Diplomarbeit - GSI

2.3 Immunzytochemische Methoden
wurden die Zellen wieder mit ihrem normalen Kulturmedium überschichtet und bis zu
ihrer Fixierung im Brutschrank inkubiert.
2.3 Immunzytochemische Methoden
2.3.1 Fixierung von Zellen ohne Extraktion
Die Zell-Fixierung mit Paraformaldehyd ist eine schonende Methode, um die native Form
von Zellen zu erhalten. Dabei wurde zunächst das Medium abgezogen und mit PBS Me-
diumreste entfernt. Die Zellen wurden dann für 15 Minuten bei RT mit 2 % Paraformal-
dehyd in PBS fixiert. Anschließend wurden die Zellen mit 0,1 % Triton X-100 in PBS für
10 Minuten bei RT für die kommende Antikörperfärbung permeabilisiert. Die Zellen wur-
den zweimal für 3 Minuten mit PBS gewaschen und im Anschluss wurden Antikörperbin-
destellen mit 0,4 % BSA in PBS für mindestens 20 Minuten abgesättigt, dies verhinderte
eine unspezifische Bindung der Antikörper. In 0,4 % BSA in PBS konnten die Proben für
einige Tage bis zur Antikörperfärbung bei 4 °C gelagert werden.
2.3.2 Antikörperfärbung der fixierten Zellen
Zunächst wurde die BSA-Lösung abgezogen und 50 µl des primären Antikörpers, wel-
cher spezifisch an das gesuchte Protein bindet, in die Mitte der Petrischale pipetiert. Die
Verdünnungen der verwendeten Antikörper (siehe Tab. 2.2) wurden in 0,4 % BSA in PBS
angesetzt. Die Inkubation dauerte eine Stunde bei RT. Danach wurde dreimal für 5 Minu-
ten mit PBS gewaschen, um den nicht gebundenen Antiköper zu entfernen. Nun wurden
50 µl des fluoreszenzgekoppelten sekundären Antikörpers (siehe Tab. 2.3) in 0,4 % BSA
in PBS auf die Probe gegeben und 30 bis 45 Minuten im Dunkeln inkubiert.
Die Proben wurden bei der Inkubation mit den primären und sekundären Antikörpern mit
Mylar-Folie abgedeckt, um sie vor dem Austrocknen zu schützen. Bei sich leicht ablö-
senden Tumorzelllinien wurden die Zellen nicht mit einer Folie, sondern die Petrischale
mit einem feuchten Tuch abgedeckt. Außerdem wurden in diesem Fall vom jeweiligen
Antikörper 100 µl Antikörperlösung verwendet.
Nach der Inkubation mit sekundärem Antikörper wurde zweimal für 5 Minuten mit PBS
gewaschen. Anschließend wurde 1 µM ToPro3 (Invitrogen, USA) in PBS für 20 min bei
RT auf die Zellen gegeben, um die DNA zu färben. Auch diese Inkubation fand im Dun-
keln statt. Im Anschluss wurde die ToPro3-Lösung abgezogen. Die Proben wurden bei
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