml) unterschiedlich lange auf den Proben inkubierte (0, 6, 15 und 30 min). 

Die anschließende Analyse erfolgte über ein Agarosegel. 

Zelllysate mit Tip60 Inhibitor, die entweder mit Röntgenstrahlen oder mit 64 Ni-Ionen be- 

strahlt wurden und danach keinem MNase-Verdau ausgesetzt waren, zeigen eine klare 

Bande von genomischer DNA im Bereich über 10 kb (Spuren 1, 2, 5 und 6 in Abbildung 

3.16a bzw. Spuren 1, 5 und 9 in Abbildung 3.17a). Ohne MNase-Behandlung konnte kei- 

ne DNA-Degradation durch kleine DNA-Fragmente in Form eines "Schmiers" sichtbar 

gemacht werden. Selbst die Röntgenbestrahlung bzw. Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen führte 

nicht zu einer DNA-Fragmentierung (Spuren 2 und 6 in Abbildung 3.16a bzw. Spuren 5 

und 9 in Abbildung 3.17a). Die DNA-Fragmentierung nach Röntgenbestrahlung in den 

Spuren 3, 4, 7 und 8 (Abbildung 3.16a) beruht also einzig auf der MNase-Behandlung. Es 

ist deutlich zu sehen, dass sowohl 15 Minuten als auch 1 Stunde nach Röntgenbestrahlung 

ein erhöhter Anteil an kleinen DNA-Fragmenten, im Gegensatz zu unbehandelten Fibro- 

blasten, sowohl in den unbestrahlten als auch in den bestrahlten Proben nachweisbar ist 

(Vergleich Spuren 3 und 4 bzw. 7 und 8 in Abbildung 3.16a). Der Anteil an kleinen DNA- 

Fragmenten ist eventuell 1 Stunde nach Röntgenbestrahlung etwas höher als 15 Minuten 

nach Bestrahlung. 

Nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen und Inhibition von Tip60 zeigt sich ein erhöhter Anteil 

an kleinen DNA-Fragmenten. Auch in der unbestrahlten Kontrolle sieht man viele kleine 

Fragmente, im Gegensatz zu unbehandelten und unbestrahlten Fibroblasten, die auf eine 

55

3 Ergebnisse 

aufgelockerte Chromatinstruktur hinweisen. 15 Minuten nach Bestrahlung ist der An- 

teil an kleinen Fragmenten etwas geringer als eine Stunde nach Bestrahlung (Vergleich 

Spuren 6, 7, 8 und 10, 11, 12 in Abbildung 3.17a). Dies ist mit den Ergebnissen der Rönt- 

genbestrahlung vergleichbar. Allerdings fällt auf, dass 15 Minuten nach Bestrahlung die 

MNase wesentlich weniger DNA verdaut hat als sowohl in der unbestrahlten und als auch 

bestrahlten Probe. Dies wird deutlich, wenn man die dicke Bande oberhalb von 10000 

bp vergleicht. Eine Auflockerung des Chromatins ist jedoch sowohl nach Bestrahlung als 

auch in der unbestrahlten Kontrolle zu sehen. 

Aufgrund dieser Ergebnisse könnte die strahlungsbedingte Chromatinauflockerung nach 

Röntgen- und Schwerionenbestrahlung von Tip60 abhängig sein. Die Chromatinauflo- 

ckerung scheint zusätzlich noch von anderen Faktoren abhängig zu sein, da trotz der In- 

hibtion von Tip60 es zu einer leichten Auflockerung eine Stunde nach Bestrahlung mit 

Röntgenstrahlen kommt. Dies ist jedoch nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen nicht eindeutig 

zu sehen. 

(a) Mit Tip60 Inhibitor-behandelte AG 1522 D Zellen 

nach Röntgenbestrahlung 

(b) Humane Fibroblasten AG 1522 D nach 

Röntgenbestrahlung 

Abbildung 3.16: Die strahlungsbedingte Chromatinauflockerung nach Röntgenbestrahlung ist 

Tip60 abhängig. (a) Auflockerung des Chromatins 1 h nach Röntgenbestrahlung ist nicht Tip60 abhängig. 

AG 1522 D Zellen wurden mit 30 µM Anakardsäure (Tip60 Inhibitor) 30 min vor Bestrahlung 

inkubiert und anschließend bestrahlt. 15 min und 1 h nach Bestrahlung wurde eine MNase 

Analyse durchgeführt, wobei Zelllysate ohne und mit MNase (300 U/ml; 15 min) behandelt wurden. 

(b) Humane AG 1522 D Fibroblasten zum Vergleich ebenfalls nach Röntgenbestrahlung und 


56


(a) Mit Tip60 Inhibitor-behandelte AG 1522 D Zellen nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen 

(b) AG 1522 D Zellen nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen 

Abbildung 3.17: Die strahlungsbedingte Chromatinauflockerung nach Bestrahlung mit 64 Ni- 

Ionen ist Tip60 abhängig. Nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen (LET: 3100 keV/µm; Fluenz: 1,0*10 7 

Teilchen/cm 2 ) ist keine strahlungsabhängige Chromatinauflockerung zu sehen. (a) AG 1522 D 

Zellen wurden mit 30 µM Anakardsäure (Tip60 Inhibitor) 30 min vor Bestrahlung inkubiert und 

anschließend bestrahlt. 15 min und 1 h nach Bestrahlung wurde eine MNase Analyse durchgeführt, 

wobei Zelllysate ohne und mit MNase (300 U/ml; 0, 6, 15, 30 min) behandelt wurden. (b) 

Humane AG 1522 D Fibroblasten zum Vergleich ebenfalls nach Bestrahlung mit 64 Ni-Ionen und 


57

3 Ergebnisse 

3.5 Nachweis von Tip60 an DNA-Doppelstrangbrüchen in anderen 

Zellsystemen 

Humane Fibroblasten AG 1522 D wachsen langsam, unterliegen einem Alterungsprozess 

und lassen sich schwer transfizieren. Dies erschwert molekularbiologische Experimen- 

te enorm. Aufgrund dieser Nachteile wurde versucht, in einer Immunfluoreszenzanalyse 

Tip60 auch in anderen Zellsystemen nachzuweisen. Zunächst wurde eine Zelllinie em- 

bryonaler Mausfibroblasten (MEF) getestet. Die Zellen dieser Linie sind immortalisiert, 

haben eine kurze Verdopplungszeit und für MEF-Zelllinien liegen eine Reihe von Knock 

out Mutanten vor. Des weiteren wurde die humane Tumorzelllinie U2-OS getestet. Auch 

diese Tumorzelllinie zeichnet sich durch Immortalität und eine kurze Verdopplungszeit 

aus. Zusätzlich ist sie leichter zu transfizieren und im Vergleich zu MEFs ist sie menschli- 

chen Ursprungs, das heißt, mit ihr gewonnene Ergebnisse sind eher auf den menschlichen 

Organismus zu übertragen. 

3.5.1 Embryonale Mausfibroblasten: Kein eindeutiger Nachweis von Tip60 an DNA- 

Doppelstrangbrüchen 

Von embryonalen Mausfibroblasten Zelllinien (MEF) gibt es viele Knock out Mutanten, 

in denen Reparaturproteine ausgeschaltet sind. Diese Mutanten würden sich für zukünfti- 

ge Experimente eignen, in denen der Einfluss von anderen Reparaturproteinen auf Tip60 

näher untersucht werden soll. 

Die bisherigen immunzytochemischen Ergebnisse für Tip60 wurden in humanen Zellen 

gewonnen. Es wurde daher zunächst getestet, ob der bisher verwendete Tip60-Antikörper 

auch Tip60 der Maus in einer immunozytochemischen Analyse detektiert und wenn ja, 

ob er an DNA-Doppelstrangbrüchen akkumuliert. Dazu wurden diese Zellen mit 124 Xe- 

Ionen bestrahlt, 30 Minuten und 2 h nach Bestrahlung mit Paraformaldehyd fixiert und 

anschließend immunzytochemisch gegen Tip60 und den DNA-Schadensmarker RPA ge- 

färbt. 

Der Schadensmarker RPA zeigte in 80 % der Zellen Foci. Es konnten weder 30 Minuten 

noch 2 Stunden nach Bestrahlung Tip60-Foci an DNA-Doppelstrangbrüchen nachgewie- 

sen werden (siehe Abbildung 3.18). 

Aufgrund dieses Ergebnisses wurden keine weiteren Tip60 spezifischen Immunfluores- 

zenzanalysen mit embryonalen Mausfibroblasten geplant. 

58

3.5 Nachweis von Tip60 an DNA-Doppelstrangbrüchen in anderen Zellsystemen 

(a) Überlagerung aus (b) und (c) (b) Tip60 (c) RPA 

(d) Überlagerung aus (e) und (f) (e) Tip60 (f) RPA 

Abbildung 3.18: Kolokalisation von Tip60 und RPA nach der Bestrahlung von embryonalen 

Mausfibroblasten mit 124 Xe-Ionen (LET: 8800 keV/µm; Fluenz: 3*10 6 Teilchen/cm 2 ). Die embryonalen 

Mausfibroblasten wurden 30 min und 2 h nach Bestrahlung fixiert und immunzytochemisch 

gegen Tip60 (grün) und RPA (rot) gefärbt. In (a) und (d) ist die Überlagerung aus (b) und 

(c) bzw. (e) und (f) zu sehen, zusätzlich ist die DNA mit ToPro3 (blau) gefärbt. 

3.5.2 Tip60 kann in der humanen Tumorzelllinie U2-OS an DNA-Doppelstrang- 

brüchen nachgewiesen werden 

U2-OS Zellen wurden mit 124 Xe-Ionen (LET: 800 keV/µm;Fluenz: 3*10 6 Teilchen/cm 2 ) 

bestrahlt, eine Stunde nach Bestrahlung mit Paraformaldehyd fixiert und immunzytoche- 

misch gegen den DNA-Doppelstrangbruch Marker γH2AX sowie Tip60 gefärbt. 

In Abbildung 3.19 sieht man an einigen DNA-Doppelstrangbrüchen eine Kolokalisati- 

on von Tip60 und dem DNA-Doppelstrangbruch-Marker γH2AX. Nachteilig ist, dass 

U2-OS Zellen viele spontane DNA-Doppelstrangbrüche zeigen, die man nicht von den 

strahleninduzierten Schäden unterscheiden kann. 

59

3 Ergebnisse 

(a) Überlagerung aus (b) und (c) (b) Tip60 (c) γH2AX 

Abbildung 3.19: Kolokalisation von Tip60 und γH2AX nach der Bestrahlung von U2-OS Zellen 

mit 124 Xe-Ionen (LET: 800 keV/µm; Fluenz: 3*10 6 Teilchen/cm 2 ). Die Tumorzellen U2-OS wurden 

1 h nach Bestrahlung fixiert und immunzytochemisch gegen Tip60 (grün) und γH2AX (rot) 

gefärbt. In (a) ist die Überlagerung aus (b) und (c) zu sehen, zusätzlich ist die DNA mit ToPro3 

(blau) gefärbt. 

3.5.3 Humane U2-OS Tumorzellen: Kolokalisation von Tip60 und phosphorylier- 

tem ATM an DNA-Doppelstrangbrüchen 

Aufgrund des Ergebnisses, dass Tip60 an manchen DNA-Schäden mit dem Schadens- 

marker γH2AX kolokalisiert, sollten U2-OS Zellen in einem zweiten Experiment mit der 

Schwerionen Mikrosonde bestrahlt werden. Mit dieser Art der Bestrahlung können aus- 

gewählte Zellkerne mit einer definierten Anzahl an Ionen in einer bestimmten Geometrie 

bestrahlt werden. Dadurch kann man beim Mikroskopieren die strahleninduzierten Schä- 

den von den spontanen Doppelstrangbrüchen unterscheiden. 

Es wurden U2-OS Zellen mit 7 x 2 197 Au-Ionen (LET: 12000 keV/µm; Fluenz: 4,7*10 6 

Teilchen/cm 2 ) aus der Mikorsonde bestrahlt. Das Bestrahlungsmuster entsprach einem 

langezogenen, aus 7 Punkten bestehenden Kreuz mit je 2 Treffern pro Punkt. Eine Stun- 

de nach Bestrahlung wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und immunzytoche- 

misch gegen Tip60 und ATMpS1981, als spezifischem DNA-Schadensmarker, gefärbt. 

In Abbildung 3.20 kolokalisieren Tip60 und ATMpS1981 deutlich an DNA-Doppelstrang- 

brüchen. Die Kolokalisation wird durch ein Intensitätsprofil (3.20d) der Daten in 3.20a be- 

stätigt, da sich die maximalen Intensitätswerte des grünen (Tip60) und des roten (γH2AX) 

Kanals an der gleichen Stelle befinden. 

60

3.5 Nachweis von Tip60 an DNA-Doppelstrangbrüchen in anderen Zellsystemen 


(d) Intensitätsprofil 

Abbildung 3.20: Tip60 und ATMpS1981 kolokalisieren in U2-OS Zellen an DNA-Doppelstrangbrüchen. 

Die Zellkerne werden mit Hilfe der Mikrosonde mit einem kreuzförmigen Muster bestehend 

aus sieben Punkten mit je 2 197 Au-Ionen pro Kreuzpunkt bestrahlt. Die Zellen wurden 

immunzytochemisch gefärbt; Tip60 (grün), ATMpS1981 (rot). In (a) ist die Überlagerung aus (b) 

und (c) gezeigt, zusätzlich ist die DNA mit ToPro3 (blau) gefärbt. (d) zeigt ein Intensitätsprofil aller 

drei Fluoreszenzfarbstoffe (rot-ATMpS1981, grün-Tip60, blau-DNA) und verläuft entlang der 

Linie in (a). 

Durch die nachgewiesene Kolokalisation von Tip60 und ATMpS1981 in U2-OS Zellen 

nach Bestrahung mit Schwerionen kann man in zukünftigen Immunfluoreszenz-Experi- 

menten auf diese Zelllinie zurück greifen. 

61

4 Diskussion 

4.1 Tip60 und ATM sind bei der DNA-Schadensrekrutierung von- 

einander abhängig 

Während dieser Arbeit wurde die Chromatinzugänglichkeit nach Bestrahlung an DNA- 

Schäden untersucht. Die DNA-Schadensrekrutierung der HAT Tip60 könnte dabei eine 

Rolle spielen. Tip60 acetyliert Histon H4 während der Transkription und sorgt für eine 

Auflockerung des Chromatins, damit Transkriptionsfaktoren binden können (Sapountzi 

et al., 2006). Die Rolle von Tip60 in der DNA-Doppelstrangbruch Reparatur ist noch nicht 

vollständig geklärt. 

Die Rekrutierung von Tip60 an DNA-Doppelstrangbrüche wurde eindeutig nach Bestrah- 

lung mit Schwerionen gezeigt (vorliegende Arbeit, Knauf (2007)). Vorherige Veröffent- 

lichungen zeigten zwar ebenfalls eine Rekrutierung an Doppelstrangbrüche, jedoch wur- 

den die Experimente nicht unter physiologischen Bedingungen durchgeführt; zum einen 

war Tip60 überexprimiert (Sun et al., 2005) und zum Anderen wurde ein DSB durch den 

Verdau mit SceI spezifisch erzeugt und anschließend die Anlagerung von Tip60 an DSB 

gemessen (Murr et al., 2006). 

Der Mechanismus der Tip60 DSB-Rekrutierung ist, wie seine Rolle in der DSB-Reparatur, 

nicht vollständig geklärt. Es besteht die Möglichkeit, dass Tip60 über ATM an Doppel- 

strangbrüche rekrutiert wird. Die Mehrheit des löslichen ATMs in der Zellen ist an Tip60 

gebunden (Sun et al., 2005). Es wäre nun möglich, dass nachdem lösliches ATM mit Hilfe 

von Tip60 aktiviert und an Doppelstrangbrüche rekrutiert wurde, ATM nach wie vor an 

Tip60 gebunden bleibt, und so Tip60 zusammen mit ATM an DNA-Doppelstrangbrüche 

rekrutiert wird. 

Im Folgenden wurde die Frage geklärt, ob ATM für die Rekrutierung von Tip60 an DNA- 

Schäden zuständig ist und ob ATM somit auch einen Einfluss auf die Chromatinzugäng- 

lichkeit hat. 

Sollte Tip60 durch ATM an Doppelstrangbrüche rekrutiert werden, so war zu erwarten, 

dass Tip60 mit aktiven ATM, ATMpS1981, an Doppelstrangbrüchen kolokalisiert. Dies 

wurde zwar bereits von Sun et al. (2005) gezeigt, allerdings waren in dem verwende- 

ten Zellsystem beide Bindungspartner überexprimiert. In der vorliegenden Arbeit konn- 

te nach 124 Xe- und 197 Au-Bestrahlung von humanen Fibroblasten nachgewiesen werden, 

dass endogenes Tip60 und ATMpS1981 an Doppelstrangbrüchen kolokalisieren (siehe 

63

4 Diskussion 

Abbildungen 3.4 und 3.5). Dieses Ergebnis wurde in der unabhängigen humanen Tumor- 

zelllinie U2-OS bestätigt (siehe Abbildung 3.20). Der Vorteil dieser Zelllinie liegt in Ih- 

rer Immortalität und leichten Transfizierbarkeit, während humane Fibroblasten langsam 

wachsen, einem Alterungsprozess unterliegen und sich nur schwer transfizieren lassen. 

Da eine Tip60 und ATMpS1981 Kolokalisation unter physiologischen Bedingungen auch 

in dem U2-OS Zellsystem nachgewiesen werden konnte, können zukünftige Experimen- 

te auch mit diesen Tumorzellen durchgeführt werden. Es konnte jedoch nicht an allen 

ATMpS1981-Foci auch Tip60 detektiert werden. Dies deckt sich mit dem Ergebnis, bei 

dem die Kolokalisation von Tip60 und dem DSB-Marker γH2AX auch nicht an allen 

DNA-DSB gezeigt werden konnte. Wahrscheinlich liegt der Anteil von Tip60 an einigen 

Doppelstrangbrüchen unter der Detektionsgrenze. Dies wird durch das Intensitätsprofil 

von Tip60 und ATMpS1981 in humanen Fibroblasten bestätigt (siehe Abbildung 3.5d), da 

die Intensität im ersten Tip60-Focus wesentlich schwächer ist als im zweiten und dritten 

Focus. Dieses Ergebnis gibt Hinweise auf ein Detektionsproblem von endogenem Tip60 

an DNA-Doppelstrangbrüchen. 

Im nächsten Schritt wurde nun untersucht, ob Tip60 ATM-abhängig an Doppelstrangbrü- 

che rekrutiert wird. In Tip60 DSB-Rekrutierungsexperimenten konnte in Zellen, in denen 

ATM inhibiert wurde bzw. ATM mutiert ist (AT1BR), eindeutig gezeigt werden, dass 

die Rekrutierung von Tip60 an Doppelstrangbrüche ATM abhängig erfolgt (siehe Ergeb- 

nisse 3.2). Es gilt hier hervorzuheben, dass obgleich die ATM-Mutante Zellinie AT1BR 

nur ein stark verkürztes ATM exprimiert, das Tip60 nicht binden kann (Stankovic et al., 

1998), diese Zelllinie immer noch Tip60 an einige wenige Doppelstrangbrüche rekrutiert. 

Daraus muss geschlossen werden, dass ATM nicht ausschließlich für eine Tip60 DSB- 

Rekrutierung verantwortlich ist. Tip60 bindet nicht nur die FATC-Domäne von ATM, 

sondern auch die anderer Proteine, die in der DNA-Reparatur involviert sind; nämlich 

DNA-PK und TRRAP aus dem NuA4-Komplex (Jiang et al., 2006). Es ist möglich, dass 

Tip60 auch über diese Interaktion an Doppelstrangbrüche rekrutiert wird. 

In einem nächsten Schritt wurde nun geklärt, ob Tip60 die Schadensrekrutierung von ak- 

tivem ATM (ATMpS1981) beeinflusst. Tip60 ist für die Aktivierung von ATM durch eine 

Acetylierung an Lysin3016 verantwortlich (Sun et al., 2007). Sun et al. (2006) konnten 

durch den Einsatz von Anakardsäure, einem Tip60 Inhibitor, zeigen, dass es nicht mehr 

zu einer Autophosphorylierung am Serin 1981 von ATM kam, nachdem in den Zellen 

DNA-Schäden durch Bleomycin induziert wurden. Auch nach Bestrahlung mit Schwe- 

rionen führte die Inhibition der Acetylierungsaktivität von Tip60 durch Anakardsäure zu 

einer deutlichen Abschwächung der ATMpS1981-DNA-Schadensrekrutierung (siehe Ab- 

bildung 3.6; rechts). Es konnte die klare Tip60-Abhängigkeit von der ATMpS1981 DNA- 

Schadensrekrutierung nach Schwerionenbestrahlung gezeigt werden. Bei diesem Experi- 

64

4.1 Tip60 und ATM sind bei der DNA-Schadensrekrutierung voneinander abhängig 

ment fiel auf, dass die Rekrutierung von Tip60 an DNA-Schäden trotz der Inhibition der 

Acetylierungsaktivität von Tip60 erfolgte. Aktives ATM (ATMpS1981) scheint also für 

die Schadensrekrutierung von Tip60 nicht notwendig zu sein (siehe Abbildung 3.6; links). 

Diese Ergebnisse zeigen, dass die ATMpS1981-Schadensrekrutierung zumindest teilwei- 

se von Tip60 abhängig ist, während umgekehrt für die Rekrutierung von Tip60 an DNA- 

Schäden die Autophosphorylierung von ATM nicht unbedingt notwendig ist. 

Im Folgenden wurde geklärt, ob Tip60 und ATMpS1981 auch direkt am Chromatin inter- 

agieren und dort die Chromatinzugänglichkeit beeinflussen können. Bisher wurde sowohl 

ATM (Ziv et al., 2006) als auch Tip60 (Murr et al., 2006) am Chromatin nachgewiesen 

und in Gesamtzelllysaten von HeLa-Zellen wurde die Interaktion von Tip60 und ATM 

durch eine Immunpräzipitation gezeigt (Sun et al., 2005). Aufgrund dieser puplizierten 

Daten schien es wahrscheinlich, dass ATMpS1981 und Tip60 am Chromatin interagieren. 

Zunächst wurde versucht, durch eine fraktionierte Proteinisolation, Tip60 und ATMpS1981 

eine Stunde nach Bestrahlung in den gleichen Zellkompartimenten nachzuweisen. Tip60 

war sowohl nach Bestrahlung mit Schwerionen als auch mit Röntgenstrahlung strahlungs- 

unabhängig im Chromatin, Nukleoplasma und Cytoplasma zu detektieren (Bestrahlung 

mit Schwerionen: siehe Abbildung 3.7; Bestrahlung mit Röntgen: Daten nicht gezeigt). 

Nach Bestrahlung mit Schwerionen war ATMpS1981 im Nukleoplasma, nicht aber im 

Chromatin, nachzuweisen (siehe Abbildung 3.7). Es war zusätzlich noch strahlungsab- 

hängig im Chromatin zu erwarten. Nach Aussagen von Bakkenist und Kastan (2003) sind 

15 Minuten nach 0,5 Gy Röntgenbestrahlung 50 % des gesamten ATMs phosphoryliert. 

Aber es scheint unwahrscheinlich, dass soviel ATM direkt am DNA-Schaden gebunden 

ist (Bakkenist und Kastan, 2003). Aus diesem Grund konnte ATMpS1981 eventuell nicht 

in der Chromatinfraktion nachgewiesen werden, da zu wenig ATMpS1981 gebunden war. 

Auch Kruhlak et al. (2006) zeigten 5 Minuten nach UV-Bestrahlung, dass sich die phos- 

phorylierte Form von ATM vom DNA-Schaden in das umliegende Nukleoplasma ausbrei- 

tet. Dies würde auch erklären, warum eine Stunde nach Bestrahlung kein ATMpS1981 im 

Chromatin detektiert werden konnte. Wahrscheinlich lag das Signal von ATMpS1981 in 

der bestrahlten Chromatinfraktion unter der Detektionsgrenze, während sich das meiste 

ATMpS1981 schon im Nukleoplasma befand. Der Zeitpunkt von 1 Stunde wurde gewählt, 

da Tip60 in der Immunfluoreszenz eine Stunde nach Bestrahlung das stärkste Signal an 

DNA-Schäden zeigt. 

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ATMpS1981 nach Bestrahlung nicht in der 

Chromatinfraktion nachgewiesen werden und auch die direkte Interaktion von Tip60 und 

ATMpS1981 konnte nach Bestrahlung nicht am Chromatin gezeigt werden. Aufgrund der 

Tatsache, dass ATMpS1981 ein relativ großes Protein ist und zusätzlich der Größenunter- 

schied zu Tip60 ca. das Sechsfache beträgt, werden auch für die Zukunft geplante Koim- 

65

4 Diskussion 

munpräzipitationsexperimente von ATMpS1981 und Tip60 sich als schwierig erweisen. 

Eventuell erfolgt die Interaktion von Tip60 und ATMpS1981 auch über ein drittes Protein, 

was eine Koimmunpräzipitation zusätzlich erschweren würde. Grund zu dieser Annahme 

liefern Sun et al. (2005), da sie keine direkte Interaktion zwischen der FATC-Domäne von 

ATM und Tip60 zeigen konnten. Da weder der gleichzeitige Aufenthalt von ATMpS1981 

und Tip60 in der Chromatinfraktion noch die direkte Interaktion gezeigt werden konnte, 

sollten in zukünftigen Experimenten kürzere Inkubationszeiten nach Bestrahlung getes- 

tet werden, um die direkte Interaktion von aktivem ATM (ATMpS1981) und Tip60 am 

Chromatin nach Bestrahlung zeigen zu können. 

4.2 Unterschiede in der Chromatinauflockerung nach Röntgen- und 

Schwerionenbestrahlung 

Um das Binden von Reparaturfaktoren an Doppelstrangbrüche zu ermöglichen, muss eine 

Auflockerung des Chromatins im Bereich des DNA-Schadens erfolgen. 

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob es nach Schwerionenbestrah- 

lung zu einer Chromatinauflockerung kommt und ob diese Tip60 bzw. ATM abhängig ist; 

Tip60-abhängig, da diese HAT im Rahmen der Transkription an der Chromatinauflocke- 

rung beteiligt ist und ATM-abhängig, da die Tip60 Rekrutierung an Doppelstrangbrüche 

ATM-abhängig erfolgt (siehe Ergebnisse 3.2). 

4.2.1 Indirekter Nachweis der Chromatinauflockerung durch die Acetylierung von 

Histon H4 

Die HAT Tip60 acetyliert im Rahmen der Transkription verschiedene Histone, insbe- 

sondere Histon H4, und führt so zu einer Chromatinauflockerung, die es erlaubt, dass 

Transkriptionsfaktoren die DNA binden (Doyon und Côté, 2004). Auch in der Reparatur 

scheint Tip60 durch die Acetylierung von Histon H4 einen Einfluss auf die Kompaktie- 

rung des Chromatins zu haben (Murr et al., 2006). Aus diesem Grund wurde in der vor- 

liegenden Arbeit der Acetylierungszustand von Histon H4 nach Bestrahlung untersucht. 

Zunächst wurde die Acetylierung von Histon H4 nach Strahlen-induzierter Schädigung 

der DNA mit Hilfe einer Western Analyse untersucht. Dabei wurde 15 Minuten nach Be- 

strahlung mit 12 C-Ionen eine erhöhte Histon H4-Acetylierung detektiert, was einer auf- 

gelockerten Chromatinstruktur entspricht (siehe Abbildung 3.9). Die maximale Acetylie- 

rung von Histon H4 20 Minuten nach Bestrahlung mit Röntgenstrahlen wurde von Falk 

66



et al. (2007) in Säugerzellen publiziert und Murr et al. (2006) zeigten ebenfalls eine er- 

höhte Acetylierung von Histon H4 an DNA-Schäden, so dass die hier gezeigte Histon H4 

Acetylierung mit Literaturdaten übereinstimmt. 

Um dieses Ergebnis zu erhärten, wurde die Histon H4-Acetylierung auch nach Bestrah- 

lung mit 64 Ni-Ionen untersucht. Allerdings konnte keine 64 Ni-strahlungsabhängige oder 

dosisabhängige Acetylierung von Histon H4 und somit auch keine durch acetyliertes 

Histon H4 induzierte Chromatinauflockerung nachgewiesen werden (siehe Abbildung 

3.10a). Allerdings wurde eine Chromatinauflockerung nach 64 Ni-Bestrahlung in dieser 

Arbeit mit einer anderen Methode, der MNase Analyse, gezeigt (siehe Abschnitt 3.4.2). 

Eventuell könnte aufgrund des hohen LETs der 64 Ni-Ionen ein so hohes Maß an DNA- 

Schäden entstanden sein, dass die Chromatinstruktur durch andere Faktoren schneller auf- 

gelockert wurde und die Acetylierung von Histon H4 durch Tip60 nicht mehr nötig war. 

Auch ist nicht auszuschließen, dass 15 Minuten nach Bestrahlung die Histon H4 Acety- 

lierung schon wieder abgebaut war. In diesem Zusammenhang wäre es interessant, das 

Verhalten der Histondeacetylasen (HDAC) näher zu untersuchen, die für die Deacetylie- 

rung von Histon H4 verantwortlich sind. Laut Kao et al. (2003) werden auch die HDACs 

an DNA-Schäden rekrutiert um dort die Acetylgruppen der acetylierten Lysin-Reste zu 

entfernen. Es wäre also ein Anstieg der HDACs zu erwarten, wenn keine erhöhte Acety- 

lierung von Histon H4 zu detektieren ist. 

Die hier vorgestellten Experimente lieferten keinen eindeutigen Beweis, dass Histon H4 

Schwerionenstrahlen-abhängig acetyliert wird. In zukünftigen Experimenten sollte man 

kürzere Inkubationszeiten nach Schwerionenbestrahlung testen, um so eine eventuell frü- 

here Histon H4-Acetylierung zu detektieren. Auch könnte man eine Immunpräzipitation 

durchführen, um acetyliertes Histon H4 anzureichern, so dass ein eventuell strahlungsab- 

hängiger Effekt besser nachweisbar wäre. 

Da Falk et al. (2007) in einem Immunfluoreszenz-Experiment einen relativen Anstieg von 

acetyliertem Histon H4 in Abhängigkeit eines Schadensmarkers 20 Minunten nach Be- 

strahlung mit Röntgenstrahlen zeigen konnten, war es interessant die Acetylierung von 

Histon H4 nach Bestrahlung mit Röntgenstrahlen biochemisch näher zu untersuchen. Im 

Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte allerdings in einer Western Analyse keine erhöh- 

te Acetylierung von Histon H4 detektiert werden (siehe Abbildung 3.11). Auch Gupta 

et al. (2005) konnten 0 Minuten und eine Stunde nach Bestrahlung mit Röntgenstrahlen 

in einer Western Analyse keine erhöhte Acetylierung von Histon H4 beobachten. Es ist 

daher möglich, dass eine strahlungabhängige Histon H4-Acetylierung nur lokal in einem 

Maße induziert wird, die biochemisch nicht, aber durch Immunfluoreszenz (Falk et al., 

2007) bzw. durch eine Chromosomen-Immunpräzipitation (Murr et al., 2006) nachgewie- 

sen werden kann. Für eine lokal eingeschränkte Histon H4-Acetylierung spricht, dass 

67

4 Diskussion 

Murr et al. (2006) acetyliertes Histon H4 0,5 kb und 2 kb von einem Schaden entfernt 

nachwiesen, während 9 kb entfernt vom Schaden keine Acetylierung von Histon H4 vor- 

lag. 

In zukünftigen Experimenten sollte versucht werden, parallel zur Untersuchung des Ace- 

tylierungsgrades von Histon H4 auf biochemischer Ebene, das Acetylierungssignal von 

Histon H4 an DNA-Schäden über ein Immunfluoreszenz-Experiment zu detektieren, wie 

es Falk et al. (2007) nach Röntgenstrahlen taten. Dies kann sich jedoch nach Bestrah- 

lung mit Schwerionen aufgrund des hohen LETs als schwierig erweisen. Es könnte zu 

einem hohen Hintergrundsignal von acetyliertem Histon H4 im Zellkern kommen, wenn 

es zu einer globalen Auflockerung des Chromatins kommt, wie sie von Ziv et al. (2006) 

beschrieben ist. Foci von acetylierten Histon H4 an Doppelstrangbrüchen könnten dann 

nicht mehr detektiert werden. Jakob et al. (2005) konnten hingegen nach Bestrahlung mit 

Schwerionen zeigen, dass es nicht unbedingt zu einer globalen Auflockerung kommen 

muss. 

Im Folgenden wurde geklärt ob die Inhibition von ATM bzw. Tip60 einen Einfluss auf den 

Acetylierungszustand von Histon H4 hat. Es konnte aber weder eine strahlungsabhängi- 

ge noch ATM- oder Tip60-abhängige Änderungen der Histon H4 Acetylierung gezeigt 

werden (siehe Abbildung 3.10b). 

Da im Rahmen dieser Arbeit keine eindeutige Aussage über den Einfluss des Acetylie- 

rungszustandes von Histon H4 nach Bestrahlung gemacht werden konnte, könnten auch 

andere posttranslationale Modifikationen, wie z. B. die Dimethylierung von Histon H3 am 

Lysin 9, im Zusammenhang mit der Chromatinzugänglichkeit interssant sein. Laut Falk 

et al. (2007) führt die verstärkte Methylierung von Histon H3 zu einer lokalen Chroma- 

tinauflockerung. Falk et al. (2007) zeigten in einem Immunfluoreszenz-Experiment nach 

Bestrahlung mit Röntgenstrahlen auch, dass der relative Anteil von dimethyliertem Histon 

H3 an DNA-Schadensstellen sich antiproportional zum relativen Anteil von acetyliertem 

Histon H4 an DNA-Schäden verhält. Wahrscheinlich sorgt die Methylierung von Histon 

H3 für die anhaltende lokale Chromatinzugänglichkeit, wenn die Acetylierung von Histon 

H4 schon wieder abgebaut wird. 

4.2.2 Direkter Nachweis der Chromatinauflockerung durch die Mikrococcus Nu- 

klease Analyse 

Da keine eindeutige Aussage über die Chromatinzugänglichkeit mit Hilfe des Acetylie- 

rungszustandes von Histon H4 nach Bestrahlung gemacht werden konnte, wurde im Fol- 

genden die Chromatinauflockerung in der Schadensantwort auf DNA-Ebene direkt über 

68



die MNase Analyse untersucht; denn nicht nur die Acetylierung von Histon H4 führt zu 

einer Chromatinauflockerung, sondern auch Faktoren wie ATP, das zur Umverteilung der 

Nukleosomen führt (Kruhlak et al., 2006), oder posttranslationale Modifikationen, wie 

Histonmodifikationen durch Phosphorylierung oder Methylierung. 

Zunächst musste diese Methode der Micrococcus Nuklease Analyse etabliert werden. Ein 

kritischer Faktor war die Lyse der Zellen, diese erfolgte direkt in den Petrischalen und 

war von Lee et al. (2007) mit 90 sec für embryonale Mausfibroblasten etabliert. Diese 

Inkubationszeit des Lysepuffers reichte aber nicht aus, um die Zellkerne der humanen 

Fibroblasten der MNase zugänglich zu machen. Während dieser Arbeit wurde für huma- 

ne Fibroblasten AG 1522 D eine Lyse von 12 bis 15 Minuten ermittelt. Die Lyse wurde 

dabei mikroskopisch überwacht. Einen längere Inkubationszeit wurde ausgeschlossen, da 

die Zellen einerseits während dieser Zeit möglicherweise noch DNA-Schäden reparie- 

ren, und andereseits anfingen sich vom Untergrund abzulösen. Die Lyse wurde direkt in 

Petrischalen und nicht in Zellsuspension durchgeführt, da so zusätzliche langwierige Zen- 

trifugationsschritte vermieden werden konnten. In der abschließenden Gelanalyse konnte 

die Chromatinzugänglichkeit über die Größe der entstandenen DNA-Fragmente gezeigt 

werden. 

Nachdem die Methode etabliert war, wurde eine mögliche strahlungsabhängige Auflocke- 

rung des Chromatins damit näher untersucht. Kruhlak et al. (2006) konnten eine Auflo- 

ckerung des Chromatins um DNA-Schadensstellen nach UV-Bestrahlung zeigen. Im Rah- 

men dieser Arbeit konnte unabhängig von der Strahlenqualität eine strahlungsabhängige 

Chromatinauflockerung gezeigt werden (siehe Abbildungen 3.12 und 3.13). Allerdings 

hielt die Auflockerung des Chromatins nach Bestrahlung mit Röntgenstrahlen wesentlich 

länger an als nach Bestrahlung mit Schwerionen. Bei beiden Strahlungsarten war eine 

Auflockerung nach 15 Minuten zu beobachten. Nach Schwerionenbestrahlung war die 

Auflockerung jedoch nach einer Stunde wieder verschwunden, nach Röntgenstrahlung 

nicht. Das Ergebnis nach Bestrahlung mit Schwerionen deckt sich mit dem der Western 

Analyse, bei der indirekt über eine erhöhte Acetylierung von Histon H4 nur 15 Minu- 

ten nach Bestrahlung mit 12 C-Ionen eine Auflockerung des Chromatins gezeigt werden 

konnte, die aber nach einer Stunde wieder verschwunden war (siehe Abbildung 3.9). Das 

beobachtete Ergebnis könnte daher rühren, dass die Schadensreparatur davon abhängt, 

in welchem Chromatinbereich der DNA-Schaden vorliegt. Das Chromatin ist in hetero- 

chromatische und euchromatische Bereiche unterteilt. DNA-Schäden in heterochroma- 

tischen (d.h. stärker kondensierten) Bereichen werden langsamer repariert als solche in 

euchromatischen (d. h. weniger kondensierten) Bereichen (Falk et al., 2008; Goodarzi 

et al., 2008); es besteht das Modell, dass DNA-Schäden im Heterochromatin erst an den 

Grenzbereich von Hetero- und Euchromatin transportiert werden müssen, bevor eine Re- 

69

4 Diskussion 

paratur erfolgt (Falk et al., 2007). Aufgrund der Tatsache, dass bei Bestrahlung mit Rönt- 

genstrahlen die Dosis homogen über die Zelle verteilt ist, kann davon ausgegangen wer- 

den, dass ein wesentlicher Teil der DNA-Schadensstellen im Heterochromatin vorliegt. 

Im Vergleich dazu wird bei Bestrahlung mit Schwerionen bei gleicher Dosis die Ener- 

gie nicht gleichmäßig über die Zelle verteilt, sondern sehr punktuell (siehe Einleitung 

1.2). Das bedeutet, die Wahrscheinlichkeit, dass heterochromatische Bereiche geschädigt 

werden ist bei niedrigen Fluenzen geringer als bei Röntgenstrahlung. Aufgrund dieser 

Annahme könnte die unterschiedliche Verteilung der DNA-Schäden im Heterochromatin 

und Euchromatin nach Röntgen- bzw. Schwerionenstrahlen erklären, warum nach Rönt- 

genbestrahlung das Chromatin länger aufgelockert ist; die Zellen müssen hier mehr he- 

terochromatische DNA-Schäden reparieren. Daraus kann man schließen, dass eventuell 

die Koordination der DNA-Reparatur abhängig von der Strahlenqualität ist. 

Des weiteren wurde die Rolle von ATM bei der Chromatinzugänglichkeit nach Bestrah- 

lung näher untersucht. Dabei wurde in ATM-defizienten und mit ATM Inhibitor-behan- 

delten Fibroblasten eine strahlungsunabhängige Chromatinauflockerung festgestellt, und 

es war keine zusätzliche Auflockerung des Chromatins nach Bestrahlung zu sehen (sie- 

he Ergebnisse 3.4.2.3). Dieses Ergebnis lässt zunächst den Schluss zu, dass ATM einen 

Einfluss auf die Chromatindichte hat. Allerdings steht dieses Ergebnis nicht im Einklang 

mit Daten in der Literatur (Ziv et al., 2006; Houldsworth et al., 1986). Houldsworth et al. 

(1986) konnten in AT-Zellen keine allgemeine Auflockerung des Chromatins in der Mi- 

crococcus Nuklease Analyse beobachten. Auch Ziv et al. (2006) beobachteten keine all- 

gemeine Chromatinauflockerung in einer Micrococcus Nuklease Analyse von HEK293 

und LA-N-5 Zellen, in denen ATM durch shRNA ausgeschaltet ist. Sie beobachteten al- 

lerdings eine DNA-Schadensabhängige Chromatinauflockerung, die ATM abhängig ist. 

Fehlt ATM (knock down), so kommt es zu keiner Auflockerung, denn ATM phosphory- 

liert schadensabhängig KAP1, das dann das Chromatin verlässt und eine Chromatinauflo- 

ckerung erlaubt. KAP1, das an Chromatin bindet und nicht phosphoryliert ist, unterbindet 

die Chromatinauflockerung. Goodarzi et al. (2008) konnten ebenfalls zeigen, dass KAP1 

bei der Auflockerung des Chromatin nach induzierten DNA-Schäden eine wichtige Rolle 

spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde auch ein schadensabhängiger Einfluss von ATM 

auf die Chromatindichte nicht beobachtet. 

Auch hMOF, eine Protein das HAT-Aktivität besitzt (Taipale et al., 2005), könnte bei der 

Chromatinauflockerung eine Rolle spielen. Zum Einen acetyliert es Histon H4 am Lysin 

16 einmalig und zum Anderen interagiert es mit ATM und beeinflusst dabei die Auto- 

phosphorylierung am Serin 1981. Wird hMOF mit shRNA ausgeschaltet, verlieren diese 

Zellen, wie auch ATM-defiziente Zellen, den G1-Checkpoint (Gupta et al., 2005). 

Die allgemeine Chromatinauflockerung in ATM-defizienten und auch Tip60-defizienten 

70



Zellen, wie sie in dieser vorliegenden Arbeit beobachtet wurde, wurde in mehreren unab- 

hängigen Experimenten beobachtet. Daher sollte in zukünftigen Versuchen herausgefun- 

den werden, ob das Ergebnis tatsächlich auf einem ATM- bzw. Tip60-Defekt beruht oder 

aber an der technischen Durchführung der Micrococcus Nuklease Analyse. 

4.2.3 Vergleich der verwendeten Analysen zur Untersuchung der Chromatinauflo- 

ckerung 

Mit Hilfe der MNase Analyse konnte eine eindeutige Auflockerung des Chromatins nach 

Bestrahlung gezeigt werden, unabhängig von der Strahlenqualität. Das Ergebnis der Wes- 

tern Analyse, bei der die erhöhte Acetylierung von Histon H4 nach Bestrahlung mit 12 C- 

Ionen detektiert wurde, konnte somit bestätigt werden. Die MNase Analyse eignet sich be- 

sonders gut, um einen Überblick über die direkte Chromatinauflockerung zu bekommen. 

Es zeigte sich jedoch eine leichte Variabilität in der MNase Behandlung. Diese wird bei 

den mit Inhibitor-behandelten Proben deutlich, da die unbestrahlten Proben eine deutliche 

Chromatinauflockerung zeigen, aber bei unterschiedlichen Inkubationszeiten (15 Minuten 

und eine Stunde nach Bestrahlung) leicht in der Signalstärke der kleinen DNA-Fragmente 

variieren. (siehe Abbildungen 3.14a, 3.14b und 3.16a). 

Es zeigte sich auch, dass die Inkubationszeiten nach Bestrahlung der beiden Methoden 

nicht komplett vergleichbar waren, da bei der MNase Analyse nach der eigentlichen Inku- 

bation im Brutschrank, die Zellen während der 12 bis 15 minütigen Lyse wahrscheinlich 

noch DNA-Schäden weiter reparieren konnten. Hingegen wurde bei der Western Analyse 

die Zellen fast sofort nach der Inkubation im Brutschrank zu Gesamtzelllysaten verarbei- 

tet, so dass die Zellen keine weitere Zeit für eine mögliche Reparatur hatten. Für zukünfti- 

ge Experimente sollte daher versucht werden, die Lyse der Zellen bei der MNase Analyse 

zu verbessern, in dem sie verkürzt wird. So könnten auch kürzere Inkubationszeiten nach 

Bestrahlung untersucht werden. 

71

5 Ausblick 

Im Laufe der Evolution entwickelten sich unterschiedliche DNA-Reparaturwege um die 

genetische Integrität der DNA in den Zellen zu erhalten. Die DNA-Reparaturmechanismen 

für Doppelstrangbrüche sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Eine übergeordnete 

Rolle in der DSB-Schadensantwort spielt ATM, das durch Tip60 acetyliert und somit zu 

einer Autophosphorylierung am Serin 1981 aktiviert wird. Die Interaktion von Tip60 und 

autophosphoryliertem ATM (ATMpS1981) an DNA-Schäden konnte zum Einen durch die 

Kolokalisation an DNA-Schäden und zum Anderen durch die Tip60-abhängige Schadens- 

rekrutierung von ATM nach Bestrahlung mit Schwerionen gezeigt werden. Es besteht die 

Möglichkeit, dass ein Komplex aus autophosphoryliertem ATM und Tip60 vorliegt, der 

aber in dieser Arbeit eine Stunde nach Bestrahlung nicht bestätigt wurde. In zukünftigen 

Experimenten sollte daher versucht werden, diesen Komplex am Chromatin nach DNA- 

Schädigung, mit Hilfe von kürzeren Inkubationszeiten nach Bestrahlung, nachzuweisen. 

Würde dies in zukünftigen Experimenten gelingen, könnte auch der Einfluss von Tip60 

auf phosphoryliertes ATM und somit die DNA-Reparatur bei strahleninduzierten Schäden 

näher analysiert werden. Es könnte zum Beispiel die Frage geklärt werden, was Tip60, an 

autophosphoryliertes ATM gebunden, am DNA-Schaden macht; ob es eventuell direkt 

Histon H4 aceyliert und somit einen Beitrag zur Chromatinauflockerung leistet oder ob 

die Histon H4 Acetylierung nur über den NuA4-Komplex stattfindet. 

Damit Reparaturproteine die DNA binden können, ist die Chromatinzugänglichkeit un- 

erlässlich. Die MNase-Analyse, die hierzu etabliert wurde, bedarf noch einiger Verbes- 

serungen. Es wäre z. B. von Vorteil, die Lyse zu verkürzen, da während der Lyse DNA- 

Schäden wahrscheinlich noch repariert werden. Auch die Konzentration der MNase kann 

möglicherweise noch optimiert werden, da die hier verwendete MNase-Konzentration 

sehr hoch ist. Ungeachtet dessen konnte die Chromatinauflockerung nach Bestrahlung 

sichtbar gemacht werden, so dass in zukünftigen Experimenten auch der Einfluss auf die 

Chromatinzugänglichkeit von anderen Reparaturproteinen, mit Hilfe der MNase-Analyse, 

näher untersucht werden kann. 

Da Tip60 und ATM anscheinend die strahlungsabhängige Chromatinzugänglichkeit be- 

einflussen, wäre es weiterhin interessant zu untersuchen, ob Tip60 auch einen Einfluss 

auf die DNA-Reparatur zeigt. Dazu könnte man in zukünftigen Experimenten nach Hem- 

mung von Tip60 (durch Inhibitoren oder auch durch Herstellung von Tip60-siRNA) die 

DNA-Reparatur über die Detektion von γH2AX messen. 

73

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Danksagung 

Herzlich Bedanken möchte ich mich bei folgenden Personen: 

➢ Herrn Prof. Dr. P. Layer für seine Interesse am Fortgang dieser Arbeit und vor 

allem für die Möglichkeit diese extern an der GSI anzufertigen 

➢ Herrn Prof. Dr. M. Löbrich für die Übernahme der Zweitkorrektur, seine Diskussi- 

onsbereitschaft während meiner Präsentation der Ergebnisse und die zu Verfügung 

gestellten Zelllinien 

➢ Herrn Prof. Dr. M. Durante und Prof. Dr. G. Kraft für die Emöglichung, meine 

Diplomarbeit in der Abteilung Biophysik der GSI anzufertigen 

➢ Frau Dr. Gisela Taucher-Scholz für die hervorragende Betreuung, Unterstützung 

und Förderung, sowie der vielseitigen Vermittlung von umfangreichem Fachwis- 

sen schon während meiner Zeit als Werksstudentin 

➢ Frau Dr. Nicole Averbeck für die hervorragende Betreuung, herzliche Zusammen- 

arbeit und die ständige Diskussionbereitschaft meiner Ergebnisse. 

➢ Frau Anna Lena Leifke, Frau Gudrun Becker und Frau Maren Herrlitz für die 

praktische Unterstützung, große Hilfsbereitschaft und gute Stimmung im Labor 

➢ Herrn Dr. Burkhard Jakob, Herrn Jörn Splinter und Herrn Frank Tobias für die 

große Hilfsbereitschaft in allen technischen Belangen 

➢ Der gesamten Arbeitsgruppe Biophysik für das angenehme und freundschaftliche 

Arbeitsklima 

➢ Abschließend noch einen ganz lieben Dank an meine Eltern, meinen Bruder und 

meinen Freund die mich immer unterstützt und an mich geglaubt haben.

Eidesstattliche Erklärung 

Hiermit versichere ich, die vorliegende Arbeit selbstständig und unter ausschließlicher 

Verwendung der angegebenen Literatur und Hilfsmittel erstellt zu haben. 

Darmstadt, den 01. März 2009 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 

Kerstin Knoop

Diplomarbeit - GSI

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