Diplomarbeit - GSI

2.3 Immunzytochemische Methoden
Tabelle 2.3: Verwendete sekundäre Antikörper für die Immunfluoreszenz
Antigen Antikörper Firma Spezies Konzentration
[mg/ml]
Maus Alexa Fluor
488
anti-Maus
Kaninchen Alexa Fluor
488
anti-
Kaninchen
Maus Alexa Fluor
568
anti-Maus
Kaninchen Alexa Fluor
568
anti-
Kaninchen
Molecular
Probes
Molecular
Probes
Molecular
Probes
Molecular
Probes
2.3.3 Konfokale Laser-Mikroskopie und Auswertung
Ziege 2 1:400
Ziege 2 1:400
Ziege 2 1:400
Ziege 2 1:400
verwendete
Verdünnung
Die Proben wurden mit dem konfokalen Laserscanning System Leica TCS, das mit in-
versem Mikroskop (DM IRBE), Argon-Krypton Laser und einem computergesteuerten
Kreuztisch (Märzhäuser SCAN 100x100) ausgestattet ist, analysiert. Mit dem Argon-
Krypton Laser lassen sich Fluoreszenzfarbstoffe im blauen (488 nm), grüngelben (568
nm) und dunkelroten (647 nm) Bereich anregen. Für die Aufnahmen der Zellen wurden
konstante Einstellungen des Photomultipliers, der Lochblende und der Leistung des La-
sers gewählt.
Für die mikroskopischen Aufnahmen wurde das erste Bildfeld zufällig angefahren. Zu-
nächst wurde ein Übersichtsbild mit dem Vergrößerungsfaktor 1 (Bildfläche 158,7 µm
x 158,7 µm) gemacht, welches die gesamte Probe repräsentierte. Von diesem Bildfeld
aus wurden nun in verschiedene Richtungen Aufnahmen mit dem Vergrößerungsfaktor 2
(Bildfläche 79,4 µm x 79,4 µm) gemacht. Diese Aufnahmen wurden für die quantitati-
ven Auswertungen verwendet. Um die Kolokalisation von Proteinen zu zeigen, wurden
außerdem einzelne Zellkerne mit dem Vergrößerungsfaktor 4 (Bildfläche 39,7 µm x 39,7
µm) aufgenommen. Die Schichtdicke bei den Aufnahmen variierte zwischen 0,234 µm
und 0,5 µm.
Für die quantitative Auswertung wurde das semiautomatische PC-Programm Image Pro
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