AUFSTEIGENDE DILATATIONEN - Universität zu Lübeck

MATERIAL UND METHODEN 29
Die Mikrozirkulation wurde mit einem Mikroskop (Nikon Eclipse E600, Nikon, Tokyo, Japan)
unter 200-facher Vergrößerung betrachtet (CFI Planfluor ELWD Objektiv: 20x / 0.45). Die
Bilder wurden mit einer CCD Kamera aufgenommen und zur späteren Auswertung auf
Videoband (S-VHS, Sony) aufgezeichnet.
Für die Membranpotentialversuche wurde ein Mikroskop mit einer 'fixed stage' Konstruktion
als Arbeitsbasis verwendet (Axioskop 2 FS, Zeiss, Jena). Durch die feste Tischposition sind
das Versuchstier auf der Mikroskopierbühne sowie die Mikromanipulatoren fixiert mit dem
ruhenden Tisch verbunden, während das Mikroskop auf einer beweglichen Bühne steht. Dies
ist für die Durchführung der empfindlichen Membranpotentialmessung von besonderem
Vorteil, da dadurch Erschütterungen der Mikroelektrode minimiert werden können. Die
freipräparierten Arteriolen wurden mit 400-facher Vergrößerung betrachtet
(Wasserimmersionsobjektiv: 40x / 0.8). Für die Fluoreszenzmikroskopie wurde eine
Quecksilberlampe verwendet (HBO, 100W, Osram, München). Der verwendete Filtersatz
(No 9, Zeiss, Jena) eignete sich zur Visualisierung der mit Fluorescein beladenen Zellen
(Anregung: 495nm, Emission: 517nm). Die Fluoreszenz wurde mit einer ICCD Kamera
(C8484, Hamamatsu, Herrsching) aufgenommen und die Bilder digital gespeichert.
2.2.4 Globale und lokale Stimulation mit Agonisten
Durch eine peristaltische Pumpe konnten der Superfusion vasoaktive Substanzen
zugemischt werden. Hierdurch wurde eine globale Stimulation des Skelettmuskels erreicht.
Die Substanzen wurden 100-fach konzentriert eingesetzt und der Superfusion mit einer
Geschwindigkeit von 0.08 ml/min zugesetzt, um die gewünschten Endkonzentrationen zu
erreichen. Im weiteren Text werden die Endkonzentrationen in der Superfusionslösung
angegeben. Die lokalisierte Stimulation von Arteriolen konnte durch gezielte Applikation
eines Agonisten über eine Mikropipette erfolgen. Hierzu wurde eine mit dem Agonisten
befüllte Mikropipette mit Hilfe eines Mikromanipulators in unmittelbarer Nähe des Gefäßes im
Skelettmuskel platziert und der Agonist durch einen kurzen Druckpuls (50 - 500 ms, 140
kPa) appliziert. Eine erfolgreiche Applikation konnte durch ein kurzes Auseinanderweichen
des Muskelgewebes an der Applikationsstelle erkannt werden.
2.2.5 Membranpotentialmessung
Bei der intrazellulären Membranpotentialmessung wird das Membranpotential direkt
gemessen, das heißt die von der Zelle gesteuerten Spannungsänderungen werden
abgeleitet. Zur Messung einer Potentialdifferenz über eine Zellmembran sind zwei
Elektroden erforderlich. Eine indifferente Elektrode im extrazellulären Raum sowie eine
intrazelluläre Elektrode, innerhalb der Zelle. Um eine Zelle intrazellulär ableiten zu können,