AUFSTEIGENDE DILATATIONEN - Universität zu Lübeck
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Aus dem Institut für Physiologie der <strong>Universität</strong> <strong>zu</strong> <strong>Lübeck</strong><br />
Direktor: Prof. Dr. Wolfgang Jelkmann<br />
<strong>AUFSTEIGENDE</strong> <strong>DILATATIONEN</strong>: KALIUM-KANÄLE UND<br />
CONNEXINE VERMITTELN DIE KOORDINATION IN DER<br />
MIKROZIRKULATION<br />
Inauguraldissertation<br />
<strong>zu</strong>r Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der<br />
Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) an der<br />
<strong>Universität</strong> <strong>zu</strong> <strong>Lübeck</strong><br />
vorgelegt von<br />
Stephanie Elisabeth Wölfle<br />
aus München<br />
<strong>Lübeck</strong>, 2006
Tag der mündlichen Prüfung: 19.12.2006<br />
Vorsitzender des Prüfungsausschusses:<br />
Prof. Dr. rer. nat. R. Hilgenfeld (Institut für Biochemie, <strong>Universität</strong> <strong>Lübeck</strong>)<br />
1. Berichterstatter:<br />
Prof. Dr. med. W. Jelkmann (Institut für Physiologie, <strong>Universität</strong> <strong>Lübeck</strong>)<br />
2. Berichterstatter:<br />
Prof. Dr. rer. nat. H. Terlau (Institut für Pharmakologie und Toxikologie, <strong>Universität</strong> <strong>Lübeck</strong>)<br />
1. Drittgutachter:<br />
Prof. Dr. rer. nat. M. Hecker (Institut für Physiologie, <strong>Universität</strong> Heidelberg)<br />
2. Drittgutachter:<br />
Prof. Dr. med. C. Wagner (Institut für Physiologie, <strong>Universität</strong> Zürich)
Meinen Eltern gewidmet
Wenn du willst, dass Menschen ein Schiff bauen,<br />
gib ihnen nicht einen Plan oder Hammer und Nägel,<br />
sondern entzünde in ihnen die Sehnsucht nach dem<br />
weiten offenen Meer<br />
Antoine de Saint-Exupéry
Inhaltsverzeichnis<br />
1 EINLEITUNG 1<br />
1.1 Durchblutung und Kreislaufregulation 1<br />
1.2 Aufbau der Arteriolen 3<br />
1.2.1 Endothelzellen 3<br />
1.2.2 Glatte Muskelzellen 3<br />
1.3 Potential vaskulärer Zellen 4<br />
1.4 K + -Kanäle in vaskulären Zellen 5<br />
1.4.1 Calciumabhängige Kaliumkanäle (K Ca ) 6<br />
1.4.2 Einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (K IR ) 9<br />
1.4.3 Spannungsgesteuerte Kaliumkanäle (K V ) 9<br />
1.4.4 ATP-sensitive Kaliumkanäle (K ATP ) 9<br />
1.4.5 Weitere Kalium- und Ionenkanäle 10<br />
1.5 Gap Junctions 10<br />
1.6 Lokale Regulation des Gefäßtonus 11<br />
1.6.1 Myogener Tonus 12<br />
1.6.2 Endotheliale Autakoide 12<br />
1.6.2.1 Stickstoffmonoxid (NO) 13<br />
1.6.2.2 Prostazyklin 13<br />
1.6.2.3 EDHF 15<br />
1.7 Koordination des Gefäßverhaltens: Aufsteigende Vasomotorantworten 17<br />
1.8 Atherosklerose: Systemische endotheliale Dysfunktion 19<br />
1.9 Ziel der Arbeit 22<br />
2 MATERIAL UND METHODEN 24<br />
2.1 Material 24<br />
2.1.1 Versuchstiere 24<br />
2.1.2 Cholesterin- und fettreiche Diät 24<br />
2.2 Methoden 25<br />
2.2.1 Narkose 25<br />
2.2.2 Versuchsvorbereitung und Präparartion 25<br />
2.2.2.1 Tracheotomie und Katheterisierung 25<br />
2.2.2.2 Cremasterpräparation 26<br />
2.2.3 Intravitalmikroskopie: Versuchsaufbau und Durchführung 28<br />
2.2.4 Globale und lokale Stimulation mit Agonisten 29<br />
2.2.5 Membranpotentialmessung 29
2.2.6 Immunfärbung 32<br />
2.2.6.1 Immunfluoreszenz 32<br />
2.2.6.2 Konfokale Lasermikroskopie 33<br />
2.2.6.3 Immunhistochemie von Paraffinschnitten 34<br />
2.2.7 Genotypisierung der Connexin40 defizienten Mäuse 35<br />
2.2.8 Magnetofektion 38<br />
2.2.9 Cholesterinbestimmung 41<br />
2.2.10 Mikropipetten 41<br />
2.3 Versuchsprotokolle 42<br />
2.3.1 Genereller Versuchsablauf 42<br />
2.3.2 Intermittierende Durchmesserbestimmung nach globaler Stimulation 43<br />
2.3.3 Kontinuierliche Durchmesserbestimmung: fortgeleitete Vasomotorantworten 43<br />
2.3.4 Blockade von vaskulären K + -Kanälen 44<br />
2.3.5 Membranpotential vaskulärer Zellen 45<br />
2.3.6 Magnetofektion 46<br />
2.4 Datenauswertung 47<br />
2.4.1 Durchmesserbestimmung 47<br />
2.4.1.1 Berechnung bei intermittierender Durchmesseruntersuchung 47<br />
2.4.1.2 Kontinuierliche Durchmesserbestimmung 48<br />
2.4.1.3 Membranpotentialmesung 49<br />
2.5 Statistik 49<br />
3 ERGEBNISSE 50<br />
3.1 Mechanismen lokaler und fortgeleiteter Dilatationen 50<br />
3.1.1 Connexin40 Expression in Arteriolen des M.cremaster 50<br />
3.1.2 Acetylcholin und KCl-induzierte Fortleitung bei endothelialer Cx40 Defizienz 53<br />
3.1.3 Bedeutung von K Ca als Effektoren lokaler und fortgeleiteter Dilatationen 56<br />
3.1.3.1 Beteiligung von BK Ca an der Auslösung und Fortleitung von Dilatationen 56<br />
3.1.3.1.1 Ruhetonus in BK Ca -defizienten Mäusen 56<br />
3.1.3.1.2 Rolle von BK Ca als Effektor von NO und cGMP induzierten Dilatationen 57<br />
3.1.3.1.3 Beteiligung von BK Ca an Dilatationen nach ACh und Adenosin 58<br />
3.1.3.1.4 Fortleitung von ACh-Dilatationen in BK Ca -defizienten Mäusen 59<br />
3.1.3.1.5 Rolle von NO und Prostazyklin bei ACh-induzierten Dilatationen in BK Ca -<br />
defizienten Mäusen 60<br />
3.1.3.1.6 BK Ca als Effektor von ACh- und SNP-induzierten Dilatationen in<br />
unterschiedlichen Mausarten 63<br />
3.1.3.2 Beteiligung von IK Ca an der Auslösung und Fortleitung von Dilatationen 65
3.1.3.2.1 Ruhetonus in IK Ca -defizienten Mäusen 65<br />
3.1.3.2.2 Effekt des IK Ca -Öffners DCEBIO in Wildtypen und IK Ca -defizienten Mäusen 65<br />
3.1.3.2.3 Beteiligung von IK Ca als Effektor von ACh, Adenosin und SNP Dilatationen 66<br />
3.1.3.2.4 DCEBIO induziert fortgeleitete Dilatationen 67<br />
3.1.3.2.5 Beteiligung von IK Ca bei fortgeleiteten Dilatationen nach ACh 68<br />
3.1.3.3 Rolle von SK Ca bei der Auslösung lokaler und fortgeleiteter Dilatationen 69<br />
3.1.3.3.1 Beteiligung von SK Ca als Effektor von ACh-, Adenosin- und<br />
SNP-Dilatationen 69<br />
3.1.3.3.2 SK Ca als Effektor fortgeleiteter ACh-Dilatationen 71<br />
3.1.4. Charakterisierung von Effektoren lokal induzierter Adenosin Dilatationen 72<br />
3.1.4.1 Rolle von NO und Prostazyklin als Mediatoren von lokal induzierten<br />
fortgeleiteten Adenosin-Dilatationen 72<br />
3.1.4.2 Vergleich der Ausbreitung lokal ausgelöster Dilatationen nach<br />
Adenosin und ACh 73<br />
3.1.4.3 IK Ca und BK Ca als Effektoren der fortgeleiteten Dilatationen nach ACh und<br />
Adenosin 75<br />
3.1.4.4 K ATP als Effektor von Adenosin Dilatationen 76<br />
3.2 Verstärkungsmechanismen fortgeleiteter Dilatationen 78<br />
3.2.1 Bupivacain zeigt die Beteiligung unterschiedliche Fortleitungsmechanismen 78<br />
3.2.2 Selektive Blockade spannungsabhängiger Na + -Kanäle mit Mepivacain 82<br />
3.2.3 Rolle von K IR bei der Fortleitung ACh, Adenosin und Bradykinin induzierter<br />
Dilatationen 83<br />
3.2.4 Rolle von K V bei der Fortleitung ACh und Adenosin induzierter Dilatationen 85<br />
3.3 Membranpotential vaskulärer Zellen 86<br />
3.3.1 Identifizierung der vaskulären Zellen 87<br />
3.3.2 Membranpotential vaskulärer Zellen 87<br />
3.3.3 Effekt einer lokalisierten Applikation von ACh und Adenosin auf das<br />
Membranpotential 89<br />
3.4 Endotheliale Funktion in hypercholesterinämischen Mausmodellen 91<br />
3.4.1 Plasmacholesterinspiegel in LDLR- und ApoE-defizienten Mäusen 91<br />
3.4.2 Ruhetonus in hypercholesterinämischen Mäusen 92<br />
3.4.3 Effekt von Hypercholesterinämie auf ACh-, Adenosin- und SNP- induzierte<br />
Dilatationen 93<br />
3.4.4 NO als Mediator von ACh Dilatationen in hypercholesterinämischen Mäusen 95<br />
3.4.5 Fortgeleitete Vasomotorantworten nach ACh und KCl bei<br />
Hypercholesterinämie 97
3.4.6 Immunhistochemischer Nachweis von Connexin40 in hypercholesterinämischen<br />
Mäusen 99<br />
3.5 Magnetofektion in vivo 101<br />
3.5.1 Targeting der Src homology domain 2 (SH2)-Tyrosinphosphatase-1<br />
(SHP-1): Effekt auf ACh- und SNP- induzierte Dilatationen 101<br />
3.5.2. Targeting des M3-Rezeptors: Effekt auf ACh, Adenosin und SNP<br />
induzierte Dilatationen 102<br />
4 DISKUSSION 104<br />
4.1 Cx40 Expression und Rolle von endothelialem Cx40 bei der<br />
Ausbreitung von Gefäßantworten 104<br />
4.2 Bedeutung von K Ca -Kanälen in der Mikrozirkulation 107<br />
4.2.1 BK Ca bei NO- und endothelabhängigen Dilatationen 107<br />
4.2.2 IK Ca und SK Ca bei endothelabhängigen Dilatationen 110<br />
4.2.3 Charakterisierung der Effektoren lokal induzierter Adenosin Dilatationen 113<br />
4.3 Verstärkungsmechanismen fortgeleiteter Dilatationen 115<br />
4.4 Membranpotential vaskulärer Zellen 119<br />
4.5 Endotheliale Funktion in hypercholesterinämischen Mausmodellen 120<br />
4.6 Magnetofektion in vivo 122<br />
5 ZUSAMMENFASSUNG 124<br />
6 LITERATURVERZEICHNIS 126<br />
7 ANHANG 140<br />
7.1 Verwendete Substanzen 140<br />
7.2 Lösungen und Puffer 142<br />
7.3 Weitere Materialien 143<br />
7.4 Abkür<strong>zu</strong>ngsverzeichnis 144<br />
Publikationen 146<br />
Lebenslauf 148<br />
Danksagung 149
EINLEITUNG 1<br />
1 Einleitung<br />
Das Kreislaufsystem hat die Aufgabe, die Gewebe und Organe ausreichend mit Sauerstoff<br />
und Nährstoffen <strong>zu</strong> versorgen. Hier<strong>zu</strong> ist es erforderlich, dass einerseits ein hinreichender<br />
Perfusionsdruck (arterieller Blutdruck) aufrechterhalten wird und andererseits eine<br />
ausreichende Gesamtstromstärke (Herzzeitvolumen) bereitgestellt wird. Sind diese beiden<br />
Vorausset<strong>zu</strong>ngen gegeben, so kann die Verteilung der Stromstärke auf die einzelnen<br />
Organe bzw. die Gewebe (Organperfusion) im Sinne einer bedarfsorientierten Durchblutung<br />
erfolgen. Da der Sauerstoffverbrauch der Organe nicht konstant ist, sondern mit deren<br />
Aktivität variiert, muss auch die Durchblutung angepasst werden. Hierbei sind lokale,<br />
innerhalb des einzelnen Gefäßgebiets ablaufende Regulationsvorgänge beteiligt. Die<br />
Zunahme der Durchblutung einzelner Organe würde <strong>zu</strong> einer Reduktion des arteriellen<br />
Blutdrucks (Perfusionsdruck) führen, wenn zentrale Regulationsmechanismen diesem nicht<br />
durch eine Zunahme des Herzzeitvolumens und vermehrter Bereitstellung der<br />
Gesamtstromstärke entgegenwirken würden. Somit lassen sich funktionell zwei<br />
unterschiedliche Regulationsmechanismen des Kreislaufs voneinander abgrenzen, nämlich<br />
erstens lokale Regulationsmechanismen, die im Dienste einer adäquaten<br />
Gewebsdurchblutung stehen und zweitens überregionale bzw. zentrale Mechanismen, die im<br />
Dienste der Aufrechterhaltung eines adäquaten Perfusionsdrucks und des Gesamtkreislaufs<br />
stehen. Wird etwa durch einen maximalen lokalen Bedarf in mehreren Organen (z.B. Haut<br />
und Muskel bei körperlichen Anstrengung in großer Hitze) das Herz und seine Pumpleistung<br />
(Gesamtstromstärke) überfordert, so muß die Anstrengung beendet werden (Erschöpfung)<br />
bzw. die zentralen Mechanismen sind nicht in der Lage, einen Perfusionsdruck<br />
aufrecht<strong>zu</strong>erhalten und es kommt <strong>zu</strong>m Versagen der Kreislaufregulation<br />
('Kreislaufversagen'). In der vorliegenden Arbeit werden die lokalen<br />
Regulationsmechanismen, die in den Arterien und Arteriolen innerhalb des Organs ablaufen,<br />
untersucht.<br />
1.1 Durchblutung und Kreislaufregulation<br />
Analog <strong>zu</strong>m Ohmschen Gesetz ist die Durchblutung eines Organs proportional <strong>zu</strong>r<br />
Druckdifferenz zwischen arterieller und venöser Seite sowie umgekehrt proportional <strong>zu</strong>m<br />
Strömungswiderstand. Der Strömungswiderstand ist wiederum proportional <strong>zu</strong>r Gefäßlänge<br />
und <strong>zu</strong>r Viskosität, aber umgekehrt proportional <strong>zu</strong>r 4. Potenz des Gefäßradius (Hagen-
EINLEITUNG 2<br />
Poiseuille). Druck und Gefäßradius sind also die bei der Regulation variierbaren Größen. Da<br />
sich der Blutdruck bei dynamischer Belastung jedoch nicht wesentlich ändert, ist die<br />
Veränderung des Widerstands die bedeutende Regulationsgröße. Der größte Widerstand ist<br />
wegen ihres Durchmessers in den kleinen Arteriolen der Mikrozirkulation lokalisiert. Da der<br />
Radius den Widerstand mit der 4. Potenz bestimmt, führen bereits kleine Änderungen ihres<br />
Gefäßdurchmessers <strong>zu</strong> großen Änderungen des Widerstands und der Durchblutung. Die<br />
bedarfsorientierte, lokale Durchblutung des Organs wird also über Durchmesseränderungen<br />
der Arteriolen geregelt. In einem arbeitenden Skelettmuskel kann die Perfusion auf das<br />
zwanzigfache des Ruhewertes ansteigen. Die Vorausset<strong>zu</strong>ng für diese Zunahme ist die<br />
Fähigkeit der Gefäße <strong>zu</strong>r Erweiterung (Dilatation). Somit müssen die Arterien und Arteriolen<br />
im Ruhe<strong>zu</strong>stand ausreichend tonisiert sein, um sich bei Bedarf erweitern <strong>zu</strong> können. Dieser<br />
Kontraktions<strong>zu</strong>stand wird hauptsächlich bedingt durch den im Gefäß herrschenden Druck<br />
(s.u.). Zwar führt die lokale Dilatation von Arteriolen im stoffwechselaktiven Gebiet <strong>zu</strong> einer<br />
Durchblutungssteigerung, ist jedoch nicht ausreichend, um eine maximale Perfusion eines<br />
Organs <strong>zu</strong> erreichen. Der Gefäßwiderstand muß auch im weiter stromaufwärts gelegenen<br />
arteriolären Netzwerk sinken, so dass die maximale Steigerung des Blutflusses innerhalb<br />
des Gewebes erreicht wird. Erst diese koordinierte Dilatation von peripheren und proximalen<br />
Arteriolen sowie <strong>zu</strong>führenden Arterien erzeugt eine bis <strong>zu</strong> zwanzigfache Steigerung, wie sie<br />
im Skeletmuskel beobachtet werden kann (1-3). Die Mechanismen, welche einer<br />
Koordination des Gefäßverhaltens im Netzwerk <strong>zu</strong>grunde liegen, sind Gegenstand dieser<br />
Arbeit.<br />
Die zentrale, überregionale Kreislaufregulation bedient sich humoraler und nervaler<br />
Mechanismen, um einen ausreichenden Blutdruck aufrecht<strong>zu</strong>erhalten. Die im Hirnstamm<br />
gelegenen Kreislaufzentren erhalten Informationen über den aktuellen Druck über<br />
Afferenzen. Als Efferenz dient das vegetative Nervensystem und humorale Faktoren, welche<br />
Herz und Blutgefäße, aber auch die Niere, beeinflußen. Die wichtigsten gefäßwirksamen<br />
Effektoren dieses Systems sind das Noradrenalin als Überträgerstoff des Sympathikus,<br />
welches über den α-Rezeptor eine Konstriktion vermittelt, die Katecholamine aus dem<br />
Nebennierenmark (v.a. das Adrenalin) und als humoraler Faktor das Angiotensin II, welches<br />
durch das endotheliale Angiotensin-konvertierende Enzym (ACE) aus Angiotensin I gebildet<br />
wird. Letzteres ensteht aus dem Angiotensinogen, das durch Renin umgesetzt wird. Diese<br />
Effektoren der zentralen Regulation wirken <strong>zu</strong>meist vasokonstriktorisch und können so den<br />
peripheren Widerstand und damit den Blutdruck erhöhen. Bei Änderungen der lokalen<br />
Durchblutung kann durch diese vasokonstriktorischen Mechanismen der Gefäßwiderstand in<br />
anderen Regionen erhöht und so der Blutdruck im Sinne einer reflexartigen Rückkopplung<br />
konstant gehalten werden. Die Beeinflußung des Herzens und seiner Pumpleistung ist
EINLEITUNG 3<br />
ebenfalls von wesentlicher Bedeutung, soll aber hier nicht weiter dargestellt werden.<br />
1.2 Aufbau der Arteriolen<br />
Die Mikrozirkulation setzt sich aus Arteriolen, Kapillaren, Venolen sowie den Lymphgefäßen<br />
<strong>zu</strong>sammen. Die Gefäße werden nach ihrer Funktion und ihrem Durchmesser in Arteriolen (8<br />
- 100 µm), Kapillaren (4 - 8 µm) und Venolen (8 - 50 µm) eingeteilt. In dieser Arbeit wurden<br />
als Effektoren der Widerstandsregulation Arteriolen mit einem Durchmesser von 10 - 70 µm<br />
untersucht. Die innerste Schicht der Arteriolen wird durch die Tunica intima gebildet, die aus<br />
Endothel und Subendothel besteht, und durch die Membrana elastica interna von der<br />
glattmuskulären Zellschicht (Tunica media) getrennt wird. Die Tunica adventitia stellt die<br />
äußerste Gefäßschicht dar, besteht aus Bindegewebe und ist v.a. in größeren Gefäßen<br />
vorhanden.<br />
1.2.1 Endothelzellen<br />
Das Endothel ist eine einfache Lage langgestreckter, flacher Zellen, die parallel <strong>zu</strong>r<br />
Längsachse des Gefäßes ausgerichtet sind und die Innenseite aller Gefäße auskleiden.<br />
Diese Endothelzellen haben eine Länge von 80 - 150 µm und eine Breite von ca. 7 µm (4).<br />
Durch seine Lokalisation zwischen den glatten Muskelzellen und dem zirkulierenden Blut<br />
kommt dem Endothel eine besondere regulatorische Bedeutung <strong>zu</strong>. Das Endothel ist eine<br />
semipermeable Barriere, welche den Transfer kleiner und großer Moleküle reguliert.<br />
Endothelzellen üben sowohl metabolische als auch synthetische Funktionen aus und<br />
beeinflussen Durchblutung, Entzündung, Gerinnung und Angiogenese in entscheidender<br />
Weise. Einerseits setzen sie im Blut befindliche Proteine <strong>zu</strong> aktiven humoralen Substanzen<br />
oder Enzymen um, oder sie deaktivieren solche Stoffe. Andererseits bilden sie multiple<br />
Faktoren, setzen diese frei oder exprimieren sie als Rezeptoren oder Enzyme auf ihrer<br />
Oberfläche. So werden Thrombozyten und Leukozyten in ihrer Funktion moduliert und vor<br />
allem die glatten Muskelzellen in ihrem Kontraktions<strong>zu</strong>stand beeinflußt, wodurch das<br />
Endothel einen entscheidenden Einfluß bei der lokalen Durchblutungsregulation ausübt (5-<br />
9).<br />
1.2.2 Glatte Muskelzellen<br />
Die Gefäßmuskelzellen umgeben als 80 - 150 µm lange, ca. 8 µm breite, zirkulär verlaufende<br />
Zellen das Endothel. Im Gegensatz <strong>zu</strong> Arterien, in denen die Media aus mehreren Schichten<br />
glatter Muskelzellen besteht, findet sich in Arteriolen teilweise nur eine Schicht. Der
EINLEITUNG 4<br />
Kontraktions<strong>zu</strong>stand von glatten Muskelzellen wird über die zytoplasmatische<br />
Calciumkonzentration sowie über die Calciumsensitivität der kontraktilen Filamente reguliert<br />
(10). Calcium bindet konzentrationsabhängig an Calmodulin und dieser Komplex aktiviert<br />
dann die Myosinleichtketten-Kinase. Die Kinase phosphoryliert Myosin, wodurch das unter<br />
ATP Verbrauch ablaufende Übereinandergleiten der Myosin- und Aktinfilamente und somit<br />
die Kontraktion der Zellen ermöglicht wird. Eine Absenkung des zytosolischen<br />
Calciumspiegels durch die Wiederaufnahme von Calcium in das endoplasmatische<br />
Retikulum durch eine Ca 2+ ATPase (SERCA) oder durch den aktiven Transport in den<br />
Extrazellulärraum führt <strong>zu</strong>r Dissoziation des Calcium-Calmodulin-Komplexes und der<br />
Deaktivierung der Myosinleichtketten-Kinase, so dass die Aktivität der Myosinphosphatase<br />
im Vordergrund steht, Myosin vermehrt dephosphoryliert wird und eine Relaxation erfolgt<br />
(11). Hierbei steht die Calciumkonzentration im Vordergrund, während die Regulation der<br />
Aktivität der Myosinphosphatase calciumunabhängig über eine Phosphorylierung erfolgt (12,<br />
13). Die Aktivierung der Myosinphosphatase führt dann <strong>zu</strong> vermehrter Dephosphorylierung<br />
des Myosins und somit <strong>zu</strong> einer verringerten Effektivität der Myosinkinase und erniedrigten<br />
Sensitivität des kontraktilen Apparates für Calcium. Während die Regulation der Aktivität der<br />
Myosinphosphatase Gegenstand aktueller Untersuchungen ist (14), ist schon relativ lang<br />
bekannt, dass die intrazelluläre Calciumkonzentration rezeptorvermittelt durch verschiedene<br />
Agonisten oder auch direkt durch physikalische Stimuli erhöht werden kann. Die Quelle des<br />
Calciums sind hierbei die internen Speicher und/oder der Extrazellulärraum.<br />
1.3 Potential vaskulärer Zellen<br />
Das elektrische Potential ist in vielen Zellen ein wichtiges Signal, welches der<br />
Informationsübertragung dient oder <strong>zu</strong> einer Änderung der Zellfunktion führt. Beide<br />
Funktionen nutzen auch vaskuläre Zellen. Das Ruhemembranpotential ist die<br />
Potentialdifferenz zwischen Innen- und Außenseite einer Zelle im Ruhe<strong>zu</strong>stand. Die Na + -K + -<br />
ATPase und sekundär aktive Transporte erzeugen chemische Gradienten zwischen Intraund<br />
Extrazellulärraum, die <strong>zu</strong> einem Ionenstrom und somit auch <strong>zu</strong>r Ladungsverschiebung<br />
führen. Die hierbei aufgebaute Spannung über die Membran wirkt dem<br />
Konzentrationsgradienten entgegen, so dass sich ein elektrochemisches Gleichgewicht<br />
einstellt. Die elektrische Spannung, die den Konzentrationsgradienten kompensiert, ist das<br />
Gleichgewichtspotential für das entsprechende Ion. Vorausset<strong>zu</strong>ng für die Einstellung des<br />
jeweiligen Potentials ist die selektive Permeabilität der Membran für dieses Ion. Die<br />
Membranpermeabilität für Ionen wird von spezifischen Ionenkanälen gewährleistet, da die
EINLEITUNG 5<br />
Lipidmembran für Ionen praktisch undurchlässig ist. Das Ruhemembranpotential hängt von<br />
den Gleichgewichtspotentialen der Ionen ab, die im Ruhe<strong>zu</strong>stand die Membran durchdringen<br />
können, wobei die Permeabilität für die verschiedenen Ionen ins Verhältnis gesetzt werden<br />
muss. Gleichgewichtspotentiale, die von den chemischen Gradienten abhängen und in<br />
glatten Muskelzellen bestimmt wurden, betragen für K + -84, Cl - -31, Na + +58 und Ca 2+<br />
+150 mV (15). Unter Ruhebedingungen ist die Offenwahrscheinlichkeit von Kaliumkanälen<br />
am höchsten und damit die Leitfähigkeit der Membran für K + am größten, weshalb das<br />
Ruhemembranpotential in vaskulären Zellen maßgeblich durch das<br />
Kaliumgleichgewichtspotential beeinflußt wird. In vitro wurden Ruhemembranpotentiale von<br />
-40 bis -55 mV gemessen (15-17). Da das Ruhemembranpotential somit positiver als das<br />
Kaliumgleichgewichtspotential ist, müssen andere Ionen beteiligt sein. Im glatten Muskel wird<br />
vor allem auch durch eine hohe Chlorid-Leitfähigkeit eine Verschiebung des Potentials <strong>zu</strong><br />
positiveren Werten verursacht (15). Dieses relativ hohe Potential hat <strong>zu</strong>r Folge, dass die<br />
Erhöhung der Leitfähigkeit für K + durch die Zunahme der Offenwahrscheinlichkeit der K + -<br />
Kanäle <strong>zu</strong> einer Negativierung des Potentials (Hyperpolarisation) führt (18). Das<br />
Membranpotential kann also durch die Aktivierung oder Deaktivierung von Ionenkanälen <strong>zu</strong><br />
negativeren oder positiveren Werten verschoben werden.<br />
Durch die Änderung des Membranpotentials steuert die Aktivität der Ionenkanälen eine<br />
Vielzahl von zellulären Prozessen. Neben dem direkten Effekt der Ionenkanäle wird das<br />
Membranpotential auch sekundär durch die nachfolgende spannungsgesteuerte Aktivierung<br />
weiterer Ionenkanäle verändert. Wichtige spannungsgesteuerte Ionenkanäle sind bestimmte<br />
K + -Kanäle, die nachstehend erläutert werden, sowie spannungsgesteuerte Ca 2+ -Kanäle, die<br />
im glatten Gefäßmuskel <strong>zu</strong> finden sind. Die Aktivierung dieser Kanäle in der<br />
Plasmamembran führt <strong>zu</strong> einer Erhöhung der zytoplasmatischen Calciumkonzentration in<br />
glatten Muskelzellen (19-21). In glatten Muskelzellen bestimmt die intrazelluläre<br />
Calciumkonzentration den Kontraktions<strong>zu</strong>stand der glatten Gefäßmuskulatur, so dass das<br />
Membranpotential eine wesentliche Determinante des Gefäßtonus ist (22, 23).<br />
1.4 K + -Kanäle in vaskulären Zellen<br />
Ionenkanäle ermöglichen den Transfer von Ionen über die Lipidmembran. Die<br />
Durchlässigkeit der Kanäle ist <strong>zu</strong>meist spezifisch für bestimmte Ionen, kann aber auch<br />
unspezifisch sein, wie es bespielsweise bei einigen Kationenkanälen der Fall ist. Die<br />
transmembranären Domänen des Kanals bilden eine wässrige Pore. Eine Kanalaktivierung
EINLEITUNG 6<br />
führt <strong>zu</strong> einer Konformationsänderung, durch die ein Tormechanismus geöffnet wird und die<br />
Pore <strong>zu</strong>gänglich wird. Die hohe Selektivität von Kaliumkanälen beruht auf einem<br />
Selektivitätsfilter, indem innerhalb der Pore Bindungsstellen präsentiert werden, welche die<br />
Hydrathülle der Kaliumionen nachahmen und die Hydratisierungsenergie nach Eintritt des<br />
Ions in die Pore konservieren können. Das Kaliumion diffundiert unter Verlust seiner<br />
Hydrathülle in den Porenkanal, während Natriumionen ausgeschlossen werden, da der<br />
energieaufwändige Vorgang der Dehydratisierung nicht stattfinden kann (24).<br />
In vaskulären Zellen werden unterschiedliche Kaliumkanäle exprimiert. Alle bekannten<br />
Kaliumkanäle gehören <strong>zu</strong> einer großen Proteinfamilie, deren Unterfamilien und Subtypen<br />
sich durch die Mechanismen der Kanalaktivierung unterscheiden. Sowohl in Endothelzellen<br />
als auch in glatten Muskelzellen konnten spannungsabhängige Kaliumkanäle (K V ), einwärts<br />
gleichrichtende Kaliumkanäle (K IR ), ATP sensitive Kaliumkanäle (K ATP ) und<br />
calciumabhängige Kaliumkanäle (K Ca ) lokalisiert werden (18). Innerhalb dieser Gruppe<br />
werden wiederum verschiedene Subtypen aufgrund ihrer Leitfähigkeit in BK Ca (große<br />
Leitfähigkeit), IK Ca (mittlere Leitfähigkeit) und SK Ca (kleine Leitfähigkeit) unterschieden (15).<br />
Die Beteiligung dieser unterschiedlichen Kanäle bei der Regulation des Gefäßtonus kann<br />
durch den Einsatz spezifischer Blocker untersucht werden. Eine Übersicht über die<br />
wichtigsten vaskulären Kaliumkanäle ist in Tabelle 1.1 dargestellt.<br />
1.4.1 Calciumabhängige Kaliumkanäle (K Ca )<br />
BK Ca sind aus einer porenbildenden α- und einer regulatorischen β-Untereinheit aufgebaut.<br />
Die Kanäle können durch einen Anstieg der Calciumkonzentration und spannungsabhängig<br />
durch eine Depolarisation aktiviert werden, wobei die β-Untereinheit überwiegend die<br />
Calciumsensitivität beeinflußt (25). Im glatten Muskel sind BK Ca -Kanäle wichtige<br />
Determinanten des Kontraktions<strong>zu</strong>standes. BK Ca -Kanäle sind funktionell mit<br />
spannungsabhängigen Calciumkanälen und der Calciumfreiset<strong>zu</strong>ng aus dem<br />
endoplasmatischen Retikulum gekoppelt. Eine Aktivierung von spannungsabhängigen<br />
Calciumkanälen führt <strong>zu</strong>r Depolarisation und <strong>zu</strong> lokalisierten Erhöhungen der Ca 2+<br />
Konzentration in einen Konzentrationsbereich (3 – 10 µmol/l), der BK Ca aktivieren kann (26,<br />
27). Diese kurzen lokalisierten Anstiege der Calciumkonzentration werden Ca 2+ -Sparks<br />
genannt und kommen durch die calciumabhängige Aktivierung von Ryanodin-Rezeptoren<br />
des endoplasmatischen Retikulums und eine Calciumfreiset<strong>zu</strong>ng <strong>zu</strong>stande (28). Beide<br />
Ereignisse, der Calciumeinstrom und die Calciumfreiset<strong>zu</strong>ng, bewirken eine Aktivierung der<br />
BK Ca (29, 30). Dies führt <strong>zu</strong> spontanen transienten Auswärtsströmen (STOCs, spontaneous<br />
transient outward currents) und damit <strong>zu</strong>r Hyperpolarisation von glatten Muskelzellen (31).
EINLEITUNG 7<br />
Tabelle 1.1: Kaliumkanäle in vaskulären Zellen:<br />
Die Tabelle gibt eine Übersicht über die wichtigsten Kaliumkanäle in vaskulären Zellen sowie deren<br />
Expressionsort (EC: Endothelzelle, SMC: glatte Muskelzelle), mögliche Mechanismen der Aktivierung,<br />
Kanalöffner und Kanalblocker. BK Ca : Calciumabhängiger Kaliumkanal großer Leitfähigkeit, IK Ca :<br />
Calciumabhängiger Kaliumkanal mittlerer Leitfähigkeit, SK Ca : Calciumabhängiger Kaliumkanal kleiner<br />
Leitfähigkeit, K IR : einwärts gleichrichtender Kaliumkanal, K V : spannungsabhängiger Kaliumkanal, K ATP :<br />
ATP abhängiger Kaliumkanal, PKA: Proteinkinase A, PKG: Proteinkinase G<br />
Kanal EC SMC Aktivierung Öffner Blocker<br />
BK Ca - + Depolarisation, Calcium, - Iberiotoxin<br />
NO, PKA, PKG<br />
Charybdotoxin<br />
IK Ca + - Calcium DCEBIO Charybdotoxin<br />
Tram 34<br />
SK Ca + - Calcium - UCL1684<br />
Apamin<br />
K IR + + Hyperpolarisation, Kalium - Barium<br />
K V + + Depolarisation, PKA - 4-Aminopyridin<br />
K ATP + + ATP↓, PKA, PKG Cromakalim Glibenclamid<br />
Hieraus ergibt sich eine Erniedrigung der Offenwahrscheinlichkeit von<br />
spannungsabhängigen Ca 2+ -Kanälen, Erniedrigung des intrazellulären Ca 2+ -Spiegels bei<br />
vorhandener Hintergrundaktivität der Ca 2+ -Pumpen und eine Relaxation (Abb. 1.1). BK Ca -<br />
Öffnung kann also als negativer Rückkopplungsmechanismus betrachtet werden, der die<br />
Aktivität von spannungsabhängigen Ca 2+ -Kanälen inhibiert und umso aktiver wird, je stärker<br />
der initiale Stimulus war. Bedingt durch die große Leitfähigkeit der Kanäle kann bereits die<br />
Aktivität von wenigen Kanälen einen großen Einfluß auf das Membranpotential ausüben (32).<br />
In Mäusen, die defizient für die β-Untereinheit des Kanals sind, war die funktionelle Kopplung<br />
von Calciumanstieg und Hyperpolarisation gestört und die Tiere wiesen eine arterielle<br />
Hypertonie auf (33). Die porenformende α-Untereinheit des Kanals könnte in diesen Tieren<br />
jedoch auch in Abwesenheit der regulatorischen Untereinheit durch eine Erhöhung der<br />
Calcium- und Spannungssensitivität durch Agonisten oder Phosphorylierung aktiviert<br />
werden. Die Entwicklung einer für die α-Untereinheit defizienten Maus (34) ermöglichte<br />
deshalb die Untersuchung vaskulärer Funktionen in kompletter Abwesenheit des Kanals. Die<br />
vaskuläre Funktion in der Mikrozirkulation dieser Tiere wurde in dieser Arbeit untersucht.<br />
Desweiteren kann die Rolle dieser Kanäle durch die spezifische Blockade mit dem<br />
Skorpiongift Iberiotoxin untersucht werden (35).
EINLEITUNG 8<br />
Ca 2+<br />
K +<br />
K +<br />
K + K +<br />
K + offene K+ Kanäle<br />
geschlossene K+ Kanäle<br />
K +<br />
-<br />
Hyperpolarisation<br />
Depolarisation<br />
+<br />
Vasodilatation<br />
Vasokonstriktion<br />
K +<br />
Abb. 1.1: Negative Feedback-Regulation durch K V - und BK Ca -Kanälen in glatten Muskelzellen<br />
Die Aktivierung von spannungsabhängigen Ca 2+ -Kanälen führt <strong>zu</strong> einer Erhöhung der zytosolischen<br />
Calciumkonzentration, Depolarisation und Vasokonstriktion. K V werden durch Depolarisation aktiviert<br />
und BK Ca -Kanäle sowohl durch eine Depolarisation als auch durch den Anstieg der<br />
Calciumkonzentration. Die Kanalaktivierung führt <strong>zu</strong>m Kaliumausstrom und dadurch <strong>zu</strong>r<br />
Hyperpolarisation. Hierdurch werden die spannungsabhängigen Calciumkanäle wiederum<br />
geschlossen und ein weiterer Anstieg der zytosolische Calciumkonzentration begrenzt. Bei<br />
gleichzeitiger Hintergrundaktivität der Ca 2+ -Pumpen sinkt der Ca 2+ -Spiegel, was <strong>zu</strong> einer Relaxation<br />
der glatten Muskelzellen und Vasodilatation führt. Somit stellt diese Rückkopplung eine 'Servobremse'<br />
dar, die umso aktiver wird, je stärker der initiale Auslöser war.Modifiziert nach Jackson, 2000 (36)<br />
Die anderen Subtypen der K Ca -Kanäle (SK Ca und IK Ca ) werden überwiegend im Endothel<br />
exprimiert und zeichnen sich durch eine geringere Leitfähigkeit aus. Weiterhin sind diese<br />
Kanäle im Gegensatz <strong>zu</strong> BK Ca nicht spannungsabhängig aktivierbar. Die Calciumsensitivität<br />
der Kanäle wird wahrscheinlich durch gebundenes Calmodulin vermittelt (37, 38). Abhängig<br />
von der Spezies und dem untersuchten Gefäßbett mediieren IK Ca - und/oder SK Ca -Kanäle die<br />
Hyperpolarisation von Endothelzellen, die durch verschiedene Substanzen, wie ACh,<br />
Bradykinin und Histamin, ausgelöst werden. Somit haben diese Kanäle eine zentrale Rolle<br />
bei Dilatationen, die durch diese endothelabhängigen Stimuli induziert werden (18, 39, 40).<br />
Der SK Ca –Kanal kann durch das Bienentoxin Apamin sowie die Verbindung UCL1684<br />
selektiv gehemmt werden, während das Skorpiongift Charybdotoxin zwar IK Ca -, aber auch<br />
BK Ca - und K V -Kanäle hemmt (41, 42).
EINLEITUNG 9<br />
1.4.2 Einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (K IR )<br />
Einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (K IR ) können als Kaliumsensoren betrachtet werden,<br />
da ihre Aktivierung durch eine moderate Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration<br />
(6 - 15 mmol/l) erfolgen kann (15). Obwohl ihr Name einen Einwärtsstrom suggeriert, kommt<br />
es physiologisch immer <strong>zu</strong> einem Auswärtsstrom von Kaliumionen bei einer<br />
Kanalaktivierung, denn die Richtung des Kaliumstroms ist nicht vom Kanal, sondern nur vom<br />
aktuellen Membranpotential und dem chemischen Gradienten abhängig. Dem<strong>zu</strong>folge führt<br />
die Aktivierung <strong>zu</strong>r Hyperpolarisation und damit <strong>zu</strong>r Dilatation (43). Des weiteren werden die<br />
Kanäle auch spannungsabhängig durch eine Hyperpolarisation aktiviert und können somit<br />
eine initiale Hyperpolarisation, die durch die Öffnung anderer K + -Kanäle wie SK Ca und IK Ca<br />
induziert wurde, verstärken. Dieser Mechanismus kann für die Ausbreitung von<br />
Hyperpolarisationen entlang der Arteriole über Gap Junctions von Bedeutung sein (44) (s.u.).<br />
K IR -Kanäle können konzentrationsabhängig (≤ 100µmol/l) relativ selektiv durch Bariumionen<br />
gehemmt werden (32), allerdings hemmt extrazelluläres Barium bei höheren<br />
Konzentrationen auch andere Kanäle (45). Da die Hemmung von K IR -Kanälen in den meisten<br />
Präparationen eine Depolarisation und damit Konstriktion induziert, ist von einer<br />
kontinuierlichen Kanalaktivität unter Ruhebedingungen aus<strong>zu</strong>gehen (32).<br />
1.4.3 Spannungsgesteuerte Kaliumkanäle (K V )<br />
Sowohl in Endothelzellen als auch in glatten Muskelzellen werden verschiedene K V -Kanäle<br />
exprimiert. Diese Kanäle werden spannungsabhängig durch eine Depolarisation in einem<br />
Bereich von -55 bis -35mV aktiviert (32) und spielen vermutlich, gemeinsam mit BK Ca -<br />
Kanälen, bei der negativen Feedback-Regulation des Membranpotentials eine Rolle. Eine<br />
Aktivierung kann jedoch auch über den cAMP/PKA-Signaltransduktionsweg erfolgen, so<br />
dass diese Kanäle auch an Dilatationen, welche durch PGI 2 und Adenosin hervorgerufen<br />
werden, beteiligt sein können (18). Umgekehrt werden sie durch einen Anstieg der<br />
intrazellulären Calciumkonzentration und durch Proteinkinase-C-Aktivität gehemmt. Die<br />
pharmakologische Blockade von K V -Kanälen kann mit 4-Aminopyridin erreicht werden, wobei<br />
dieser Inhibitor möglicherweise auch K ATP -Kanäle beeinflußt und in hohen Konzentrationen<br />
auch K Ca -Kanäle hemmt (15). Die physiologische Bedeutung von K V -Kanälen in<br />
Endothelzellen ist noch nicht geklärt, jedoch führt die Hemmung von K V Kanälen in einigen<br />
Präparationen <strong>zu</strong> einer Konstriktion der Gefäße, was auf eine basale Aktivität hindeutet (32).<br />
1.4.4 ATP-sensitive Kaliumkanäle (K ATP )<br />
ATP-sensitive Kaliumkanäle (K ATP ) sind aus einer porenbildenden (K IR 6.1) und einer<br />
regulatorischen Untereinheit (Sulfonylharnstoffrezeptor) aufgebaut. Sie werden durch die<br />
Erhöhung der intrazellulären ATP-Konzentration inaktiviert, woraus diese Bezeichnung
EINLEITUNG 10<br />
resultiert. Eine wichtige Rolle spielen diese Kanäle in β-Zellen des Pankreas bei der<br />
Freiset<strong>zu</strong>ng von Insulin. Die Kanäle zeigen aufgrund eines <strong>zu</strong> ihrer Hemmung ausreichenden<br />
ATP-Spiegels in vaskulären Zellen unter basalen Bedingungen in den meisten Präparationen<br />
eine relativ geringe Aktivität (43). Die Kanalaktivität wird jedoch auch durch andere Stimuli<br />
moduliert. So inaktiviert die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration die Kanäle.<br />
Die Aktivierung erfolgt durch ein Absinken des ATP-Spiegels sowie durch die Proteinkinase<br />
A und G. Diese letzten beiden Wege spielen möglicherweise eine Rolle bei der<br />
Hyperpolarisation und Dilatation, die endogene Subsanzen wie Adenosin (46, 47), PGI 2 (47)<br />
und NO (15) durch die Aktivierung von K ATP -Kanälen induzieren können. Allerdings ist die<br />
Beteiligung dieser Kanäle bei der Dilatation durch diese Substanzen nur in wenigen<br />
Präparationen gezeigt. Die pharmakologische Blockade erfolgt mit Sulfonylharnstoffen (z.B.<br />
Glibenclamid). Die Kanalblockade hat jedoch in den meisten Präparationen keinen Einfluß<br />
auf das Membranpotential oder den Tonus (32). Für diesen Kanal stehen auch Substanzen<br />
<strong>zu</strong>r Verfügung (z.B. Cromakalim), die eine selektive Öffnung ermöglichen (43).<br />
1.4.5 Weitere Kalium- und Ionenkanäle<br />
Eine relativ neu entdeckte Gruppe von K + -Kanälen sind die K 2P -Kanäle. Die Expression von<br />
K 2P -Kanälen (two pore domain) konnte vor kurzem auch in glatten Muskelzellen gezeigt<br />
werden (48). Möglicherweise sind sie an der Regulation des vaskulären Tonus beteiligt (49).<br />
Die funktionelle Bedeutung der K 2P -Kanal-Aktivität ist Gegenstand aktueller Untersuchungen,<br />
jedoch aufgrund mangelnder pharmakologischer Blocker schwer <strong>zu</strong> fassen. Weiterhin<br />
werden in vaskulären Zellen Chlorid-Kanäle und eine Reihe von unspezifischen Kationen-<br />
Kanälen der TRP-Familie (transient reseptor potential) exprimiert. TRP-Kanäle sind an der<br />
IP 3 -vermittelten Erhöhung der zytosolischen Calciumkonzentration nach Stimulation mit<br />
Agonisten beteiligt (50). Spezifische Blocker dieser Kanäle stehen noch nicht <strong>zu</strong>r Verfügung.<br />
1.5 Gap Junctions<br />
Gap Junctions werden aus bis <strong>zu</strong> einigen hundert interzellulären Kanälen gebildet, welche<br />
aus Connexinen aufgebaut sind. Hierbei bilden jeweils zwei Halbkanäle in<br />
gegenüberliegenden Zellmembranen eine Pore. Ein Halbkanal ist wiederum aus sechs<br />
Connexinen <strong>zu</strong>sammengesetzt (51-53). Connexine werden in nahe<strong>zu</strong> allen Geweben<br />
exprimiert. In vaskulären Zellen wurden bisher vier verschiedene Connexine (Cx) identifiziert<br />
(Cx43, Cx40, Cx37 und Cx45), die nach ihrem Molekulargewicht benannt werden (54, 55).<br />
Hierbei wird Cx40 und Cx37 überwiegend in Endothelzellen exprimiert, wohingegen Cx43
EINLEITUNG 11<br />
und Cx45 vorwiegend in glatten Muskelzellen <strong>zu</strong> finden sind (56, 57). Die Kanäle sind relativ<br />
unspezifisch durchlässig für niedermolekulare Verbindungen bis <strong>zu</strong> 1 kDa und erlauben so<br />
die Passage von Ionen und second Messengern wie cAMP und IP 3 . Da durch die<br />
interzellulären Kanäle eine Verbindung mit niedrigem elektrischen Widerstand entsteht,<br />
können sich elektrische Impulse zwischen benachbarten Zellen elektrotonisch ausbreiten.<br />
Gap Junctions eröffnen somit einen Kommunikationskanal zwischen den Zellen und<br />
ermöglichen ein koordiniertes Verhalten innerhalb des Zellverbands. In der Gefäßwand<br />
existieren zwei potentielle Leitungswege, die glattmuskuläre Zellschicht und das Endothel,<br />
denn beide Zelltypen sind durch Gap Junctions miteinander gekoppelt (58, 59). Die<br />
homozelluläre Kopplung der Endothelzellen bzw. der glatten Muskelzellen wurde einerseits<br />
durch die Ausbreitung fluoreszierender Farbstoffe (58) und andererseits durch die<br />
Ausbreitung von lokal induzierten Membranpotentialänderungen aufgezeigt (59). Weiterhin<br />
spielt aber auch eine heterozelluläre Kopplung der beiden vaskulären Zelltypen über<br />
myoendotheliale Gap Junctions eine Rolle (60, 61). Endotheliale Projektionen treten durch<br />
Öffnungen in der Membrana elastica interna und bilden so die Plattform für myoendotheliale<br />
Zellkontakte (62). Eine bidirektionale Kommunikation elektrischer Signale wurde bisher aber<br />
nur in isolierten Gefäßen gezeigt (63, 64). Die Bedeutung des Endothels als direkte Quelle<br />
der Membranpotentialänderung des glatten Muskels nimmt jedoch mit <strong>zu</strong>nehmender Dicke<br />
der Media ab, da das Signal bei der Ausbreitung über mehrere Zellschichten schnell<br />
abgeschwächt wird (65).<br />
1.6 Lokale Regulation des Gefäßtonus<br />
Die Perfusion des Skelettmuskels schwankt in Abhängigkeit vom Bedarf erheblich und die<br />
maximale Durchblutung kann das 20-fache des Ruhewertes erreichen. Vorausset<strong>zu</strong>ng für<br />
die Dilatation der Arteriolen ist eine ausreichende Tonisierung der Gefäße im Ruhe<strong>zu</strong>stand,<br />
wobei sich der Gefäßtonus aus dem Verhältnis von Ruhe- und dem maximal dilatierten<br />
Durchmesser des Gefäßes ergibt. Dieser basale Tonus der Gefäße beruht hauptsächlich auf<br />
einem myogenen druckabhängigen Mechanismus, der vom kontinuierlich konstriktorischen<br />
Einfluß des Sympathikus unterstützt wird. Des weiteren führt die Freiset<strong>zu</strong>ng von<br />
vasoaktiven Substanzen aus dem Endothel <strong>zu</strong> einer Änderung des Gefäßtonus und auch<br />
metabolische Faktoren können hier einen Einfluß ausüben.<br />
1.6.1 Myogener Tonus<br />
Arteriolen weisen einen spontanen Kontraktions<strong>zu</strong>stand auf, der mit dem transmuralen Druck
EINLEITUNG 12<br />
<strong>zu</strong>nimmt. Bayliss postulierte erstmals 1902, dass der basale Gefäßtonus maßgeblich durch<br />
den intravaskulären Druck determiniert wird (66). Diese druckinduzierte Konstriktion wird<br />
durch glatte Muskelzellen erzeugt und ist in Abwesenheit von nervalen oder endokrinen<br />
Stimuli und nach Endothelentfernung an isolierten Gefäßen <strong>zu</strong> beobachten, weshalb sie als<br />
myogenen Ursprungs identifiziert wurde (67, 68). Allerdings wird die myogene Antwort durch<br />
nervale oder endokrine Stimuli modifiziert (69-72). Auch in vivo kann beobachtet werden,<br />
dass sich Änderungen des transmuralen Drucks auf den Kontraktions<strong>zu</strong>stand der Gefäße<br />
auswirken, denn eine Drucksenkung führt <strong>zu</strong>r Dilatation und eine Drucksteigerung <strong>zu</strong>r<br />
Konstriktion. Die druckinduzierte Dehnung der Zellen bewirkt eine Depolarisation der<br />
Zellmembran mit nachfolgender Aktivierung von L–Typ-spannungsabhängigen<br />
Calciumkanälen, einem Calcium-Einstrom, der Erhöhung der zytoplasmatischen<br />
Calciumkonzentration und einer calciumabhängigen Konstriktion. Der initial aktivierte<br />
Mechanosensor, der die Dehnung detektiert, ist jedoch weiterhin umstritten, könnte aber<br />
möglicherweise ein dehnungsabhängiger Kationenkanal sein (68). Die physiologische<br />
Bedeutung des myogenen Tonus einerseits ist die Erzeugung des basalen Tonus als<br />
Vorausset<strong>zu</strong>ng für die Auslösung einer Dilatation und der myogenen Antwort andererseits<br />
die Konstanthaltung des Blutflusses und des kapillaren Filtrationsdrucks im Sinne einer<br />
Autoregulation bei Änderungen des Blutdrucks.<br />
1.6.2 Endotheliale Autakoide<br />
Das Endothel spielt bei der lokalen Regulation der Durchblutung eine entscheidende Rolle.<br />
Durch die Freiset<strong>zu</strong>ng vasoaktiver Substanzen, die in unmittelbarer Umgebung ihrer Bildung<br />
aktiv werden und daher Autakoide genannt werden, wird eine dilatierende oder<br />
konstriktorische Wirkung erzielt. Die Freiset<strong>zu</strong>ng der Autakoide erfolgt kontinuierlich, kann<br />
jedoch durch mechanische Stimulation, wie die durch den Blutfluß auf das Endothel<br />
einwirkende Wandschubspannung oder durch pulsatile Druckschwankungen, sowie nach<br />
Stimulation durch Agonisten gesteigert werden. Zu den vasodilatatorisch wirksamen<br />
Autakoiden werden Stickstoffmonoxid (NO), Prostazyklin (PGI 2 ) und ein weiterer Faktor, der<br />
unabhängig von NO und Prostazyklin <strong>zu</strong>r Hyperpolarisation von glatten Muskelzellen führt<br />
und deshalb endothelabhängiger hyperpolarisierender Faktor (Endothelium-derived<br />
hyperpolarizing factor, EDHF) genannt wird, gerechnet. Im folgenden werden die auch in der<br />
Abbildung 1.2 dargestellten Mechanismen der endothelialen Dilatation weiter ausgeführt.<br />
1.6.2.1 Stickstoffmonoxid (NO)<br />
1980 entdeckten Furchgott und Zawadzki, dass Acetylcholin seine vasodilatatorische<br />
Wirkung nur an Gefäßen mit intaktem Endothel entfalten konnte (5). Sie postulierten daher
EINLEITUNG 13<br />
einen vom Endothel gebildeten Faktor (Endothelium-derived relaxing factor, EDRF). Diese<br />
initialen Beobachtungen wurden <strong>zu</strong>m Begriff der endothelabhängigen Dilatation. Wenig<br />
später wurde EDRF von zwei Arbeitsgruppen als Stickstoffmonoxid (NO) identifiziert (73, 74).<br />
NO wird aus der Aminosäure L-Arginin durch NO-Synthasen unter Bildung von L-Citrullin<br />
gebildet (75). Die Aktivität der endothelialen NO-Synthase (eNOS) wird durch den<br />
intrazellularen Ca 2+ -Spiegel kontrolliert. Eine durch Agonisten induzierte Erhöhung der<br />
intrazellularem Ca 2+ -Konzentration führt nach Bildung des Ca 2+ -Calmodulin-Komplexes <strong>zu</strong>r<br />
Konformationsänderung der eNOS, die das Enzym in seine aktive Form überführt (76).<br />
Neben der eNOS ist eine weitere Isoform der NO-Synthase im Endothel identifiziert worden,<br />
die durch Entzündungen auch im Endothel induziert wird (induzierbare NOS, iNOS) (76). Im<br />
Gegensatz da<strong>zu</strong> ist eNOS ein konstitutiv exprimiertes Enzym, dessen Expressionniveau aber<br />
Regulationen unterliegt (77, 78). NO diffundiert in die Gefäßmuskelzellen und aktiviert dort<br />
die lösliche Guanylatcyclase, welche aus Guanosintriphosphat das zyklisches<br />
Guanosinmonophosphat (cGMP) bildet. Die so ausgelöste Aktivierung der Proteinkinase G<br />
führt über unterschiedliche Mechanismen <strong>zu</strong>r Erniedrigung der zytosolischen<br />
Calciumkonzentration und damit <strong>zu</strong>r Relaxation (79). Zumindest partiell induziert NO in<br />
einigen Gefäßpräparationen jedoch auch eine Dilatation durch eine Hyperpolarisation glatter<br />
Muskelzellen. Verschiedene Kaliumkanäle (BK Ca, K IR , K ATP ) können durch NO aktiviert<br />
werden, wobei dies entweder direkt (80) oder indirekt über einen cGMP abhängigen Weg<br />
erfolgt (81, 82).<br />
1.6.2.2 Prostazyklin<br />
Die membranständige, calciumabhängige Phospholipase A 2 spaltet aus Phospholipiden der<br />
Zellmembran Arachidonsäure ab. Dies ist das Substrat der Cyclooxygenase, welche<br />
<strong>zu</strong>nächst Prostaglandin H bildet. Aus dieser Vorstufe entstehen eine Reihe weiterer<br />
Eicosanoide mit unterschiedlichen Eigenschaften, wobei der bedeutendste Vasodilatator das<br />
Prostazyklin (Prostaglandin I 2 , PGI 2 ) ist. Die Prostazyklin induzierte Dilatation wurde erstmals<br />
1976 beschrieben (83). PGI 2 führt rezeptorvermittelt <strong>zu</strong> einer Aktivierung der Adenylatcyclase<br />
und somit <strong>zu</strong> einem Anstieg der cAMP Spiegel im glatten Muskel, welches letztlich nach<br />
Aktivierung der Proteinkinase A ein Absinken der intrazellulären Calciumkonzentration und<br />
eine Relaxation <strong>zu</strong>r Folge hat (84). Allerdings kann die Erhöhung des cAMP Spiegels<br />
ebenfalls eine Aktivierung von K ATP -Kanälen oder BK Ca -Kanälen bewirken (38). So kann auch<br />
beim PGI 2 eine Hyperpolarisation der Zellen an der Relaxation beteiligt sein.
EINLEITUNG 14<br />
Ado<br />
ACh, Bk<br />
TRP K +<br />
K ATP BK Ca K ATP BK Ca<br />
P 1<br />
PLC IP 3<br />
Ca 2+<br />
[Ca 2+ ?<br />
↑]<br />
Ca 2+<br />
PLA 2<br />
?<br />
AA<br />
CYP 450 COX eNOS EDHF<br />
ER<br />
EC<br />
Ado<br />
EETs PGI 2 NO EDHF<br />
P 1<br />
AC GC<br />
SMC<br />
cAMP ↑ cGMP ↑<br />
M 3 ACh, B 2<br />
K + K + K +<br />
BK Ca<br />
K + K +<br />
K Ca<br />
HYPERPOLARISATION<br />
RELAXATION<br />
Abb. 1.2: Mechanismen von Agonist induzierten rezeptorvermittelten Hyperpolarisationen<br />
Verschiedene Agonisten können rezeptorvermittelt eine Hyperpolarisation glatter Muskelzellen<br />
induzieren. Dies kann auf endothelabhängigen oder endothelunabhängigen Mechanismen beruhen.<br />
ACh: Acetylcholin; Bk: Bradykinin; Ado: Adenosin; M 3 : muskarinischer ACh Rezeptor; B 2 :<br />
Bradykininrezeptor; P1: Purinerger-(Adenosin-)Rezeptor; PLC: Phospholipase C; IP 3 : Inositoltriphosphat;<br />
ER: Endoplasmatisches Retikulum; PLA 2 : Phospholipase A 2 ; AA: Arachidonsäure;<br />
CYP 450 : CytochromP 450 Monooxygenase; COX Cyclooxygenase; eNOS: endotheliale NO-Synthase;<br />
EDHF: endothelium derived hyperpolarizing factor; EET: Epoxyeicosatriensäure; PGI 2 : Prostazyklin;<br />
NO: Stickstoffmonoxid; AC: Adenylatcyclase; GC: Guanylatcyclase; cAMP: zyklisches<br />
Adenosinmonophosphat; cGMP: zyklisches Guanosinmonophosphat; K ATP : ATP abhängiger<br />
Kaliumkanal; K Ca : Calciumabhängiger Kaliumkanal BK Ca: Calciumabhängiger Kaliumkanal großer<br />
Leitfähigkeit; TRP: transient receptor potential, unspezifischer Ca 2+ -Kanal
EINLEITUNG 15<br />
1.6.2.3 EDHF<br />
Die Beobachtung, dass endothelabhängige Dilatationen auch nach effektiver Hemmung der<br />
NO- und Prostazyklinsynthese persistierten, führte <strong>zu</strong> dem Schluss, dass ein weiterer<br />
Mechanismus beteiligt sei (85, 86). Dieser dritte, endothelabhängige Mechanismus geht mit<br />
der Hyperpolarisation der glatten Muskelzellen einher und wurde <strong>zu</strong>nächst in Arterien vom<br />
Schwein, Meerschweinchen und Hund nach Stimulation mit ACh oder Bradykinin<br />
beschrieben (87, 88, 88). Die Dilatation wurde einem nicht identifizierten endothelialen<br />
Faktor, dem EDHF (endothelium-derived hyperpolarising factor) <strong>zu</strong>geschrieben (89). EDHF<br />
mediierte Dilatationen wurden an vielen Gefäßpräparationen in verschiedenen Spezies und<br />
auch an menschlichen Präparaten gezeigt. Die Identität des EDHF erwies sich jedoch als<br />
heterogen und es wurden unterschiedliche Substanzen als EDHF vorgeschlagen bzw.<br />
identifiziert. Das gemeinsame Merkmal von EDHF-vermittelten Dilatationen ist die<br />
Endothelabhängigkeit, die Unabhängigkeit von NO bzw. Prostazyklin sowie die begleitende<br />
Hyperpolarisation glatter Muskelzellen. EDHF-vermittelte Antworten werden jedoch nicht in<br />
allen Präparationen beobachtet und die Bedeutung des EDHF nimmt mit abnehmender<br />
Gefäßgröße <strong>zu</strong> (90).<br />
Die endothelabhängige Hyperpolarisation (EDH) glatter Muskelzellen beruht <strong>zu</strong>nächst auf<br />
der Agonist-induzierten Hyperpolarisation des Endothels. Die Aktivierung endothelialer<br />
calciumabhängiger Kalium-Kanäle (K Ca ) konnte als zentrales Ereignis der EDH identifiziert<br />
werden, da die Blockade calciumabhängiger Kaliumkanäle die Hyperpolarisation und damit<br />
Relaxation des glatten Muskels verhindert (91-93). Die nachfolgende Hyperpolarisation des<br />
glatten Muskels kann über die Aktivität eines diffusiblen Faktors (EDHF) vermittelt werden<br />
oder aber die Hyperpolarisation kann auch unabhängig von einem Faktor durch direkten<br />
Ladungstransfer über myoendotheliale Gap Junctions erfolgen. Die wichtigsten beteiligten<br />
Mechanismen werden im Folgenden näher erläutert und sind in der Abbildung 1.3<br />
<strong>zu</strong>sammengefasst.<br />
Kalium<br />
Die Öffnung endothelialer K Ca führt <strong>zu</strong> einem Efflux von Kaliumionen und damit <strong>zu</strong> erhöhten<br />
Kaliumkonzentrationen im interstitiellen Raum. Solche lokalisierten Erhöhungen der<br />
Kaliumkonzentration können eine Aktivierung von einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanälen<br />
(K IR ) sowie die Aktivierung der Na + /K + -ATPase auf glatten Muskelzellen <strong>zu</strong>r Folge haben.<br />
Beide Mechanismen führen <strong>zu</strong> einer Hyperpolarisation des glatten Muskels, die <strong>zu</strong>m einen<br />
auf dem Kaliumaustrom über die Öffnung von K IR -Kanälen, <strong>zu</strong>m anderen auf einer<br />
Aktivitätssteigerung der elektrogenen Na + /K + -ATPase basiert, welche 3 Na + im Austausch<br />
gegen 2 K + aus der Zelle transportiert. In einigen Präparationen (Arterien des
EINLEITUNG 16<br />
Mesenterialgebiets) konnte durch die Hemmung der Na + /K + -ATPase und des K IR gezeigt<br />
werden, dass Kaliumionen als EDHF <strong>zu</strong> identifizieren sind (94-96). Die Blockade von K IR mit<br />
Barium und der Na + /K + -ATPase mit Ouabain führte aber in vielen anderen Gefäßen nicht <strong>zu</strong><br />
einer Hemmung der EDHF-vermittelten Dilatation.<br />
Metabolite der Arachidonsäure<br />
Epoxyeicosatrieensäuren (EET), die von der Cytochrom P 450 -Monooxygenase gebildet<br />
werden, sind besonders in Gefäßen des Koronargebiets und in einigen Spezies auch des<br />
Skeletmuskels an endothelabhängigen Hyperpolarisationen beteiligt (97-100). EET können<br />
eine Hyperpolarisation durch die Aktivierung von BK Ca -Kanälen in glatten Muskelzellen<br />
induzieren, möglicherweise nach Bindung an einen spezifischen, membranständigen<br />
Rezeptor (101-103). Des weiteren können EET auch die endotheliale Hyperpolarisation<br />
durch eine Erhöhung der endothelialen Calciumkonzentration fördern und dies erhöht dann<br />
wiederum die Offenwahrscheinlichkeit von K Ca (104, 105). EET haben somit evtl. in einigen<br />
Gefäßen eine EDHF-Funktion, während sie in anderen Gebieten die Funktion eines<br />
interendothelialen Mediators und Verstärkers einnehmen oder aber auch bedeutungslos<br />
sind.<br />
Myoendotheliale Gap Junctions<br />
Die heterozelluläre Kopplung von Endothelzellen und glatten Muskelzellen über Gap<br />
Junctions könnte die direkte elektrische Kopplung dieser Zellen erlauben. Die endotheliale<br />
Hyperpolarisation würde sich so direkt auf den glatten Muskel ausbreiten. An isolierten<br />
Gefäßen konnte gezeigt werden, dass eine Hyperpolarisation, die entweder durch<br />
Stimulation mit ACh oder durch direkte Strominjektion induziert wurde, in Endothelzellen und<br />
glatten Muskelzellen simultan <strong>zu</strong> beobachten war. Dabei war der zeitliche Verlauf der<br />
Potentialänderung in beiden Zelltypen identisch (63, 106). Zusätzlich führte die Blockade von<br />
Gap Junctions in vitro <strong>zu</strong> einer Hemmung der glattmuskulären Hyperpolarisationen, ohne die<br />
endotheliale Hyperpolarisation <strong>zu</strong> beeinflussen (62, 107). Dennoch ist die Bedeutung dieses<br />
Mechanismus umstritten, und es werden Unterschiede zwischen in vitro und in vivo<br />
Präparationen sowie zwischen unterschiedlich großen Gefäßen in Be<strong>zu</strong>g auf die Relevanz<br />
der heterozellulären Kopplung diskutiert.
EINLEITUNG 17<br />
Agonist<br />
EC<br />
eNOS<br />
HYPERPOLARISATION<br />
Rezeptor<br />
+ +<br />
[Ca 2+ ↑]<br />
PLA 2<br />
Arachidonsäure ↑<br />
COX / LOX CYP 450 EPOX<br />
+<br />
SK Ca IK Ca<br />
PGs, LTs EET<br />
MEGJ<br />
Ouabain<br />
Apamin<br />
+<br />
[K + ] ↑<br />
+<br />
Chtx<br />
Ba 2+<br />
+<br />
Ibtx<br />
K IR<br />
3Na + 2K + BK Ca<br />
SMC<br />
HYPERPOLARISATION<br />
RELAXATION<br />
Abb. 1.3: Mechanismen der EDHF vermittelten Dilatation<br />
Unterschiedliche Mechanismen können <strong>zu</strong> einer EDHF vermittelten Dilatation führen, verschiedene<br />
diffusible Faktoren oder einfache Ladungsübertragung von Endothelzellen auf glatte Muskelzellen sind<br />
hierbei identifiziert worden. EDHF induzierte Dilatationen werden initial durch einen Agonist<br />
induzierten endothelialen Calciumanstieg ausgelöst. Dies führt <strong>zu</strong> einer Aktivierung der Phospholipase<br />
A 2 (PLA 2 ) und der Aktivierung von calciumabhängigen Kaliumkanälen von kleiner (SK Ca ) und mittlerer<br />
Leitfähigkeit (IK Ca ). Die endotheliale Hyperpolarisation könnte sich dann entweder passiv über<br />
myoendotheliale Gap Junctions (MEGJ) ausbreiten, oder der Kaliumausstrom könnte durch<br />
Aktivierung von Na + /K + ATPase und K IR -Kanälen <strong>zu</strong> einer glattmuskulären Hyperpolarisation führen.<br />
Weiterhin könnte die durch PLA 2 freigesetzte Arachidonsäure, die durch Cyclooxygenase (COX) und<br />
Lipoxygenase (LOX) <strong>zu</strong> Prostaglandinen und Leukotrienen umgesetzt wird, auch durch Cytochrom<br />
P 450 Monooxygenasen (CYP 450 ) in Epoxyeicosatriensäuren (EET) umgesetzt werden, die BK Ca -Kanäle<br />
auf glatten Muskelzellen aktivieren könnten. Chtx: Charybdotoxin, Ibtx: Iberiotoxin<br />
1.7 Koordination des Gefäßverhaltens: Aufsteigende Vasomotorantworten<br />
Arteriolen besitzen für die Regulation der Durchblutung besondere Bedeutung, da in diesem<br />
Gebiet 50-70% des gesamten Widerstands ruht. Daher werden diese Gefäße auch als<br />
Widerstandsgefäße bezeichnet. Da sich der Widerstand in einem Gefäßgebiet jedoch aus<br />
der Summe der hintereinander geschalteten Widerstände der arteriellen Gefäße ergibt, kann<br />
eine maximale Dilatation der distalen Widerstandsgefäße den Gesamtwiderstand nur partiell<br />
senken. Der flußlimitierende Widerstand verlagert sich in die weiter stromaufwärts gelegenen<br />
Regionen. Dies verdeutlicht den Stellenwert einer koordinierten Dilatation von Arteriolen und
EINLEITUNG 18<br />
stromaufwärtsgelegenen, <strong>zu</strong>führenden Gefäßen, denn nur nach Dilatation der<br />
vorangeschalteten Gefäße kann eine maximale Flußerhöhung erfolgen.<br />
Die Bedeutung dieser Koordination in vivo wird durch eine Reihe von Studien<br />
veranschaulicht. Experimentell kann die Fortleitung von Vasomotorantworten mittels<br />
Intravitalmikroskopie untersucht werden, indem Arteriolen durch eine streng lokalisierte<br />
Applikation von Agonisten über eine Mikropipette in unmittelbarer Nähe des Gefäßes oder<br />
durch Strominjektion in Gefäßzellen stimuliert werden. Die Gefäßantwort bleibt nicht auf den<br />
Ort der Stimulation beschränkt, sondern breitet sich rasch in beide Richtungen entlang des<br />
Gefäßes aus, wobei dies je nach Spezies und Agonist in Arteriolen mit ~30 µm Durchmesser<br />
über Entfernungen bis <strong>zu</strong> mehreren Millimetern erfolgen kann. Verschiedene Agonisten<br />
können solche sich ausbreitenden Gefäßantworten, die Konstriktionen oder Dilatationen sein<br />
können, auslösen. Allerdings induzieren nicht alle Agonisten eine Fortleitung und auch<br />
hierbei existieren Speziesunterschiede. Dennoch wurden fortgeleitete Dilatationen im<br />
Skelettmuskel von Hamstern und Mäusen (108-110) sowie in mesenterialen, cerebralen,<br />
renalen und koronaren Arteriolen beobachtet (44, 111).<br />
In den letzten Jahren wurde die flußinduzierte Dilatation in Arterien und Arteriolen als ein<br />
möglicher Mechanismus von aufsteigenden koordinierten Dilatationen identifiziert (112). Die<br />
Abhängigkeit der Gefäßwandbewegung von der Flußgeschwindigkeit wurde bereits 1921 von<br />
Thoma und 1932 von Schretzenmayr an der Femoralarterie beschrieben (113). Hierbei ist<br />
ein schubspannungsinduzierte endotheliale NO-Freiset<strong>zu</strong>ng entscheidend an der Dilatation<br />
beteiligt (114). Eine metabolisch induzierte distale Dilatation führt <strong>zu</strong> einer lokalen<br />
Widerstandssenkung und damit <strong>zu</strong> einer Flußsteigerung in stromaufwärtsgelegenen<br />
Gefäßabschnitten. Die so induzierte NO-Freiset<strong>zu</strong>ng und Dilatation könnte <strong>zu</strong>r Koordination<br />
des Gefäßverhaltens beitragen und ist auch in Arteriolen von Bedeutung (8). Die<br />
flußinduzierte Dilatation ist jedoch vergleichsweise langsam, die Dilatationen sind erst nach<br />
10 - 40 Sekunden <strong>zu</strong> beobachten (114, 115). Im Gegensatz da<strong>zu</strong> ist die Ausbreitung<br />
fortgeleiteter Dilatationen mit weniger als einer Sekunde nahe<strong>zu</strong> instantan und eine<br />
Zunahme der Wandschubspannung an entfernten Positionen nach lokaler Stimulation wurde<br />
nicht beobachtet (99, 116). Da die Arteriolen des Cremastermuskels von einem dichten<br />
Netzwerk perivaskulärer Nerven umgeben werden (109), könnte nervale Aktivität an der<br />
Koordination der Gefäßantwort beteiligt sein. Die Blockade schneller Natriumkanäle mit<br />
Tetrodotoxin zeigt jedoch, dass sowohl die Ausbreitung von lokal initiierten Konstriktionen als<br />
auch die Ausbreitung von Dilatationen nach lokaler Stimulation mit Acetylcholin hierdurch<br />
unbeeinflußt blieben (109, 116). Vor kurzem wurde jedoch postuliert, dass die Ausbreitung
EINLEITUNG 19<br />
von Dilatationen nach Acetylcholin durch tetrodotoxininsensitive sensorische Nervenfasern<br />
vermittelt werden könnte (117).<br />
Die Substanzen, die eine fortgeleitete Vasomotorantwort auslösen, haben gemeinsam, dass<br />
sie eine lokale Membranpotentialänderung in den vaskulären Zellen auslösen (58, 110, 118-<br />
120). Die schnelle Ausbreitung des Signals führte <strong>zu</strong> der Hypothese, dass den fortgeleiteten<br />
Antworten eine elektrotonische Ausbreitung einer lokal initiierten Änderung des<br />
Membranpotentials <strong>zu</strong>grunde liegt. Tatsächlich wurden Membranpotentialänderungen auch<br />
an entfernten Positionen beobachtet, bei Dilatationen eine vorangehende Hyperpolarisation,<br />
bei Konstriktionen eine Depolarisation (22, 120). Die molekulare Grundlage für die<br />
elektrotonische Ausbreitung bilden Gap Junctions und deren Blockade zeigte auch ihre<br />
Bedeutung bei fortgeleiteten Gefäßantworten und der Koordination des Gefäßverhaltens (58,<br />
121). Von den vaskulär exprimierten Connexinen ist das Cx40 von besonderer Bedeutung,<br />
da die Ausbreitung von lokal induzierten Dilatationen in Cx40-defizienten Mäusen<br />
abgeschwächt ist (110). Wie erwähnt, erstreckt sich die Ausbreitung von Gefäßantworten in<br />
vivo über sehr große Strecken und besonders Dilatationen überbrücken große Distanzen.<br />
Sie sind deutlich größer als bei passiver elektrotonische Signalausbreitung <strong>zu</strong> erwarten ist (3,<br />
122). Dies legt die Vermutung nahe, dass ein aktiver Mechanismus beteiligt ist, welcher das<br />
Signal entlang der Arteriole regeneriert (123). Zusammengefaßt zeigt sich, dass fortgeleitete<br />
Dilatationen von besonderer Bedeutung sein können, ihre Mechanismen aber noch<br />
unvollständig verstanden sind. In dieser Arbeit steht die Untersuchung von fortgeleiteten<br />
Dilatationen und ihrer Mechanismen im Vordergrund.<br />
1.8 Atherosklerose: Systemische endotheliale Dysfunktion<br />
Hypercholesterinämie gehört <strong>zu</strong> den Hauptrisikofaktoren, welche die Entwicklung von<br />
Atherosklerose und Herzinfarkt fördern. Physiologisches Ziel des endogenen<br />
Lipidstoffwechsels ist der Transport von Nahrungslipiden in die Leber und nachfolgender<br />
Versorgung der peripheren Gewebe mit Cholesterin und Lipiden. Cholesterin und<br />
Triacylglyceride werden im Körper mit Hilfe von Lipoproteinen transportiert. Die<br />
Proteinkomponenten dienen dabei der Solubilisierung der hydrophoben Lipide. Lipoproteine<br />
bestehen im Kern aus hydrophoben Lipiden, die von einer Hülle aus polaren Lipiden und<br />
Apoproteinen umgeben werden. Die Lipoproteine werden nach ihrer Dichte in<br />
Chylomikronen, very low density lipoproteins (VLDL), intermediate density lipoproteins (IDL),<br />
low density lipoproteins (LDL) und high density lipoproteins (HDL) klassifiziert. Besonders die
EINLEITUNG 20<br />
LDL-Fraktion ist als proatherogen ein<strong>zu</strong>stufen.<br />
Mäuse sind sehr resistent gegen atherosklerotische Veränderungen, da übliche<br />
Cholesterinspiegel von 2.5 mmol/l überwiegend in der antiatherogenen HDL-Fraktion<br />
vorliegen. Die Verabreichung einer cholesterin- und fettreichen Diät führt in Mäusen jedoch<br />
<strong>zu</strong> einer Verdoppelung bis Verdreifachung der Cholesterinspiegel, wobei die größte Menge<br />
dann nicht in der HDL-Fraktion <strong>zu</strong> finden ist. Einige Mausarten (z.B. C57BL/6) entwickeln<br />
nach mehreren Monaten Diät Läsionen vom fatty-streak-Typ, während andere Mausarten<br />
keine Läsionen entwickeln. Auf der Suche nach in vivo Modellen, die den Krankheitsverlauf<br />
im Menschen widerspiegeln, gelang es 1992 zwei Arbeitsgruppen eine ApoE-defiziente<br />
Maus (ApoE-/-) <strong>zu</strong> generieren (124, 125). ApoE wird überwiegend in der Leber synthetisiert<br />
und ist ein Oberflächenbestandteil von Lipoproteinen. Als Ligand von Lipoproteinrezeptoren<br />
ist ApoE für die Erkennung und Clearance von VLDL-und Chylomikronen-Remnants durch<br />
Lipoprotein-Rezeptoren von großer Bedeutung, weshalb ApoE-/- Tiere eine verzögerte<br />
Lipoprotein-Clearance und erhöhte Plasmacholesterinspiegel haben. Durch die gezielte<br />
Ausschaltung des LDL-Rezeptors wurde ein weiteres proatherogenes Modell in der Maus<br />
erzeugt (126). Der LDL-Rezeptor ist auf Zelloberflächen lokalisiert und erkennt<br />
Apolipoprotein B auf LDL und ApoE auf IDL. LDL-Rezeptor-defiziente Mäuse (LDLR-/-)<br />
haben infolgedessen hohe Plasmaspiegel dieser proatherogenen Lipide (126). Generell<br />
entwickeln ApoE-defiziente Mäuse gravierendere Läsionen als LDLR-/- Tiere. Die<br />
<strong>zu</strong>sätzliche Verabreichung einer cholesterin- und fettreichen Diät führt in beiden Modellen <strong>zu</strong><br />
einer weiteren Erhöhung der Cholesterinspiegel und einer Progresssion der<br />
atherosklerotischen Vorgänge.<br />
Die endotheliale Dysfunktion ist ein Begriff, der am ehesten eine systemische Erkrankung<br />
widerspiegelt, und sich durch verminderte endothelabhängige Gefäßdilatationen bis hin <strong>zu</strong>m<br />
Auftreten einer paradoxen Vasokonstriktion auszeichnet. Dies beruht vermutlich auf einer<br />
verminderten Bioverfügbarkeit von dilatierenden Autakoiden und gleichzeitig gesteigerter<br />
Bildung von Vasokonstriktoren (127). Die Auswirkung von Hypercholesterinämie auf die<br />
endotheliale Funktion in großen Leitungsgefäßen ist mittlerweile gut untersucht. NOmediierte,<br />
endothelabhängige Dilatationen sind in großen Leitungsgefäßen beeinträchtigt,<br />
wie es in der Aorta (128-131), in Carotiden (132, 133) und Mesenterialarterien (134) gezeigt<br />
wurde. Die Beteiligung der unterschiedlichen endothelialen Mediatoren (NO, Prostazyklin<br />
und EDHF) bei der endothelabhängigen Dilatation ist jedoch in Abhängigkeit von Spezies,<br />
Gefäßbett und vor allem Gefäßgröße unterschiedlich gewichtet. So ist EDHF der<br />
Hauptmediator von ACh-induzierten Dilatationen in der Mikrozirkulation der Maus,<br />
wohingegen die ACh-Dilatation in großen Arterien der Maus überwiegend von einer NO-
EINLEITUNG 21<br />
Freiset<strong>zu</strong>ng abhängt (135). Der Effekt von Hypercholesterinämie auf endothelabhängige<br />
Dilatationen in der Mikrozirkulation ist jedoch kaum untersucht, bedingt auch durch den<br />
Befund, dass in Widerstandsgefäßen keine atherosklerotische Veränderungen in der<br />
Gefäßwand beobachtet werden (136). Interessanterweise beeinflussen aber Änderungen<br />
des Cholesteringehalts der Plasmamembran die Offenwahrscheinlichkeit von<br />
calciumabhängigen Kaliumkanälen (K Ca ) (80). In Hasen führte Hypercholesterinämie <strong>zu</strong> einer<br />
Verschiebung der Bedeutung von Autakoiden bei Dilatationen von NO <strong>zu</strong> NO-unabhängigen<br />
Mechanismen. Die NO-unabhängigen Dilatationen wurden durch Aktivierung von K Ca<br />
vermittelt und die Gefäßantwort war in hypercholesterinämischen Tieren trotz einer<br />
vergleichsweise erhöhten Bedeutung dieses EDHF-Mechanismus abgeschwächt (137). Auch<br />
in menschlichen Arterien waren EDHF-Dilatationen bei Hypercholesterinämie deutlich<br />
reduziert (138). Somit kann Hypercholesterinämie sowohl durch Beeinträchtigung von NOabhängigen<br />
als auch von NO-unabhängigen Mechanismen <strong>zu</strong>r endothelialen Dysfunktion in<br />
großen Arterien führen.<br />
Hypercholesterinämie beeinflußt nicht nur die Aktivität, sondern auch die Expression von<br />
Proteinen in der Gefäßwand. Interessanterweise ist auch die Expression von Cx40 und Cx37<br />
in Aorten von ApoE-defizienten Mäusen reduziert (139). Dies war nicht nur in Gebieten mit<br />
atherosklerotischen Veränderungen der Fall, sondern auch in morphologisch normal<br />
erscheinenden Arealen. Weiterhin ist die Connexinexpression in atherosklerotischen Plaques<br />
in chrakteristischer Weise verändert (140). Veränderungen in der Connexinexpression<br />
könnten eine alterierte Zellkopplung nach sich ziehen, was sich in verminderten fortgeleiteten<br />
Vasomotorantworten widerspiegeln kann. Daher sollte der Effekt der Hypercholesterinämie<br />
auf fortgeleitete Vasomotorantworten in dieser Arbeit untersucht werden.
EINLEITUNG 22<br />
1.9 Ziel der Arbeit<br />
In dieser Arbeit sollte die Rolle verschiedener K + -Kanäle, die die Dilatation in der<br />
Mikrozirkulation nach Stimulation mit endogenen Substanzen (ACh, Adenosin, NO)<br />
induzieren und <strong>zu</strong> einer koordinierten Gefäßerweiterung führen, in Arteriolen des<br />
Skeletmuskels der Maus charakterisiert werden.<br />
→ Die Aktivierung calciumabhängiger Kaliumkanäle (K Ca ) ist ein Schlüsselereigneis bei der<br />
Auslösung EDHF-vermittelter Dilatationen. Die spezifische Funktion der<br />
unterschiedlichen Subtypen (BK Ca , IK Ca , SK Ca ) bei der Dilatation und deren Ausbreitung<br />
sollte in IK Ca - und BK Ca -defizienten Mäusen sowie nach pharmakologischer Blockade des<br />
SK Ca untersucht werden.<br />
→ Die Fortleitung lokal ausgelöster Dilatationen beruht auf der elektrotonischen<br />
Ausbreitung von Hyperpolarisationen, die sich über mehrere Millimeter entlang des<br />
Gefäßes erstrecken. Die Auslöser solcher Antworten, die Mechanismen, die eine<br />
Regeneration des Signals ermöglichen können, und die beteiligten Leitungswege sollten<br />
unter Zuhilfenahme unterschiedlicher Kanalblocker und Mäusen mit spezifischen<br />
Gendeletionen untersucht werden.<br />
→ Endothelabhängige Dilatationen sind in großen Leitungsgefäßen durch Atherosklerose<br />
und Hypercholesterinämie beeinträchtigt. Der Effekt einer Hypercholesterinämie auf<br />
endotheliale und fortgeleitete Dilatationen sollte daher in der Mikrozirkulation in zwei<br />
hyperlipidämischen Mausmodellen (LDL-R-, ApoE-defiziente Tiere) untersucht werden.
MATERIAL UND METHODEN 24<br />
2 Material und Methoden<br />
2.1 Material<br />
2.1.1 Versuchstiere<br />
Die Versuche wurden an männlichen Mäusen aus sieben verschiedenen Mausstämmen<br />
durchgeführt. Die untersuchten Versuchstiere hatten ein Gewicht zwischen 15 und 52 g und<br />
waren 3 - 17 Monate alt . Die Tiere wurden in der Tierhaltung des Institutes für Physiologie<br />
der LMU München bzw. der <strong>Universität</strong> <strong>zu</strong> <strong>Lübeck</strong> gehalten und <strong>zu</strong>m Teil gezüchtet. Maximal<br />
sechs Mäuse waren in einem Typ 2 Makrolonkäfigen untergebracht. Die Tiere hatten freien<br />
Zugang <strong>zu</strong> Standardfutter (bzw. speziellem Diätfutter) und Wasser. Alle Versuche erfüllten<br />
die Richtlinien des Deutschen Tierschutzgesetzes und wurden durch die Regierung<br />
Oberbayern (209.1/211-2531-12/99) bzw. das Ministerium für Umwelt, Naturschutz und<br />
Landwirtschaft des Landes Schleswig-Holstein genehmigt (21/1g/03).<br />
Insgesamt wurden 229 Versuchstiere untersucht. Hiervon waren aus der eigenen Zucht<br />
C57BL/6 (123 Tiere), ApoE-defiziente Mäuse in einem C57BL/6 Hintergrund (25 Tiere), LDL-<br />
Rezeptor-defiziente Mäuse in einem C57BL/6 Hintergrund (29 Tiere), Cx40-defiziente Tiere<br />
in einem C57BL/6 Hintergrund (11 Tiere). Des weiteren wurden BK Ca -Kanal defiziente Mäuse<br />
in einem SV129/C57BL/6 Mischhintergrund (9 BK+/+, 9BK-/- Tiere) (Kooperation mit Prof.<br />
Ruth, Uni Tübingen), IK Ca -Kanal defiziente Mäuse in einem 129ola/C57BL/6 Hintergrund (8<br />
IK+/+, 8 IK-/-Tiere) (Kooperation mit PD Dr. Köhler, Uni Marburg) sowie ApoE-defiziente<br />
Mäuse mit einer <strong>zu</strong>sätzlichen endothelspezifischen Connexin40 Defizienz in einem C57BL/6<br />
Hintergrund (2 Cx40+/+, 5 Cx40-/- TIE-2 CreTiere) (freundlicherweise von Dr. Kwak, Division<br />
of Cardiology, University of Geneve, <strong>zu</strong>r Verfügung gestellt) untersucht.<br />
2.1.2 Cholesterin- und fettreiche Diät<br />
Bei einem Teil der untersuchten transgenen hypercholesterinämischen Mäuse wurde die<br />
bestehende Hypercholesterinämie durch Fütterung einer cholesterin- und fettreichen Diät<br />
weiter akzentuiert. Dieses Futter hatte einen Cholesteringehalt von 0.5% und einen Fettanteil<br />
von 40%. Die Tiere waren einer Langzeitdiät ausgesetzt. LDL-Rezeptor defiziente Mäuse<br />
bekamen das Diätfutter über einen Zeitraum von 6 Monaten, ApoE defiziente Mäuse über<br />
einen Zeitraum von 4 Monaten vor Durchführung der Versuche. Alle Tiere hatten freien<br />
Zugang <strong>zu</strong> Futter und Wasser, der Diätgruppe stand während dieses Zeitraums<br />
ausschließlich das Diätfutter <strong>zu</strong>r Verfügung.
MATERIAL UND METHODEN 25<br />
2.2 Methoden<br />
2.2.1 Narkose<br />
Die Narkose erfolgte initial durch eine intraperitoneale Gabe von Medetomidin (1 mg / kg)<br />
Midazolam (10 mg / kg) und Fentanyl (0.1 mg / kg). Nach Einleitung der Narkose erreichten<br />
die Tiere nach ca. 3 Minuten das Toleranzstadium. Die Narkose wurde nach Präparation<br />
durch eine kontinuierliche Applikation während des gesamten Versuchs aufrechterhalten.<br />
Hier<strong>zu</strong> wurde die Narkose mit einem Perfusor (Secura FT, B.Braun, Melsungen) über einen<br />
Katheter in der V. jugularis infundiert (Medetomidin 0.01 mg / h; Midazolam 0.1 mg / h;<br />
Fentanyl 0.001 mg / h). Während des Versuchs wurde die Narkosetiefe durch mechanische<br />
Stimulation (Zwicken oder Pusten) überprüft und die Dosis gegebenenfalls angepasst. Die<br />
Versuche <strong>zu</strong>r Magnetofektion (s.u.) erforderten eine Antagonisierung der Narkose nach Ende<br />
der Transfektion. Dies erfolgte durch subkutane Applikation der Antagonisten Naloxon (1.2<br />
mg / kg), Flumazenil (0.5 mg / kg) und Atipamezol (2.5 mg / kg). Die Tiere erwachten ca. 3<br />
Minuten nach Applikation. Nach Beendigung des Versuchs wurden alle Mäuse durch Gabe<br />
einer i.v. Bolusinjektion von 0.3 ml Pentobarbital (16 g / 100 ml) euthanasiert.<br />
2.2.2 Versuchsvorbereitung und Präparation<br />
2.2.2.1 Tracheotomie und Katheterisierung<br />
Zu Beginn des Versuchs wurden die Mäuse im Hals- und Genitalbereich mit einem<br />
handelsüblichen Langhaarschneider (Braun, Kronberg) rasiert. Anschließend wurden sie auf<br />
eine Präparierplattform aus Styropor überführt und an den Vorderpfoten fixiert. Nach Setzen<br />
eines Hautschnitts wurde die Trachea freipräpariert und mit zwei Baumwollfäden<br />
aufgespannt. Nach Inzision der Trachea zwischen zwei Knorpelsegmenten wurde ein<br />
Polyethylenschlauch (PE 50) als Tubus eingeführt und mit den beiden Baumwollfäden fixiert.<br />
Der Tubus erleichterte hierbei die Spontanatmung der Maus. Nach Lagerung der Maus auf<br />
das Mikroskop wurde die Maus mit einem Respirator (Hugo-Basile, Italien) beatmet. Die<br />
mechanische Ventilation erfolgte mit einer Frequenz von 150 / min und einem Druck von 2<br />
cm H 2 O.<br />
Zur Kanülierung der Halsvene wurde über den für die Tracheotomie gesetzten Hautschnitt<br />
die rechte V. jugularis freipräpariert und mit zwei Baumwollfäden gespannt. Nach Inzision<br />
wurde das Gefäß mit einem Polyethylen Katheter (PE 10) kanüliert. Die korrekte Lage des<br />
Katheters wurde durch Aspiration von Blut überprüft und die Narkose im weiteren<br />
Versuchsverlauf über diesen Zugang infundiert.
MATERIAL UND METHODEN 26<br />
Speicheldrüsen<br />
V. jugularis<br />
V. jugularis<br />
V. jugularis<br />
Trachea<br />
V. jugularis<br />
Abb.: 2.1: Tracheotomie und Katheterisierung.<br />
Nach Setzen eines Hautschnittes werden <strong>zu</strong>r Tracheotomie und Kanülierung der Halsvene die<br />
Trachea sowie die rechte V. jugularis freipräpariert.<br />
2.2.2.2 Cremasterpräparation<br />
Die Cremasterpräparation wurde nach einer erstmals 1973 von Baez beschriebenen<br />
Methode (141) mit nur minimalen Modifikationen durchgeführt. Hier<strong>zu</strong> wurde die Maus in<br />
Rückenlage auf einen für die Intravitalmikroskopie entworfenen Plexiglastisch mit<br />
Heizvorrichtung gelagert. Das rechte Skrotum wurde dann am unteren Pol durch einen<br />
kleinen Hautschnitt geöffnet und der Schnitt median Richtung kranial bis in die Inguinalregion<br />
verlängert. Der untere Pol des nun freiliegenden M. cremaster wurde an einem Faden fixiert<br />
und der Skelettmuskel senkrecht <strong>zu</strong>r Maus aufgespannt. Nunmehr wurde vorsichtig das<br />
umliegende Bindegewebe entfernt. Der freiliegende M. cremaster wurde nun horizontal<br />
zwischen den Hinterbeinen der Maus über ein im Plexiglastisch eingelassenes Deckglas<br />
gezogen und mit dem Faden in einem das Deckglas umgebenden Silikonring befestigt. Über<br />
einen kleinen Schnitt in der Spitze des Skelettmuskels wurde der M. cremaster eröffnet,<br />
indem der Schnitt median nach kranial verlängert wurde. Der Skelettmuskel wurde nun mit<br />
insgesamt 6 Fäden so aufgespannt, dass er flach über dem Deckglas <strong>zu</strong> liegen kam (Abb.<br />
2.2). Die Faszie, die Nebenhoden, Hoden und Skelettmuskel verbindet, wurde durchtrennt<br />
und Hoden und Nebenhoden daraufhin in die Bauchhöhle <strong>zu</strong>rückgeschoben. Der geöffnete<br />
Skelettmuskel wurde vom ersten Schnitt an über die gesamte Versuchsdauer mit<br />
temperierter (34 °C) Krebslösung betropft.
MATERIAL UND METHODEN 27<br />
Abb. 2: Schematische Darstellung eines präparierten Cremastermuskels<br />
In den Präparationen, in denen Membranpotentialmessungen durchgeführt werden sollten,<br />
wurden <strong>zu</strong>sätzliche präparatorische Schritte notwendig. Um störende Atembewegungen des<br />
Tieres auf das Präparat <strong>zu</strong> verhindern, wurden für die Durchführung von<br />
Membranpotentialmessungen zwei weitere Fäden jeweils rechts und links an der Basis des<br />
Skelettmuskels gesetzt und im Silikonring befestigt. Durch Anlegen von Zugspannung konnte<br />
das Präparat von der Atmungsbewegung isoliert werden. Anschließend wurden mit einem<br />
Operationsmikroskop (Wild Heerbrugg, Schweiz) 2 - 3 für die Membranpotentialmessung<br />
geeignete Arteriolen ausgesucht und über eine Strecke von etwa 2 mm vorsichtig von dem<br />
sie umgebenden Skelettmuskel freipräpariert.<br />
A<br />
B<br />
Abb. 2.3: Durchlichtaufnahme des Cremastermuskels und einer freipräparierten Arteriole<br />
A: Abbildung des M.cremaster, der Gefäßbaum ist deutlich sichtbar. B: Skelettmuskel mit einer<br />
freipräparierten Arteriole, wie sie <strong>zu</strong>r Membranpotentialmessung verwendet wurde.
MATERIAL UND METHODEN 28<br />
2.2.3 Intravitalmikroskopie: Versuchsaufbau und Durchführung<br />
Wie auch während der Präparation des Skelettmuskels wurde der M. cremaster während der<br />
gesamten Versuchsdauer mit temperierter Krebslösung superfundiert (Abb. 2.4). Das<br />
Superfusionssystem bestand aus einem Vorratsbehältnis, das nur über ein dünnes Glasrohr<br />
mit der Raumluft verbunden war. Über eine Öffnung im unteren Teil des Vorratsgefäßes<br />
konnte die Superfusionslösung in ein zweites kleineres, doppelwandiges und beheiztes<br />
Vorratsgefäß abfließen. Beim Abfließen der Lösung wurde die Flüssigkeit im Glasrohr durch<br />
Luft ersetzt, das Ende der Luftsäule am Boden des großen Vorratsgefäßes bestimmte somit<br />
den Flüssigkeitsstand im kleinen Vorratsgefäß. Über einen Drehregler konnte der<br />
Flüssigkeitsfluß aus dem kleinen Gefäß auf eine konstante Geschwindigkeit von 8ml/min<br />
eingestellt werden. Die Superfusionslösung wurde im kleineren Vorratsgefäß über eine Fritte<br />
mit einem Gasgemisch (95% N 2 , 5% CO 2 ) begast und der pH-Wert der Lösung aufgrund der<br />
gewählten Hydrogencarbonatkonzentration in der Lösung somit auf 7.4 eingestellt. Die<br />
Superfusionslösung wurde <strong>zu</strong>sätzlich über einen nachgeschalteten beheizten<br />
Schlangenkühler erwärmt, so dass die Salzlösung beim Erreichen des Skelettmuskels eine<br />
Temperatur von 34°C besaß. Die doppelwandigen Glasgeräte wurden über ein<br />
temperierbares zirkulierendes Wasserbad beheizt.<br />
Abb. 2.4: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
MATERIAL UND METHODEN 29<br />
Die Mikrozirkulation wurde mit einem Mikroskop (Nikon Eclipse E600, Nikon, Tokyo, Japan)<br />
unter 200-facher Vergrößerung betrachtet (CFI Planfluor ELWD Objektiv: 20x / 0.45). Die<br />
Bilder wurden mit einer CCD Kamera aufgenommen und <strong>zu</strong>r späteren Auswertung auf<br />
Videoband (S-VHS, Sony) aufgezeichnet.<br />
Für die Membranpotentialversuche wurde ein Mikroskop mit einer 'fixed stage' Konstruktion<br />
als Arbeitsbasis verwendet (Axioskop 2 FS, Zeiss, Jena). Durch die feste Tischposition sind<br />
das Versuchstier auf der Mikroskopierbühne sowie die Mikromanipulatoren fixiert mit dem<br />
ruhenden Tisch verbunden, während das Mikroskop auf einer beweglichen Bühne steht. Dies<br />
ist für die Durchführung der empfindlichen Membranpotentialmessung von besonderem<br />
Vorteil, da dadurch Erschütterungen der Mikroelektrode minimiert werden können. Die<br />
freipräparierten Arteriolen wurden mit 400-facher Vergrößerung betrachtet<br />
(Wasserimmersionsobjektiv: 40x / 0.8). Für die Fluoreszenzmikroskopie wurde eine<br />
Quecksilberlampe verwendet (HBO, 100W, Osram, München). Der verwendete Filtersatz<br />
(No 9, Zeiss, Jena) eignete sich <strong>zu</strong>r Visualisierung der mit Fluorescein beladenen Zellen<br />
(Anregung: 495nm, Emission: 517nm). Die Fluoreszenz wurde mit einer ICCD Kamera<br />
(C8484, Hamamatsu, Herrsching) aufgenommen und die Bilder digital gespeichert.<br />
2.2.4 Globale und lokale Stimulation mit Agonisten<br />
Durch eine peristaltische Pumpe konnten der Superfusion vasoaktive Substanzen<br />
<strong>zu</strong>gemischt werden. Hierdurch wurde eine globale Stimulation des Skelettmuskels erreicht.<br />
Die Substanzen wurden 100-fach konzentriert eingesetzt und der Superfusion mit einer<br />
Geschwindigkeit von 0.08 ml/min <strong>zu</strong>gesetzt, um die gewünschten Endkonzentrationen <strong>zu</strong><br />
erreichen. Im weiteren Text werden die Endkonzentrationen in der Superfusionslösung<br />
angegeben. Die lokalisierte Stimulation von Arteriolen konnte durch gezielte Applikation<br />
eines Agonisten über eine Mikropipette erfolgen. Hier<strong>zu</strong> wurde eine mit dem Agonisten<br />
befüllte Mikropipette mit Hilfe eines Mikromanipulators in unmittelbarer Nähe des Gefäßes im<br />
Skelettmuskel platziert und der Agonist durch einen kurzen Druckpuls (50 - 500 ms, 140<br />
kPa) appliziert. Eine erfolgreiche Applikation konnte durch ein kurzes Auseinanderweichen<br />
des Muskelgewebes an der Applikationsstelle erkannt werden.<br />
2.2.5 Membranpotentialmessung<br />
Bei der intrazellulären Membranpotentialmessung wird das Membranpotential direkt<br />
gemessen, das heißt die von der Zelle gesteuerten Spannungsänderungen werden<br />
abgeleitet. Zur Messung einer Potentialdifferenz über eine Zellmembran sind zwei<br />
Elektroden erforderlich. Eine indifferente Elektrode im extrazellulären Raum sowie eine<br />
intrazelluläre Elektrode, innerhalb der Zelle. Um eine Zelle intrazellulär ableiten <strong>zu</strong> können,
MATERIAL UND METHODEN 30<br />
muß <strong>zu</strong>nächst ein elektrischer Zugang erreicht werden. Dies erfolgte mit einer scharfen<br />
Elektrode. Es handelt sich hierbei um eine mit einer Salzlösung gefüllte Elektrode, in die ein<br />
chlorierter Silberdraht ragt, der den elektrischen Zugang darstellt. Die Elektrode zeichnet sich<br />
durch einen sehr kleinen Spitzendurchmesser (< 1 µm) und einen sehr großen Widerstand<br />
(> 50 MΩ) aus. Mit einer scharfen Elektrode ist es möglich, die Zellmembran direkt <strong>zu</strong><br />
penetrieren, das heißt allein durch mechanische Belastung die Zellmembran <strong>zu</strong><br />
durchdringen. Die visuelle Kontrolle bringt bei Verwendung von scharfen Elektroden nur<br />
geringe Vorteile mit sich, da die Spitzen von scharfen Elektroden selbst unter guten<br />
Lichtmikroskopen nur schwer auflösbar sind. Die Penetration einer vaskulären Zelle mit einer<br />
scharfen Elektrode ist somit visuell kaum steuerbar.<br />
Um den Messplatz weitestgehend von seiner Umgebung <strong>zu</strong> isolieren, wurden verschiedene<br />
Vorkehrungen getroffen. Da bei der intrazellulären Membranpotentialmessung bereits<br />
geringe Erschütterungen eine erfolgreiche Zellpenetration verhindern können, wurde eine<br />
mechanische Abschirmung des Messplatzes von seiner Umgebung vorgenommen. Um die<br />
Übertragung von mechanischen Schwingungen der Umgebung <strong>zu</strong> minimieren wurde das<br />
Mikroskop auf einen Mikroskopiertisch mit einer schweren Marmorplatte gestellt, der durch<br />
Luftpolster vom Boden entkoppelt war. Die Membranpotentialmessung wird bereits durch<br />
geringe elektromagnetische Strahlung, die beispielsweise durch das Niederspannungsnetz<br />
erzeugt wird, gestört. Das Mikroskop mit Messelektrode wurde deshalb in einen nur nach<br />
vorne geöffneten Faraday-Käfig gestellt, der <strong>zu</strong>sätzlich mit einer Erdung verbunden war.<br />
Sämtliche elektrischen Geräte, wie Computer, Verstärker und Oszilloskop wurden außerhalb<br />
des Faraday-Käfigs platziert. Die Geräte selbst waren mit ihren Metallgehäusen am Faraday-<br />
Käfig angeschlossen um eine gemeinsane Erdung <strong>zu</strong> erreichen.<br />
Zur Membranpotentialmessung wurde eine Silber/Silberchloridelektrode verwendet. Der<br />
Silberdraht der Messelektrode wurde vor jedem Versuch, durch einstündige Reaktion des<br />
Silberdrahtes der Elektrode mit Natrium Hypochlorit, neu chloriert. Die Spitze der<br />
Mikroelektrode wurde mit 10 % Carboxyfluorescein-Farbstoff (in 3 mol/l KCl gelöst) beladen.<br />
Die Mikroelektrode war in einem Mikroelektrodenhalter befestigt, dessen Silberdraht in die<br />
3M KCl-Lösung der Elektrode eintauchte und das Signal an den Vorverstärker weiterleitete.<br />
Die Referenzelektrode wurde neben dem M. cremaster in der Superfusionslösung<br />
positioniert. Die verwendete Technik der intrazellulären Ableitung wird auch als "voltage<br />
follower" bezeichnet. Hierbei wird die Mikroelektrode mit einem Verstärker verbunden,<br />
dessen Widerstand um ein vielfaches größer ist als der Widerstand der Mikropipette. Der<br />
Ausgang des Verstärkers folgt dem Potential an der Spitze der Mikroelektrode. Der Strom<br />
durch die Mikroelektrode wird hierbei auf null geklemmt. Das Membranpotential wurde mit
MATERIAL UND METHODEN 31<br />
einem Potentialverstärker (SEC 1L, NPI Advanced Electronics, Tamm) gemessen, an dem<br />
das Membranpotential auch digital abgelesen werden konnte. Zur Orientierung im Gewebe<br />
wurde ein repetitiver Stromimpuls erzeugt. Da mit der Elektrode das gesamte Potential und<br />
nicht nur das Membranpotential gemessen wird, ist es schwierig den generierten<br />
wechselnden Spannungsabfall über die Elektrode von dem auf Zellpenetration beruhenden<br />
Spannungsabfall <strong>zu</strong> unterscheiden. Daher werden spezielle Kompensationskreisläufe des<br />
Verstärkers verwendet, die das durch den Verstärker erzeugte Signal subtrahieren. Der<br />
generierte Stomimpuls interferiert somit nicht mit der Messung. Durch einen Impulsgenerator<br />
(Anapulse Stimulator Model 302-T, W-P Instruments, New Haven, USA) wurde ein<br />
rechteckförmiges Signal mit einer Dauer von 25 ms, einer Verzögerung von 10 ms und<br />
einem Intervall von 65 ms erzeugt. Der Impulsgeber steuerte den Verstärker der einen<br />
Stromimpuls von 0.3 nA erzeugte, der dann entlang der Meßelektrode floß. Der<br />
Spannungsabfall, der sich aus dem Produkt von Stromfluß durch die Pipette und<br />
Pipettenwiderstand ergibt, wurde mit einem externen Oszilloskop dargestellt und konnte nun<br />
durch manuellen Abgleich über einen Drehregler am Verstärker aus der Aufzeichnung<br />
eliminiert werden. Gleichzeitig wurde über eine Anzeige am Drehregler der<br />
Pipettenwiderstand abgelesen.<br />
Die Membranpotentialmessung wird durch die Kapazität am Verstärkereingang<br />
beeinträchtigt. Deshalb mußte die Kapazität ebenfalls kompensiert werden. Die Kapazität hat<br />
verschieden Ursachen, z.B. die Kapazität über die Glaswand des Teils der Mikroelektrode<br />
der in die Superfusionslösung taucht, die Streukapazität des übrigen Teils der Mikropipette<br />
oder die Streukapazität des Mikroelektodenhalters. Der Kapazitätsausgleich erfolgte mit<br />
einem speziellen Kreislauf <strong>zu</strong>r Neutralisation der Kapazität und konnte am Verstärker<br />
eingestellt werden. Eine Überkompensation der Kapazität wurde in manchen Fällen <strong>zu</strong>r<br />
Penetration von Zellen genutzt. Der Kontakt der Elektrodenspitze mit einer Zellmembran<br />
konnte durch die auftretende Widerstandsänderung erkannt werden, die als<br />
Spannungsänderung auf dem Oszilloskop beobachtet werden konnte. Die Zellpenetration<br />
erfolgte dann mit Hilfe eines Piezo-Steppers durch schnelle kurze (1 µm Schritte)<br />
Vorwärtsbewegung der Mikropipette. Um die Zellpenetration <strong>zu</strong> erleichtern wurde zeitweise<br />
ein kurzer hochfrequent oszillierender Stromstoß über die Mikroelektrode appliziert. Das<br />
Membranpotential wurde dann über einen Analog-Digitalwandler (Elektronikwerkstatt der<br />
LMU München) mit Open Source Software (XmAD) auf der Festplatte eines Rechners mit<br />
einer Frequenz von 500 Hz aufgezeichnet. Vor der Messung erfolgte eine Kalibrierung des<br />
Messprogramms.
MATERIAL UND METHODEN 32<br />
2.2.6 Immunfärbung<br />
Die Immunhistochemie ist eine sensitive Methode <strong>zu</strong>m Nachweis von Proteinen. Die<br />
Methode wurde 1940 von dem Mikrobiologen Albert Coons eingeführt (142). Die indirekte<br />
Immunfluoreszenz ermöglicht es mit Hilfe von spezifischen, gegen das Zielprotein<br />
gerichteten primären Antikörpern Proteine <strong>zu</strong> lokalisieren. Die Visualisierung erfolgt dann<br />
entweder durch Bindung von sekundären Antikörpern, die mit einem Fluorophor gekoppelt<br />
sind, oder durch Bindung von Enzymen an den sekundären Antikörper, die in Gegenwart der<br />
entsprechenden Substrate <strong>zu</strong>r Bildung eines gefärbten Niederschlags führen. Nach<br />
Anregung der Farbstoffe mit bestimmten Wellenlängen emittieren Chromophore Licht im<br />
sichtbaren Bereich. Das heute meist durchgeführte Verfahren ist die indirekte<br />
Doppelimmunfluoreszenz. Mit Hilfe dieser Technik ist es möglich, eine Kolokalisation von<br />
zwei verschiedenen Proteinen nach<strong>zu</strong>weisen.<br />
2.2.6.1 Immunfluoreszenz<br />
Um Connexin40 in den Arteriolen des M. cremasters nach<strong>zu</strong>weisen, wurden<br />
Immunfluoreszenzversuche am ganzen Präparat durchgeführt. Hier<strong>zu</strong> wurde <strong>zu</strong>nächst der<br />
Cremaster wie beschrieben präpariert und mit Hilfe eines Mikroskops mit 20-facher<br />
Vergrößerung eine Karte des Gefäßbaumes gezeichnet, um später Gefäße anhand ihrer<br />
Lokalisation als Venolen oder Arteriolen identifizieren <strong>zu</strong> können. Der Cremaster wurde<br />
anschließend an der Basis abgeschnitten und die Spannfäden aus dem Silikonring gelöst.<br />
Nach Kennzeichnung der ursprünglichen Ausrichtung, durch spezifische Verknotung der<br />
Fäden wurde der Cremaster in 4.5 % Formaldehyd für 10 min fixiert. Die für die<br />
Immunfärbung verwendeten thorakalen Aorten wurden den Tieren entnommen und in einen<br />
mit Sylgard bedeckten Well überführt. Die Gefäße wurden dann vom umgebenden<br />
periadventitiellem Fett befreit. Nach Fixierung eines Endes mit einer Präpariernadeln wurde<br />
die Aorta aufgeschnitten und mit der luminalen Seite nach oben mit weiteren Nadeln<br />
aufgespannt. Die weiteren Arbeitsschritte erfolgten ohne die Position des Gefäßes <strong>zu</strong><br />
verändern. Die Fixierung erfolgte 3 Minuten in 4.5 % Formaldehyd. Die Vorhöfe wurden<br />
ebenfalls sofort nach Organentnahme fixiert (10 min, 4.5 % Formaldehyd).<br />
Anschließend wurden alle Präparate in Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) überführt,<br />
ausgiebig gewaschen und danach 2 Stunden in einem Blockier-Puffer aus 2 % BSA und<br />
0.2 % Triton-X in PBS bei Raumtemperatur blockiert, um unspezifische Bindungsstellen<br />
ab<strong>zu</strong>sättigen und so das Hintergrundsignal bei der folgenden Immunodetektion <strong>zu</strong><br />
minimieren. Die Präparate wurden anschließend mit dem Antikörper gegen Connexin40 (1:<br />
400) (Rabbit Anti-Maus Cx40, Chemicon, Temucula, USA) in Blockier-Puffer über Nacht bei<br />
4 °C inkubiert. Nach wiederholtem Waschen mit 1 % Triton-X in PBS und abschließendem
MATERIAL UND METHODEN 33<br />
Waschen in PBS wurde mit dem sekundären Antikörper (1:800 in PBS, Alexa Fluor 594 Goat<br />
Anti-Rabbit, Molecular Probes, Leiden, NL) 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Zugabe<br />
des Kernfarbstoffs Hoechst (1:10000) <strong>zu</strong>r Inkubationslösung erfolgte die Färbung der<br />
Zellkerne ebenfalls in diesem Schritt. Abschließend wurde nochmals intensiv mit PBS<br />
gewaschen. Der M. cremaster wurde dann entsprechend seiner ursprünglichen Ausrichtung<br />
auf einem Objektträger aufgespannt. Die Aorten wurden vorsichtig auf den Objekträger<br />
überführt, so dass sie mit der luminalen Seite nach oben lagen. Die Vorhöfe wurden<br />
ebenfalls auf Objektträger überführt. Alle Präparate wurden in Mowiol (Calbiochem,<br />
Darmstadt) eingebettet und über Nacht getrocknet.<br />
Die Präparate wurden bis <strong>zu</strong>r mikroskopischen Betrachtung lichtgeschützt gelagert. Die<br />
Betrachtung der Zielstrukturen erfolgte mit einem Axioplan 2 Imaging Fluoreszenzmikroskop<br />
der Firma Zeiss (Jena) in 200-facher (Objektiv: plan-Neofluar 20x / 0.5), 400-facher<br />
(Objektiv: plan-Neofluar 40x / 0.75) und 630-facher (Ölimmersionsobjektiv: plan-Apochromat<br />
63x / 1.40) Vergrößerung. Das Mikroskop ist mit mehreren Filtersätzen ausgestattet, welche<br />
unter anderem eine Visualisierung von Alexa Fluor 594 ermöglichen. Diese Verbindung<br />
emittiert Licht nach Anregung mit einer Wellenlänge von 617 nm (rot). Außerdem kann der<br />
Kernfarbstoff Hoechst durch Emission im Bereich von 385-470nm (blau) <strong>zu</strong>r Darstellung<br />
gebracht werden.<br />
2.2.6.2 Konfokale Lasermikroskopie (CLSM)<br />
Ein Teil der wie oben beschrieben aufgearbeiteten Präparate wurde mit einem konfokalen<br />
Laser-Scanning-Mikroskop betrachtet (LSM, LSM 5 Meta, Zeiss, Jena). Die Aufnahme der<br />
konfokalen Bilder erfolgte in Kooperation mit Prof. Dr. Gebert, Institut für Anatomie,<br />
<strong>Universität</strong> <strong>zu</strong> <strong>Lübeck</strong>. Bei dieser Methode rastert ein fokussierter, monochromatischer<br />
Laserstrahl zeilenweise über die Probenoberfläche. Die aus den erleuchteten Bereichen des<br />
Gewebes emittierte Strahlung gelangt über eine konfokale Blende (Pinhole) auf einen<br />
Detektor, wo ihre Intensität gemessen wird. Das Pinhole ist die entscheidende Besonderheit<br />
eines konfokalen Mikroskops gegenüber herkömmlichen Lichtmikroskopen. Durch die<br />
konfokale Blende gelangt lediglich Laserlicht aus einer extrem dünnen Fokusebene auf den<br />
Detektor (xy-Scan). Durch schrittweises Verfahren der Höhenposition des Objekttischs wird<br />
eine Stapel von Einzelbildern parallel <strong>zu</strong>r Oberfläche erhalten. Durch Übereinanderprojektion<br />
dieser parallelen Einzelbilder kann rechnergestützt eine Summation aller Bildinformationen<br />
erreicht werden, so dass Mikrogewebestrukturen im Verlauf durch das Gewebe als<br />
dreidimensionales Bild visualisiert werden können. Mit einem konfokalen Mikroskop ist es<br />
somit möglich eine Probe bis <strong>zu</strong> einer Tiefe von etwa 100 µm in optischen Schnitten<br />
ab<strong>zu</strong>bilden. Der Vorteil der Methode ist, dass die von uns verwendeten relativ dicken
MATERIAL UND METHODEN 34<br />
Gewebeproben in Form der 'optischen Schnitte' scharf abgebildet werden können. Es wurde<br />
die Connexin40 Expression in Vorhof, Aorta und Arteriolen des M. cremasters in Wildtypen<br />
und als Negativkontrolle in Connexin40-defizienten Mäusen untersucht. Des weiteren<br />
wurden Kontrollen, bei denen auf die Inkubation mit dem primären Antikörper verzichtet<br />
wurde, untersucht. Die Kernfärbung erfolgte mit Hoechst, darüber hinaus wurde die<br />
Autofluoreszenz der Gefäße und des Vorhofgewebes genutzt, um Gewebestrukturen<br />
dar<strong>zu</strong>stellen. Es wurden Bilder mit einer Größe von 512 x 512 Bildpunkten aufgenommen.<br />
Die Aufnahmen erfolgten mit 200-facher (Objektiv: Plan Apochromat 20x/0.75), 400-facher<br />
(Wasserimmersionsobjektiv: C-Apochromat 40x/1.2) und 630-facher<br />
((Wasserimmersionsobjektiv: C-Apochromat 63x/1.2) Vergrößerung mit Objektiven der Firma<br />
Zeiss.<br />
Tabelle 2.1: Verwendete Anregungswellenlängen am CLSM<br />
Fluorophor Laser verwendete Emissionslinie (nm)<br />
Autofluoreszenz Argon/Krypton 488<br />
Alexa Fluor 594 Helium/Neon 543<br />
Hoechst Argon 364<br />
2.2.6.3 Immunhistochemie von Paraffinschnitten<br />
Der immunhistochemische Nachweis der Expression von Connexin40, sowie die Färbung<br />
des endothelzellspezifischen Markers wurde an Paraffinschnitten der Aorta und an Schnitten<br />
von aus dem Cremaster isolierten Arteriolen in hypercholesterinämischen und wildtyp<br />
Mäusen durchgeführt. Die Durchführung erfolgte in Kooperation mit PD Dr. Wagner, Klinik<br />
für Anästhesiologie, <strong>Universität</strong> <strong>zu</strong> <strong>Lübeck</strong>. Nach Einleitung der Narkose wurde der M.<br />
cremaster wie beschrieben präpariert. Um Arteriolen nach Fixierung <strong>zu</strong> identifizieren wurde<br />
eine detaillierte Karte des Gefäßbaumes gezeichnet. Die Gefäße wurden fixiert, indem das<br />
Gefäßsystem der Mäuse nach Öffnung des Thorax über den linken Ventrikel durch eine<br />
hydrostatische Drucksäule perfundiert wurde. Zunächst wurde eine Lösung aus 1 % FCS, 10<br />
U / µL Heparin, 10 µmol / l SNP in angewärmter Salzlösung verwendet, anschließend wurde<br />
mit 2 % Formaldehyd in Salzlösung perfundiert. Die <strong>zu</strong>vor ausgewählten Arteriolen wurden<br />
nun aus dem Cremaster isoliert, die Aorta thoracalis wurde ebenfalls freipräpariert und<br />
isoliert. Die Gefäße wurden über Nacht in 0.45 % Formaldehyd gelagert. Nach Dehydratation<br />
und Einbettung in Paraffin wurden 2 µm Schnitte angefertigt. Die Schnitte wurden dann mit<br />
Xylol entparaffinisiert und mit absteigenden Konzentrationen von Ethanol (100 - 70 %)<br />
rehydriert. Die Wiedergewinnung der Antigenbindungsstellen erfolgte durch Erhitzen der<br />
Schnitte mit 0.01 mol/l Natriumcitrat (pH 6) in einer Mikrowelle. Endogene Peroxidasen
MATERIAL UND METHODEN 35<br />
wurden durch Behandlung mit 0.3 % Wasserstoffperoxid-Lösung inaktiviert. Die Präparate<br />
wurden blockiert (Blocking-Solution: CSA-Kit K1500; Dakocytomation, Carpenteria, CA) und<br />
über Nacht mit dem Cx40 Antikörper (1:200; Chemicon, Temucula, USA) inkubiert. Zur<br />
Visualisierung des primären Antikörpers wurde ein Signalverstärkungssystem (Catalyzed<br />
Signal Amplifikation, CSA, DakoCytomation, Carpenteria, USA) verwendet. Es handelt sich<br />
hierbei um eine empfindliche Färbemethode, die eine Signalverstärkung benutzt, welche auf<br />
der Peroxidase katalysierten Ablagerung einer biotinylierten phenolischen Verbindung<br />
beruht. Zur Verwendung des primären Cx40 Antikörpers, der aus Hasenserum stammte,<br />
mußte ein 'CSA Rabbit Link' verwendet werden, um das System einsetzen <strong>zu</strong> können.<br />
Dadurch konnte der <strong>zu</strong>r Detektion des primären Antikörpers eingesetzte, biotinylierte<br />
sekundäre Antikörper den primären Antikörper erkennen. Im nächsten Schritt wurde ein<br />
Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex <strong>zu</strong>gesetzt der an den biotinylierten sekundären<br />
Antikörper bindet. Die so gebundene Peroxidase katalysiert die Präzipitation eines<br />
biotinylierten Phenols. Peroxidase gekoppelte Antikörper wurden mit Diaminobenzidin braun<br />
gefärbt. Bei Koimmunfärbungen wurde Double Stain Block (Dakocytomation, Carpenteria,<br />
USA) zwischen der Inkubation mit zwei primären Antikörper verwendet. Bei der Detektion der<br />
Antikörper gegen den endothelspezifischen Marker von Willebrand Faktor wurde das Enzym<br />
Alkalische Phosphatase als Sonde eingesetzt. Das Enzym führt ebenfalls <strong>zu</strong>r Bildung eines<br />
lokalen gefärbten Niederschlags. Die Entwicklung erfolgte hier mit Fast Red. Die Betrachtung<br />
der Zielstrukturen erfolgte auch hier mit dem Axioplan 2 Imaging Fluoreszenzmikroskop wie<br />
unter 2.2.6.1, Immunfluoreszenz beschrieben.<br />
2.2.7 Genotypisierung der Connexin40 defizienten Mäuse<br />
Mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) läßt sich eine sehr kleine Menge eines<br />
definierten DNA-Abschnitts so stark vervielfältigen, dass er problemlos nachgewiesen und<br />
untersucht werden kann. Vorrausset<strong>zu</strong>ng hierfür ist, dass die Sequenzen am Anfang und am<br />
Ende des DNA Fragments bekannt sind. Dann können spezifische Primer hergestellt<br />
werden, die komplementär <strong>zu</strong> den Anfangs- und Endsequenzen sind und mit der Matritze<br />
hybridisieren. Die Vervielfältigung erfolgt durch DNA-Polymerasen, die sich an je ein Ende<br />
des hybridisierten Primers heften und den neuen DNA-Strang komplementär <strong>zu</strong>r Matritze<br />
synthetisieren.<br />
Eine PCR besteht aus mehreren aufeinanderfolgenden Zyklen, wobei jeder Zyklus die DNA-<br />
Menge verdoppelt. Ein Zyklus besteht aus drei Phasen, Erhit<strong>zu</strong>ng, einer Abkühlung und<br />
erneutem Erwärmen. In der ersten Phase wird der Doppelstrang der DNA durch Erhitzen in<br />
zwei Einzelstränge getrennt (Denaturierung). In der zweiten, kühleren Phase lagern sich die<br />
Primer an die Bereiche der Einzelstränge mit ihrer komplementären Sequenz (Anlagerung)
MATERIAL UND METHODEN 36<br />
an. Durch erneutes Erwärmen auf die optimale Temperatur der Polymerase kann diese an<br />
den Primern beginnend aus einzelnen Nukleotiden neue komplementäre Stränge <strong>zu</strong> den<br />
vorhandenen Einzelsträngen bilden (Elongation). Auf diese Weise entstehen aus je einem<br />
Einzelstrang ein doppelsträngiges DNA-Fragment. Danach folgt der nächste Zyklus mit den<br />
gleichen Temperaturwechseln. Die <strong>zu</strong>r Genotypisierung der Connexin40 defizienten Mäuse<br />
verwendeten Primer (MWG Biotech AG, Ebersberg) sind in Tabelle 2.2 aufgelistet. Die<br />
Vervielfältigung erfogte mit einem Thermocycler (iCycler, Biorad, München), das verwendete<br />
Programm ist in Tabelle 2.3 dargestellt.<br />
Tabelle 2.2: Verwendete Primer<br />
Primer Sequenz Länge<br />
Cx 40-/- forward 5'-GGATCGGCCATTGAACAAGATGGATTGCAC-3' 30-mer<br />
Cx40-/- reverse 5'-CTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCG-3' 31-mer<br />
wt forward 5'-GGGAGATGAGCAGGCCGACTTCCGGTGCG-3 29-mer<br />
wt reverse 5'-GTAGGGTGCCCTGGAGGACAATCTTCCC-3' 28-mer<br />
Tabelle 2.3: Programm Connexin40 PCR<br />
Anzahl der Zyklen Temperatur Zeit<br />
38 Zyklen 94°C 40sec<br />
65°C 1min<br />
72°C 1min<br />
Einmalig 72°C 7min<br />
Zur Gewinnung der genomischen DNA wurde den Mäusen in einem Alter von ca. 6 Wochen<br />
ein etwa 2 mm langes Stück der Schwanzspitze entnommen. Die Probe wurde in Laird<br />
Puffer überführt, mit Proteinase K (0.2 mg / ml) versetzt und bei 55°C 24 h verdaut. Nach<br />
Inaktivierung des Enzyms durch Erhitzen auf 95°C für 20min wurde die DNA mit eiskaltem<br />
Isopropanol gefällt und abzentrifugiert (13000 rcf, 15 min Microzentrifuge MC-13, Amicon,<br />
Witten). Nach Aufnehmen des DNA-Pellets in TE-Puffer wurden die Proben für die<br />
Amplifikation eingesetzt. Der Reaktionsansatz für die PCR-Reaktion ist Tabelle 2.4 <strong>zu</strong><br />
entnehmen.
MATERIAL UND METHODEN 37<br />
Tabelle 2.4: PCR-Reaktionsansatz<br />
Mastermix (Endkonzentration)<br />
Volumen (µl)<br />
MgCl 2 (2.5mM) 2,5<br />
10xPCR Puffer 5,0<br />
Primermix (0,8pmol/µl) 1,6<br />
dNTP-Mischung (0,16mM) 0,8<br />
H 2 O 32,6<br />
Taq Invitrogen (0,05U/µl) 0,5<br />
Probe 7,0<br />
Der Erfolg der PCR kann mit Hilfe einer Gel-Elektrophorese überprüft werden. Dabei werden<br />
DNA-Fragmente in einem Agarose-Gel durch ein elektrisches Feld nach ihrer Größe<br />
aufgetrennt. Um die DNA-Fragmente an<strong>zu</strong>färben, wird der DNA-Interkalator Ethidiumbromid<br />
verwendet. So kann die DNA unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Die amplifizierte DNA<br />
wurde in einem 0.5 % TBE-Agarosegel für 35 min bei 60 mA und 120 V in einer dafür<br />
gebauten Gelkammer aufgetrennt. Als Negativkontrolle wurde Wasser und als Referenzskala<br />
DNA Ladder Plus (100 bp, Invitrogen, Karlsruhe) eingesetzt. Das PCR-Produkt für das<br />
Wildtyp-Allel hatte eine Länge von 314 bp und das Produkt des Connexin40-defizienten<br />
Allels 494 bp.<br />
494 bp<br />
314 bp<br />
Cx40 +/+ Cx40 -/- Cx40 +/- H 2 O Marker<br />
Abb. 2.5: Genotypisierung der Connexin40-defizienten Mäuse<br />
Aus der Verpaarung der heterozygoten Connexin40 Mäuse (eigene Zucht) ergeben sich drei mögliche<br />
Genotypen: Connexin40 wildtyp (Cx40+/+), Connexin40 defizient (Cx40-/-) und Connexin40<br />
heterozygot (Cx40+/-). Die zwei unterschiedlichen DNA-Abschnitte (314 bp für das Wildtyp-Allel und<br />
494 bp für das k.o.-Allel) wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt. Als Negativkontrolle diente<br />
Wasser. Der verwendete 100bp Marker diente als Referenz.
MATERIAL UND METHODEN 38<br />
2.2.8 Magnetofektion<br />
Magnetofektion ist eine relativ neue Technologie, welche die einfache und schnelle<br />
Transfektion von Zellen in Kultur ermöglicht. Die Methode beruht auf der reversiblen<br />
Kopplung von Oligonukleotiden oder Genvektoren an magnetische Nanopartikel, die von<br />
einer kationischen Polymerhülle umgeben sind und in wässriger Suspension vorliegen. Diese<br />
"Ferrofluide" können mit Hilfe eines externen Magnetfeldes am Zielort festgehalten und<br />
dadurch konzentriert werden. Die Aufnahme der Oligonukleotide in die Zellen erfolgt durch<br />
Endozytose. Wie in unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden konnte, erreicht die<br />
Magnetofektion in vitro gegenüber den klassischen Transfektionsmethoden eine höhere<br />
Transfektionseffizienz und eignet sich insbesondere als Methode <strong>zu</strong>r Transfektion von<br />
schwer transfizierbaren Zelllinien. Des weiteren konnte in vivo nach Injektion von<br />
fluoreszenzmarkierten Antisenseoligonukleotiden in die A. femoralis, aus der das den M.<br />
cremaster versorgende Gefäß hervorgeht, fluoreszenzmikroskopisch die zelluläre Aufnahme<br />
und Lokalisation der Oligonukleotide am Zielort gezeigt werden (143). Ziel unserer weiteren<br />
Arbeit war die Etablierung der magnetischen Transfektion in vivo, um in dem transfizierten<br />
Gefäßareal die Effekte der Ausschaltung bestimmter Zielproteine mittels Gen-Silencing auf<br />
die vaskuläre Funktion <strong>zu</strong> untersuchen. Die erfolgreiche Etablierung würde es ermöglichen,<br />
die spezifische Funktion bestimmter Proteine (z.B. K + -Kanäle, K 2P ) für die es keine<br />
spezifischen Hemmstoffe gibt, <strong>zu</strong> charakterisieren.<br />
Antisenseoligonukleotide sind kurze Nukleotidsequenzen, bestehend aus 15 - 20 Basen, die<br />
komplementär <strong>zu</strong>r Ziel-mRNA sind. Die Wirkung von Antisense-Oligonukleotiden beruht auf<br />
unterschiedlichen Mechanismen. Ein Mechanismus ist die Aktivierung der RNase H. Dieses<br />
Enzym erkennt DNA/RNA Doppelstränge und schneidet den mRNA Strang, was <strong>zu</strong> einem<br />
Abbau der Ziel mRNA führt. Des weiteren können Antisenseoligonukleotide durch sterische<br />
Behinderung des Ribosoms die Proteinsynthese inhibieren (Abbildung 2.6).
MATERIAL UND METHODEN 39<br />
Abb. 2.6: Wirkmechanismus von Antisenseoligonukleotiden<br />
A: Durch Bindung von Antisenseoligonukleotiden an die Ziel mRNA kommt es <strong>zu</strong> einer Aktivierung der<br />
RNAse H. Dieses Enzym erkennt RNA/DNA Doppelstränge und schneidet den RNA Strang. Dies führt<br />
<strong>zu</strong>m Abbau der Ziel mRNA. B: Durch Bindung an die Ziel mRNA führen Antisensoligonukleotide <strong>zu</strong><br />
einer Hemmung der Translation, da das Riosom sterisch gehindert wird. Modifiziert nach Kurreck,<br />
2003 (144)<br />
Die Halbwertszeit von Oligonukleotiden in biologischen Flüssigkeiten ist allerdings nur<br />
gering, da ein rascher Abbau durch Nukleasen erfolgt. Um die Stabilität der verwendeten<br />
Oligonukleotide <strong>zu</strong> erhöhen, wurden Modifikationen des 5' und 3' Endes der<br />
Nukleotidsequenzen vorgenommen, hierbei wurden jeweils die ersten 5 und letzten 4 Basen<br />
modifiziert. Die häufigste Modifikation, die auch in dieser Arbeit verwendet wurde, ist eine<br />
Veränderung des Phosphoesters. Hierbei wird eines der nichtbindenden Sauerstoffatome<br />
durch Schwefel ersetzt (Abbildung 2.7). Dadurch erhöht sich die Halbwertszeit in humanem<br />
Serum von 1h auf 9-10h.<br />
Abb. 7: Stabilisierung von Antisenseologonukleotiden<br />
Durch Modifikationen des Zucker-Phosphat Rückgrats wird die DNA stabilisiert. Eines der<br />
nichtbindenden Sauerstoffatome des Phosphoesters wird durch Schwefel ersetzt. Dies erhöht die<br />
Halbwertszeit um den Faktor 10.
MATERIAL UND METHODEN 40<br />
Target unserer Versuche war <strong>zu</strong>nächst die Src homology domain 2 (SH2)-<br />
Tyrosinphosphatase-1 (SHP-1). SHP-1 wurde in menschlichen Endothelzellen der<br />
Umbilicalvene (HUVEC) als wichtiger Regulator der NADPH-Oxidase abhängigen Superoxid-<br />
Produktion identifiziert. In diesen Endothelzellen vermindert SHP-1 sowohl die basale als<br />
auch die stimulierte Superoxid-Produktion (145).<br />
In einer weiteren Gruppe von Experimenten wurde der muskarinische Acetylcholin-Rezeptor<br />
(M 3 Rezeptor), welcher die Acetylcholin (ACh) induzierte Gefäßdilatationen über Freiset<strong>zu</strong>ng<br />
endothelialer Faktoren vermittelt, als Target ausgewählt. Um den im Endothel exprimierten<br />
M 3 Rezeptor aus<strong>zu</strong>schalten, wurde eine in der Zellkultur erfolgreich eingesetzte Mischung<br />
von sechs verschiedenen gegen die mRNA des M 3 Rezeptors gerichteten<br />
Antisenseoligonukleotiden verwendet (146). Die entsprechenden, gegen die mRNA<br />
gerichteteten Antisenseoligonukleotide wurde kommerziell erworben (MWG-Biotech,<br />
Ebersberg).<br />
Tabelle 5: Sequenz der verwendeten Oligonukleotide<br />
Oligonukleotid Sequenz (5' → 3') Modifikation<br />
SHP-1 antisense CCTTGAGCAGGGTCTCTGCATCC PS<br />
SHP-1 nonsense CCGGCCCTGAAGCATG PS<br />
RAF1_nonsense TCCCGCGCACTTGATGCTTT PS, 5' Fluorescein<br />
M3 ACh antisense ACAGTCTCTCAATTGGACAG PS<br />
M3 ACh antisense (1/6) CTGTTATTGTGCAAGGTCAT PS<br />
M3 ACh antisense (2/6) GCTGCTCGAGAAACATTGTA PS<br />
M3 ACh antisense (3/6) TGGAGAGGAGAAATTGCCAG PS<br />
M3 ACh antisense (4/6) GAAGACCACTTGCCAGACGG PS<br />
M3 ACh antisense (5/6) TGACCTTAAATGACACAATT PS<br />
M3 ACh antisense (6/6) ATCAGATCGGCACAGGCCAG PS<br />
Alle Versuche wurden in C57Bl/6 Mäusen durchgeführt. Zur Herstellung des<br />
Transfektionsgemisches wurden Antisenseoligonukleotide (0.01 µg / µl) und Eisenpartikel<br />
(PolyMAG, 0.02 µg / µl) im Verhältnis 1:2 in isotonischer NaCl Lösung gemischt. Ein<br />
Zeitraum von 30 min wurde <strong>zu</strong>r vollständigen Aggregation eingehalten. Nach Narkotisierung<br />
der Tiere wurde ein Katheter in die A. femoralis gelegt, durch den die an magnetische<br />
Nanopartikel gekoppelten Antisenseoligonukleotide über den Zeitraum von einer Minute<br />
injiziert wurden. Ein starker Magnet (Neodelta, IBS Magnet, Berlin) wurde während der<br />
Injektion sowie weitere 15 Minuten nach Applikation unmittelbar über dem Hoden platziert.<br />
Nach Verschließen der Wunde wurde die Narkose antagonisiert. Die vaskuläre Funktion<br />
wurde drei Tage nach Transfektion intravitalmikroskopisch untersucht.
MATERIAL UND METHODEN 41<br />
2.2.9 Cholesterinbestimmung<br />
Das Gesamtcholesterin wurde im Plasma von hypercholesterinämischen Mäusen (ApoE-/-,<br />
LDL-R-/-) nach Standardfutter oder einer fett- und cholesterinreichen Diät und von Wildtyp-<br />
Kontrollen (C57BL/6) bestimmt. Hier<strong>zu</strong> wurde in den Mäusen nach Abschluß des<br />
durchgeführten Versuches die A. carotis freipräpariert. Das Gefäß wurde mit zwei<br />
Baumwollfäden aufgespannt und katheterisiert. Über diesen Zugang wurde die Maus<br />
exsanguiniert. Das entnommene Blutvolumen variierte zwischen 600 - 1000 µl. Die <strong>zu</strong>r<br />
Entnahme verwendete Spritze sowie der kurze Katheterschlauch waren mit 100µl<br />
heparinisierter NaCl befüllt, so dass eine Endkonzentration von 12 – 30 IE / ml Heparin in der<br />
Blutprobe erreicht wurde. Die Probe wurde sofort zentrifugiert (3000 rcf, 15 min,<br />
Microzentrifuge MC-13, Amicon, Witten), das Plasma abgenommen und <strong>zu</strong>r späteren<br />
Cholesterinbestimmung eingefroren (-20 °C).<br />
Die Cholesterinbestimmung erfolgte in Kooperation mit Dr. Dibbelt, Institut für Klinische<br />
Chemie, <strong>Universität</strong> <strong>zu</strong> <strong>Lübeck</strong>. Es wurde ein kommerziell erwerblicher Kit <strong>zu</strong>r<br />
Cholesterinbestimmung verwendet (Cholesterol, Abbott Clinical Chemistry, Ludwigshafen).<br />
Zunächst wurde die Probe mit Cholesterinesterasen versetzt, um Cholesterinester <strong>zu</strong><br />
Cholesterin und freien Fettsäuren <strong>zu</strong> hydrolisieren. Das freie Cholesterin und die<br />
ursprünglich vorhandenen Menge an ungebundenem Cholesterin wird, durch das Enzym<br />
Cholesterinoxidase <strong>zu</strong> Cholest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid oxidiert.<br />
Wasserstoffperoxid reagiert dann mit Hydroxybenzoesäure und 4-Aminophenazon <strong>zu</strong> einem<br />
Chinonimin-Farbstoff. Die Quantifizierung des Chromophors erfolgte photometrisch bei<br />
500nm.<br />
2.2.10 Mikropipetten<br />
Alle verwendeten Mikropipetten wurden aus Borosilikatglaskapillaren mit internem Filament<br />
(Aussendurchmesser 1 mm, Innendurchmesser 0,58 mm, Länge 100 mm) mit einem<br />
Mikropipettenpuller (Model P-20 Sutter Instrument Co., Novato, CA, USA) gezogen. Da die<br />
verwendeten Pipetten unterschiedlichen Anforderungen entsprechen mußten, wurden<br />
verschiedene Programme, die in Tabelle 2.6 <strong>zu</strong>sammengefaßt sind, <strong>zu</strong>m Ziehen der<br />
Kapillaren verwendet.
MATERIAL UND METHODEN 42<br />
Tabelle 2.6: Herstellung von Mikropipetten<br />
Aufgelistet sind die Programme die <strong>zu</strong>m Ziehen von einfachen Stimulationspipetten, für die<br />
Membranpotentialmessung verwendeten Stimulationspipetten und Elektroden benutzt wurden.<br />
Pipettenart Heat Pull Velocity Time<br />
einfache Stimulationspipette cycle1 285 - 40 150<br />
cycle2 315 170 160 100<br />
Elektrodenpipette cycle1 305 140 100 130<br />
MP-Stimulationspipette cycle1 300 - 70 150<br />
cycle2 300 - 50 200<br />
cycle3 310 - 110 150<br />
2.3 Versuchsprotokolle<br />
2.3.1 Genereller Versuchsablauf<br />
Nach Präparation des Cremastermuskels und Überführung der Maus auf den Mikroskoptisch<br />
wurde eine ca. 30 minütige Äquilibrationsphase eingehalten. Während dieser Zeit wurde das<br />
Präparat auf gleichmäßige Perfusion, den Kontraktions<strong>zu</strong>stand der Arteriolen sowie auf<br />
eventuelle Blutungen im Muskel selbst überprüft. Bereiche, in denen der Blutfluß<br />
un<strong>zu</strong>reichend war, die Blutungen aufwiesen und Gefäße, welche <strong>zu</strong> dicht am Rand des<br />
Präparates lagen, wurden vom Versuch ausgeschlossen. Es wurden zwei unterschiedliche<br />
Versuchsabläufe durchgeführt. Um Konzentrations-Wirkungskurven <strong>zu</strong> erhalten, wurden die<br />
Durchmesser von mehreren Gefäßen (8 - 12 Gefäße) in einem Präparat vor und nach<br />
Behandlung mit unterschiedlichen Agonisten untersucht (intermittierende<br />
Durchmessermessung). Um die Durchmesseränderung kontinuierlich über die Zeit <strong>zu</strong><br />
beobachten wurden ein bzw. maximal vier Gefäße je Präparat über einen Zeitraum von zwei<br />
Minuten kontinuierlich in ihrem Verhalten vor und nach Behandlung mit unterschiedlichen<br />
Agonisten untersucht (kontinuierliche Durchmessermessung).<br />
In einigen Versuchen wurde, um den NO- und Prostazyklin-unabhängigen Anteil der<br />
Gefäßantwort <strong>zu</strong> untersuchen, N ω -nitro-L-arginin (L-NA, 30 µM), ein NO-Synthase Inhibitor<br />
und Indomethacin, ein Hemmstoff der Cyclooxygenase (3 µM), superfundiert. Nach einer<br />
Inkubationszeit von 20 Minuten erreichen die eingesetzten Konzentrationen in unserer<br />
Präparation eine effektive Hemmung beider Enzyme (7). Um den maximalen Durchmesser<br />
der untersuchten Arteriolen <strong>zu</strong> bestimmen, wurde am Ende jedes Versuches eine<br />
Kombination aus den Vasodilatatoren SNP , Adenosin und Acetylcholin in supramaximalen<br />
Konzentrationen (jeweils 30 µM) superfundiert.
MATERIAL UND METHODEN 43<br />
2.3.2 Intermittierende Durchmesserbestimmung nach globaler Stimulation<br />
Um die Bedeutung verschiedener Agonisten unter physiologischen und<br />
pathophysiologischen Bedingungen sowie die Beteiligung verschiedener K + -Kanäle an der<br />
lokalen Dilatation <strong>zu</strong> untersuchen, wurden die Durchmesser der Arteriolen während<br />
unterschiedlicher Behandlungen im Wildtyp und transgenen Mäusen bestimmt. Hier<strong>zu</strong><br />
wurden mehrere Gefäße untersucht, die jeweils unmittelbar vor und nach Stimulation mit den<br />
Agonisten betrachtet wurden. Um <strong>zu</strong> gewährleisten, dass über die gesamte Versuchsdauer<br />
immer dieselben Gefäßabschnitte betrachtet werden konnten, wurde in der<br />
Äquilibrationsphase eine detaillierte Skizze des Gefäßbaums angefertigt. Nerven, Venen und<br />
besonders markante Verläufe der Arteriolen dienten als Orientierungshilfe. In einem Präparat<br />
wurden 8 - 12 Arteriolen unterschiedlicher Gefäßgenerationen, unterschiedlichen<br />
Kontraktions<strong>zu</strong>standes und unterschiedlicher Lage innerhalb des Gefäßbaumes <strong>zu</strong>r<br />
Durchmesserbeobachtung ausgewählt. Diese Arteriolen wurden im weiteren Versuchsablauf<br />
in definierter Reihenfolge aufgesucht, jeweils etwa fünf Sekunden fokussiert und gleichzeitig<br />
auf Videoband aufgenommen. Die Beobachtung aller ausgewählten Gefäße dauerte ca. eine<br />
Minute und erfolgte sowohl unmittelbar vor Stimulation mit einem Agonisten als auch<br />
während der Superfusion der vasoaktiven Substanz. Die Agonisten wurden dem Superfusat<br />
wie bereits beschrieben mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe beigemischt. Die nächsthöhere<br />
Konzentration oder eine weitere Substanz wurden erst untersucht, wenn die Gefäße den<br />
Ausgangsdurchchmesser wiedererlangt hatten. Dies variierte je nach Agonist und<br />
Kontraktions<strong>zu</strong>stand der Arteriolen und dauerte etwa 1-5 Minuten.<br />
2.3.3 Kontinuierliche Durchmesserbestimmung: fortgeleitete Vasomotorantworten<br />
Die Arteriolen, an denen die Ausbreitung von lokal induzierten Dilatationen oder<br />
Konstriktionen untersucht wurden, mussten mehreren Anforderungen entsprechen. Zum<br />
einen war eine Gefäßlänge von mindestens 1.5 mm zwingende Vorausset<strong>zu</strong>ng um die<br />
Durchmesseränderungen an den entfernten Positionen betrachten <strong>zu</strong> können. Zum anderen<br />
sollte die Arteriole weder in Nachbarschaft <strong>zu</strong> einer Vene lokalisiert sein, um veno-arterielle<br />
Diffusion der Agonisten ausschließen <strong>zu</strong> können, noch im Randbereich der Präparation<br />
liegen. Des weiteren mußte die Arteriole einen ausreichenden Kontraktions<strong>zu</strong>stand<br />
aufweisen, um die Ausbreitung von lokal induzierten Dilatationen <strong>zu</strong> untersuchen. Die<br />
Gefäßstimulation erfolgte über eine Mikropipette, welche mit Hilfe eines Mikromanipulators in<br />
unmittelbarer Nähe des Gefäßes (Abstand < 15 µm) im Skelettmuskel positioniert wurde. Die<br />
Mikropipette war mit der Stimulationssubstanz (Kaliumchlorid (3 M), Adenosin (10 mM),<br />
Bradykinin (10 mM) oder Acetylcholin (10 mM) gefüllt und hatte einen Spitzendurchmesser<br />
von ca. 2 µm. Durch Druckejektion (140 kPa, 50 - 800 ms) wurde ein sehr kleines Volumen
MATERIAL UND METHODEN 44<br />
der Stimulationssubstanz lokal appliziert. Die Durchmesseränderung nach Stimulation wurde<br />
an der lokalen Position und dann nach erneuter lokaler Stimulation an den entfernten<br />
Positionen beobachtet. Die entfernt gelegenen Stellen (Stimulation mit KCl: 225 µm, 550 µm,<br />
775 µm und 1100 µm; Stimulation mit Adenosin oder ACh: 550 µm, 1100 µm) wurden<br />
stromaufwärts von der Stimulationsstelle gewählt, um einen konvektiven Transport des<br />
Agonisten mit dem Blut <strong>zu</strong>r beobachteten entfernten Stelle aus<strong>zu</strong>schließen. Wenn die<br />
Stimulationsstelle außerhalb des Blickfeldes lag, wurde nach jeder Stimulation die korrekte<br />
Position der Mikropipette überprüft. Der Gefäßdurchmesser wurde sowohl an der<br />
Stimulationsstelle als auch an entfernt gelegenen Positionen 30 Sekunden vor und 90<br />
Sekunden nach Stimulation beobachtet und auf Videoband aufgezeichnet. Je nach<br />
Fragestellung wurden anschließend Substanzen superfundiert und das Stimulationsschema<br />
wiederholt.<br />
2.3.4 Blockade von vaskulären K + -Kanälen<br />
In Versuchen, die die Beteiligung von K + und Na + -Kanälen an lokalen und fortgeleiteten<br />
Dilatationen untersuchen wurde nach Aufzeichnung der Kontrollserien, sowohl bei<br />
Versuchen mit globaler als auch lokaler Stimulation Hemmer von K + -Kanälen superfundiert.<br />
Die Messungen wurden daraufhin nach einer Inkubationszeit von ca. 20 - 30 Minuten<br />
wiederholt. Charybdotoxin, Iberiotoxin, 4-Aminopyridin, Bariumchlorid, Bupivacain und<br />
Mepivacain wurden in Wasser gelöst. UCL1684, Glibenclamid und die Kanal-Öffner DCEBIO<br />
(5,6-Dichloro-1-ethyl-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one) und Cromakalim wurden in DMSO<br />
gelöst und auf die im Versuch eingesetzten Konzentrationen weiter mit Wasser verdünnt. Die<br />
maximale DMSO-Konzentration betrug für Superfusions-Experimente 1 % DMSO. Bei lokaler<br />
Applikation der Kanalöffner war der Einsatz von 50 % DMSO im Lösungsmittelgemisch<br />
erforderlich. Für alle Versuche, in denen DMSO <strong>zu</strong>m Lösen von Substanzen eingesetzt<br />
wurde, wurden Kontrollen mit DMSO in der entsprechenden Konzentration durchgeführt. Das<br />
Präparat wurde in der Regel einige Zeit mit den Blockern vorinkubiert, der Blocker wurde<br />
dann während des Versuchs weiter superfundiert. Ausnahme waren die Substanzen<br />
Charybdotoxin und Iberiotoxin, hier wurde das Präparat lediglich vorinkubiert, die<br />
nachfolgende Messung wurde innerhalb von 45 Minuten durchgeführt. Tabelle 2.7 und 2.8<br />
geben eine Übersicht über die verwendeten Substanzen.
MATERIAL UND METHODEN 45<br />
Tabelle 2.7: Ionenkanal-Blocker<br />
Kanal Blocker Konzentration Lösungsmittel Inkubation Superfusion<br />
IK Ca / BK Ca Charybdotoxin 1 µM H 2 O 20min nein<br />
BK Ca Iberiotoxin 0.1 µM H 2 O 20min nein<br />
SK Ca UCL 1684 100 µM 1% DMSO in H 2 O 20min ja<br />
K V 1.5/1.6 4-Aminopyridin 1 µM H 2 O 20min ja<br />
K IR 2.1 Barium 75 µM H 2 O 15min ja<br />
K ATP Glibenclamid 1 µM 0,5% DMSO inH 2 O 30min ja<br />
Na + / K + Bupivacain 100 µM H 2 O 20min ja<br />
Na + >> K + Mepivacain 200 µM H 2 O 20min ja<br />
Tabelle 2.8: K + -Kanal Öffner<br />
K + -Kanal Kanal-Öffner Konzentration Lösungsmittel Applikationsart<br />
IK Ca DCEBIO 1 mM 50% DMSO in H 2 O lokal<br />
IK Ca DCEBIO 10 µM 0,5% DMSO in H 2 O global<br />
K ATP Cromakalim 1 mM 50% DMSO in H 2 O lokal<br />
2.3.5 Membranpotential vaskulärer Zellen<br />
Um das Ruhemembranpotential vaskulärer Zellen sowie die Änderung des<br />
Membranpotentials nach lokaler Stimulation <strong>zu</strong> untersuchen, wurde <strong>zu</strong>nächst mit einem<br />
Mikromanipulator (M-152, Narishige, Tokio) eine Stimulationspipette am stromabwärts<br />
gelegenen Ende der freipräparierten Arteriole in einem Abstand von 5 – 10 µm vor dem<br />
Gefäß positioniert. Die Applikation der Substanzen erfolgte über einen Druckgeber. Durch<br />
steigende Druckpulsdauer (50 - 7000 ms) konnten ansteigende Konzentrationen des<br />
Agonisten erreicht werden. Um <strong>zu</strong> verfizieren, dass der applizierte Bolus das Gefäß erreicht,<br />
wurde der Stimulationslösung eine kleine Menge Carboxyfluorescein (ca. 1:1000)<br />
beigemischt. Die Ejektion des Agonisten konnte somit unter Fluoreszenzmikroskopie verfolgt<br />
werden und wurde nach jeder Zellpenetration überprüft. Die Mikroelektrode wurde von der<br />
gegenüberliegenden Seite des Gefäßes, stromaufwärts von der Stimulationspipette mit<br />
einem elektrischen Mikromanipulator (PM 20H, Samwoo Scientific Co., Seoul, Korea) in<br />
einem Winkel von etwa 45° positioniert. Der Mikromanipulator wurde über einen Joystick<br />
bedient, der auch den Piezostepper steuerte. Die verwendeten Mikroelektroden hatten einen<br />
Spitzendurchmesser < 1 µm und einen elektrischen Widerstand von ca. 80 - 120 MΩ . Die<br />
Spitze der Elektrode war lang ausgezogen und daher so flexibel, dass sie sich in der<br />
Gefäßwand bewegen konnte. Kontakt der Elektrodenspitze mit einer Zellmembran führte <strong>zu</strong><br />
einem raschen Spannungsabfall auf dem Oszilloskop. Zellpenetration erfolgte durch schnelle<br />
kurze Vorwärtsbewegung der Elektrode. Kriterien für eine erfolgreiche Punktion waren 1. ein<br />
rascher Potentialabfall, 2. ein geringer Widerstand über die Zellmembran, 3. ein stabiles
MATERIAL UND METHODEN 46<br />
Potential über mindestens 30 s, sowie 4. eine schnelle Rückkehr auf den Nullwert nach dem<br />
Austritt der Elektrode aus der Zelle. Sobald die Mikroelektrode die Zellmembran penetriert<br />
hatte, wurde der Stromimpuls am Verstärker ausgeschaltet und die Messung begonnen.<br />
Gemessen wurde sowohl das Ruhemembranpotential als auch die Potentialänderung nach<br />
Gefäßstimulation mit steigenden Konzentrationen von ACh und Adenosin. Nach Penetration<br />
der Zelle diffundiert der Fluoreszenzfarbstoff aus der Mikroelektrode in die gemessene Zelle<br />
und ermöglicht so deren Identifizierung als Endothelzelle oder glatte Muskelzelle. Die<br />
Identifizierung der vaskulären Zellen erfolgte direkt im Anschluß an die Messung mittels<br />
Fluoreszenzmikroskopie anhand ihrer jeweils charakteristischen Ausrichtung in Be<strong>zu</strong>g auf<br />
das Gefäß.<br />
1 2<br />
Abb. 2.8: Schematische Darstellung einer für die Membranpotentialmessung isolierten<br />
Arteriole<br />
Zur Membranpotentialmessung wurden eine Arteriole von dem umgebenden Skelettmuskel<br />
freipräpariert und Zellen in einem Winkel von 45 - 90° mit der Messelektrode penetriert (1). Stimulation<br />
mit ACh und Adenosin erfolgte über zwei stromaufwärts der Messelektrode in unmittelbarer Nähe der<br />
Gefäßwand positionierten Stimulationspipetten (2).<br />
2.3.6 Magnetofektion<br />
Mittels Magnetofektion transient transfizierte Mäuse wurden drei Tage nach Transfektion<br />
untersucht. Hier<strong>zu</strong> wurden die Tiere wie bereits beschrieben narkotisiert und präpariert.<br />
Gefäßantworten wurden vor und nach globaler Stimulation mit ACh und SNP (10 -7 - 10 -5 M)<br />
sowie Adenosin (10 -6 M) aufgezeichnet. In einer Reihe von Vorversuchen wurde außerdem<br />
der Effekt einer Kompression der abdominalen Aorta auf die Transfektion untersucht,<br />
wodurch der Blutfluß im Cremastermuskel während der Applikation von Antisense-<br />
Oligonukleotiden unterbunden werden konnte.
MATERIAL UND METHODEN 47<br />
2.4 Datenauswertung<br />
2.4.1 Durchmesserbestimmung<br />
Die Bestimmung der Innendurchmesser der Gefäße erfolgte im Anschluss an den Versuch<br />
anhand der aufgezeichneten Videosequenz mit kommerziell erwerblicher Software<br />
(LABView, National Instruments), welche in unserem Labor an den jeweiligen Bedarf<br />
angepasst wurde. Das Video wurde <strong>zu</strong>nächst digitalisiert, im Anschluß daran wurde nach<br />
Erreichen der jeweiligen <strong>zu</strong> messenden Position die Gefäßränder mit zwei parallelen Balken<br />
markiert. Der Abstand der beiden Balken, multipliziert mit einem Faktor, um die<br />
Vergrößerung des Mikroskops <strong>zu</strong> berücksichtigen, ergab den Durchmesser des Gefäßes.<br />
Die vorherige Kalibration erfolgte mittels eines Objektmikrometers dessen Abbildung durch<br />
das Mikroskop auf Videoband aufgezeichnet wurde.<br />
Die kontinuierliche Durchmesserbestimmung erfolgte anhand des analog aufgezeichneten<br />
Videos. Hier<strong>zu</strong> wurde ein rechteckiger Kasten auf das Abbild des Gefäßes gelegt. Der<br />
Durchmesser des Rechtecks konnte mittels Tastendruck verändert werden, so dass der<br />
Untersucher die Balken über den Untersuchungszeitraum hinweg immer entsprechend dem<br />
jeweiligen Innendurchmesser auf den Gefäßrändern positionieren konnte. Die gemessenen<br />
Durchmesserwerte wurden kontinuierlich mit einer Frequenz von 2 Hz auf der Festplatte<br />
gespeichert. Die maximale Auflösung, die mit unserem System erreicht werden konnte,<br />
betrug 0.5 µm.<br />
2.4.1.1 Berechnung bei intermittierender Durchmesseruntersuchung<br />
Um den Tonus (Kontraktions<strong>zu</strong>stand) der Arteriolen <strong>zu</strong> untersuchen, wurde der<br />
Ruhedurchmesser (D 0 ) jedes Gefäßes auf seinen maximalen Durchmesser (D max ).<br />
Tonus = D 0 / D max<br />
Hierbei ist (D 0 ) der Ruhedurchmesser des Gefäßes im unbehandelten Zustand. D max ist der<br />
maximale Durchmesser, der durch Superfusion von SNP, ACh und Adenosin (30 µM) am<br />
Ende des Versuches ermittelt wurde. Der Tonus ist umso höher, je kleiner die<br />
dimensionslose Zahl.
MATERIAL UND METHODEN 48<br />
Die Dilatation der Arteriolen nach Superfusion von Agonisten wurde in Prozent der<br />
maximalen Dilatation angegeben und nach folgender Formel berechnet:<br />
% der maximalen Dilatation = [(D i – D 0 ) / (D max – D 0 )] x 100<br />
Hierbei ist D i der Durchmesser während der Behandlung mit einem Agonisten, D 0 der basale<br />
Gefäßdurchmesser, welcher unmittelbar vor Behandlung gemessen wurde, und D max der<br />
maximale Durchmesser. Die Normalisierung der Durchmesseränderung des Gefäßes (D i –<br />
D 0 ) auf die maximal mögliche Dilatation (D max – D 0 ) der Arteriole ermöglicht es, die<br />
Gefäßantwort unabhängig von dem absoluten Durchmesser bzw. Kontraktions<strong>zu</strong>stand <strong>zu</strong><br />
beurteilen.<br />
Die Berechnung der Konstriktion erfolgte entsprechend, wobei die maximal erreichbare<br />
Änderung ein Durchmesser von 0 ist, und sich folgende Formel ergibt:<br />
% der maximalen Antwort =(D i / D 0 x 100) - 100<br />
Zur genaueren Charakterisierung der Konzentrations - Wirkungsbeziehungen wurden EC 50 ,<br />
die Konzentration die eine halbmaximale Antwort hervorruft, und E max , die maximale Antwort<br />
bestimmt. E max und EC 50 wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse nach folgender<br />
Formel errechnet:<br />
E = E max x Konzentration / (EC 50 + Konzentration)<br />
Hierbei ist E jeweils der gemessene Effekt (Dilatation), der bei der jeweiligen untersuchten<br />
Konzentrationen aufgetreten ist. Signifikante Änderungen der E max und EC 50 wurden nach<br />
der von Meddings und Mitarbeitern (147) beschriebenen Methode errechnet.<br />
2.4.1.2 Kontinuierliche Durchmesserbestimmung<br />
Die Berechnung des Gefäßtonus erfolgte bei Versuchen in denen der Durchmesser<br />
kontinuierlich bestimmt wurde, innerhalb des Zeitintervalls von 30 Sekunden vor der<br />
Stimulation. Hier<strong>zu</strong> wurde der Mittelwert aus den Daten vor Stimulation gebildet und durch<br />
den maximalen Gefäßdurchmesser geteilt. Die Berechnung des prozentualen Anteils der<br />
maximal möglichen Antwort erfolgte bei der kontinuierlichen Durchmesserbestimmung für<br />
jede Sekunde separat, hierbei wurde als Ruhedurchmesser (D 0 ) der Mittelwert aus den<br />
Durchmesserwerten 30 Sekunden vor der Applikation des Agonisten verwendet. Die Zeit der<br />
gesamten Antwort (Dauer der Konstriktion bzw. Dilatation) wurde aus dem Zeitintervall
MATERIAL UND METHODEN 49<br />
zwischen Gefäßstimulation und dem Wiedererreichen des Ausgangsdurchmessers<br />
errechnet. Aus der Dauer der Antwort und der aktuellen Durchmesseränderung <strong>zu</strong> den<br />
verschiedenen Zeitpunkten wurde das Integral der Gefäßantwort errechnet (area under<br />
curve, AUC).<br />
2.4.1.3 Membranpotentialmessung<br />
Die arteriolären Durchmesser wurden mit LABView (National Instruments) bestimmt. Das<br />
Membranpotential wurde mit dem open source Datenverarbeitungsprogramm XmAD<br />
(http://www.ibiblio.org/pub/Linux/science/lab) auf einem Linuxsystem aufgezeichnet.<br />
Anschließend wurden die Dateien mit dem Programm XmANA<br />
(http://www.ibiblio.org/pub/Linux/science/lab) analysiert und konvertiert.<br />
2.5 Statistik<br />
Alle Daten wurden mit dem Statistikprogramm Stata 8.0 (Stata Corporation, College Station,<br />
Texas, USA) weiterverarbeitet. Es wurden Zusammenfassungen gebildet, Größen abgeleitet<br />
und statistische Vergleiche angestellt.<br />
Alle dargestellten Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardfehler (SEM) angegeben.<br />
Statistische Vergleiche zweier Behandlungen untereinander wurden, in Abhängigkeit von<br />
den Versuchsvariablen, mit einem t-test für gepaarte oder ungepaarte Werte durchgeführt.<br />
Unterschiede wurden als signifikant erachtet, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit kleiner 5 %<br />
(p < 0.05) war.
ERGEBNISSE 50<br />
3 Ergebnisse<br />
3.1 Mechanismen lokaler und fortgeleiteter Dilatationen<br />
3.1.1 Connexin40 Expression in Arteriolen des M. cremaster<br />
Gap Junctions bestehen aus interzellulären Kanälen, die aus Connexinen aufgebaut sind. In<br />
vaskulären Zellen wurden bisher vier Connexine (Cx) identifiziert, Cx43, Cx40, Cx37 und<br />
Cx45. Aufgrund der zentralen Rolle von Cx40 bei der Fortleitung von Acetylcholin induzierten<br />
Dilatationen sollte dessen Expression in vaskulären Zellen des Cremastermuskels der Maus<br />
gezeigt werden.<br />
Zur Etablierung der Methode in unserem Labor wurde die Cx40-Immunfärbung <strong>zu</strong>nächst an<br />
der Aorta und im Vorhof des Herzens (148, 149) von Wildtyp- und Cx40-defizienten Mäusen<br />
durchgeführt. In der Maus wird Cx40 in den Vorhöfen und im proximalen Teil des<br />
ventrikulären Leitungssystems exprimiert (149-151). Connexine ermöglichen hier die<br />
elektrische Kopplung von Kardiomyozyten. In der Aorta wird Cx40 im Endothel exprimiert<br />
(57, 151, 152), daher wurden Vorhof und Aorta <strong>zu</strong>nächst als Positivkontrollen verwendet.<br />
Wie erwartet wurde Cx40 im Vorhof und der Aorta von C57BL/6 Mäusen exprimiert (Abb. 3.1<br />
A,C), in Cx40-defizienten Mäusen war Cx40 hingegen nicht detektierbar (Abb 3.1 B,D). Cx40<br />
wurde in der Aorta an den Zellgrenzen der Endothelzellen lokalisiert, die anhand ihrer<br />
longitudinalen Ausrichtung entlang der luminalen Gefäßoberfläche identifiziert werden<br />
konnten.
ERGEBNISSE 51<br />
A<br />
Cx40 +/+<br />
B<br />
Cx40 -/-<br />
Vorhof<br />
Aorta<br />
C<br />
D<br />
Abb.3.1: Connexin40 Expression in Vorhof und Aorta in C57BL/6 und Cx40 defizienten Mäusen.<br />
Spezifische Connexin-Färbung in Kardiomyozyten des Vorhofs (A) und Endothelzellen der Aorta (C).<br />
Abbildung C zeigt eine luminale Aufsicht auf die Aorta. Cx40 wurde an den Grenzen der<br />
Endothelzellen nachgewiesen, die durch ihre longitudinale Ausrichtung entlang des Gefäßes<br />
identifiziert werden konnten. B,D: Die Behandlung von Präparaten aus Cx40 defizienten Mäusen<br />
zeigte wie erwartet keine detektierbare Färbung. Balken entspricht 50µm.<br />
Die Detektion von Cx40 in den Arteriolen des Cremasters erfolgte am ganzen<br />
Muskelpräparat. Die Behandlung mit Cx40-Antikörpern ergab eine spezifische Färbung von<br />
Cx40 (Abb. 3.2). In den Arteriolen des M. cremaster konnte Cx40 ebenfalls an den<br />
Zellgrenzen der Endothelzellen lokalisiert werden (Abb. 3.2 A-D). Die Spezifität der Färbung<br />
wurde durch das Fehlen eines Signals in Cx40 defizienten Mäusen (Abb.3.2 E) sowie durch<br />
Immunfluoreszenz in einem Muskel einer Wildtypmaus, der als Negativkontrolle nicht mit<br />
dem primären Antikörper inkubiert wurde, (Abb. 3.2 F) gezeigt.
ERGEBNISSE 52<br />
Abb. 3.2: Connexin40 Expression in Arteriolen des M. cremaster der Maus.<br />
Gezeigt sind Cx40-Färbung (rot) und Kernfärbung (blau). A-D: Cx40 Färbung in Arteriolen<br />
unterschiedlicher Größe im Wildtyp. Die Kernfärbung zeigt die Zellkerne von glatten Muskelzellen<br />
perlenschnurartig entlang des Gefäßes aufgereiht sowie längliche Endothelzellkerne (B). Die<br />
Lokalisation von Cx40 an den Zellgrenzen der Endothelzellen ist deutlich sichtbar. E: Cx40-Expression<br />
und Kernfärbung in einer Cx40 defizienten Maus. Wie <strong>zu</strong> erwarten wird Cx40 nicht exprimiert. F: Als<br />
Negativkontrolle wurde der Cremaster (Wildtyp) ohne primären Antikörper inkubiert. Der sekundäre<br />
Antikörper verursacht keine unspezifische Färbung. Die Pfeile zeigen den Gefäßverlauf (E,F). Balken<br />
entspricht 20µm.
ERGEBNISSE 53<br />
3.1.2 Acetylcholin und KCl-induzierte Fortleitung bei endothelialer Cx40 Defizienz<br />
Homologe Rekombination ermöglicht es, spezifisch bestimmte Gene in der Keimbahn von<br />
Mäusen <strong>zu</strong> mutieren und somit aus<strong>zu</strong>schalten (153, 154). Die Funktion einzelner Proteine<br />
kann so in vivo untersucht werden. Um die Geninaktivierung auf bestimmte<br />
Zellsubpopulation <strong>zu</strong> begrenzen, stehen Systeme für ein konditionelles, zelltypspezifisches<br />
Gen-Targeting (155) <strong>zu</strong>r Verfügung. Das Cre-lox-System macht sich eine<br />
sequenzspezifische Rekombinase aus dem Cre/loxP Rekombinationssystem des<br />
Bakteriophagen P1 <strong>zu</strong>nutze. Es benötigt zwei Komponenten: das rekombinierende Protein<br />
Cre-Rekombinase sowie die Cre-spezifische Erkennungssequenz loxP (156, 157) Zur<br />
Generierung konditioneller „Knockouts“ wird ein Target-Konstrukt mit zwei die Zielsequenz<br />
flankierenden loxP-Stellen verwendet. Kreu<strong>zu</strong>ng der loxP-tragenden Maus mit einer<br />
transgenen Maus, die das Gen für die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines<br />
zelltypspezifischen Promotors exprimiert (endothelialer Promotor: Tie-2), führt <strong>zu</strong>m<br />
Herausschneiden der von loxP-flankierten Zielsequenz (Cx40) im Zielgewebe (Endothel)<br />
(155). Basierend auf diesem System wurden Mäuse mit einem endothelialen Cx40-Verlust<br />
untersucht. Die Mäuse waren außerdem homozygot defizient für ApoE und hatten einen<br />
C57BL/6 Hintergrund. Sie wurden freundlicherweise von Dr. Kwak, Division of Cardiology,<br />
University of Geneve, <strong>zu</strong>r Verfügung gestellt. Es wurden 5 Mäuse mit einem endothelialen<br />
Cx40-Verlust (eCx40-/-) und als Kontrolle 2 Mäuse mit einem gefloxten Cx40-Gen ohne Cre -<br />
Rekombinase untersucht.<br />
Wie bereits von unserer Arbeitsgruppe gezeigt wurde, ist die Ausbreitung von ACh-<br />
Dilatationen in Cx40-defizienten Mäusen beeinträchtigt, wohingegen die Ausbreitung von<br />
KCl-induzierten Konstriktionen nicht beeinflußt wird. Dies könnte durch unterschiedliche<br />
Ausbreitungswege entlang der endothelialen oder glattmuskulären Zellschicht bedingt sein.<br />
Daher wurde der Effekt eines endothelialen Cx40-Verlustes auf die Fortleitung von<br />
Vasomotorantworten untersucht, indem Gefäße lokal mit ACh oder KCl stimuliert wurden.<br />
Die untersuchten Gefäße (n = 10) hatten einen maximalen Durchmesser von 25 bis 40 µm<br />
(Mittelwert: 32 ± 1 µm). Lokalisierte Applikation von ACh induzierte sowohl in Kontrolltieren<br />
als auch in eCx40-/- Tieren nach 2 ± 0.2 s eine rasche Dilatation, deren Maximum nach 11 ±<br />
2 bzw. 9 ± 1 s in Cx40+/+ oder eCx40-/- Tieren erreicht wurde (Abb. 3.3 A). Die lokale<br />
Dilatation breitete sich ohne zeitliche Verzögerung (
ERGEBNISSE 54<br />
A<br />
% der maximalen Dilatation<br />
ACh Kontrolle<br />
90<br />
eCx40 ko<br />
60<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit Zeit [s] [s]<br />
Zeit [s]<br />
B<br />
% der maximalen Antwort<br />
30<br />
0<br />
-30<br />
KCl<br />
lokal 275µm<br />
550µm 775µm<br />
1100µm<br />
0 60 0 60 0 60 0 60 0 60<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.3: Fortgeleitete Vasomotorantworten in eCx40 defizienten Mäusen.<br />
Die Arteriolen wurden lokal mit ACh oder KCl stimuliert. Dargestellt sind die Durchmesseränderungen<br />
an der lokalen Position und (nach erneuter lokaler Stimulation) an den entfernten Positionen<br />
stromaufwärts von der Stimulationsstelle über die Zeit. A: Lokalisierte Stimulation mit ACh führte <strong>zu</strong><br />
einer raschen Dilatation, die sich entlang des Gefäßes in die Entfernung ausbreitet. B: Lokale<br />
Stimulation der Arteriolen mit KCl löste eine fortgeleitete Konstriktion aus. Kontrolle: n=3 Gefäße in 2<br />
Mäusen, eCx40-/-: n= 7 Gefäße in 4 Mäusen<br />
In der eCx40-/- Gruppe erfolgte eine stärkere lokale Stimulation mit ACh als in der<br />
Kontrollgruppe (79 ± 3 vs 65 ± 2 % der maximalen Dilatation, p
ERGEBNISSE 55<br />
Applikation von KCl führte in beiden Gruppen <strong>zu</strong> einer raschen Konstriktion an der lokalen<br />
Stelle (51 ± 6 bzw. 51 ± 4 % der maximalen Antwort). Dieses Maximum wurde in den<br />
Kontrolltieren nach 4 ± 0.6 s und in eCx40-/- Tieren ebenfalls nach 4 ± 0.4 s erreicht und<br />
unterschied sich somit nicht. Auch die Dauer der lokalen Konstriktion war in beiden Gruppen<br />
gleich (Abb. 3.4 B). Die Konstriktion breitete sich ohne zeitliche Verzögerung entlang der<br />
Arteriole aus (Abb. 3.3 B), wobei die Amplitude mit <strong>zu</strong>nehmender Entfernung in beiden<br />
Gruppen in identischer Weise abnahm (Abb. 3.5). Interessanterweise war die Entfernung,<br />
über die sich die Konstriktion erstreckte, deutlich kleiner als dies bei den ACh-induzierten<br />
Dilatationen <strong>zu</strong> beobachten war (Abb.3.4 B). Dies läßt vermuten, dass unterschiedliche<br />
Fortleitungswege an der Ausbreitung von Dilatationen und Konstriktionen beteiligt sind. Da<br />
der endotheliale Cx40-Verlust nur die Ausbreitung der Dilatation modifiziert, steht das<br />
Endothel als Leitungsweg hierbei wahrscheinlich im Vordergrund und benötigt Cx40.<br />
A<br />
ACh<br />
B<br />
KCl<br />
% der maximalen Dilatation<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
Amplitude<br />
*<br />
*<br />
% der maximalen Antwort<br />
-60<br />
-50<br />
-40<br />
-30<br />
-20<br />
-10<br />
Amplitude<br />
0<br />
0 550 1100<br />
0<br />
0 275 550 825 1100<br />
60<br />
Dauer<br />
Kontrolle<br />
eCx40-/-<br />
30<br />
Dauer<br />
Kontrolle<br />
eCx40-/-<br />
Zeit [s]<br />
40<br />
20<br />
*<br />
*<br />
Zeit [sec]<br />
20<br />
10<br />
0<br />
0 550 1100<br />
Entfernung von der Stimulationsstelle [µm]<br />
0<br />
0 275 550 825 1100<br />
Entfernung von der Stimulationsstelle [µm]<br />
Abb. 3.4: Amplitude und Dauer der Ausbreitung von lokal induzierten ACh und KCl Antworten.<br />
Amplitude (oben) und Dauer (unten) der ACh-Dilatationen (A) und der KCl-induzierten Konstriktionen<br />
(B) entlang der Arteriole. Kontrolle n = 3 - 4 in 2 Mäusen, eCx40-/- n = 7 - 8 in 5 Tieren. * t-Test p ≤<br />
0.01 vs lokal.
ERGEBNISSE 56<br />
ACh<br />
Amplitude<br />
KCl<br />
Amplitude<br />
% der lokalen Antwort<br />
100<br />
50<br />
0<br />
eCx40+/+<br />
eCx40-/-<br />
0 550 1100<br />
*<br />
% der lokalen Antwort<br />
100<br />
50<br />
0<br />
eCx40+/+<br />
eCx40-/-<br />
0 275 550 825 1100<br />
Entfernung von der Stimulationsstelle [µm]<br />
Entfernung von der Stimulationsstelle [µm]<br />
Abb. 3.5: Amplitude nach Normalisierung der Antworten.<br />
Dargestellt sind die Gefäßantworten entlang der Arteriole nach Normalisierung auf die lokal induzierte<br />
Antwort. Die Dilatation nach ACh-Stimulation nahm in eCx40-/- Tieren über die Strecke ab, was in der<br />
Kontrolle nicht <strong>zu</strong> beobachten war. Die Amplitude der Konstriktion nach KCl nahm in beiden Gruppen<br />
mit der Entfernung monoton ab. * t-Test p ≤ 0.01 vs lokal.<br />
3.1.3 Bedeutung von K Ca als Effektoren lokaler und fortgeleiteter Dilatationen<br />
Die endotheliale Hyperpolarisation ist das zentrale Ereignis bei der Auslösung von ACh<br />
induzierten Dilatationen. Die endotheliale Hyperpolarisation beruht auf einer Aktivierung von<br />
K Ca -Kanälen. In vaskulären Zellen werden unterschiedliche K Ca -Kanäle exprimiert, die<br />
aufgrund ihrer Leitfähigkeit in BK Ca - (große Leitfähigkeit), IK Ca - (mittlere Leitfähigkeit) und<br />
SK Ca -Kanäle (kleine Leitfähigkeit) unterschieden werden. Spezifische Blocker hemmen<br />
selektiv diese Kanäle, Apamin und UCL1684 SK Ca -, Charybdotoxin BK Ca - und IK Ca - und<br />
Iberiotoxin BK Ca -Kanäle. Die Rolle von K Ca als Effektoren von Dilatationen, die durch<br />
Agonisten (Acetylcholin, Bradykinin oder Adenosin) ausgelöst werden, sollte in Tieren<br />
defizient für BK Ca - oder IK Ca -Kanälen in Kombination mit diesen Blockern untersucht werden.<br />
3.1.3.1 Beteiligung von BK Ca an der Auslösung und Fortleitung von Dilatationen<br />
Die untersuchten Mäuse waren defizient für die porenbildende Untereinheit des BK Ca -Kanals<br />
(BK-/-). Der genetische Hintergrund der Tiere war eine Kombination aus SV129 und C57BL/6<br />
(immer F2-Generation, 18 Tiere).<br />
3.1.3.1.1 Ruhetonus in BK Ca defizienten Mäusen<br />
Der Gefäßtonus wurde berechnet, indem das Verhältnis aus Ruhedurchmesser und<br />
maximalem Durchmesser der Arteriolen gebildet wurde. In diese Berechnung wurden<br />
ausschließlich Gefäße einbezogen, die in den Experimenten <strong>zu</strong>r globalen Stimulation mit
ERGEBNISSE 57<br />
Tabelle 3.1: Ruhetonus in Arteriolen von BK-/-, BK+/+ und C57BL/6 Mäusen.<br />
Angegeben ist die Anzahl der Gefäße (n) und deren spontaner Kontraktions<strong>zu</strong>stand (Tonus), der sich<br />
aus dem Ruhedurchmesser und dem maximalen Durchmesser (Maximum, angegeben in µm)<br />
errechnet. Der Tonus ist angegeben für unbehandelte Arteriolen (Kontrolle) und nach Hemmung der<br />
NO-Synthase und Cyclooxygenase (LNA, 30 µM, Indo, 3 µM) sowie nach Blockade des BK Ca -Kanals<br />
mit Iberiotoxin (Ibtx, 0.1 µM). * t-Test p≤ 0.01 vs Kontrolle.<br />
n Maus Behandlung Tonus Durchmesser Maximum<br />
50 BK+/+ Kontrolle 0.36 ± 0.02 14 ± 1 39 ± 1<br />
47 BK-/- Kontrolle 0.41 ± 0.02 15 ± 1 36 ± 2<br />
79 BK+/+ Indo LNA 0.25 ± 0.02 * 9 ± 1 37 ± 1<br />
55 BK-/- Indo LNA 0.27 ± 0.02 * 10 ± 1 35 ± 2<br />
21 Bl6 Indo LNA 0.22 ± 0.03 6 ± 1 29 ± 2<br />
49 BK+/+ Indo LNA Ibtx 0.24 ± 0.02 9 ± 1 34 ± 2<br />
21 Bl6 Indo LNA Ibtx 0.24 ± 0.04 8 ± 2 29 ± 2<br />
ACh untersucht wurden, wobei der Ruhedurchmesser den Durchmesser vor Stimulation mit<br />
den Agonisten darstellt. Die maximalen Durchmesser der untersuchten Gefäße waren in<br />
BK-/- und deren Wildtypwurfgeschwister identisch. Somit wurden Gefäße gleicher<br />
Generationen untersucht. Der Tonus in diesen Arteriolen war in BK Ca -defizienten Tieren nicht<br />
unterschiedlich <strong>zu</strong> den Wildtypen (Tabelle 3.1). Hemmung der NO-Synthase und<br />
Cyclooxygenase (L-Nitroarginin und Indomethacin, LNA Indo) führte in beiden Genotypen <strong>zu</strong><br />
einer signifikanten Erhöhung des Tonus. Eine <strong>zu</strong>sätzliche Blockade von BK Ca mit Iberiotoxin<br />
hatte weder in BK+/+, BK-/- noch in BL6 einen Effekt auf den Ruhetonus. Dies zeigt, dass<br />
die basale Aktivität des BK Ca den Ruhedurchmesser nicht beeinflußt, wohingegen NO und/<br />
oder Prostazyklin-Synthese kontinuierlich erfolgt und dilatierend ist.<br />
3.1.3.1.2 Rolle von BK Ca als Effektor der NO und cGMP induzierten Dilatation<br />
Die Aktivierung des NO/cGMP/Proteinkinase G Signaltransduktionsweges führt <strong>zu</strong> einer<br />
Relaxation von glatten Muskelzellen, die in einigen Präparationen partiell über eine<br />
Aktivierung von BK Ca -Kanälen erfolgt. Deshalb sollte die Beteiligung von BK Ca bei NO und<br />
cGMP-Dilatationen in Arteriolen getestet werden. Hier<strong>zu</strong> wurde die Dilatation nach globaler<br />
Superfusion von NO-Donoren (DEA NONOate und SNP, 0.3-10 µM) sowie dem<br />
zellpermeablen cGMP Derivat 8-pCPT-cGMP (1-10 µM) in BK Ca -defizienten Tieren und<br />
Wildtypen untersucht. In BK+/+ Tieren wurden 50 Arteriolen mit einem maximalen<br />
Durchmesser von 39 ± 1 µm untersucht, in BK-/- 47 Arteriolen. Der maximale<br />
Gefäßdurchmesser betrug 36 ± 2 µm und unterschied sich nicht zwischen den Gruppen. Der<br />
NO-Donor SNP bewirkte in beiden Gruppen eine konzentrationsabhängige Dilatation. Das<br />
Ausmaß der SNP-induzierten Dilatation war bei einer Konzentration von 10µM in den BK Ca -/-
ERGEBNISSE 58<br />
% der maximalen Dilatation<br />
75<br />
50<br />
25<br />
0<br />
BK+/+<br />
BK-/-<br />
SNP<br />
*<br />
% der maximalen Dilatation<br />
75<br />
50<br />
25<br />
DEA NONOate<br />
8-pCPT-cGMP<br />
0<br />
0<br />
0.3 1 10 µM 0.3 1 10 µM<br />
1 10 µM<br />
% der maximalen Dilatation<br />
75<br />
50<br />
25<br />
Abb. 3.6 NO induzierte Dilatationen in Tieren defizient für BK Ca -Kanäle<br />
Globale Stimulation mit steigenden Konzentrationen der NO Donoren SNP und DEA NONOate sowie<br />
des zellpermeablen cGMP Analogon 8-pCPT-cGMP induzierte konzentrationsabhängige Dilatationen<br />
in beiden Genotypen. Die Gefäßantwort war in BK-/- Tieren nicht abgeschwächt. BK+/+: n=50 Gefäße<br />
in 5 Tieren, BK-/-: n=47 Gefäße in 5 Tieren. * t-Test p ≤ 0.01 vs BK+/+.<br />
Tieren signifikant erhöht (43 ± 4 vs 61 ± 4 % der maximalen Dilatation). Ein chemisch<br />
unterschiedlicher NO-Donor, DEA NONOate, induzierte ebenfalls eine<br />
konzentrationsabhängige Dilatation in den Arteriolen, die in BK Ca +/+ und BK Ca -/- Mäusen<br />
aber nicht unterschiedlich war (10 µM: 61 ± 4 vs 63 ± 4 % der maximalen Dilatation). Das<br />
zellpermeable cGMP-Derivat 8-pCPT-cGMP bewirkte ebenfalls eine<br />
konzentrationsabhängige Dilatation von ähnlichem Ausmaß in beiden Gruppen (10 µM: 21 ±<br />
4 vs 23 ± 2 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.6). Diese Ergebnisse zeigen, dass BK Ca -<br />
Kanäle als Effektoren von NO-induzierten Dilatationen in der Mikrozirkulation keine Rolle<br />
spielen.<br />
3.1.3.1.3 Beteiligung von BK Ca an Dilatationen nach ACh und Adenosin<br />
Um die Rolle der BK Ca als Effektoren von ACh und Adenosin induzierten Dilatationen <strong>zu</strong><br />
untersuchen, wurden die Arteriolen global mit steigenden Konzentrationen der Agonisten<br />
stimuliert (0.3-10 µM) und die Dilatation in BK+/+ (n = 50 Gefäße in 5 Tieren) und BK-/-<br />
(n = 47 Gefäße in 5 Tieren) untersucht. Acetylcholin induzierte in Wildtypen und BK Ca<br />
defizienten Tieren eine konzentrationsabhängige Dilatation, die durch BK Ca -Defizienz nicht<br />
abgeschwächt wurde. 10 µM ACh induzierte in BK+/+ Tieren 79 ± 4 und in BK-/- Mäusen<br />
73 ± 4 % der maximalen Dilatation. Adenosin induzierte-Dilatationen waren in BK-/- Mäusen<br />
ebenfalls unverändert (10 µM: 48 ± 4 vs 52 ± 5 % der maximalen Dilatation). Nur bei einer<br />
Konzentration von 0.3 µM war die Dilatation in BK-/- Mäusen signifikant stärker (5 ± 3 vs<br />
19 ± 4 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.7).
ERGEBNISSE 59<br />
% der maximalen Dilatation<br />
90<br />
60<br />
30<br />
0<br />
% der maximalen Dilatation<br />
90<br />
60<br />
30<br />
0<br />
ACh<br />
BK+/+<br />
BK-/-<br />
-7 -6 -5<br />
Adenosin<br />
BK+/+<br />
BK-/-<br />
*<br />
-7 -6 -5<br />
[log mol/l]<br />
[log mol/l]<br />
Abb 3.7: Dilatationen nach globaler Stimulation mit ACh und Adenosin.<br />
Die Dilatation ist dargestellt als % der maximalen Dilatation in Abhängigkeit von der Konzentration von<br />
ACh (links) und Adenosin (rechts) nach globaler Stimulation. Die ACh und Adenosin induzierten<br />
Dilatationen waren in BK Ca -defizienten Tieren nicht abgeschwächt. BK+/+: n=50 Gefäße in 5 Tieren<br />
BK-/-: n=47 Gefäße in 5 Tieren. * t-test p ≤ 0.01 vs BK+/+.<br />
Acetylcholin induzierte in Wildtypen und BK Ca -defizienten Tieren eine<br />
konzentrationsabhängige Dilatation, die durch BK Ca -Defizienz nicht abgeschwächt wurde.<br />
10 µM ACh induzierte in BK+/+ Tieren 79 ± 4 und in BK-/- Mäusen 73 ± 4 % der maximalen<br />
Dilatation. Adenosin induzierte-Dilatationen waren in BK-/- Mäusen ebenfalls unverändert<br />
(10 µM: 48 ± 4 vs 52 ± 5 % der maximalen Dilatation). Nur bei einer Konzentration von<br />
0.3 µM war die Dilatation in BK-/- Mäusen signifikant stärker (5 ± 3 vs 19 ± 4 % der<br />
maximalen Dilatation, Abb. 3.7).<br />
3.1.3.1.4 Fortleitung von ACh Dilatationen in BK Ca defizienten Mäusen<br />
Um die Rolle von BK Ca -Kanälen bei der Ausbreitung von lokal induzierten fortgeleiteten ACh-<br />
Dilatationen <strong>zu</strong> untersuchen, wurde die Fortleitung in BK+/+ Tieren (n=8 Arteriolen in 6<br />
Tieren) und BK-/- Tieren (n= 12 Arteriolen in 9 Tieren) untersucht . Die lokale Applikation von<br />
ACh mittels eines Druckpulses (1,4bar; 100-300ms) über eine Mikropipette führte <strong>zu</strong> einer<br />
raschen lokalen Dilatation in Wildtypen und BK-/- Mäusen. Die Amplitude der lokalen<br />
Dilatation war in BK-/- Mäusen (54 ± 3 % der maximalen Dilatation) verglichen mit Wildtypen<br />
(64 ± 4 % der maximalen Dilatation) geringfügig, aber signifikant erniedrigt. Die Dilatation<br />
breitete sich in beiden Gruppen ohne zeitliche Verzögerung (
ERGEBNISSE 60<br />
% der maximalen Dilatation<br />
ACh<br />
BK+/+<br />
90<br />
BK-/-<br />
60<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s] Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.8: Ausbreitung von ACh Dilatationen in BK Ca defizienten Tieren.<br />
ACh wurde lokal über eine Mikropipette an das Gefäß als Bolus appliziert (vertikale Linie). Die<br />
Abbildungen zeigen von links nach rechts die Dilatation an der lokalen, sowie an entfernten Positionen<br />
(550 und 1100µm) stromaufwärts von der Stimulationsstelle über die Zeit. Die Applikation von ACh<br />
induziert eine lokale Dilatation, die sich entlang der Arteriole ausbreitet. Obwohl die lokale Dilatation in<br />
BK-/-Tieren marginal abgeschwächt war, ist die Dilatation an den entfernten Positionen nicht<br />
verschieden. BK+/+: n=7 Gefäße in 5 Tieren; BK-/-: n=6 Gefäße in 4 Tieren. * t-Test p ≤ 0.05 vs<br />
BK+/+.<br />
3.1.3.1.5 Rolle von NO und Prostacyclin bei ACh induzierten Dilatationen in BK Ca defizienten<br />
Mäusen<br />
Möglicherweise kommt es in BK-/- Tieren <strong>zu</strong> einer kompensatorisch erhöhten NO- und<br />
Prostazyklin-Freiset<strong>zu</strong>ng. Um dies <strong>zu</strong> untersuchen, wurden Arteriolen nach<br />
pharmakologischer Blockade der NO-Synthase (L-NA) und Cyclooxygenase (Indo) in BK Ca<br />
defizienten Mäusen und Wildtypen mit ACh stimuliert. Die Arteriolen wurden nach 20<br />
Minuten mit den Hemmstoffen inkubiert und dann bei kontinuierlicher Superfusion der<br />
Blocker mit Acetylcholin stimuliert. In Experimenten mit globaler Stimulation erfolgte die<br />
Bestimmung der Kontrollantworten in Wildtypen an 50 Arteriolen in 5 Tieren, die Gefäße<br />
hatten einen maximalen Durchmesser von 39 ± 1 µm. Nach Behandlung mit Indo und LNA<br />
wurden 79 Arteriolen in 8 Tieren mit einem maximalen Durchmesser von 37 ± 1 µm<br />
untersucht. In BK Ca -defizienten Tieren wurden 47 Arteriolen in 5 Tieren mit einem maximalen<br />
Durchmesser von 36 ± 2 µm bzw. 55 Arteriolen in 6 Tieren mit einem maximalen<br />
Durchmesser von 35 ± 2 µm (Indo und LNA) untersucht. Die Hemmung der NO-Synthase<br />
und Cyclooxygenase führte in beiden Genotypen <strong>zu</strong> einer signifikanten Konstriktion (BK+/+:<br />
von 14 ± 1 auf 9 ± 1 µm, BK-/- von 15 ± 1 auf 10 ± 1 µm). Der Ruhetonus war somit in beiden<br />
Genotypen vor und nach Hemmung der NO-Synthase und Cyclooxygenase gleich (Tabelle<br />
3.1). Dies zeigt, dass die basale Freiset<strong>zu</strong>ng dieser Autakoide unverändert ist. Die globale<br />
Stimulation mit steigenden Acetylcholinkonzentrationen (0.3 - 10 µM) führte in beiden<br />
Gruppen auch in diesen Versuchsgruppen <strong>zu</strong> einer konzentrationsabhängigen Dilatation<br />
(Abb.3.9). Obwohl die Hemmung von NO-Synthase und Cyclooxygenase die<br />
Ruhedurchmesser der Gefäße verringerte, wurde die durch ACh-induzierte Dilatation der<br />
Gefäße in BK+/+ und BK-/- Tieren nicht signifikant beeinträchtigt (Abb. 3.9)
ERGEBNISSE 61<br />
% der maximalen Dilatation<br />
90 BK+/+<br />
90 BK-/-<br />
60<br />
30<br />
0<br />
-7 -6 -5<br />
ACh [log mol/l]<br />
Kontrolle<br />
Indo LNA<br />
% der maximalen Dilatation<br />
60<br />
30<br />
0<br />
Kontrolle<br />
Indo LNA<br />
-7 -6 -5<br />
ACh [log mol/l]<br />
Abb. 3.9: ACh Dilatationen in BK-/- nach Hemmung von Cyclooxygenase und NO-Synthase.<br />
Dargestellt ist die Dilatation in Abhängigkeit von der ACh-Konzentration. Globale Stimulation mit ACh<br />
führt sowohl in Wildtypen als auch in BK-/- Mäusen <strong>zu</strong> einer konzentrationsabhängigen Dilatation, die<br />
durch Superfusion von Hemmstoffen der NO-Synthase (L-NA) und Cyclooxygenase (Indo) nicht<br />
signifikant verändert wurde. BK+/+: n= 50 in 5 bzw n= 79 in 8 Tieren (Indo und L-NA); BK-/-: n= 47 in 5<br />
bzw n= 55 in 6 Tieren (Indo und L-NA).<br />
In ähnlicher Form wurde die Beteiligung von NO und Prostazyklin bei der Ausbreitung von<br />
lokal induzierten ACh Dilatationen untersucht. Es wurden 5 Arteriolen in 3 Mäusen mit einem<br />
maximalen Durchmesser von 37 ± 2 µm (BK+/+) und 10 Arteriolen in 8 Tieren mit einem<br />
maximalen Durchmesser von 38 ± 1 µm (BK-/-) untersucht. Die lokale Stimulation mit<br />
Acetylcholin erfolgte mittels Druckpuls (140 kPa) bei einer Stimulationsdauer von<br />
100 - 300 ms. Wie bereits gezeigt (3.1.3.1.4), induzierte ACh in Wildtypen und BK-/- Mäusen<br />
eine lokale Dilatation, die sich rasch entlang der Arteriole ausbreitete (Abb. 3.10).<br />
In Wildtypen hatte die Hemmung von NO- und Prostazyklinsynthese weder einen Effekt auf<br />
die lokal induzierte ACh Dilatation noch auf deren Ausbreitung (maximale Amplitude in<br />
BK+/+: lokal 60 ± 4 vs 52 ± 5 %, 550 µm 47 ± 4 vs 45 ± 5 %, 1100 µm 45 ± 7 vs 44 ± 5 % der<br />
maximalen Dilatation). In BK Ca -defizienten Tieren war die Amplitude der lokalen Antwort zwar<br />
nach LNA und Indo signifikant abgeschwächt (BK-/- lokal: 53 ± 3 vs 35 ± 4 % der maximalen<br />
Dilatation), die Ausbreitung des Signals in die entfernten Positionen blieb jedoch nach<br />
Hemmung der Cyclooxygenase und NO-Synthase unbeeinträchtigt, da die maximale<br />
Amplitude der Dilatation mit der Entfernung nicht stärker abnahm als dies in unbehandelten<br />
BK-/- Tieren der Fall war (BK-/-: 550 µm 44 ± 4 vs 30 ± 3, 1100 µm 38 ± 5 vs 22 ± 2 % der<br />
maximalen Dilatation, Abb. 3.10:). Somit findet sich ein Unterschied zwischen den<br />
Genotypen nur nach Behandlung mit Indo und LNA. Da nach globaler Stimulation kein<br />
signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle und Behandlung mit Indo und LNA <strong>zu</strong> finden<br />
war, ist dies vermutlich auf ein unterschiedliches Ausmaß der lokalen Stimulation<br />
<strong>zu</strong>rück<strong>zu</strong>führen. Die Dauer der Dilatation wurde durch die Behandlung mit Indo und LNA
ERGEBNISSE 62<br />
kaum beeinträchtigt, lediglich an der lokalen Position war eine Verkür<strong>zu</strong>ng <strong>zu</strong> beobachten<br />
(Abb.3.11). Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass NO und Prostazyklin weder im<br />
Wildtyp noch kompensatorisch in BK-/- als Mediatoren der ACh-Dilatation von Bedeutung<br />
sind und auch die Ausbreitung der Dilatation nicht auf diesen Autakoiden beruht.<br />
% der maximalen Dilatation<br />
% der maximalen Dilatation<br />
BK+/+<br />
ACh<br />
Kontrolle<br />
90<br />
Indo LNA<br />
60<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
BK-/-<br />
ACh<br />
90<br />
60<br />
30<br />
*<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Kontrolle<br />
Indo LNA<br />
*<br />
*<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s] [s]<br />
Zeit Zeit [s] [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.10: Ausbreitung von Dilatationen in BK-/- nach Hemmung der NO- und<br />
Prostazyklinsynthese.<br />
ACh wurde lokal über eine Mikropipette an das Gefäß appliziert (vertikale Linie). Die Abbildungen<br />
zeigen von links nach rechts die Dilatation an der lokalen und an entfernten Positionen (550 und<br />
1100µm über die Zeit. Hemmung der Cyclooxygenase und NO-Synthase (Indo und LNA) veränderte<br />
die Amplitude der Dilatation im Wildtyp nicht. Demgegenüber war die Dilatation in BK-/- Tieren<br />
hierdurch an allen Positionen abgeschwächt, die Ausbreitung selbst blieb jedoch unverändert. Dies ist<br />
am ehesten mit einer reduzierten lokalen Stimulation vereinbar, da die Dilatation nach globaler<br />
Stimulation unverändert war (Abb. 3.9). BK+/+: n = 5 Arteriolen in 3 Tieren, BK-/-: 10 in 8 Tieren, *<br />
p
ERGEBNISSE 63<br />
% der maximalen Dilatation<br />
Zeit [s]<br />
90<br />
60<br />
30<br />
0<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
#<br />
*<br />
Amplitude<br />
* # BK+/+<br />
*<br />
#<br />
#<br />
0 550 1100 [µm]<br />
BK-/-<br />
Dauer<br />
BK+/+ Indo LNA<br />
BK-/- Indo LNA<br />
*<br />
Abb. 3.11: Amplitude und Dauer<br />
der fortgeleiteten ACh induzierten<br />
Dilatationen<br />
Dargestellt ist die Amplitude (oben)<br />
und die Dauer (unten) der<br />
fortgeleiteten Dilatationen nach<br />
lokaler Stimulation mit ACh in BK+/+<br />
und BK-/- Mäusen vor und nach<br />
Hemmung der NO- und<br />
Prostazyklinsynthese. Die Amplitude<br />
war nach Indo und LNA lediglich in<br />
BK-/- Mäusen abgeschwächt. Da<br />
dies an allen Positionen<br />
gleichmäßig der Fall war, ist die<br />
Ausbreitung des Signals entlang der<br />
Arteriole jedoch nicht beeinträchtigt.<br />
Die Dauer der Dilatation war im<br />
Wildtyp durch Behandlung mit Indo<br />
und L-NA lokal verkürzt. Anzahl der<br />
Beobachtungen siehe Abb. 3.10<br />
* P
ERGEBNISSE 64<br />
Durchmesser von 29 ± 2 µm untersucht. Die Superfusion von Iberiotoxin (0.1 µM) hatte<br />
keinen Einfluß auf den Ruhetonus der Gefäße (BL6: 0.22 ± 0.03 vs 0.24 ± 0.04, BK+/+: 0.27<br />
± 0.02 vs 0.24 ± 0.02, Tabelle 3.1). In BK+/+ Mäusen (C57BL/6 / SV129 Mischhintergrund)<br />
führte die Superfusion steigender ACh Konzentrationen (0.3 - 10 µM), wie in den<br />
vorhergehenden Versuchen, <strong>zu</strong> einer konzentrationsabhängigen Dilatation. Nach Inkubation<br />
mit Iberiotoxin blieb die Dilatation in diesen Tieren unbeeinflußt. Die Superfusion des NO-<br />
Donors SNP führte ebenfalls <strong>zu</strong> einer Dilatation (10 µM: von 9 ± 1 auf 22 ± 1 µm), die nach<br />
Iberiotoxin ebenfalls nicht beeinträchtigt wurde (von 8 ± 1 auf 20 ± 2 µm, Abb. 3.12). In<br />
C57BL/6 Mäusen induzierte ACh ebenfalls eine konzentrationsabhängige Dilatation, die aber<br />
nach Iberiotoxin signifikant reduziert war (Abb. 3.12). Im Gegensatz <strong>zu</strong>m ACh wurde die<br />
endothelunabhängige Dilatation (SNP, 10 µM) nicht beeinflußt. Somit ist die durch SNP<br />
induzierte Dilatation in der Mikrozirkulation beider Mausstämme nicht durch eine Aktivierung<br />
von BK Ca vermittelt. Im Gegensatz da<strong>zu</strong> ist die ACh Dilatation einerseits vermittelt durch die<br />
Aktivierung des BK Ca -Kanals (C57BL/6) und andererseits von diesen Kanälen unabhängig<br />
(C57BL/6 / SV129 Mischhintergrund).<br />
BK+/+<br />
% der maximalen Dilatation<br />
% der maximalen Dilatation<br />
90<br />
60<br />
ACh<br />
90<br />
60<br />
SNP<br />
30<br />
30<br />
Indo LNA<br />
Indo LNA Ibtx<br />
0<br />
0<br />
-7 -6 -5<br />
-5<br />
[log mol/l]<br />
[log mol/l]<br />
C57BL/6<br />
90<br />
60<br />
ACh<br />
90<br />
60<br />
SNP<br />
30<br />
* 30 Indo LNA<br />
*<br />
*<br />
Indo LNA Ibtx<br />
0<br />
0<br />
-7 -6 -5<br />
-5<br />
[log mol/l]<br />
[log mol/l]<br />
Abb. 3.12: Effekt von Iberiotoxin<br />
auf ACh und SNP-induzierte<br />
Dilatationen in unterschiedlichen<br />
Mausstämmen.<br />
Dargestellt ist die Dilatation in<br />
abhängigkeit von der<br />
Konzentration des Agonisten.<br />
Während Iberiotoxin in BK+/+<br />
Mäusen mit einem C57BL/6 /<br />
SV129 Hintergrund ohne Wirkung<br />
auf die Dilatation war (oben),<br />
reduzierte es die ACh Dilatation in<br />
C57BL/6 Mäusen (unten). Die<br />
durch den NO-Donor SNP<br />
induzierten Dilatationen blieben<br />
jeweils unbeeinträchtigt. Alle<br />
Versuche in Anwesenheit von<br />
Indo und LNA (3 bzw. 30 µM).<br />
BK+/+: n = 49 Arteriolen in 5<br />
Mäusen, C57BL/6: n = 21<br />
Arteriolen in 2 Mäusen. *p < 0.01<br />
vs Indo LNA.
ERGEBNISSE 65<br />
3.1.3.2 Beteiligung von IK Ca an der Auslösung und Fortleitung von Dilatationen<br />
Die endotheliale Hyperpolarisation als zentrales Ereignis bei der Auslösung von AChvermittelten<br />
Dilatationen beruht vermutlich auf einer Aktivierung endothelialer IK Ca und/oder<br />
SK Ca -Kanäle . Der Beitrag des IK Ca -Kanals als Effektor von ACh-, Adenosin- und SNPinduzierten<br />
Dilatationen in der Mikrozirkulation sollte in IK Ca defizienten Mäusen (IK-/-)<br />
untersucht werden. Die Tiere wiesen einen 129ola/C57BL/6 Mischhintergrund auf. Daher<br />
wurden als Kontrolltiere die Wildtypwurfgeschwister (IK+/+) mit einem identischen<br />
genetischen Hintergrund untersucht.<br />
3.1.3.2.1 Ruhetonus in IK Ca defizienten Mäusen<br />
Der Ruhetonus wurde nach Hemmung von NO- (LNA) und Prostazyklin- Synthese (Indo) in<br />
80 Arteriolen in 8 IK+/+ Tieren untersucht. Die Gefäße hatten einen Ruhedurchmesser von<br />
12 ± 1 µm bei einem maximal möglichen Durchmesser von 37 ± 1 µm. In den IK-/- Tieren<br />
wurden ebenfalls 80 Arteriolen in 8 Mäusen untersucht, deren Ruhedurchmesser 9 ± 1 µm<br />
bei einem maximal erreichbaren Durchmesser von 38 ± 1 µm betrug. Der Gefäßtonus war<br />
somit in IK-/- Mäusen (0.22 ± 0.01) im Vergleich <strong>zu</strong>r Kontrollgruppe (0.31 ± 0.02) signifikant<br />
erhöht (p
ERGEBNISSE 66<br />
% der maximalen Dilatation<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
DCEBIO [0.1µM]<br />
IK+/+<br />
IK-/-<br />
IK+/+ 0.5% DMSO<br />
Abb. 3.13: Effekt der Aktivierung von IK Ca -Kanälen auf den arteriolären Durchmesser.<br />
Die globale Stimulation mit einem Öffner von IK Ca -Kanälen (DCEBIO) führt im Wildtyp <strong>zu</strong> einer<br />
Dilatation, das Lösungsmittel (0.5% DMSO) hatte keinen Effekt. DCEBIO war in IK Ca -/- Tieren ohne<br />
Wirkung auf den Durchmesser. IK+/+: n = 30, IK-/-: n =4, DMSO: n= 60.*p< 0.01 vs IK+/+.<br />
3.1.3.2.3 Beteiligung von IK Ca als Effektor von ACh, Adenosin und SNP Dilatationen<br />
Um die Beteiligung von IK Ca als Effektor von ACh-, Adenosin- und SNP- induzierten<br />
Dilatationen <strong>zu</strong> untersuchen, wurden die Agonisten in steigenden Konzentrationen<br />
(0.1 - 10 µM) global superfundiert. Alle Experimente wurden in Anwesenheit von Indo (3 µM)<br />
und LNA (30 µM) durchgeführt, um die NO- und Prostazyklin-unabhängige Komponente der<br />
Dilatation <strong>zu</strong> betrachten. Es wurden jeweils 80 Arteriolen in 8 IK+/+ und 8 IK-/- Tieren<br />
untersucht. Die Gefäße hatten einen maximalen Durchmesser von 36 ± 1 µm in Wildtypen<br />
und 38 ± 1 µm in IK Ca -defizienten Tieren. Stimulation mit ACh induzierte im Wildyp eine<br />
konzentrationsabhängige Dilatation (Abb. 3.14). In IK Ca -defizienten Tieren führte dies<br />
ebenfalls <strong>zu</strong> einer konzentrationsabhängigen Dilatation. Im Vergleich <strong>zu</strong> den Wildtypen war<br />
die Dilatation aber vor allem im mittleren Konzentrationsbereich (0.3 - 3 µM) deutlich<br />
abgeschwächt (Abb. 3.14). Bei der höchsten untersuchten ACh-Konzentration (10 µM) war<br />
auch in diesen Tieren eine deutliche Dilatation <strong>zu</strong> beobachten (Abb. 3.14 A). Der<br />
endothelunabhängige Agonist SNP dilatierte die Arteriolen in Wildtyp und in IK Ca -defizienten<br />
Mäusen ebenfalls konzentrationsabhängig. In IK-/- Tieren war im mittleren<br />
Konzentrationsbereich eine geringe, aber signifikante Abschwächung der Dilatation <strong>zu</strong><br />
beobachten, wobei die maximale Antwort auf SNP nicht beeinträchtigt war (10 µM: 63 ± 3 vs<br />
66 ± 3 % der maximalen Dilatation, Abb.: 3.14 B). Im Gegensatz da<strong>zu</strong> war die Adenosin<br />
induzierte Dilatation in IK Ca defizienten Tieren nicht reduziert, sondern im Vergleich <strong>zu</strong>m<br />
Wildtyp sogar gering verstärkt. Die Aktivierung von IK Ca -Kanälen ist somit für die ACh<br />
induzierte Dilatation von großer Bedeutung, für die NO induzierte Dilatation jedoch von<br />
untergeordneter Bedeutung und bei Adenosin induzierten Dilatationen nicht beteiligt.
ERGEBNISSE 67<br />
% der maximalen Dilatation<br />
A B C<br />
90<br />
60<br />
30<br />
0<br />
*<br />
ACh<br />
*<br />
*<br />
IK+/+<br />
IK-/-<br />
SNP<br />
-7 -6 -5<br />
-7 -6 -5<br />
[log mol/l] [log mol/l]<br />
90<br />
* #<br />
60<br />
30<br />
0<br />
#<br />
#<br />
IK+/+<br />
IK-/-<br />
90<br />
60<br />
30<br />
0<br />
Ado<br />
-7 -6 -5<br />
[log mol/l]<br />
*<br />
IK+/+<br />
IK-/-<br />
Abb. 3.14: Dilatation auf ACh, NO und Adenosin in IK-/- Mäusen.<br />
Dargestellt ist die Dilatation nach globaler Stimulation mit verschiedenen Agonisten (A: ACh , B: SNP,<br />
C: Adenosin) in Abhängigkeit von deren Konzentration. Die konzentrationsabhängige Dilatation in IK-/-<br />
war vor allem nach Stimulation mit ACh reduziert. Die Dilatationen nach Stimulation mit dem<br />
endothelunabhängigen Dilatator SNP waren nur leicht beeinträchtigt und Adenosin induzierte<br />
Dilatationen waren nicht abgeschwächt. Alle Experimente erfolgten in Anwesenheit von Indo und LNA.<br />
n = 80 Arteriolen in 8 Tieren je Gruppe. t-Test # p
ERGEBNISSE 68<br />
A<br />
% der maximalen Dilatation<br />
% der maximalen Dilatation<br />
DCEBIO<br />
IK+/+<br />
90<br />
IK-/-<br />
60<br />
* lokal *<br />
30<br />
550µm * 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
B<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
50% DMSO IK+/+<br />
90<br />
60<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.15: Lokale Aktivierung von IK Ca -Kanälen durch DCEBIO<br />
DCEBIO (A) bzw die Lösungsmittelkontrolle wurde lokal appliziert (vertikale Linie) und die<br />
Durchmesseränderung an der Stimulationsstelle und entfernten Positionen gemessen. In IK+/+<br />
Mäusen wurde eine lokale Dilatation induziert, die sich entlang des Gefäßes ausbreitete. Dies war<br />
nicht bedingt durch das Lösungsmittel (50% DMSO). In IK Ca defizienten Tieren war DCEBIO ohne<br />
Effekt. IK+/+: n=4 Arteriolen in 4 Tieren, IK-/-: n= 5 Arteriolen in 5 Tieren, DMSO: n=4 Arteriolen in 4<br />
IK+/+ Tieren . * ttest p < 0.01 vs IK+/+.<br />
3.1.3.2.5 Beteiligung von IK Ca bei fortgeleiteter Dilatationen nach ACh<br />
Da die Aktivierung von IK Ca -Kanälen eine fortgeleitete Dilatation induzierte, sollte nun die<br />
Beteiligung von IK Ca an der Auslösung von fortgeleiteten Dilatationen nach lokalem ACh-<br />
Stimulus untersucht werden. Die Experimente wurden in Anwesenheit von Indo und LNA (3<br />
bzw. 30 µM) durchgeführt. ACh-Dilatationen wurden in 8 Arteriolen in 8 IK+/+ Tieren<br />
(maximaler Durchmesser 39 ± 1 µm) und in 7 Arteriolen in 7 IK-/- Tieren (maximaler<br />
Durchmesser 42 ± 2 µm) durchgeführt. ACh Applikation erfolgte mit einer Stimulationsdauer<br />
von 100 - 500 ms und einem Druck von 140 kPa.<br />
Die lokal induzierte Dilatation war in IK-/- Tieren im Vergleich <strong>zu</strong>r Kontrollgruppe bereits lokal<br />
abgeschwächt. Dennoch breiteten sich die Dilatationen in beiden Genotypen ohne<br />
signifikante Abnahme der Amplitude in die Entfernung aus (Abb. 3.16). Die maximale<br />
Amplitude der Dilatation war an allen beobachteten Positionen in IK-/- Tieren signifikant<br />
erniedrigt (Abb. 3.16).
ERGEBNISSE 69<br />
% der maximalen Dilatation<br />
ACh<br />
90<br />
60<br />
30<br />
*<br />
IK+/+<br />
IK-/-<br />
*<br />
*<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.16: Fortgeleitete Dilatationen nach ACh in IK-/- Tieren:<br />
Dargestellt ist die Durchmesseränderung nach lokaler Stimulation mit ACh (vertikale Linie). ACh löste<br />
auch in IK Ca -defizienten Tieren eine fortgeleitete Dilatation aus. Die Amplituden der Gefäßantwort<br />
waren jedoch gegenüber dem Wildtyp an allen Positionen signifikant erniedrigt. Alle Experimente in<br />
Anwesenheit von Indo und LNA (3 bzw. 30µM). IK+/+: n = 8 Arteriolen in 8 Tieren, IK-/-: n=7 Arteriolen<br />
in 7 Tieren. * ttest p
ERGEBNISSE 70<br />
% der maximalen Dilatation<br />
A<br />
90<br />
60<br />
30<br />
0<br />
*<br />
ACh<br />
-7 -6 -5<br />
[log mol/l]<br />
*<br />
*<br />
Indo LNA<br />
Indo LNA UCL<br />
B<br />
90<br />
60<br />
30<br />
0<br />
Ado<br />
Indo LNA<br />
-7 -6 -5<br />
[log mol/l]<br />
Indo LNA UCL<br />
Abb. 3.17: ACh- und Adenosin-induzierte Dilatation in IK+/+ Tieren nach Blockade von SK Ca -<br />
Kanälen<br />
Dargestellt ist die Dilatation nach globaler Stimulation mit steigenden ACh- (A) und Adenosin- (B)<br />
Konzentrationen in IK+/+ Mäusen nach Blockade von SK Ca -Kanälen mit UCL1684. Weder ACh noch<br />
Adenosin-induzierte Dilatationen wurden durch die Blockade von SK Ca -Kanälen abgeschwächt. Alle<br />
Experimente erfolgten nach Hemmung von NO und Prostazyklinsynthese. n = 30 Arteriolen in 3 IK+/+<br />
Mäusen. * ttest
ERGEBNISSE 71<br />
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktivität der SK Ca -Kanäle bei ACh-induzierten<br />
Dilatationen beteiligt ist. SK Ca -Kanäle haben jedoch gegenüber IK Ca -Kanälen eine eher<br />
untergeordnete Bedeutung, da ihre Blockade in IK+/+ Tieren keinen Effekt hatte. NOvermittelte<br />
Dilatationen sind hingegen unabhängig von der Aktivierung der SK Ca -Kanäle.<br />
3.1.3.3.2 SK Ca als Effektor fortgeleiteter ACh-Dilatationen<br />
In diesen Experimenten sollte untersucht werden, welche Rolle die Aktivität von SK Ca -<br />
Kanälen bei der Ausbreitung von ACh-induzierten Dilatationen hat. Hier<strong>zu</strong> wurde die<br />
Gefäßantwort nach lokaler ACh-Stimulation in 3 Gefäßen (maximaler Durchmesser 36 ± 1<br />
µm) in 3 IK+/+ Mäusen vor und nach pharmakologischer Blockade von SK Ca mit UCL1684<br />
untersucht. Die lokale Stimulationsdauer betrug 200 ms (Druck: 140 kPa). Alle Experimente<br />
erfolgten in Anwesenheit von Indo (3 µM) und LNA (30 µM). ACh induzierte im Wildtyp eine<br />
fortgeleitete Dilatation, wie auch in den vorangegangenen Experimenten gezeigt wurde.<br />
Nach Blockade von SK Ca induzierte ACh weiterhin eine fortgeleitete Dilatation, deren<br />
Amplitude weder lokal noch an den entfernten Positionen reduziert war (Abb. 3.19). Die AChinduzierte<br />
Dilatation breitet sich somit unabhängig von der Aktivierung von SK Ca -Kanälen<br />
entlang der Arteriole aus.<br />
IK+/+<br />
% der maximalen Dilatation<br />
ACh<br />
Indo LNA<br />
90<br />
Indo LNA UCL<br />
60<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.19: Fortgeleitete Dilatationen auf ACh nach Blockade von SK Ca mit UCL1684:<br />
Dilatationen wurden durch lokale Stimulation (vertikale Linie) mit ACh induziert, dargestellt sind die<br />
Dilatationen in Abhängigkeit von der Zeit entlang der Arteriolen (links: lokal, Mitte: 550 µm, rechts:<br />
1100 µm Entfernung). Die Fortleitung der lokal induzierten ACh-Dilatation wurden durch Blockade von<br />
SK Ca -Kanälen nicht beeinträchtigt Alle Experimente in Anwesenheit von Indo und L-NA. n = 3<br />
Arteriolen in 3 Mäusen.
ERGEBNISSE 72<br />
3.1.4. Charakterisierung von Effektoren lokal induzierter Adenosindilatationen<br />
In diesen Experimenten wurde untersucht, ob die lokale Stimulation mit Adenosin (10 µM)<br />
eine fortgeleitete Dilatation auslöst. Hier<strong>zu</strong> wurden 6 Arteriolen in 5 C57BL/6 Mäusen lokal<br />
stimuliert und die Dilatation lokal und nach erneuter lokaler Stimulation in einer Entfernung<br />
von 550 und 1100 µm stromaufwärts von der Stimulationsstelle beobachtet. Die Arteriolen<br />
hatten einen maximalen Durchmesser von 34 ± 2 µm. Die Stimulation erfolgte über eine<br />
Mikropipette für 50 - 400 ms mit 140 kPa. Adenosin induzierte eine lokale Dilatation, die nach<br />
1 Sekunde auch in einer Entfernung von 1100 µm <strong>zu</strong> beobachten war. Die maximale<br />
Amplitude der Dilatation nahm über die beobachtete Strecke von 1100 µm signifikant ab<br />
(lokal: 62 ± 5, 550 µm: 51 ± 4, 1100 µm: 41 ± 5 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.20).<br />
3.1.4.1 Rolle von NO und Prostazyklin als Mediatoren von lokal induzierten fortgeleiteten<br />
Adenosin-Dilatationen<br />
Die Beteiligung von NO und Prostazyklin als Mediatoren bei der Auslösung von lokalen<br />
Adenosin induzierten Dilatationen sowie deren Ausbreitung entlang der Arteriole wurden in 4<br />
Arteriolen in 4 C57BL/6 Mäusen untersucht. Der mittlere maximale Durchmesser betrug 36 ±<br />
1 µm. Die lokale Stimulation der Arteriolen erfolgte mittels Druckpuls (140 kPa) für 50 - 500<br />
ms. Adenosin induzierte auch nach Hemmung der Cyclooxygenase und NO-Synthase mit<br />
Indomethacin (Indo, 3 µM) und LNA (30 µM) eine fortgeleitete Dilatation. Die maximale<br />
Amplitude der Dilatation war weder an der Stimulationsstelle noch an den entfernten<br />
Positionen verändert (lokal: 61 ± 5 vs 64 ± 4, 550 µm: 51 ± 4 vs 53 ± 4, 1100 µm: 34 ± 6 vs<br />
31 ± 4 % der maximalen Dilatation), die Abbildung 3.21 zeigt den zeitlichen Verlauf. Somit<br />
sind lokal induzierte Dilatationen nach Adenosin und deren Ausbreitung entlang der Arteriole<br />
unabhängig von NO und Prostazyklin.<br />
BL6<br />
% der maximalen Dilatation<br />
Ado<br />
Kontrolle<br />
90<br />
60<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s] [s]<br />
Zeit Zeit [s] [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.20: Ausbreitung von lokal durch Adenosin induzierten Dilatationen:<br />
Arteriolen wurden lokal mit Adenosin durch Mikroapplikation stimuliert (vertikale Linie). Abgebildet ist<br />
die Durchmesseränderung nach lokaler Stimulation und nach erneuter lokaler Stimulation an den<br />
Positionen in einer Entfernung von 550 und 1100 µm über die Zeit. Adenosin induziert eine lokale<br />
Dilatation, die sich in die Entfernung ausbreitet. Hierbei nimmt die Amplitude mit der Entfernung ab. n<br />
= 6 Arteriolen in 5 Mäusen.
ERGEBNISSE 73<br />
BL6<br />
% der maximalen Dilatation<br />
Ado<br />
Kontrolle<br />
90<br />
Indo L-NA<br />
60<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s] [s]<br />
Zeit Zeit [s] [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.21: Fortleitung der Dilatation auf Adenosin nach Hemmung der Prostaglandine und NO<br />
Dargestellt sind die Durchmesseränderungen nach lokaler Applikation von Adenosin (vertikale Linie)<br />
an der Stimulationsstelle und entfernten Positionen über die Zeit. Nach Hemmung der<br />
Cyclooxygenase (Indo, 3 µM) und NO-Synthase (LNA, 30 µM) war weder die lokal induzierte<br />
Adenosindilatation noch deren Ausbreitung entlang der Arteriole reduziert. n = 4 Arteriolen in 4<br />
C57BL/6 Mäusen.<br />
3.1.4.2 Vergleich der Ausbreitung lokal ausgelöster Dilatationen nach Adenosin und ACh<br />
Die Ausbreitung der lokal ausgelösten Dilatationen nach Adenosin sollten weiter<br />
charakterisiert werden. Hier<strong>zu</strong> wurden die maximale Amplitude der Dilatation, deren Dauer<br />
und die Fläche unter der Kurve an der lokalen und den Positionen in 550 und 1100 µm<br />
Entfernung berechnet und mit Gefäßantworten, die durch ACh induziert wurden, verglichen.<br />
Die Daten von 23 Arteriolen in 23 Tieren nach Adenosinstimulation (maximaler Durchmesser<br />
30 ± 1 µm) und von 30 Arteriolen in 27 Tieren nach ACh-Stimulation (maximaler<br />
Durchmesser 35 ± 1µm) wurden <strong>zu</strong>sammengefasst. Alle Experimente waren in Anwesenheit<br />
von Indo und LNA (3 bzw. 30 µM) durchgeführt worden. Arterioläre Stimulation mit Adenosin<br />
erfolgte lokal über eine Mikropipette für 50 - 500 ms (Mittelwert: 210 ±11 ms) und einem<br />
Druck von 140 kPa. Adenosin induzierte eine fortgeleitete Dilatation, deren Amplitude über<br />
die Entfernung abnahm. ACh induzierte nach arteriolärer Stimulation (50 - 300 ms,<br />
Mittelwert: 120 ± 6 ms, 140kPa) dagegen eine Dilatation, die sich ohne Abnahme der<br />
Amplitude bis in die größte beobachtete Entfernung von 1100 µm ausbreitete (Abb. 3.22 A).<br />
Somit war die Amplitude der Dilatation nach ACh in 1100 µm Entfernung signifikant größer<br />
als die jenige nach Stimulation mit Adenosin, obwohl an der Stimulationsstelle die Amplitude<br />
nach Adenosin signifikant größer war (Abb. 3.22 A). Auch die Dauer der Dilatation war bei<br />
den Stimuli unterschiedlich. Die Dauer der Adenosin-induzierten Dilatationen war an den<br />
entfernten Positionen im Vergleich <strong>zu</strong>r lokalen Antwort signifikant verkürzt, dies war bei<br />
Stimulation mit ACh nicht <strong>zu</strong> beobachten (Abb. 3.22 B). Beide Parameter (Amplitude und<br />
Dauer) determinieren die Gesamtfläche unter der Kurve (AUC), die in Abbildung 3.22 C<br />
ebenfalls dargstellt ist. Es zeigt sich, dass sich die Fläche unter Kurve nach Stimulation mit<br />
Adenosin mit <strong>zu</strong>nehmender Entfernung signifikant reduziert. ACh induzierte Dilatationen<br />
zeigten hingegen keine Abnahme der Fläche über eine Entfernung von 1100 µm. Somit ist
ERGEBNISSE 74<br />
die AUC nach Adenosinstimulation in der Entfernung von 1100 µm signifikant kleiner als<br />
diejenige nach ACh-Stimulation, obwohl dies an der Stimulationsstelle umgekehrt war.<br />
Zusammengenommen zeigt dies, dass nach lokaler Stimulation der Arteriole sowohl mit ACh<br />
als auch mit Adenosin eine fortgeleitete Dilatation induziert wird. Die Ausbreitung der<br />
Dilatation in die Entfernung ist jedoch nach Stimulation mit Adenosin weniger effizient als<br />
nach ACh.<br />
A<br />
Adenosin<br />
ACh<br />
% der maximalen Dilatation<br />
B<br />
Zeit [s]<br />
C<br />
Fläche<br />
80<br />
* Amplitude<br />
60<br />
#<br />
* #<br />
40<br />
20<br />
0<br />
0 550 1100<br />
60 *<br />
Dauer<br />
40<br />
#<br />
#<br />
20<br />
0<br />
0 550 1100<br />
900<br />
*<br />
AUC<br />
600<br />
#<br />
* #<br />
300<br />
0<br />
0 550 1100<br />
Entfernung von der Stimulationsstelle [µm]<br />
Abb. 3.22: Vergleich der Ausbreitung<br />
von Dilatationen nach Adenosin und<br />
ACh<br />
Nach lokaler Stimulation der Arteriolen<br />
mit ACh oder Adenosin wurde die<br />
Amplitude und Dauer der Dilatation<br />
sowie die Fläche unter der Kurve an der<br />
lokalen Stelle und in einer Entfernung<br />
von 550 und 1100µm berechnet. A: Die<br />
Amplitude der Adenosindilatation war an<br />
den entfernten Position im Vergleich <strong>zu</strong>r<br />
lokalen Antwort signifikant verringert.<br />
Dagegen blieb die Amplitude der ACh-<br />
Antwort bis in die größte beobachtete<br />
Entfernung von 1100µm konstant. B:<br />
Auch die Dilatationsdauer verkürzte sich<br />
nach Stimulation mit Adenosin mit<br />
<strong>zu</strong>nehmender Entfernung. Die Dauer<br />
der ACh-induzierten Dilatation blieb<br />
hingegen über die Entfernung konstant.<br />
C: Die Berechnung der Fläche unter der<br />
Kurve (AUC) zeigt, dass Adenosin<br />
induzierte Dilatationen sich mit der<br />
Entfernung deutlich reduzierten. ACh-<br />
Antworten blieben hingegen über die<br />
beobachtete Entfernung konstant Alle<br />
Versuche in Anwesenheit von Indo und<br />
LNA (3 bzw. 30 µM). Es wurden 23<br />
Arteriolen in 23 Tieren mit Adenosin<br />
stimuliert und in 30 Arteriolen in 27<br />
Tieren ACh appliziert. * p< 0.05 vs ACh;<br />
# p
ERGEBNISSE 75<br />
3.1.4.3 IK Ca und BK Ca als Effektoren der fortgeleiteten Dilatationen nach ACh und Adenosin<br />
In den oben dargestellten Experimenten wurde gezeigt, dass IK Ca - und BK Ca -Kanäle bei der<br />
ACh-Dilatation von entscheidender Bedeutung sind. Daher sollte hier untersucht werden, ob<br />
die Aktivierung von diesen K Ca -Kanälen auch an der Auslösung und Fortleitung von<br />
Adenosin-induzierten Dilatationen beteiligt ist. Es wurden 3 Arteriolen in 3 C57BL/6 Mäusen<br />
untersucht, deren maximaler Durchmesser 38 ± 1 µm betrug. In jedem Gefäß wurden<br />
fortgeleitete Dilatation sowohl mit Adenosin als auch mit ACh ausgelöst. Nach Aufzeichnung<br />
der Kontrollantworten wurden die Gefäße 10 min mit Charybdotoxin (1 µM), einem Blocker<br />
der IK Ca - und BK Ca -Kanäle, inkubiert und anschließend die Stimulationen mit ACh und<br />
Adenosin erneut wiederholt. Alle Experimente wurden in Anwesenheit von Indo und LNA (3<br />
bzw. 30 µM) durchgeführt. Die lokale Applikation von Adenosin führte <strong>zu</strong> einer sich<br />
ausbreitenden Dilatation, deren maximale Amplitude durch Charybdotoxin weder an der<br />
lokalen noch den entfernten Stellen beeinträchtigt wurde (lokal: 54 ± 9 vs 50 ± 4, 550 µm: 43<br />
± 6 vs 51 ± 1, 1100 µm: 44 ± 7 vs 55 ± 2 % der maximalen Dilatation). Die Abbildung 3.23 A<br />
zeigt den zeitlichen Verlauf. Im Gegensatz da<strong>zu</strong> war die lokal induzierte ACh-Dilatation in<br />
A<br />
% der maximalen Dilatation<br />
B<br />
% der maximalen Dilatation<br />
Ado<br />
Indo LNA<br />
90<br />
Indo L-NA Chtx<br />
60<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
ACh<br />
90<br />
60<br />
30<br />
*<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Indo LNA<br />
Indo L-NA Chtx<br />
*<br />
*<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s] [s]<br />
Zeit Zeit [s] [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.23: Vergleich fortgeleiteter Dilatationen auf Adenosin und ACh nach Blockade von K Ca<br />
Abgebildet ist die Änderung des Gefäßdurchmessers nach lokaler Stimulation mit Adenosin (A) oder<br />
ACh (B) an der Stimulationsstelle sowie in 550 und 1100 µm Entfernung über die Zeit. Lokalisierte<br />
Stimulation der Arteriolen mit Adenosin führt <strong>zu</strong> einer lokalen Dilatation, die sich in die Entfernung<br />
ausbreitet. Durch pharmakologische Blockade von IK Ca - und BK Ca -Kanälen mit Charybdotoxin (1 µM)<br />
wurde weder die lokale noch die fortgeleitete Dilatation abgeschwächt. Im Gegensatz da<strong>zu</strong> waren<br />
ACh-Dilatationen in denselben Gefäßen wie erwartet an allen beobachteten Stellen fast vollständig<br />
aufgehoben. Alle Versuche erfolgten in Anwesenheit von Indo und LNA (3 bzw. 30 µM). n =3<br />
Arteriolen in 3 Gefäßen. *p
ERGEBNISSE 76<br />
denselben Gefäßen an der lokalen Stelle und auch in der Entfernung fast vollständig<br />
aufgehoben (Amplitude lokal: 60 ± 4 vs 14 ± 3, 550 µm: 53 ± 3 vs 17 ± 2, 1100 µm: 45 ± 4 vs<br />
10 ± 6 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.23 B). Die deutliche Abschwächung der ACh-<br />
Dilatation verifiziert die Effektivität der Blockade der K Ca -Kanäle und die hierbei erhaltene<br />
Antwort auf Adenosin zeigt, dass Adenosin unabhängig von der Aktivität von IK Ca - und BK Ca -<br />
Kanälen dilatierend wirkt und dieses Signal sich entlang der Arteriole ausbreitet.<br />
3.1.4.4 K ATP als Effektor von Adenosin Dilatationen<br />
An einigen isolierten Arteriolen wurde gezeigt, dass Dilatationen nach Adenosin auf der<br />
Öffnung von K ATP -Kanälen beruhen. In diesen Experimenten wurde daher die Beteiligung<br />
dieser Kanäle in der Mikrozirkulation bei fortgeleiteten Dilatation untersucht. Hier<strong>zu</strong> wurde<br />
einerseits geprüft, ob der K ATP -Öffner Cromakalim eine sich ausbreitende Dilatation auslösen<br />
kann und andererseits, ob die Hemmung dieser Kanäle die Dilatation nach Adenosin<br />
modifiziert. Es wurden 4 Arteriolen in 4 C57BL/6 Mäusen (maximaler Durchmesser: 38 ± 0.3<br />
µm) mit Cromakalim für 100 - 500 ms mit 140 kPa lokal stimuliert. Alle Experimente wurden<br />
in Anwesenheit von Indo und LNA durchgeführt. Cromakalim induzierte eine lokale<br />
A<br />
% der maximalen Dilatation<br />
Cromakalim<br />
Indo LNA<br />
90<br />
Indo LNA Glib<br />
60<br />
*<br />
30<br />
lokal * 550µm * 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s] [s]<br />
Zeit Zeit [s] [s]<br />
Zeit [s]<br />
B<br />
% der maximalen Dilatation<br />
50%DMSO<br />
Indo LNA<br />
60<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit Zeit [s] [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.24: Gefäßantworten nach lokaler Stimulation mit dem K ATP -Öffner Cromakalim<br />
Dargestellt ist die Durchmesseränderung über die Zeit. Nach lokaler Stimulation mit Cromakalim<br />
wurden die Durchmesser lokal und nach erneuter lokaler Stimulation in 550 und 1100 µm bestimmt.<br />
Der K ATP -Öffner Cromakalim induziert in Arteriolen eine fortgeleitete Dilatation die durch den K ATP -<br />
Blocker Glibenclamid (Glib) vollständig aufgehoben wurde (A). Das <strong>zu</strong>m Lösen von Cromakalim<br />
verwendete DMSO (50%) verursachte keinen Gefäßrektion (B). In 550 µm Entfernung zeigt das Gefäß<br />
spontane Vasomotion, die unabhängig von der Applikation auftrat. Alle Experimente in Anwesenheit<br />
von Indo und LNA. n=4 Arteriolen (4Tiere). p
ERGEBNISSE 77<br />
Dilatation, die sich mit abnehmender Amplitude in die Entfernung ausbreitete. Die durch den<br />
K ATP -Öffner induzierte Dilatation ließ sich mit dem K ATP -Blocker Glibenclamid (1 µM)<br />
blockieren (maximale Amplitude: lokal: 43 ± 7 vs 1 ± 2, 550 µm: 24 ± 8 vs -5 ± 8, 1100 µm:<br />
17 ± 7 vs -2 ± 3 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.24 A). Die lokale Applikation des<br />
verwendeten Lösungsmittels (50% DMSO) löste im Gegensatz <strong>zu</strong>m Cromakalim keine<br />
Dilatation aus (Abb. 3.24 B). Dies zeigt, dass die lokale Aktivierung von K ATP -Kanälen nicht<br />
nur eine lokale Dilatation auslöst, sondern sich diese lokale Dilatation auch entlang der<br />
Arteriole ausbreitet. Die Beteiligung von K ATP -Kanälen an der Auslösung von Adenosininduzierten<br />
Dilatationen und deren Fortleitung wurde untersucht, indem Gefäße mit Adenosin<br />
und ACh vor und nach Superfusion des K ATP -Blockers Glibenclamid (1 µM) lokal stimuliert<br />
wurden. Die Dilatation nach Adenosin wurde sowohl an der Stimulationsstelle als auch an<br />
allen entfernten Positionen durch Glibenclamid komplett aufgehoben (maximale Amplitude:<br />
lokal: 53 ± 7 vs 1 ± 3, 550 µm: 35 ± 8 vs -1 ± 4, 1100 µm: 32 ± 1 vs -4 ± 5 % der maximalen<br />
Dilatation Abb. 3.25 A). Im Gegensatz da<strong>zu</strong> blieb die ACh-induzierte Dilatation in<br />
Anwesenheit von Glibenclamid unverändert (maximale Amplitude: lokal: 43 ± 4 vs 35 ± 12,<br />
550 µm: 47 ± 5 vs 50 ± 2, 1100 µm: 48 ± 8 vs 40 ± 6 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.25<br />
B). Somit ist die Aktivierung von K ATP Kanälen entscheidend für die sich ausbreitende<br />
Dilatation nach Adenosin, während diejenige nach ACh hiervon komplett unabhängig ist.<br />
A<br />
% der maximalen Dilatation<br />
Ado<br />
Indo LNA<br />
90<br />
*<br />
Indo L-NA Glib<br />
60<br />
*<br />
*<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
B<br />
% der maximalen Dilatation<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
ACh<br />
Indo LNA<br />
90<br />
Indo L-NA Glib<br />
60<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s] [s]<br />
Zeit Zeit [s] [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.25: Adenosin und ACh induzierte Dilatationen nach Blockade von K ATP -Kanälen<br />
Dargestellt ist die Dilatation nach lokaler Stimulation mit Adenosin (A) und ACh (B) über die Zeit.<br />
Adenosin induzierte Dilatationen wurden durch Superfusion des K ATP -Blockers Glibenclamid (Glib) an<br />
allen beobachteten Positionen komplett blockiert. ACh-induzierte Dilatationen und deren Fortleitung<br />
blieben hingegen unbeeinflußt (B). n = 4 Arteriolen in 4 Tieren. * ttest p
ERGEBNISSE 78<br />
3.2 Verstärkungsmechanismen fortgeleiteter Dilatationen<br />
Lokale Stimulation von Gefäßen führt bei einer Reihe von Agonisten nicht nur <strong>zu</strong> einer<br />
lokalen Dilatation, sondern die Gefäßantwort breitet sich wie im Kapitel 3.1.3 und 3.1.4<br />
gezeigt instantan über eine Strecke von mehreren Millimetern in beide Richtungen entlang<br />
des Gefäßes aus. Diese Ausbreitung ermöglicht eine Koordination des Gefäßverhaltens<br />
innerhalb des Netzwerks. Die Amplitude der fortgeleiteten Dilatation nahm nach lokaler<br />
Stimulation mit ACh über eine Strecke von 1100 µm nicht signifikant ab (Kapitel 3.1.3). Dies<br />
impliziert, dass möglicherweise ein aktiver Mechanismus beteiligt ist, der das Signal bei<br />
seiner Ausbreitung entlang der Gefäßwand verstärkt bzw. auffrischt. Hierbei könnten<br />
besonders K + -Kanäle eine Rolle spielen, die eine Hyperpolarisation möglicherweise<br />
verstärken. Da die Ausbreitung in Abhängigkeit vom Agonisten (Adenosin, ACh)<br />
unterschiedlich war, sind eventuell auch differente Verstärkungsmechanismen beteiligt. Die<br />
Identität der an der Ausbreitung der Dilatation beteiligten Kanäle wurde durch Superfusion<br />
verschiedener Ionenkanalblocker untersucht.<br />
3.2.1 Bupivacain zeigt die Beteiligung unterschiedliche Fortleitungsmechanismen<br />
Das Lokalanästhetikum Bupivacain hemmt relativ unspezifisch K + - und Na + -Kanäle, nämlich<br />
spannungsabhängige Na + -Kanäle und aus der Gruppe der K + -Kanäle BK Ca ,<br />
spannungsabhängige (K V ) und möglicherweise einwärts gleichrichtende K + -Kanäle (K IR ).<br />
Daher wurde Bupivacain verwendet, um <strong>zu</strong> untersuchen, ob unterschiedliche Mechanismen<br />
nach lokaler Stimulation mit unterschiedlichen Agonisten an der Ausbreitung des Signals<br />
entlang der Arteriole beteiligt sind. Nach Bestimmung der Kontrollantworten wurden die<br />
Arteriolen 20 min mit Bupivacain (100 mM) inkubiert und die Durchmesseränderugen<br />
anschließend in dessen Anwesenheit erneut bestimmmt. Die Applikation von Bupivacain<br />
führte <strong>zu</strong> einer signifikanten Erhöhung des Ruhetonus der Arteriolen in An- und Abwesenheit<br />
von NO und Prostaglandinen (Tabelle 3.2).<br />
Tabelle 3.2: Ruhetonus in Arteriolen nach Hemmung von Na + - und K + -Kanälen mit Bupivacain<br />
Der Gefäßtonus wurde durch Bupivacain sowohl in An- als auch in Abwesenheit von Indo und LNA<br />
signifikant erhöht. * ttest p < 0.01 vs Kontrolle bzw Indo LNA.<br />
n Maus Behandlung Tonus Durchmesser Maximum<br />
14 C57BL/6 Kontrolle 0.45 ± 0.01 14 ± 0.3 32 ± 1<br />
5 C57BL/6 Bupivacain 0.36 ± 0.01* 12 ± 0.4 33 ± 1<br />
5 C57BL/6 Indo LNA 0.38 ± 0.01 13 ± 0.5 33 ± 1<br />
4 C57BL/6 Bupivacain 0.21 ± 0.02* 7 ± 0.6 34 ± 1
ERGEBNISSE 79<br />
Die Fortleitung von ACh-induzierten Dilatationen wurde in 3 Arteriolen (3 C57BL/6 Mäuse)<br />
mit einem maximalen Durchmesser von 35 ± 1 µm untersucht. Die lokale Stimulation mit<br />
ACh erfolgte für 100 – 300 ms mit 140 kPa. Die ACh induzierte-Dilatation war an der lokalen<br />
Stelle nach Bupivacain zwar deutlich abgeschwächt, die Fortleitung dieser lokal<br />
schwächeren Dilatation war jedoch nicht eingeschränkt. So war die maximale Amplitude in<br />
einer Entfernung von 1100 µm nicht signifikant unterschiedlich <strong>zu</strong>r lokalen Antwort vor und<br />
nach Bupvicain (Kontrolle: lokal 65 ± 7, 550 µm 50 ± 4, 1100 µm 55 ± 4%; Bupivacain: lokal<br />
44 ± 5, 550 µm 26 ± 11, 1100 µm 23 ± 5 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.26 A). Ähnliche<br />
Befunde wurden in Anwesenheit von Indo und LNA erhoben (5 Gefäße in 3 Tieren,<br />
maximaler Gefäßdurchmesser 32 ± 1 µm). Die lokale Gefäßantwort war nach Behandlung<br />
mit Bupivacain abgeschwächt, die Ausbreitung des abgeschwächten Signals entlang der<br />
Arteriole jedoch nicht beeinträchtigt. Auch unter diesen Bedingungen unterschied sich die<br />
Amplitude an den entfernten Stellen nicht von der lokalen Antwort (Indo LNA: lokal 65 ± 6,<br />
550µm 68 ± 5, 1100 µm 59 ± 8; Bupivacain: lokal 40 ± 6, 550 µm: 35 ± 7, 1100 µm: 49 ± 7 %<br />
der maximalen Dilatation, Abb. 3.26 B).<br />
A<br />
% der maximalen Dilatation<br />
B<br />
% der maximalen Dilatation<br />
ACh<br />
Kontrolle<br />
90 *<br />
Bupivacain<br />
60<br />
*<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
ACh<br />
90<br />
60<br />
30<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
*<br />
Indo LNA<br />
Indo LNA Bupivacain<br />
*<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s] [s]<br />
Zeit Zeit [s] [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.26: Ausbreitung der ACh-induzierten Dilatation nach Blockade von Na + - und K + -Kanälen<br />
ACh wurde mittels Mikropipette appliziert (vertikale Linie) und die Durchmesseränderungen sind lokal<br />
und in der Entfernung über die Zeit dargestellt. In unbehandelten (A) Arteriolen und nach Indo LNA (B)<br />
reduzierte Bupivacain (100 mM) die Dilatation an der Stimulationsstelle. Diese abgeschwächte<br />
Dilatation breitete sich aber ohne signifikante Abschwächung der Amplitude entlang der Arteriole bis in<br />
eine Entfernung von 100 µm aus. n= 3 (Kontrolle) bzw. 5 (Indo und LNA) Arteriolen in jeweils 3<br />
Mäusen, * ttest p
ERGEBNISSE 80<br />
Der Effekt von Bupivacain auf lokal ausgelöste, fortgeleitete Adenosindilatationen wurde in 2<br />
Arteriolen betrachtet. Die Stimulation erfolgte in der Kontrollgruppe für 50 – 100 ms und nach<br />
Behandlung mit Bupivacain für 80 – 200 ms mit 140 kPa. Im Gegensatz <strong>zu</strong> ACh, waren<br />
Adenosin-induzierte Dilatationen an der Stimulationsstelle nicht abgeschwächt. Dagegen war<br />
die fortgeleitete Antwort bereits in einer Entfernung von 550 µm komplett aufgehoben (Abb.<br />
3.27 A). In einer größeren Gruppe (5 Arteriolen in 5 Tieren, maximaler Durchmesser von 35<br />
± 0.3 µm) wurde Bupivacain auch nach Hemmung der NO-Synthase und Cyclooxygenase<br />
untersucht. Die Stimulation mit Adenosin erfolgte für 50 – 500 ms mit 1.4 bar. Ähnlich wie in<br />
unbehandelten Präparationen war auch hier die lokale Antwort durch Bupivacain nur wenig<br />
beeinflußt (Indo LNA: 51 ± 3, Bupivacain: 37 ± 7%), während die Dilatation an entfernten<br />
Stellen nach Bupivacain komplett aufgehoben war (Indo LNA: 550 µm 43 ± 8, 1100 µm: 33 ±<br />
7%, Bupivacain: 550 µm -10 ± 7, 1100 µm -8 ± 8% der maximalen Dilatation, Abb.: 3.27 B).<br />
A<br />
% der maximalen Dilatation<br />
B<br />
% der maximalen Dilatation<br />
Ado<br />
Kontrolle<br />
90<br />
Bupivacain<br />
*<br />
*<br />
60<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
30<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Ado<br />
90<br />
60<br />
30<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Indo LNA<br />
Indo LNA Bupivacain<br />
*<br />
*<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s] [s]<br />
Zeit Zeit [s] [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.27: Ausbreitung der Adenosin-induzierten Dilatation nach Blockade von Na + - und K + -<br />
Kanälen<br />
Adenosin (Ado) wurde mittels Mikropipette appliziert (vertikale Linie) und die Durchmesseränderungen<br />
sind lokal und in der Entfernung über die Zeit dargestellt. In unbehandelten (A) Arteriolen und nach<br />
Indo LNA (B) hatte Bupivacain (100 mM) nur wenig Einfluß auf die lokale Dilatation, während die<br />
Dilatation in der Entfernung komplett aufgehaben war. n = 5 Arteriolen in 5 C57BL/6 Tieren. * p
ERGEBNISSE 81<br />
% der maximalen Dilatation<br />
90<br />
60<br />
30<br />
0<br />
BK<br />
-30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Kontrolle<br />
Bupivacain<br />
* *<br />
*<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
-30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
-30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.28: Bradykinin-induzierte Dilatationen nach Blockade von Na + - und K + -Kanälen<br />
Bradykinin (Bk) wurde mittels Mikropipette appliziert (vertikale Linie). Dargestellt sind<br />
Durchmesseränderungen an der Stimulationsstelle und in der Entfernung über die Zeit. Bupivacain<br />
(100 mM) reduzierte die lokale Dilation. Diese abgeschwächte Dilatation breitete sich jedoch<br />
uneingeschränkt entlang der Arteriole aus. n= 5 Arteriolen in 5 Mäusen. *p
ERGEBNISSE 82<br />
% der maximalen Antwort<br />
30<br />
0<br />
-30<br />
KCl Kontrolle<br />
Bupivacain<br />
lokal 275µm<br />
550µm 775µm<br />
1100µm<br />
0 15 30 0 15 30 0 15 30 0 15 30 0 15 30<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.29: Ausbreitung lokal induzierter Konstriktionen nach Blockade von Na + - und K + -<br />
Kanälen<br />
Lokale KCl-Applikation (3 M, vertikale Linie) induzierte eine Konstriktion, die sich ohne zeitliche<br />
Verzögerung entlang der Arteriole ausbreitet. Im Gegensatz <strong>zu</strong> Dilatationen, nimmt die Amplitude der<br />
Konstriktion mit <strong>zu</strong>nehmender Entfernung ab. Bupivacain hatte keinerlei Einfluß auf die lokale Antwort<br />
oder die Fortleitung der Konstriktion, lediglich die sich anschließende Dilatation wurde durch<br />
Bupivacain aufgehoben. n= 6 Arteriolen in 4 C57BL/6 Mäusen.<br />
Zusammengefaßt zeigen diese Daten, dass die relativ unspezifische Kanalblockade mit<br />
Bupivacain die Ausbreitung der Dilatationen unterschiedlich beeinflußt. So wird die<br />
Fortleitung nach Adenosin unterdrückt, während nach ACh und Bradykinin kein wesentlicher<br />
Effekt <strong>zu</strong> beobachten ist. Ebenso bleibt die Ausbreitung einer lokal ausgelösten Konstriktion<br />
unverändert. Dies zeigt, dass bei der Ausbreitung der Dilatationen differente Mechanismen<br />
beteiligt sind und nur Kanäle, die nach Adenosinstimulation aktiviert werden, gegenüber<br />
Bupivacain sensitiv sind.<br />
3.2.2 Selektive Blockade spannungsabhängiger Na + -Kanäle mit Mepivacain<br />
Die Beobachtung, dass die Fortleitung von Adenosin induzierten Dilatationen nach<br />
Behandlung mit dem Lokalanästhetikum Bupivacain aufgehoben waren, könnte auf die<br />
Beteiligung spannungsabhängiger Na + -Kanäle und eines nervalen Mechanismus deuten.<br />
Daher wurde in dieser experimentellen Serie das Lokalanästhetikum Mepivacain (200 µM)<br />
untersucht, da diese Substanz ebenfalls spannungsabhängige Na + -Kanäle blockiert, K + -<br />
Kanäle jedoch nicht oder in deutlich geringerem Ausmaß beeinflußt. Die Superfusion von<br />
Mepivacain führte nicht <strong>zu</strong> einer signifikanten Änderung des arteriolären Durchmessers (14 ±<br />
1 vs. 12 ± 1 µm, maximaler Durchmesser: 34 ± 1 µm, n = 7) und der Ruhetonus blieb im<br />
Gegensatz <strong>zu</strong> Bupivacain konstant (0.41 ± 0.03 vs 0.35 ± 0.02, p = 0.1).<br />
Adenosin-induzierte fortgeleitete Dilatationen waren nach Behandlung mit Mepivacain in<br />
Anwesenheit von Indo und LNA weder lokal noch in einer Entfernung von 1100 µm<br />
abgeschwächt (Abb. 3.30 B). Die durch ACh induzierte Dilatationen wurde durch Mepivacain<br />
an der lokalen Stelle signifikant abgeschwächt, die Ausbreitung dieser verminderten Antwort
ERGEBNISSE 83<br />
A<br />
% der maximalen Dilatation<br />
ACh<br />
Indo LNA<br />
90 *<br />
Indo LNA Mepivacain<br />
60<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
B<br />
% der maximalen Dilatation<br />
Ado<br />
Indo LNA<br />
90<br />
Indo LNA Mepivacain<br />
60<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.30: Effekt von Mepivacain auf fortgeleitete Dilatationen nach ACh und Adenosin<br />
Dargestellt sind die Durchmesseränderungen nach lokaler Stimulation mit Adenosin (Ado, oben) und<br />
ACh (unten) entlang der Arteriole. Mepivacain (200 µM) ließ die Dilatation nach Adenosin und deren<br />
Ausbreitung unbeeinflußt. Die lokal induzierte Dilatation nach ACh wurde reduziert, deren Ausbreitung<br />
entlang der Arteriole wurde jedoch nicht beeinträchtigt. Alle Experimente in Anwesenheit von Indo und<br />
LNA. n = 2 in 2 (Ado) bzw. n= 5 Arteriolen in 4 Mäusen (ACh). p
ERGEBNISSE 84<br />
Durchmesser: 31 ± 1 µm, n = 4), der Ruhetonus stieg von 0.37 ± 0.01 auf 0.29 ± 0.01<br />
(p < 0.05).<br />
In Anwesenheit von Ba 2+ war die nach lokaler ACh Stimulation induzierte Dilatation weder<br />
lokal (maximale Amplitude: 67 ± 6 vs 70 ± 5%) noch in einer Entfernung von 550 µm (54 ± 5<br />
vs 50 ± 7%) abgeschwächt. An der entfernten Position 1100 µm stromaufwärts von der<br />
Stimulationsstelle führte Ba 2+ jedoch <strong>zu</strong> einer signifikanten Abschwächung der Amplitude der<br />
Dilatation (57 ± 3 vs 34 ± 6 %). Diese Abschwächung spiegelte sich auch in einer<br />
A<br />
% der maximalen Dilatation<br />
ACh<br />
Kontrolle<br />
90<br />
BaCl 2<br />
* #<br />
60<br />
30<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
0<br />
-30<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
B<br />
% der maximalen Dilatation<br />
C<br />
% der maximalen Dilatation<br />
90<br />
60<br />
30<br />
0<br />
-30<br />
90<br />
60<br />
30<br />
0<br />
Ado<br />
*<br />
-30 0 30 60 90<br />
Bk<br />
Zeit [s]<br />
Indo LNA<br />
-30<br />
-30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Indo LNA BaCl 2<br />
* #<br />
* #<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
Kontrolle<br />
BaCl 2<br />
-30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
-30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
-30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
-30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.31: Effekt von Ba 2+ auf die Fortleitung lokal ausgelöster Dilatationen<br />
Dargestellt sind Dilatationen auf lokale Applikation von ACh (A), Adenosin (Ado, in Anwesenheit von<br />
Indo und LNA, B) und Bradykinin (C) entlang der Arteriole über die Zeit. In Anwesenheit von Ba 2+ (75<br />
µM) war die Dilatation nach ACh lediglich an der entferntesten Position (1100 µm) reduziert. Die<br />
Ausbreitung von Adenosin induzierten Dilatationen ist nach Ba 2+ am deutlichsten reduziert. Die<br />
Dilatation war bereits in einer Entfernung von 550 µm stark abschwächt und bei 1100 µm kaum noch<br />
<strong>zu</strong> beobachten. Im Gegensatz da<strong>zu</strong> waren lokale und enfernte Dilatationen nach Bk unverändert.<br />
ACh: n = 5 in 4, Ado n = 5 in 5 und Bk n = 4 Arteriolen in 4 Tieren. ttest * p < 0.01 vs Kontrolle bzw.<br />
Indo LNA, # p < 0.01 vs lokal.
ERGEBNISSE 85<br />
signifikanten Abnahme der Amplitude mit <strong>zu</strong>nehmender Entfernung in Anwesenheit von Ba 2+<br />
wider (lokal: 70 ± 5, 1100µm: 34 ± 6%, p < 0.05), was in unbehandelten Kontrollen nicht <strong>zu</strong><br />
beobachten war (lokal: 67 ± 6, 1100 µm: 57 ± 3% der maximalen Dilatation). Der zeitliche<br />
Verlauf ist in Abbildung 3.31 A dargestellt. Wurde Adenosin <strong>zu</strong>r lokalen Stimulation<br />
verwendet, so war die lokale Dilatation nach Ba 2+ geringfügig abgeschwächt (68 ± 5 vs 45 ±<br />
7%, p
ERGEBNISSE 86<br />
A<br />
% der maximalen Dilatation<br />
ACh<br />
Indo LNA<br />
90<br />
Indo LNA 4-AP<br />
60<br />
* *<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
30<br />
0<br />
-30<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
B<br />
% der maximalen Dilatation<br />
Ado<br />
Indo LNA<br />
90<br />
Indo LNA 4-AP<br />
60<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
30<br />
0<br />
-30<br />
-30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90 -30 0 30 60 90<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.32: Effekt der Hemmung von K V -Kanälen auf lokal ausgelöste Dilatation und<br />
Konstriktion<br />
Dargestellt sind relative Durchmesseränderungen auf lokale Applikation von ACh (A), Adenosin (Ado,<br />
B) und entlang der Arteriole über die Zeit. In Anwesenheit von 4-Aminopyridin (4-AP, 1 mM), einem<br />
Blocker von K V Kanälen waren die lokal ausgelösten Gefäßantworten unverändert. Während die<br />
Ausbreitung nach Adenosin unbeeinflußt blieb, war die Dilatation nach ACh an den entfernten<br />
Positionen (550 und 1100 µm) reduziert. Alle Experimente in Anwesenheit von Indo und LNA. ACh<br />
und Ado: n = 5 Arteriolen in 5 Tieren; * p< 0.05, # p< 0.01 vs Indo LNA.<br />
Somit verhält sich die hemmende Wirkung von 4-AP umgekehrt <strong>zu</strong> Ba 2+ , denn 4-AP<br />
schwächt die Ausbreitung der Dilatation nach ACh ab, läßt aber die Ausbreitung nach<br />
Adenosin im wesentlichen unbeeinflußt.<br />
3.3 Membranpotential vaskulärer Zellen<br />
Die Messung des Membranpotentials von Gefäßzellen in Arteriolen der Maus in vivo zeigte,<br />
die unterschiedliche hyperpolarisierende Wirkung von ACh auf Endothelzellen und glatte<br />
Muskelzellen, denn Endothelzellen werden stärker hyperpolarisiert. Das Endothel hat somit<br />
als Leitungsweg für fortgeleitete Dilatationen nach ACh große Bedeutung. Die<br />
Hyperpolarisation beruht auf der Aktivierung von K Ca , K + strömt entlang des<br />
Konzentrationsgradienten aus der Zelle und das Membranpotential wird negativer. Sowohl
ERGEBNISSE 87<br />
das Ruhemembranpotential als auch die Potentialänderungen nach ACh sind in<br />
Endothelzellen und glatten Muskelzellen unterschiedlich. Dies zeigt, dass die heterozelluläre<br />
Kopplung in vivo nicht sehr ausgeprägt oder stark reguliert ist. Es ist daher möglich, dass<br />
fortgeleitete Dilatationen nach Adenosin sich im Gegensatz <strong>zu</strong>r ACh-Dilatation überwiegend<br />
entlang der glattmuskulären Zellschicht ausbreiten. Die Potentialänderung, die nach<br />
Adenosin-Applikation an der Stimulationsstelle und an entfernten Positionen auftreten und<br />
die Zellschicht, in der das Signal weitergeleitet wird, sollten deshalb charakterisiert werden.<br />
Deshalb sollten die Methode in unserem Labor neu etabliert werden, um<br />
Membranpotentialänderungen, insbesondere an entfernten Positionen, nach Blockade der<br />
potentiellen Verstärkungsmechanismen von fortgeleiteten Dilatationen (K ATP , K IR ) messen <strong>zu</strong><br />
können.<br />
3.3.1 Identifizierung der vaskulären Zellen<br />
Um die Zellen, in denen das Membranpotential gemessen wurde, <strong>zu</strong> visualisieren, wurde der<br />
Elektrolytlösung in der Mikroelektrode der anionische Farbstoff Carboxyfluorescein<br />
<strong>zu</strong>gesetzt. Nach Penetration einer Zelle diffundierte der Farbstoff entlang seines<br />
Konzentrationsgradienten in die Zelle. Endothelzellen sind entlang der Gefäßlängsachse<br />
orientiert sind, wohingegen glatte Muskelzellen quer <strong>zu</strong>r Gefäßlängsachse liegen. Nach<br />
Visualisierung der gefärbten Zelle mit einem Fluoreszenzmikroskop konnte der Zelltyp daher<br />
anhand seiner Ausrichtung in Be<strong>zu</strong>g auf das Gefäß identfiziert werden. Parallel <strong>zu</strong>r<br />
Gefäßlängsachse orientierte Zellen wurden daher als Endothelzellen (Abb. 3.33 D), quer <strong>zu</strong>r<br />
Gefäßlängsachse angeordnete Zellen als glatte Muskelzellen (Abb. 3.33 B) identifiziert.<br />
3.3.2 Membranpotential vaskulärer Zellen<br />
Das Membranpotential wurde in jeder Zelle nach einer kurzen Stabilisierungsphase<br />
gemessen, insgesamt wurden 13 Tiere untersucht. Das mittlere Ruhemembranpotential der<br />
Endothelzellen betrug -42 ± 5 mV und wurde in 7 Zellen gemessen. In glatten Muskelzellen<br />
betrug das Membranpotential (-21 ± 2 mV) und wurde in 11 Zellen ermittelt (Abb. 3.34). Die<br />
Endothelzellen hatten somit ein um 21 ± 5 mV negativeres Potential (p < 0.01).
ERGEBNISSE 88<br />
A<br />
B<br />
C<br />
D<br />
Abb 3.33: Identifizierung der vaskulären Zellen<br />
B: Gezeigt ist eine mit Carboxyfluorescein gefärbte glatte Muskelzelle, die anhand Ihrer Ausrichtung<br />
quer <strong>zu</strong>r Gefäßlängsachse identifiziert wurde. D: Angefärbte Endothelzelle, die Ausrichtung parallel<br />
<strong>zu</strong>r Gefäßlängsachse ist charakteristisch für diesen Zelltyp. A und C, entsprechende Durchlichtbilder<br />
<strong>zu</strong> den Fluoreszenzaufnahmen, die die Arteriole zeigen.<br />
Membranpotential [mV]<br />
0<br />
-15<br />
-30<br />
-45<br />
*<br />
EC<br />
SMC<br />
Abb 3.34: Ruhemembranpotential vaskulärer Zellen<br />
Das Ruhemembranpotential wurde in Endothelzellen (EC) und glatten Muskelzellen (SMC) gemessen.<br />
Das Potential der glatten Muskelzellen war gegenüber den Endothelzellen deutlich depolarisiert. EC<br />
n=7, SMC n=11, p
ERGEBNISSE 89<br />
3.3.3 Effekt einer lokalisierten Applikation von ACh und Adenosin auf das<br />
Membranpotential.<br />
Um den Effekt einer lokalisierten Applikation von Adenosin und ACh auf das<br />
Membranpotential <strong>zu</strong> untersuchen, wurden die Gefäße nach erfolgreicher Penetration einer<br />
Zelle lokalisiert mit steigenden Konzentrationen des Agonisten stimuliert und das<br />
Membranpotential simultan aufgezeichnet. Das Membranpotential wurde nach Stimulation<br />
mit ACh in 6 und nach Adenosin in 4 glatten Muskelzellen gemessen. Adenosin und ACh<br />
(jeweils 10 mM) induzierten eine Hyperpolarisation, deren Amplitude und Dauer mit<br />
steigender Applikationsdauer und somit Konzentration der Agonisten <strong>zu</strong>nahm. Abbildung<br />
3.35 oben) zeigt die Originalregistrierung des Membranpotentials. Diese Befunde zeigen,<br />
dass sowohl Adenosin als auch ACh eine Hyperpolarisation von glatten Muskelzellen<br />
induzieren können.<br />
SMC<br />
Membranpotential [mV]<br />
-20<br />
-30<br />
-40<br />
Adenosin 100ms<br />
8 10 12 14<br />
Adenosin 1000 ms<br />
16 18 20 22<br />
Adenosin 4000 ms<br />
90 92 94 96<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Membranpotential [mV]<br />
-20<br />
-30<br />
-40<br />
ACh 100ms<br />
448 450 452 454<br />
ACh 1000 ms<br />
472 474 476 478<br />
ACh 2000 ms<br />
486 488 490 492<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.35: Originalregistrierung des Membranpotentials einer glatten Muskelzelle nach<br />
Stimulation mit ACh und Adenosin<br />
Dargestellt ist das Membranpotential in einer glatten Muskelzelle (SMC) nach lokaler Stimulation<br />
durch Adenosin (oben) und ACh (unten) mit steigender Applikationsdauer (von links nach rechts). Die<br />
vertikalen Linien zeigen den Applikationszeitpunkt an. ACh und Adenosin induzieren eine<br />
Hyperpolarisation glatter Muskelzellen, deren Amplitude und Dauer mit <strong>zu</strong>nehmender<br />
Stimulationsdauer <strong>zu</strong>nehmen.
ERGEBNISSE 90<br />
EC<br />
Membranpotential [mV]<br />
-20<br />
-30<br />
-40<br />
-50<br />
Adenosin 100 ms<br />
252 254 256 258<br />
Zeit [s]<br />
Adenosin 1000 ms<br />
274 276 278 280<br />
Zeit [s]<br />
Membranpotential [mV]<br />
ACh 100 ms<br />
-20<br />
-30<br />
-40<br />
-50<br />
252 254 256 258<br />
ACh 700 ms<br />
270 272 274 276<br />
Abb. 3.36: Originalregistrierung des Membranpotentials einer Endothelzelle nach Stimulation<br />
mit ACh und Adenosin<br />
Dargestellt ist das Membranpotential einer Endothelzelle (EC) nach lokaler Stimulation mit Adenosin<br />
und ACh, die Applikationsdauer ist von links nach rechts erhöht. Die vertikalen Linien geben den<br />
Zeitpunkt der ACh- bzw. Adenosin-Ejektion an. ACh induzierte eine Hyperpolarisation der<br />
Endothelzellen während Adenosin keine erkennbare Änderung hervorrief.<br />
In Endothelzellen induzierte ACh ebenfalls eine Hyperpolarisation, deren Ausmaß durch<br />
steigende Appplikationsdauer von ACh vergrößert wurde (Abb 3.36, unten). Adenosin<br />
induzierte in den beobachteten Zellen keine Hyperpolarisation (Abb 3.36, oben). Allerdings<br />
ist die Anzahl der Versuche bisher gering (ACh n = 8 , Adenosin n = 3). Die Ergebnisse sind<br />
jedoch ein Hinweis darauf, dass ACh sowohl glattmuskuläre als auch endotheliale<br />
Hyperpolarisation auslöst, wohingegen Adenosin vermutlich nur eine glattmuskuläre<br />
Hyperpolarisation erzeugt.
ERGEBNISSE 91<br />
3.4 Endotheliale Funktion in hypercholesterinämischen Mausmodellen<br />
Die Hypercholesterinämie beeinträchtigt die endotheliale Funktion in großen Gefäßen. Dies<br />
zeichnet sich durch eine verminderte Vasodilatation der Gefäße auf Stimulation mit<br />
endothelabhängigen Dilatatoren (z.B. Acetylcholin) aus, bis hin <strong>zu</strong>m Auftreten einer<br />
paradoxen Vasokonstriktion. Sowohl in Leitungs- als auch in Widerstandsgefäßen nimmt das<br />
Endothel durch die Freiset<strong>zu</strong>ng der vasoaktiven Autakoide NO, Prostazyklin und des<br />
endothelialen hyperpolarisierenden Faktors (EDHF) entscheidenden Einfluß auf den<br />
Kontraktions<strong>zu</strong>stand der glatten Muskelzellen. Neben der kontinuierlichen Freiset<strong>zu</strong>ng wird<br />
die Bildung der Autakoide auch durch Stimulation mit Acetylcholin induziert. Der Effekt der<br />
Hypercholesterinämie auf die endothelabhängige Dilatation in der Mikrozirkulation ist jedoch<br />
nicht bekannt und könnte sich anders als in Leitungsgefäßen verhalten, da die beteiligten<br />
Mediatoren in den verschiedenen Gefäßtypen möglicherweise variieren. In diesen<br />
Experimenten sollten daher endothelabhängige Dilatation und die Fortleitung lokal<br />
ausgelöster Dilatationen in hypercholesterinämischen Mausmodellen untersucht werden.<br />
3.4.1 Plasmacholesterinspiegel in LDL-R- und ApoE-defizienten Mäusen<br />
Mäuse müssen für eine Hypercholesterinämie und atherosklerotische Veränderungen<br />
sensibilisiert werden. Die Verabreichung einer cholesterin- und fettreichen Diät führt <strong>zu</strong> einer<br />
Verdoppelung bis Verdreifachung der Cholesterinspiegel und einige Mausarten (z.B.<br />
C57BL/6) entwickeln nach mehreren Monaten Diät atherosklerotische Läsionen. Akzentuiert<br />
ist die Entwicklung einer Hypercholesterinämie in Mäusen, die für Proteine <strong>zu</strong>r Entfernung<br />
des Cholesterins aus dem Plasma defizient sind, wie der LDL-Rezeptor- (LDLR-/-) und<br />
ApoE-defizienten Maus (ApoE-/-). Cholesterinspiegel wurden in 11 C57BL/6, 8 LDLR-/- und<br />
5 ApoE-/- bei normaler Diät (ND) und nach Verabreichung einer cholesterin- und fettreichen<br />
Plasmacholesterin<br />
Gesamtcholesterin [mmol/l]<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
C57BL/6 ND<br />
LDLR-/- ND<br />
ApoE-/- ND<br />
LDLR-/- HCD<br />
ApoE-/- HCD<br />
*<br />
*<br />
ohne Diät<br />
*<br />
#<br />
*<br />
mit Diät<br />
#<br />
Abb. 3.37: Plasmacholesterinspiegel in<br />
LDLR-/- und ApoE-/- Mäusen<br />
LDLR-/- und ApoE-/- Tiere haben bereits<br />
bei normaler Diät (ND) gegenüber dem<br />
Wildtyp (C57BL/6) erhöhte Plasmacholesterinspiegel,<br />
die nach Verabreichung einer<br />
cholesterin- und fettreichen Diät (HCD)<br />
weiter anstiegen. n = 11 (C57BL/6) bzw<br />
jeweils 5 - 8 Tiere (LDLR-/- und ApoE-/-).<br />
* p
ERGEBNISSE 92<br />
Diät (HCD) bestimmt. Die Plasmacholesterinspiegel waren sowohl in LDLR-/- als auch in<br />
ApoE-/- Mäusen gegenüber dem Wildtyp signifikant erhöht (Abb. 3.37). Die cholesterin- und<br />
fettreiche Diät erhöhte die Cholesterinspiegel weiter. Diese Diät führte in LDLR-/- nach 6<br />
Monaten Diät und in ApoE-/- Tieren nach 4 Monaten Diät <strong>zu</strong> ähnlich hohen<br />
Cholesterinspiegeln (Abb. 3.37).<br />
3.4.2 Ruhetonus in hypercholesterinämischen Mäusen<br />
Die untersuchten Gefäße hatten einen maximalen Durchmesser von 16 – 61 µm und waren<br />
zwischen den untersuchten Gruppen nicht verschieden. Der Ruhetonus der Arteriolen war in<br />
transgenen Mäusen gegenüber dem Tonus der Kontrolltiere nicht unterschiedlich (C57BL/6:<br />
0.39 ± 0.02; LDLR-/-: 0.43 ± 0.02; ApoE-/- 0.38 ± 0.02). Die Gruppierung der Arteriolen in<br />
kleine (maximaler Durchmesser ≤ 35 µm) und große Arteriolen (max. Durchmesser > 35 µm)<br />
zeigte, dass der Kontraktions<strong>zu</strong>stand der großen Arteriolen im Wildtyp signifikant kleiner war,<br />
d.h. der Ruhetonus nahm einen größeren Wert an (0.59 ± 0.04 vs 0.33 ± 0.02). Ein ähnlich<br />
verminderter Kontraktions<strong>zu</strong>stand war in großen Arteriolen der transgenen Mäuse, die mit<br />
normaler Diät gefüttert wurden, <strong>zu</strong> beobachten (Tabelle 3.3). Demgegnüber war aber in<br />
LDLR-/- und ApoE-/- Tieren nach der cholesterin- und fettreichen Diät kein erniedrigter<br />
Kontraktions<strong>zu</strong>stand in den großen Arteriolen <strong>zu</strong> beobachten, so dass der Ruhetonus in<br />
großen Arteriolen in diesen Gruppen keinen signifikanten Unterschied gegenüber dem Tonus<br />
in kleinen Arteriolen aufwies (Tabelle 3.3). Dies zeigt, dass in den großen Arteriolen nach<br />
Diät kontinuierlich eine Dilatationswirkung fehlt oder ein konstringierender Faktor hin<strong>zu</strong>tritt.<br />
Tabelle 3.3: Ruhetonus hypercholesterinämischer Mäuse<br />
Ruhetonus (Durchmesser / maximalen Durchmesser) im Wildtyp (C57BL/6) und in LDLR-/- und<br />
ApoE-/- Mäusen ohne (ND) oder mit cholesterin- und fettreicher Diät (HCD). Die Arteriolen wurden<br />
nach ihrem maximalen Durchmesser gruppiert. * p 35 µm)<br />
n Tonus Maximum n Tonus Maximum<br />
C57BL/6 ND 75 0.33±0.02 28±1 23 0.59±0.04 * 43±2<br />
LDLR-/- ND 36 0.35±0.03 29±1 35 0.50±0.03 * 42±1<br />
ApoE-/- ND 68 0.36±0.02 29±1 21 0.45±0.05 * 43±2<br />
LDLR-/- HCD 30 0.33±0.02 30±1 36 0.39±0.03 44±1<br />
ApoE-/- HCD 30 0.40±0.02 30±1 19 0.40±0.03 40±1
ERGEBNISSE 93<br />
3.4.3 Effekt von Hypercholesterinämie auf ACh-, Adenosin- und SNP-induzierte<br />
Dilatationen<br />
Der Einfluß von Hypercholesterinämie auf die endotheliale Funktion wurde durch globale<br />
Superfusion von steigenden ACh Konzentrationen (0.3 – 10 µM) untersucht. Weiterhin<br />
wurden Dilatationen, die durch den endothelunabhängigen Dilatator SNP (0.3 – 10 µM)<br />
induziert wurden, sowie Dilatationen nach Stimulation mit Adenosin (1, 10 µM) untersucht.<br />
Es wurden 90 Arteriolen in 9 C57BL/6 Mäusen, 59 Arteriolen in 6 LDLR-/- Tieren und 81<br />
Arteriolen in 8 ApoE defizienten Mäusen beobachtet. ACh induzierte<br />
konzentrationsabhängige Dilatationen in allen Gruppen. Die Dilatation, die durch die maximal<br />
verwendete ACh-Konzentration ausgelöst wurde, war nicht unterschiedlich zwischen den<br />
Gruppen (C57BL/6: 74 ± 3; LDLR-/-: 83 ± 3; ApoE-/-: 79 ± 2 % der maximalen Dilatation). In<br />
transgenen Mäusen, die normale Diät erhalten hatten, war jedoch eine geringe aber<br />
signifikante Abschwächung der Dilatation bei einer Konzentration von 1 µM <strong>zu</strong> beobachten.<br />
Dieser Effekt war in ApoE-/- Mäusen stärker ausgeprägt als in LDLR-/- Mäusen (C57BL/6: 50<br />
± 3; LDLR-/-: 39 ± 4; ApoE-/-: 19 ± 4 % der maximalen Dilatation, Abb. 3.38). Die<br />
abgeschwächte Dilatation im mittleren Konzentrationswirkungsbereich deutet auf eine<br />
reduzierte Sensitivität gegenüber ACh hin. Daher wurde die Konzentration, die eine<br />
halbmaximale Wirkung induziert (EC 50 ), sowie die maximale Antwort (E Max ) der<br />
A<br />
100<br />
ND<br />
B<br />
100<br />
HCD<br />
% der maximalen Dilatation<br />
75<br />
50<br />
25<br />
0<br />
C57BL/6<br />
LDLR-/-<br />
ApoE -/-<br />
75<br />
50<br />
25<br />
0<br />
C57BL/6<br />
LDLR-/-<br />
ApoE -/-<br />
-7 -6 -5<br />
-7 -6 -5<br />
ACh [log mol/l]<br />
ACh [log mol/l]<br />
Abb. 3.38: ACh-induzierte Dilatationen in hypercholesterinämischen Mäusen und<br />
Kontrolltieren.<br />
Die transgenen Tiere (LDLR-/-, ApoE-/-) erhielten entweder normales Futter (ND) oder eine<br />
cholesterin- und fettreiche Diät (HCD) über mehrere Monate. Dargestellt ist die Dilatation nach<br />
Superfusion von ACh in steigenden Konzentrationen. A: In Tieren mit normaler Diät führte ACh <strong>zu</strong><br />
einer konzentrationsabhängigen Dilatation, wobei die Dilatation im mittleren Konzentrationsbereich in<br />
ApoE-/- Tieren abgeschwächt war (reduzierte Sensitivität). Die maximale Dilatation war unverändert.<br />
B: Cholesterin-und fettreiche Diät führte in transgenen Mäusen trotz signifikanter Erhöhung der<br />
Cholesterinspiegel nicht <strong>zu</strong> einer weiteren Abschwächung der ACh Antwort. n = 90 Arteriolen in 9<br />
C57BL/6 Mäusen, 59 Arteriolen in 6 LDLR-/- Tieren und 81 Arteriolen in 8 ApoE-/- Mäusen. EC 50 und<br />
E max Werte in Tabelle 3.4.
ERGEBNISSE 94<br />
Tabelle 3.4: Halbmaximale Konzentration (EC 50 in µM) und maximale Antwort (E max in % der<br />
maximalen Dilatation) nach Stimulation mit ACh<br />
n: Anzahl der beobachteten Arteriolen; ND: normale Diät, HCD: cholesterin- und fettreiche Diät; LNA:<br />
L-Nitroarginin (30 µmol/l) *: p < 0.05 vs. Wildtyp ND, # : p < 0.05 vs. jeweilige Kontrollgruppe.<br />
Genotyp Diät Behandlung n EC 50 E Max<br />
C57BL/6 ND -- 90 0.58 ± 0.09 78 ± 3<br />
LDLR-/- ND -- 59 0.57 ± 0.12 81 ± 4<br />
ApoE-/- ND -- 81 2.11 ± 0.32 * 98 ± 5*<br />
LDLR-/- HCD -- 56 0.48 ± 0.08 85 ± 3<br />
ApoE-/- HCD -- 40 1.40 ± 0.30 * 89 ± 6<br />
C57BL/6 ND Kontrolle 30 0.99 ± 0.24 86 ± 6<br />
C57BL/6 ND L-NA 30 4.46 ± 1.46 # 102 ± 15<br />
ApoE-/- ND Kontrolle 30 1.96 ± 0.30 103 ± 5<br />
ApoE-/- ND L-NA 30 2.15 ± 0.49 93 ± 7<br />
verschiedenen Konzentrationswirkungskurven berechnet. Es zeigte sich, dass die EC 50 in<br />
ApoE-/- Tieren ohne Diät gegenüber den Kontrolltieren auf das ca. 3-fache erhöht war ohne<br />
eine Abschwächung der E Max (Tabelle 3.4). Obwohl die Plasmacholesterinspiegel durch eine<br />
cholesterin- und fettreiche Diät signifikant erhöht wurden, führte die Diät in den transgenen<br />
Mäusen nicht <strong>zu</strong> einer weiteren Abschwächung der ACh-Dilatation, da sowohl die maximalen<br />
Gefäßantworten (E Max ) als auch die EC 50 in ND- und HCD-Gruppen ähnlich waren (Tabelle<br />
3.4). Somit zeigt sich lediglich ein geringer Effekt einer Hypercholesterinämie auf<br />
endothelabhängige Dilatationen in der Mikrozirkulation im Sinne einer Desensitivierung.<br />
% der maximalen Dilatation<br />
A<br />
75<br />
50<br />
25<br />
ND<br />
LDLR-/-<br />
ApoE -/-<br />
0<br />
-7 -6 -5<br />
SNP [log mol/l]<br />
*<br />
C57BL/6<br />
B<br />
HCD<br />
75<br />
50<br />
25<br />
C57BL/6<br />
LDLR-/-<br />
ApoE -/-<br />
0<br />
-7 -6 -5<br />
SNP [log mol/l]<br />
Abb. 3.39: SNP induzierte Dilatationen in hypercholesterinämischen Mäusen.<br />
Dargestellt ist die Dilatation in Abhängigkeit von der Konzentration des NO-Donors Nitroprussid<br />
(SNP). In allen Gruppen führte die Applikation des NO-Donors SNP <strong>zu</strong> einer<br />
konzentrationsabhängigen Dilatation und die Gefäßantwort war in LDLR-/- und ApoE-/- Tieren weder<br />
nach Standardfutter (ND, A) noch nach Fütterung einer cholesterin- und fettreichen Diät (HCD, B)<br />
abgeschwächt. n= 90 Arteriolen in 9 C57BL/6 Mäusen, 59 Arteriolen in 6 LDLR-/- Tieren und 81<br />
Arteriolen in 8 ApoE-/- Mäusen. * p
ERGEBNISSE 95<br />
% der maximalen Dilatation<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
ND<br />
HCD<br />
} LDLR-/-<br />
ND<br />
HCD<br />
} ApoE-/-<br />
C57BL/6<br />
#<br />
#<br />
*<br />
#<br />
0<br />
-6 -5<br />
Adenosin [log mol/l]<br />
Abb. 3.40: Adenosin induzierte Dilatationen in hypercholesterinämischen Mäusen.<br />
Superfusion von Adenosin induzierte konzentrationsabhängige Dilatationen in allen Gruppen. Bei<br />
niedrigen Adenosin-Konzentrationen (1 µM) war die Dilatation jedoch in transgenen Mäusen mit und<br />
ohne cholesterin- und fettreiche Diät reduziert, während die maximale Dilatation nicht verändert war.<br />
n=40 Arteriolen in 4 Tieren. *p
ERGEBNISSE 96<br />
A<br />
C57BL/6<br />
B<br />
ApoE<br />
% der maximalen Dilatation<br />
100<br />
75<br />
50<br />
25<br />
0<br />
Kontrolle<br />
LNA<br />
100<br />
75<br />
50<br />
25<br />
0<br />
Kontrolle<br />
LNA<br />
-7 -6 -5<br />
-7 -6 -5<br />
ACh [log mol/l]<br />
ACh [log mol/l]<br />
Abb. 3.41: Effekt der Inhibition der NO-Synthase auf ACh-Dilatationen in C57BL/6 und ApoE-/-<br />
Tieren<br />
Dargestellt ist die ACh-Dilatation in Abhängigkeit von der Konzentration. A: In Wildtyptieren (C57BL/6)<br />
induzierte LNA eine Rechtsverschiebung der Konzentrationswirkungskurve ohne die maximale<br />
Dilatation <strong>zu</strong> beeinflussen. B: Im Gegensatz da<strong>zu</strong> hat LNA keinen Effekt in ApoE-/- Mäusen. Jeweils n<br />
= 30 Arteriolen in 3 Tieren. EC 50 und E max sind in Tabelle angegeben<br />
Dilatation auf ACh (E Max , Tabelle 3.4) <strong>zu</strong> verändern (Abb. 3.41). Demgegenüber hatte die<br />
Behandlung mit LNA in den hypercholesterinämischen ApoE-/- Mäusen, deren EC 50 schon<br />
unter Kontrollbedingungen erhöht war, keinen Einfluß auf die ACh-Dilatation (Abb. 3.41,<br />
Tabelle 3.4). SNP-induzierte Dilatationen wurden dagegen in keiner der beiden Gruppen<br />
durch LNA beeinflußt (Abb. 3.42)<br />
% der maximalen Dilatation<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Kontrolle<br />
LNA<br />
Kontrolle<br />
LNA<br />
} C57BL/6<br />
} ApoE-/-<br />
SNP [1µM]<br />
Abb.3.42: Effekt der Inhibition der NO-Synthase auf SNP-Dilatationen<br />
Der Inhibitor der NO-Synthase (LNA) hatte keinen Effekt auf die SNP induzierte Dilatation. Jeweils<br />
n = 30 in 3 C57BL/6 und 3 ApoE-/- Tieren.
ERGEBNISSE 97<br />
3.4.5 Fortgeleitete Vasomotorantworten nach ACh und KCl bei Hypercholesterinämie<br />
Die Ausbreitung einer Gefäßantwort benötigt eine Kopplung der Zellen über Gap Junctions<br />
und bei der Ausbreitung von Dilatationen hat Cx40, wie in Kapitel 3.1 gezeigt, eine<br />
besondere Bedeutung. Eine Hypercholesterinämie geht mit einer reduzierten Expression von<br />
Cx40 und Cx37 in Aorten in morphologisch normal erscheinenden Gebieten einher. Somit<br />
könnte sich eine durch Hypercholesterinämie veränderte Expression der Connexine auf die<br />
Ausbreitung von lokal induzierten Vasomotorantworten entlang des Gefäßes auswirken.<br />
Deshalb sollte in diesen Experimenten die Ausbreitung von lokal induzierten Gefäßantworten<br />
in hypercholesterinämischen Mäusen untersucht werden.<br />
Es wurden Arteriolen mit einem maximalen Gefäßdurchmesser von 36 ± 1 µm lokal mit ACh<br />
über Mikropipetten stimuliert. Diese lokalisierte Applikation von ACh induzierte im Wildtyp<br />
(C57BL/6) eine lokale Dilatation, die innerhalb von 10 ± 1 s ein Maximum von 69 ± 5%<br />
erreichte (n = 8 Arteriolen in 6 Tieren). Die Gefäße erreichten ihren Ausgangsdurchmesser<br />
% der maximalen Dilatation<br />
LDL-/-<br />
ACh<br />
90<br />
C57BL/6<br />
LDL-/- ND<br />
LDL-/- HCD<br />
60<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
30<br />
0<br />
-30<br />
-30 0 30 60 -30 0 30 60 -30 0 30 60<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
% der maximalen Dilatation<br />
ApoE-/-<br />
ACh<br />
90<br />
C57BL/6<br />
ApoE-/- ND<br />
ApoE-/- HCD<br />
60<br />
lokal 550µm 1100µm<br />
30<br />
0<br />
-30<br />
-30 0 30 60 -30 0 30 60 -30 0 30 60<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Zeit [s]<br />
Abb. 3.43: Fortgeleitete Dilatationen nach ACh in hypercholesterinämischen Tieren<br />
Dargestellt sind die Durchmesseränderungen nach lokaler Stimulation mit ACh (vertikale Linie) in<br />
LDLR-/- (oben) und ApoE-/- Tieren (unten) über die Zeit. Die Tiere erhielten entweder eine normale<br />
(ND) oder eine cholesterin- und fettreiche Diät (HCD). Zum Vergleich sind die Antworten in<br />
Wildtyptieren (C57BL/6) in beiden Abbildungen dargestellt. Weder die lokale Dilatation noch die<br />
Ausbreitung der Dilatation entlang der Arteriole wurde durch Hypercholesterinämie beeinträchtigt.<br />
Ebenso blieb die weitere Erhöhung der Cholesterinspiegel durch Diät (HCD) ohne Auswirkung auf die<br />
ACh Dilatation und deren Fortleitung. n= 8 - 12 Arteriolen in 6 Mäusen für jede Gruppe.
ERGEBNISSE 98<br />
innerhalb 43 ± 5 s. Die lokale Dilatation breitete sich ohne Verzögerung (< 1 s) entlang der<br />
Arteriole aus, wobei die Amplitude der Dilatation bis in eine Entfernung von 1100 µm nicht<br />
abnahm. Die Dauer der Dilatation verkürzte sich jedoch mit <strong>zu</strong>nehmender Entfernung von<br />
der Stimulationsstelle (Abb. 3.44). Die lokalisierte Stimulation der Arteriolen mit ACh führte in<br />
den transgenen Tieren ebenfalls <strong>zu</strong> einer fortgeleiteten Dilatation (LDLR-/-: n = 12 in 6,<br />
ApoE-/-: n = 8 in 5 Tieren). Die Dilatation breitete sich auch in diesen Tieren über eine große<br />
Entfernung entlang der Arteriole aus (Abb. 3.43). Die Gefäßantworten an der lokalen Position<br />
und den entfernten Stellen unterschieden sich in der Amplitude und der Dauer nicht von der<br />
Dilatation im Wildtyp (Abb. 3.44). Die weitere Erhöhung der Cholesterinspiegel durch die<br />
Verabreichung einer cholesterin- und fettreichen Diät über einen Zeitraum von 4-6 Monaten<br />
hatte ebenfalls keine Auswirkung auf die fortgeleiteten Dilatationen in den transgenen<br />
Mäusen (Abb. 3.43 und 3.44). Somit ist die Ausbreitung von Dilatationen, die durch ACh<br />
lokal ausgelöst wurden, bei Hypercholesterinämie nicht eingeschränkt.<br />
A<br />
% der maximalen Dilatation<br />
B<br />
s<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
60<br />
40<br />
20<br />
Amplitude<br />
0 550 1100<br />
Dauer<br />
*<br />
* *<br />
}<br />
ND<br />
LDLR-/-<br />
HCD<br />
ND<br />
ApoE-/-<br />
HCD<br />
}<br />
C57BL/6<br />
Abb. 3.44: Amplitude und Dauer<br />
fortgeleiteteter Dilatationen nach<br />
ACh bei Hypercholesterinämie<br />
A: Die Amplitude der Dilatation<br />
zeigte in allen Gruppen bis in eine<br />
Entfernung von 1100 µm keine<br />
Abschwächung und war in den<br />
verschiedenen Gruppen nicht<br />
unterschiedlich. Eine <strong>zu</strong>sätzliche<br />
Erhöhung der Cholesterinspiegel in<br />
den transgenen Mäusen durch eine<br />
cholesterinreiche Diät (HCD)<br />
anstelle des Standardfutters (ND)<br />
hatte ebenso keinen Einfluß auf die<br />
Gefäßantwort.<br />
B: Die Dauer der Dilatation<br />
verkürzte sich in den meisten<br />
Gruppen mit <strong>zu</strong>nehmender<br />
Entfernung. Dennoch fanden sich<br />
keine signifikanten Unterschiede<br />
zwischen den Genotypen oder den<br />
mit Diät behandelten Gruppen. Die<br />
Daten stammen aus 8 - 12<br />
Arteriolen in 6 Experimenten.<br />
* p < 0.05 vs lokal.<br />
0<br />
0 550 1100<br />
Entfernung von der Stimulationsstelle [µm]
ERGEBNISSE 99<br />
3.4.6 Immunhistochemischer Nachweis von Connexin40 in hypercholesterinämischen<br />
Mäusen<br />
Die Expression von Connexin 40 wurde in hypercholesterinämischen Mäusen mittels<br />
Immunhistochemie an Paraffinschnitten untersucht. Es wurde der Creamstermuskel mit den<br />
in ihm verlaufenden Arteriolen (n = 6) und <strong>zu</strong>r methodischen Kontrolle Aorten (n = 4) und der<br />
Vorhof des Herzens (n = 2) untersucht, da in diesem Gewebe Cx40 reichlich exprimiert wird.<br />
Das Gewebe wurde Wildtyp- und ApoE-/- Tieren sowie als Negativkontrolle Cx40-defizienten<br />
Mäusen entnommen. Um die Methode <strong>zu</strong> etablieren, wurden <strong>zu</strong>nächst Aorten betrachtet.<br />
Cx40 wurde in Aorten von Wildtypmäusen detektiert (Abb. A, braune Färbung) und war mit<br />
dem endothelspezifischen Marker von Willebrand Faktor (vWF, rote Färbung, Abb. 3.45 A,<br />
D) kolokalisiert. Diese Färbung war spezifisch, da in Aorten Cx40-defizienter Mäusen zwar<br />
vWF lokalisiert werden konnte, das Cx40 Signal jedoch nicht detektierbar war (Abb. 3.45 B,<br />
E). Weiterhin war nach Inkubation der Schnitte ohne die jeweiligen primären Antikörper<br />
weder eine Rot- (vWF) noch eine Braunfärbung (Cx40) detektierbar (Abb. 3.45 C, F). Als<br />
weitere Positivkontrolle wurde der Vorhof von Wildtyptieren untersucht, auch in diesem<br />
Gewebe war eine deutliche Braunfärbung als Nachweis des Cx40 sichtbar (Abb. 3.45 G). Die<br />
Untersuchung der Arteriolen erwies sich jedoch als technisch schwierig. Die meisten<br />
angefertigten Schnitte waren nicht <strong>zu</strong> verwerten, da in diesen Arteriolen nicht eindeutig <strong>zu</strong><br />
erkennen waren und nur in wenigen Schnitten konnten Arteriolen identifiziert verwertet. Die<br />
Abbildungen 3.45 H und I zeigen eine Arteriole in dem Cremastermuskel einer ApoE-/-<br />
Maus. Cx40 ist deutlich sichtbar (braun) und kolokalisiert mit vWF (rot). Da die<br />
Gewebeaufarbeitung nicht optimiert werden konnte und die wenigen erhaltenen Ergebnisse<br />
heterogen waren, würde eine Quantifizierung selbst unter optimalen Bedingungen<br />
bestenfalls einen Hinweis auf eine veränderte Cx40 Expression liefern. Von weiteren<br />
Experimenten und der Quantifizierung wurde daher abgesehen. Dennoch zeigen diese<br />
Befunde, dass Cx40 auch in hypercholesterinämischen Tieren in den Arteriolen exprimiert<br />
wird.
ERGEBNISSE 100<br />
Abb. 3.45: Immunhistochemischer Nachweis von Cx40 in hypercholesterinämischen Tieren<br />
Paraffinschnitte der Aorta, des Vorhofs und Arteriolen des M. cremaster nach immunhistochemischer<br />
Färbung von Cx40 (braun) und eines endothelspezifischen Markers (von Willebrand Faktor, vWF, rot).<br />
In der Aorta einer Wildtypmaus war Cx40 (braun) und vWF (rot) kolokalisiert (A; D). Cx40 war in der<br />
Aorta einer Cx40-defizienten Maus nicht detektierbar (B; E), obwohl das Endothel erkennbar am<br />
Nachweis von vWF (rot) intakt war. Ohne die Inkubation der Schnitte mit den primären Antikörpern<br />
war keine Färbung detektierbar (C; F). Cx40 wurde ebenfalls im Vorhof des Herzens detektiert (G,<br />
braun). Im Cremastermuskel einer ApoE-/- war Cx40 (braun) in einem longitudinal angeschnittenen<br />
Gefäß mit vWF (rot) deutlich sichtbar kolokalsiert (H, I).
ERGEBNISSE 101<br />
3.5 Magnetofektion in vivo<br />
3.5.1 Targeting der Src homology domain 2 (SH2)-Tyrosinphosphatase-1 (SHP-1):<br />
Effekt auf ACh- und SNP- induzierte Dilatationen<br />
Magnetofektion ermöglicht die einfache und schnelle Transfektion von Zellen in Kultur. Die<br />
Methode beruht auf der reversiblen Kopplung von Oligonukleotiden oder Genvektoren an<br />
magnetische Nanopartikel, die von einer kationischen Polymerhülle umgeben sind und in<br />
wässriger Suspension vorliegen. Die magnetischen Nanopartikel mit den gebundenen<br />
Antisensenukleotiden können mit Hilfe eines externen Magnetfeldes am Zielort fixiert und<br />
konzentriert werden.<br />
Target unserer Versuche war <strong>zu</strong>nächst die Src homology domain 2 (SH2)-<br />
Tyrosinphosphatase-1 (SHP-1). SHP-1 wurde in menschlichen Endothelzellen der<br />
Nabelschnur (HUVEC) als wichtiger Regulator der NADPH-Oxidase abhängigen Superoxid-<br />
Produktion identifiziert. In Endothelzellen reduziert SHP-1 sowohl die basale als auch die<br />
stimulierte Superoxid-Produktion, was sekundär die NO-vermittelte Dilatation beeinflußen<br />
könnte, da Superoxid prinzipiell in der Lage ist, NO <strong>zu</strong> deaktivieren. Der Effekt der<br />
Behandlung mit Antisensenukleotiden gegen SHP-1 auf SNP- und ACh- induzierte<br />
Dilatationen wurde in 42 Arteriolen (4 Tieren) untersucht. Als Kontrollen wurden Mäuse<br />
verwendet, die mit einer Nonsense-Sequenz (Scrambled) transfiziert wurden (39 Arteriolen in<br />
4 Tieren). Die vaskuläre Funktion wurde 3 Tage nach der Applikation der Nukleotide in der<br />
Mikrozirkulation in Arteriolen mit einem maximalen Durchmesser von 10 bis 56 µm<br />
untersucht. Der NO Donor SNP induzierte in beiden Gruppen eine Konzentrationsabhängige<br />
Dilatation, die in den transfizierten Tieren nicht abgeschwächt war, es zeigte sich ein leicht<br />
verstärkte Dilatation, dieser Effekt war jedoch nicht signifikant (1µM: p= 0.055). ACh<br />
induzierte ebenfalls eine konzentrationsabhängige Dilatation, in den mit SHP-1<br />
Antisenseoligonukleotiden transfizierten Tieren. Die Dilatation war nicht wesentlich<br />
unterschiedlich <strong>zu</strong> der Dilatation, die in den mit einer Nonsense-Sequenz behandelten Tieren<br />
beobachtet wurde. Lediglich bei der Konzentration von 0.1 und 10 µM ACh war die Dilatation<br />
in den mit der wirksamen Nukleotidsequenz behandelten Tieren abgeschwächt, der Effekt<br />
war jedoch nur bei 0.1µM signifikant (0.1µM: 1 ± 7 vs 17 ± 4, p = 0.02; 10 µM: 56 ± 6 vs 70 ±<br />
5, % der maximalen Dilatation, p = 0.06, Abb. 3.46).
ERGEBNISSE 102<br />
.<br />
A<br />
90<br />
SNP<br />
B<br />
90<br />
ACh<br />
% der maximalen Dilatation<br />
60<br />
30<br />
0<br />
Antisense<br />
Kontrolle<br />
60<br />
30<br />
0<br />
*<br />
Antisense<br />
Kontrolle<br />
-6 -5<br />
Konzentration [log mol/l]<br />
-7 -6 -5<br />
Konzentration [log mol/l]<br />
Abb. 3.46: Effekt nach Transfektion von Antisenseoligonukleotiden gegen die Tyrosinposphatase<br />
SHP-1 auf die Dilatation<br />
Die vaskuläre Funktion wurde 3 Tage nach Applikation der Oligonukleotide untersucht. Dargestellt ist<br />
die Dilatation in Abhängigkeit von der Konzentration von ACh bzw. SNP. SNP (A) und ACh (B)<br />
induzieren konzentrationsabhängige Dilatationen die sich zwischen Antisense- und Nonsense-<br />
Sequenz (Kontrolle) nicht wesentlich unterschied. n = 39 - 42 in 4 Tieren je Gruppe.<br />
3.5.2 Targeting des M 3 -Rezeptors: Effekt auf ACh, Adenosin und SNP induzierte<br />
Dilatationen<br />
In einer weiteren Gruppe von Experimenten wurde der muskarinische Acetylcholin-Rezeptor<br />
(M 3 Rezeptor) als Target ausgewählt, da dieser endotheliale Rezeptor die Acetylcholin (ACh)<br />
induzierte Gefäßdilatationen vermittelt. Hier<strong>zu</strong> wurde ein Gemisch aus 6 verschiedenen<br />
Antsenseoligonukleotiden verwendet, die die Expression des M 3 Rezeptors in Keratinozyten<br />
in vitro um 80% reduzierte.<br />
Die endotheliale Funktion wurde 3 Tage nach Behandlung mit den Oligonukleotiden in der<br />
Mikrozirkulation untersucht. Die ACh induzierte Dilatation wurden durch diese Behandlung<br />
jedoch nicht verändert, die Konzentrationswirkungskurven verliefen nahe<strong>zu</strong> identisch (Abb.<br />
3.47 A). SNP induzierte Dilatationen waren nach der Applikation der Oligonukleotide sogar<br />
signifikant verstärkt (Abb. 3.47 B), während die Dilatation induziert durch die Superfusion von<br />
Adenosin unverändert blieb (Abb. 3.47 C). Dies zeigt, dass eine effektive Ausschaltung des<br />
die ACh-Dilatation vermittelnden Rezeptors mit dieser Methode nicht durchführbar ist. Auch<br />
die Untersuchung der vaskulären Funktion <strong>zu</strong> einem früheren Zeitpunkt nach Behandlung<br />
waren ohne deutlichen Hemmeffekt (Daten nicht gezeigt).
ERGEBNISSE 103<br />
% der maximalen Dilatation<br />
A B C<br />
90<br />
60<br />
30<br />
0<br />
ACh<br />
Antisense<br />
Kontrolle<br />
SNP<br />
-7 -6 -5<br />
-7 -6 -5<br />
[log mol/l] [log mol/l]<br />
90<br />
60<br />
30<br />
0<br />
*<br />
*<br />
*<br />
*<br />
Antisense<br />
Kontrolle<br />
90<br />
60<br />
30<br />
0<br />
Adenosin<br />
-6 -5<br />
[log mol/l]<br />
Antisense<br />
Kontrolle<br />
Abb. 3.47: Vaskuläre Funktion nach Behandlung mit Nukleotiden <strong>zu</strong>r Ausschaltung des<br />
muskarinischen ACh-Rezeptors<br />
Ein Gemisch aus 6 Antisensenukeotiden, die gegen die mRNA des muskarinischen M 3 -Rezeptors<br />
gerichtet war, wurde 3 Tage vor der Untersuchung der vaskulären Funktion appliziert. Dargestellt ist<br />
die Dilatation in Abhängigkeit von der Konzentration der Agonisten ACh (A), SNP (B) und Adenosin<br />
(C). Weder durch ACh- noch durch Adenosin-induzierte Dilatationen wurden hierdurch beeinflußt,<br />
während die SNP-induzierten Dilatationen nach Behandlung verstärkt waren. n= 50 Arteriolen in 5<br />
Tieren. * ttest p
DISKUSSION 104<br />
4 Diskussion<br />
4.1 Cx40 Expression und Rolle von endothelialem Cx40 bei der Ausbreitung<br />
von Gefäßantworten<br />
Die Regulation der Organperfusion ermöglicht die schnelle und adäquate Anpassung der<br />
Perfusion an den momentanen Bedarf des Organs. Die Koordination erfolgt einerseits durch<br />
vaskuläre Effekte der Wandschubspannung, die durch das fließende Blut auf die Gefäßwand<br />
ausgeübt werden (8) und andererseits durch Fortleitung von Vasomotorantworten entlang<br />
der Zellschichten der Gefäßwand (158). Die Fortleitung von Vasomotorantworten beruht auf<br />
der Ausbreitung von Membranpotentialänderungen, wobei sowohl die glattmuskuläre<br />
Zellschicht als auch das Endothel als separate Leitungswege dienen können (120, 159).<br />
Lokal induzierte Membranpotentialänderungen können sich über eine Strecke von mehreren<br />
Millimetern entlang des Gefäßes ausbreiten (59, 160). Dabei ist die Ausbreitung des Signals<br />
abhängig von einer intakten elektrischen Kopplung der Zellen über Gap Junctions.<br />
Connexin40 (Cx40) hat für die Ausbreitung von ACh-induzierten EDHF-vermittelten<br />
Dilatationen entlang der Arteriole eine besondere Bedeutung, wie von unserer Arbeitsgruppe<br />
bereits gezeigt wurde (110). In Cx40-defizienten Mäusen war die Ausbreitung des Signals in<br />
die Entfernung deutlich abgeschwächt. In dieser Arbeit wurde untersucht, in welcher<br />
Zellschicht Cx40 die Fortleitung ermöglicht. Immunfärbung in Arteriolen des<br />
Cremastermuskels zeigte die Lokalisation von Cx40 an den Zellgrenzen der Endothelzellen.<br />
Die Konturen der Endothelzellen werden nach Markierung von Cx40 gänzlich sichtbar, was<br />
die reichliche Expression von Cx40 in der Zellmembran deutlich zeigt. Diese Lokalisation ist<br />
vereinbar mit der Hypothese, dass fortgeleitete Dilatationen, die durch ACh induziert wurden,<br />
sich entlang der Endothelzellschicht ausbreiten. Die Expression von Cx40 konnte in einer<br />
Reihe von Spezies im Endothel von Leitungs- und Widerstandsgefäßen nachgewiesen<br />
werden (56, 106, 161-165). In der vorliegenden Arbeit wurde in glatten Muskelzellen kein<br />
Cx40 detektiert und auch in der Literatur sind Berichte über eine Expression in glatten<br />
Muskelzellen mit Ausnahme des Nachweises von Cx40 in Renin sekretierenden Zellen der<br />
afferenten Nierenarteriolen selten (166-168). Allerdings wurde in der Mikrozirkulation der<br />
Backentasche des Hamsters Cx40 sowohl in Endothelzellen als auch in glatten Muskelzellen<br />
lokalisiert, was auf gewebe- oder speziesspezifische Unterschiede der Connexinexpression<br />
hindeutet (163, 164). Möglicherweise findet sich Cx40 auch in der glatten Muskulatur in dem<br />
hier untersuchten Präparat, welches unterhalb der Nachweisbarkeitsgrenze der verwendeten<br />
Methode nicht detektiert werden konnte. Ein solch niedriges Expressionsniveau kann<br />
eventuell auch eine intakte elektrische Kopplung von Zellen über vereinzelte Gap Junctions<br />
herstellen, ohne dass sie mittels Immunfluoreszenz nachweisbar waren (169).<br />
Daher wurde die Ausbreitung von Dilatationen und Konstriktionen auch in Mäusen mit einem
DISKUSSION 105<br />
endothelialen Cx40 (eCx40-/-) Verlust untersucht. Die untersuchten Tiere wiesen ein von lox-<br />
Sites flankiertes Cx40 Gen auf (floxed Cx40), welches durch die Cre-Rekombinase unter der<br />
Kontrolle eines TIE-2 Promotors selektiv im Endothel deletiert wurde. (170). In diesen Tieren<br />
und dem Wildtyp breiteten sich ACh induzierte Dilatationen in die Entfernung aus. Der<br />
endotheliale Cx40 Verlust führte jedoch mit <strong>zu</strong>nehmender Entfernung von der<br />
Stimulationsstelle <strong>zu</strong> einer Abschwächung der Amplitude der Gefäßantwort, wohingegen die<br />
Amplitude im Wildtyp konstant blieb. Dies zeigt, dass die endotheliale Zellschicht bei der<br />
Ausbreitung von ACh-induzierten Dilatationen als Leitungsweg im Vordergrund steht und<br />
Cx40 hier eine besondere Bedeutung <strong>zu</strong>kommt. Prinzipiell stehen sowohl das Endothel als<br />
auch die glattmuskuläre Zellschicht als Leitungsweg <strong>zu</strong>r Verfügung. In Arteriolen der<br />
Backentasche des Hamsters konnten ACh-induzierte Dilatationen beide Leitungswege<br />
nutzen, wie durch selektive Zerstörung der einzelnen Leitungswege gezeigt wurde. Erst nach<br />
Zerstörung der Endothel- und der glattmuskulären Zellschicht breitete sich das Signal nicht<br />
mehr in die Entfernung aus (120, 159). Ähnliche Experimente im Cremastermuskel der Maus<br />
identifizierten jedoch das Endothel als alleinigen Leitungsweg, entlang dessen sich das<br />
Signal nach lokaler ACh-Stimulation ausbreitete (164). Die intakte glatte Muskelzellschicht<br />
war hierbei nicht in der Lage, die Zerstörung des Endothels <strong>zu</strong> kompensieren. Diese Befunde<br />
lassen für die abgeschwächte Fortleitung in eCx40-/- vermuten, dass andere Connexine die<br />
longitudinale Kopplung entlang des Endothels <strong>zu</strong>mindest partiell ermöglichen und dass nicht<br />
die glatte Muskelzellschicht als Signalweg für die verbleibende Antwort fungiert.<br />
Die Untersuchung spezifischer Funktionen in Mausmodellen mit einer Deletion eines<br />
Connexins ist dadurch erschwert, dass die Deletion das Expressionsmuster anderer<br />
Connexine beeinflussen kann. So führte die Deletion von Cx40 im Mausmodell <strong>zu</strong> einer<br />
gesteigerten Expression von Cx37 und Cx43 (171, 172). Der endothelspezifische Verlust von<br />
Cx43 führte hingegen <strong>zu</strong> einer ebenfalls verringerten Expression von Cx43 in glatten<br />
Muskelzellen (173). Der Einfluß des endothelspezifischen Verlusts von Cx40 auf die<br />
Expression anderer Connexine wurde in dieser Arbeit nicht untersucht. Die vorliegenden<br />
Daten erlauben jedoch die Schlußfolgerung, dass Cx40 für die Ausbreitung von ACh<br />
Dilatationen von großer Bedeutung ist und die Ausbreitung der Dilatation vermutlich entlang<br />
des Endothels erfolgt. Offen ist die Frage, ob eine mögliche Heraufregulation anderer<br />
Connexine im Endothel nach spezifischer Deletion von Cx40 die verbleibende Fortleitung nur<br />
nach der Deletion ermöglicht oder ob dies den physiologischerweisen Beitrag der anderen<br />
Connexine widerspiegelt. Um dies <strong>zu</strong> beantworten, muß die Funktion von Cx40 kurzfristig<br />
ausgeschaltet werden. Da spezifische Blocker nicht <strong>zu</strong>r Verfügung stehen, ist hier<strong>zu</strong> eine<br />
gewebsspezifische und zeitlich induzierbare Gendeletion notwendig. Interessanterweise ist<br />
die kombinierte Deletion der beiden wichtigen endothelialen Connexine Cx40 und Cx37 nicht
DISKUSSION 106<br />
mit dem Leben vereinbar (174), was die physiologische Relevanz der Zellkopplung im<br />
Endothel nochmals betont.<br />
Konstriktionen, die durch lokale Applikation von KCl induziert wurden, breiteten sich im<br />
Gegensatz <strong>zu</strong> ACh induzierten Dilatationen mit abnehmender Amplitude in die Entfernung<br />
aus. Dies wurde durch den Verlust von endothelialem Cx40 nicht beeinflußt. In der<br />
Hamsterbackentasche konnten Segal und Mitarbeiter durch selektive Zerstörung von glatten<br />
Muskelzellen oder Endothelzellen in einem Bereich zwischen Stimulationsstelle und<br />
beobachteter Position zeigen, dass eine lokal induzierte biphasische Gefäßantwort nach<br />
KCl-Stimulation in unterschiedlichen Zellschichten fortgeleitet wurden. Die biphasische<br />
Gefäßantwort bestand aus einer Konstriktion, die von einer Dilatation gefolgt wurde. Hierbei<br />
breitete sich die Konstriktion ausschließlich entlang der glattmuskulären Zellschicht aus,<br />
wohingegen die Dilatation entlang des Endothels fortgeleitete wurde (159). KCl induzierte in<br />
unserer Präparartion ebenfalls eine biphasische Reaktion und beide Komponenten wurden in<br />
die Entfernung fortgeleitet. Die initiale Konstriktion entsteht durch die Öffnung<br />
spannungsabhängiger Calciumkanäle, die durch die direkte KCl-induzierte Depolarisation<br />
aktiviert werden, denn sie wurde durch den Calcium-Kanal-Blocker Nifedipin inhibiert (159).<br />
Die folgende Dilatation ist in tonisierten Gefäßen <strong>zu</strong> beobachten und beruht vermutlich auf<br />
der allmählichen Abnahme der lokalen Kaliumkonzentration nach Stimulation. Im Gegensatz<br />
<strong>zu</strong>r Depolarisation bei hohen Kaliumkonzenztrationen aktiviert Kalium in einem niedrigen<br />
Konzentrationsbereich von 6 - 20 mM <strong>zu</strong>m einen K IR -Kanäle und <strong>zu</strong>m anderen die<br />
elektrogene Na + /K + ATPase. Beide Vorgänge bewirken eine Hyperpolarisation und eine sich<br />
ausbreitende Dilatation (159). Die Ausbreitung dieser Dilatation wurde jedoch durch den<br />
Verlust von endothelialem Cx40 nicht beeinflußt. Möglicherweise sind andere Connexine<br />
(Cx37, Cx43) an der Ausbreitung der Dilatation entlang des Endothels beteiligt oder das<br />
Signal breitet sich in dieser Präparation ebenfalls entlang der glattmuskulären Zellschicht<br />
aus. Auffällig ist, dass sich die durch KCl induzierten Konstriktionen im Vergleich <strong>zu</strong><br />
Dilatationen nach ACh deutlich schlechter in die Entfernung ausbreiten. Das Endothel ist<br />
aufgrund seiner longitudinalen Ausrichtung entlang des Gefäßes und der Länge, die eine<br />
Endothelzelle besitzt (~150 µm), als Leitungsweg besonders geeignet. Ein sich<br />
ausbreitendes Signal müßte <strong>zu</strong>r Überwindung einer Strecke von 2 mm 280 glatte<br />
Muskelzellen, jedoch nur 14 Endothelzellen passieren (4). Die größere Zellzahl, die das<br />
Signal bei der Ausbreitung entlang der glattmuskulären Zellschicht überwinden muß, könnte<br />
an der Abschwächung des Signals in der Entfernung beteiligt sein. Ebenso könnte das<br />
Ausmaß der homozellulären Kopplung entlang der glattmuskulären Zellschicht Einfluß auf<br />
die Effizienz der Fortleitung nehmen, denn die Zellkopplung über Gap Junctions ist in glatten<br />
Muskelzellen weniger gut ausgeprägt (166). Die mathematische Modellierung der
DISKUSSION 107<br />
Signalweitergabe in Arteriolen zeigt ebenfalls, dass differente Signalwege existieren und die<br />
glatte Muskelzellschicht deutlich schlechter gekoppelt ist (175). Die hier vorgelegten<br />
Ergebnisse lassen vermuten, dass die Ausbreitung von Konstriktionen entlang dieser<br />
glattmuskulären Zellschicht erfolgt und unabhängig von Cx40 ist.<br />
4.2 Bedeutung von K Ca –Kanälen in der Mikrozirkulation<br />
4.2.1 BK Ca bei NO- und endothelabhängigen Dilatationen<br />
In vitro Untersuchungen haben gezeigt, dass die Aktivität von spannungs- und<br />
calciumsensitiven BK Ca -Kanälen in glatten Muskelzellen den Calciumeinstrom und damit die<br />
Kontraktion inhibieren (Abb. 1.1 (30, 36, 176-179)). Kanalaktivierung repolarisiert glatte<br />
Muskelzellen und führt dadurch <strong>zu</strong>m Schließen von spannungsabhängigen Calciumkanälen,<br />
die <strong>zu</strong>vor beispielsweise durch Agonisten aktiviert wurden (38). Die Kanäle zeigen jedoch<br />
auch basale Aktivität, die durch lokalisierte Freiset<strong>zu</strong>ng von Ca 2+ aus internen Speichern<br />
induziert wird (180). Der Verlust der regulatorischen β-Untereinheit des Kanals führt in der<br />
Maus <strong>zu</strong> arterieller Hypertonie und kardialer Hypertrophie (33, 181). Aktuelle Befunde<br />
zeigen, dass die verminderte Expression der β-Untereinheit in Ratten ebenfalls eine<br />
Hypertonie begünstigt (182) und erhöhte Aktivität der regulatorischen Untereinheit die<br />
Prävalenz eines diastolischen Hypertonus senkt (183). Da die porenbildende α-Untereinheit<br />
jedoch auch in Abwesenheit der regulatorischen Untereinheit Aktivität zeigen könnte, wurde<br />
eine Maus entwickelt, die für die α-Untereinheit defizient ist (34). Die vaskuläre Funktion<br />
dieser Tiere wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht.<br />
Der Ruhetonus der Arteriolen in der Mikrozirkulation dieser Tiere war im Vergleich <strong>zu</strong><br />
Wildtyp-Wurfgeschwistern nicht erhöht. Im Gegensatz da<strong>zu</strong>, war in kleinen Arterien (A.<br />
tibialis, Durchmesser ca. 120 µm) sowohl das Ruhemembranpotential als auch der myogene<br />
Tonus erhöht (184). Erstaunlicherweise wiesen diese Tiere im Gegensatz <strong>zu</strong> Mäusen, in<br />
denen die regulatorische Untereinheit ausgeschaltet war, nur eine leichte Erhöhung des<br />
Blutdrucks von 5 mmHg ohne Anzeichen einer kardialen Hypertrophie auf (184). Diese<br />
moderate Blutdruckerhöhung wurde von Sausbier und Mitarbeitern auf endokrine und<br />
vaskuläre Effekte <strong>zu</strong>rückgeführt. In BK-/- Mäusen waren die Aldosteronspiegel erhöht und<br />
die Dilatation auf cGMP, einem Effektor in der NO/PKG Signalkaskade, vermindert. Als<br />
weitere Ursache des erhöhten myogenen Tonus wurde die Abwesenheit von transienten<br />
Kaliumauswärtsströmen (STOCs) identifiziert, die ein Strom über K Ca nach Aktivierung durch<br />
lokale Ca 2+ Freiset<strong>zu</strong>ng aus internen Speichern sind, und eine dilatierende Wirkung in
DISKUSSION 108<br />
myogen aktiven Gefäßen haben (184). STOCs sind ebenso in Tieren, denen die<br />
regulatorische β-Untereinheit des Kanals fehlt, ohne eine Änderung der Ca 2+ -Sparks<br />
vermindert (185).<br />
Die Beteiligung des BK Ca bei endothelunabhängigen Dilatationen wurde durch die Applikation<br />
von NO oder cGMP-Analoga untersucht und zeigte, dass BK Ca -Kanäle in der Mikrozirkulation<br />
nicht als Effektoren des NO/cGMP/PKG Signaltransduktionsweges beteiligt sind, da weder<br />
die Dilatation nach NO-Donoren noch nach einem cGMP-Analogon in BK Ca -defizienten<br />
Tieren verändert war. Dies bestätigt Untersuchungen in eNOS-defizienten Mäusen, in denen<br />
die pharmakologische Blockade des BK Ca ebenfalls ohne Effekt auf NO-induzierte<br />
Dilatationen blieb (186). In anderen Präparationen kann NO jedoch entweder direkt oder<br />
auch cGMP abhängig BK Ca -Kanäle aktivieren (80, 82). Ebenso fand sich in der A. tibialis in<br />
BK Ca -defizienten Tieren eine Abschwächung von Dilatationen nach NO (184). In der NO-<br />
Signalkaskade ist die Proteinkinase G (PKG) ein wichtiges Glied und auch die Relevanz<br />
dieser Kinase war ebenfalls verschieden zwischen der A. tibialis (187) und den Arteriolen in<br />
der Mikrozirkulation (186). Die beobachteten Unterschiede zeigen in der Summe, dass bei<br />
der NO-mediierten Dilatation in der Mikrozirkulation andere Signaltransduktionswege als bei<br />
größeren Gefäßen verwendet werden, die Proteinkinase G ist bedeutend, aber der BK Ca –<br />
Kanal ist nicht beteiligt. Offensichtlich ist auch die basale Aktivität dieses Kanals<br />
unterschiedlich, möglicherweise bedingt durch eine stärkere Depolarisation der glatten<br />
Muskulatur in größeren Gefäßen.<br />
K Ca -Kanäle haben als Effektoren der endothelabhängigen EDHF-vermittelten Dilatationen<br />
große Bedeutung und die Aktivierung von BK Ca ist in einer Reihe von Präparationen an der<br />
Dilatation beteiligt (118, 119, 186, 188). Die Rolle dieser Kanäle bei Dilatationen nach<br />
Adenosin und Acetylcholin wurden durch globale Superfusion der Agonisten untersucht.<br />
Adenosin induzierte Dilatationen waren unabhängig von BK Ca -Kanal-Aktivität.<br />
Überraschenderweise waren jedoch auch Dilatationen, die durch ACh induziert wurden, in<br />
BK Ca -defizienten Tieren unbeeinträchtigt. Dies steht im Gegensatz <strong>zu</strong> Ergebnissen, die in<br />
unserer Arbeitsgruppe nach pharmakologischer Blockade der BK Ca -Kanälen erhoben<br />
wurden, denn nach Blockade der BK Ca -Kanäle waren ACh-Dilatation deutlich abgeschwächt<br />
(186). Auch nach lokaler Applikation von ACh zeigte sich jedoch, dass die lokale Antwort und<br />
auch deren Ausbreitung entlang der Arteriole durch den Verlust von BK Ca unbeeinträchtigt<br />
war. Da möglicherweise in BK Ca -defizienten Tieren, anders als bei transienter<br />
pharmakologischer Blockade, die Synthese von Prostazyklin und NO kompensatorisch<br />
erhöht ist, wurden diese Versuche in Anwesenheit einer Blockade von NO-Synthase und<br />
Cyclooxygenase wiederholt. Obwohl die Hemmung der Prostazyklin- und NO-Synthese den
DISKUSSION 109<br />
basalen Tonus der Arteriolen erhöhte, was die effektive Blockade der Produktion dieser<br />
Mediatoren aufzeigt, blieb die Dilatation nach globaler Stimulation mit steigenden ACh-<br />
Konzentrationen in BK Ca -defizienten Mäusen und auch den Wildtypwurfgeschwistern<br />
unbeeinflußt. Lediglich die Dilatation nach lokaler Stimulation mit ACh war nach Hemmung<br />
der NO-Synthase und Cyclooxygenase in BK Ca -defizienten Mäusen an der Stimulationsstelle<br />
abgeschwächt. Die Ausbreitung dieser Antwort entlang der Arteriole war jedoch nicht<br />
beeinträchtigt. Im Gegensatz <strong>zu</strong>r globalen Stimulation ist die Kontrolle der Konzentration des<br />
Agonisten bei lokaler Stimulation nur schwierig <strong>zu</strong> gewährleisten und die beobachtete<br />
Abschwächung am ehesten auf eine unterschiedlich starke Stimulation der Arteriolen vor und<br />
nach Behandlung <strong>zu</strong>rück<strong>zu</strong>führen. Somit zeigen diese Daten, dass BK Ca -Kanäle in diesen<br />
Tieren bei der Dilatation nach Adenosin und ACh nicht beteiligt sind. Desweiteren tragen<br />
auch die anderen endothelialen Mediatoren, NO und Prostazyklin, weder im Wildtyp noch<br />
kompensatorisch in BK-/- Tieren als Mediatoren hier<strong>zu</strong> bei.<br />
Die Diskrepanz <strong>zu</strong> den Ergebnissen nach pharmakologischer Blockade des Kanals mit<br />
Iberiotoxin (186) könnte auf Unterschieden zwischen den Mausstämmen beruhen. Die<br />
transgenen Mäuse sowie deren Wildtyp-Wurfgeschwister hatten einen genetischen<br />
Mischhintergrund (C57BL/6 / SV129, F2 Generation), wohingegen die vorhergehenden<br />
Experimente, in denen Iberiotoxin eingesetzt wurde, an C57BL/6 Mäusen durchgeführt<br />
wurden (186). Deshalb wurde die Rolle von BK Ca in C57BL/6 und dem Wildtyp im<br />
Mischhintergrund mittels pharmakologischer Blockade erneut überprüft. Hierbei bestätigte<br />
sich die starke Abschwächung der ACh-Dilatation nach Blockade von BK Ca -Kanälen in<br />
C57BL/6 Mäusen, während Iberiotoxin in den BK+/+ Mäusen mit einem Mischhintergrund<br />
keinen Einfluß auf die Gefäßantwort nach ACh hatte. Die Dilatation auf exogenes NO blieb<br />
dagegen in beiden Mausstämmen intakt und zeigt, wie oben diskutiert, die Unabhängigkeit<br />
der NO-Dilatation von diesen Kanälen. Im Gegensatz da<strong>zu</strong> war die ACh-Dilatation in<br />
C57BL/6, aber nicht im C57BL/6 / SV129 Mischhintergrund, vermittelt durch den BK Ca -Kanal.<br />
Der Einfluß des genetischen Hintergrundes auf die Funktion unterschiedlicher Vorgänge ist<br />
bekannt. Bereits bei der Narkose verschiedener Mausstämme sind verschiedene Narkotika<br />
unterschiedlich effektiv, was vermutlich auf die unterschiedliche Expression<br />
metabolisierender Enzyme <strong>zu</strong>rück<strong>zu</strong>führen ist (189). Verschiedene Mausstämme weisen<br />
ebenfalls eine unterschiedliche Prädisposition für die Entwicklung von Hyperlipidämie und<br />
atherosklerotischen Veränderungen auf (190). Die hier erhobenen Daten verdeutlichen den<br />
Stellenwert des genetischen Hintergrundes bei der Interpretation experimenteller Befunde<br />
und betont die Notwendigkeit der Verwendung von Wildtypwurfgeschwistern als Kontrolle.<br />
Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse verschiedener Labore ist nur dann gewährleistet, wenn
DISKUSSION 110<br />
eine zeitaufwändige Rückkreu<strong>zu</strong>ng der Tiere in einen üblichen genetischen Hintergrund (z.B.<br />
C57BL/6) erfolgt ist. Die vorgelegten Ergebnisse machen deutlich, dass die Auswirkung der<br />
globalen Defizienz der porenbildenden Untereinheit des BK Ca -Kanals auf die vaskuläre<br />
Funktion sehr vorsichtig <strong>zu</strong> interpretieren ist, da dieser Kanal bereits im Wildtyp mit einem<br />
Mischhintergrund nur eine untergeordnete Bedeutung besitzt. Dies spiegelt sich auch in dem<br />
nur moderat erhöhten Blutdruck der Tiere (184) im Gegensatz <strong>zu</strong> der Hypertonie und<br />
kardialen Hypertrophie, die nach Verlust der vaskulär exprimierten regulatorischen<br />
Untereinheit beobachtet wird (33, 181). Allerdings wurden auch in diesen beiden Studien<br />
Subtypen eines Mausstamms verwendet (SV129 und 129svj), die in ihrem genetischen<br />
Hintergrund ebenfalls erheblich variieren können (191, 192). Nach vollständiger<br />
Rückkreu<strong>zu</strong>ng der BK Ca -defizienten Tieren in den C57BL/6 Hintergrund sollte die erneute<br />
Durchführung ähnlicher Versuche weiteren Aufschluß über die Funktion des BK Ca -Kanals in<br />
der Mikrozirkulation ergeben.<br />
4.2.2 IK Ca und SK Ca bei endothelabhängigen Dilatationen<br />
Die Aktivierung von endothelialen SK Ca - und IK Ca -Kanälen ist ein Schlüsselereignis, das <strong>zu</strong>r<br />
Hyperpolarisation und Relaxation von glatten Muskelzellen führt und somit mit der EDHFabhängigen<br />
Dilatation verknüpft ist (39, 82, 193). Die Kanäle werden durch Agonisten<br />
aktiviert, die einen Anstieg der endothelialen Calciumkonzentration induzieren (194). Hierbei<br />
können SK Ca und IK Ca gemeinsam an der endothelabhängigen Dilatation beteiligt sein oder<br />
jeder Kanal spezifisch <strong>zu</strong>r EDHF-Antwort beitragen. So wurde die EDHF-Antwort in<br />
Leberarterien von Ratten und Koronararterien von Schweinen sowie Mesenterialarterien von<br />
Ratten erst nach simultaner Blockade von IK Ca - und SK Ca -Kanälen inhibiert (95, 195, 196).<br />
Interessanterweise waren endotheliale Hyperpolarisationen und somit EDHF-Dilatationen in<br />
Cerebralarterien von Ratten und menschlichen Mesenterialarterien (197, 198) durch die<br />
alleinige Blockade von IK Ca -Kanälen, aber in Mesenterialarterien von Hasen durch alleinige<br />
SK Ca -Blockade aufgehoben (199). Dies deutet auf eine spezifische Funktion von IK Ca - und<br />
SK Ca -Kanälen hin. Die Generierung einer Maus, die defizient für den IK Ca -Kanal ist,<br />
ermöglicht die differenzierte Betrachtung der Bedeutung von SK Ca - und IK Ca -Kanälen (200).<br />
Der Verlust des IK Ca -Kanals führte in der Mikrozirkulation <strong>zu</strong> einer Erhöhung des<br />
Gefäßtonus. Die Aktivierung der Kanäle mit dem IK Ca -Öffner DCEBIO führte im Wildtyp, nicht<br />
aber in IK-/- Tieren, <strong>zu</strong>r Dilatation. Dies zeigt, dass einerseits die basale IK Ca -Aktivität in<br />
Abwesenheit von NO und Prostazyklin einen kontinuierlichen dilatierenden Effekt hat und<br />
andererseits die spezifische Aktivierung von IK Ca -Kanälen eine weitere Dilatation auslösen<br />
kann. Die Beteiligung von IK Ca -Kanälen an ACh-, NO- und Adenosin-induzierten Dilatationen
DISKUSSION 111<br />
wurde durch globale Superfusion der Agonisten untersucht. Die Dilatationen nach NO waren<br />
in IK Ca -defizienten Mäusen lediglich im mittleren Konzentrationsbereich leicht abgeschwächt,<br />
wobei die maximale Dilatation nicht beeinflußt wurde. Dieser Befund ist überraschend, da es<br />
bisher keine Hinweise auf eine durch NO induzierte Aktivierung von IK Ca -Kanälen gibt. Der<br />
Effekt ist jedoch nicht sehr ausgeprägt und möglicherweise ist die Abschwächung nicht auf<br />
eine direkte Beteiligung von IK Ca an NO-induzierten Dilatationen <strong>zu</strong>rück<strong>zu</strong>führen, sondern auf<br />
den erhöhten Kontraktions<strong>zu</strong>stand der Gefäße in IK Ca -defizienten Tieren. Im Gegensatz<br />
hier<strong>zu</strong> waren Dilatationen nach Adenosin in IK Ca - defizienten Tieren nicht beeinträchtigt.<br />
Auch nach <strong>zu</strong>sätzlicher Blockade von SK Ca waren die Gefäßantworten auf Adenosin in den<br />
IK-/- Tieren intakt. EDHF ist der entscheidende Mediator bei ACh-induzierten Dilatationen in<br />
der Mikrozirkulation der Maus (160, 186) und die Aktivität von K Ca -Kanälen ist für diese NOund<br />
Prostazyklin-unabhängige Antwort essentiell. Die Dilatation auf ACh war nach globaler<br />
Stimulation in IK-/- Tieren vor allem im mittleren Konzentrationsbereich deutlich<br />
abgeschwächt und auch die maximale Gefäßantwort war reduziert. Nach <strong>zu</strong>sätzlicher<br />
Blockade des SK Ca -Kanals mit UCL1684 war auch die verbleibende Antwort verschwunden.<br />
Im Wildtyp hatte diese Substanz hingegen keinen Effekt. Dies zeigt, dass SK Ca - und IK Ca -<br />
Kanäle essentielle Mediatoren bei Dilatationen nach ACh sind, wobei der IK Ca Kanal<br />
allerdings im Vordergrund steht. Lediglich eine Restantwort kann durch die Aktivität des<br />
SK Ca -Kanals aufrechterhalten werden.<br />
Bereits publizierte Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass die endotheliale<br />
Hyperpolarisation nach pharmakologischer Blockade von SK Ca mit Apamin abgeschwächt<br />
wird. Dagegen war die Hyperpolarisationen der glatten Muskelzelle durch Blockade von IK Ca -<br />
und BK Ca -Kanälen mit Charybdotoxin oder durch selektive Blockade von BK Ca durch<br />
Iberiotoxin reduziert (119). Die mechanische Gefäßantwort wurde in diesen Versuchen<br />
ähnlich beeinflußt. Die Blockade von SK Ca schwächte die Dilatation nach ACh lediglich ab,<br />
während die Blockade von BK Ca mit Iberiotoxin oder IK Ca und BK Ca mit Charybdotoxin einen<br />
deutlich stärkeren Effekt hatte (119). Die Rolle des IK Ca als Effektor wurde in diesen<br />
Versuchen jedoch nicht untersucht, da ein selektiver Blocker nicht eingesetzt wurde. Die in<br />
dieser Arbeit in IK Ca -defizienten Mäusen erhobenen Befunde zeigen eine übergeordnete<br />
Bedeutung der Aktivierung von IK Ca gegenüber SK Ca und die Beteiligung von SK Ca zeigte<br />
sich erst nach Verlust der IK Ca -Aktivität. Dies läßt vermuten, dass IK Ca eine <strong>zu</strong>sätzliche<br />
Funktion als Verstärker einer SK Ca induzierten Hyperpolarisation bzw. Dilatation haben.<br />
Umgekehrt ist der Verlust der IK Ca -Komponente der EDHF-abhängigen Dilatation durch SK Ca<br />
Aktivität nicht <strong>zu</strong> kompensieren.<br />
In Mesenterialarterien von Ratten in vitro wurde eine umgekehrte Gewichtung von IK Ca und
DISKUSSION 112<br />
SK Ca bei Antworten nach ACh beobachtet. Die Hyperpolarisation war komplett SK Ca<br />
abhängig und Blockade von IK Ca blieb ohne Effekt (196). Nach Vorkontraktion mit<br />
Noradrenalin hatte SK Ca zwar weiterhin den größten Anteil an der Hyperpolarisation, aber<br />
unter diesen Bedingungen war ein Teil der Antwort auch auf die Aktivität von IK Ca<br />
<strong>zu</strong>rück<strong>zu</strong>führen. Aufgrund der Beobachtung von Oishi und Mitarbeitern, dass Stimulation von<br />
glatten Muskelzellen mit Noradrenalin einen Anstieg der endothelialen Calciumkonzentration<br />
induziert, der vermutlich auf der Diffusion von IP 3 oder Calcium durch myoendotheliale Gap<br />
Junctions beruht (201), spekulierten die Autoren, dass SK Ca -Kanäle an myoendothelialen<br />
Gap Junctions lokalisiert sein könnten, wohingegen IK Ca -Kanäle an Endothelzellgrenzen<br />
exprimiert werden (196). Dadurch könnte die Aktivierung von SK Ca durch einen<br />
Calciumtransfer aus dem glatten Muskel umgekehrt wiederum eine glattmuskuläre<br />
Hyperpolarisation fördern und somit der Kontraktion entgegenwirken. Eine ähnliche negative<br />
Rückkopplung des glatten Muskels auf die Bildung endothelialer Autakoide vermittelt durch<br />
myoendotheliale Gap Junctions wurde auch in kleinen Arterien des Cremastermuskles in<br />
vitro gefunden (202). Die Blockade von SK Ca führte jedoch in unserer Präparation nicht <strong>zu</strong><br />
einer Beeinflussung des glattmuskulären Membranpotentials und weiterhin ist die<br />
heterozelluläre Kopplung in unserer Präparartion nicht ausgeprägt (160). Dennoch zeigen<br />
diese Befunde in IK Ca -defizienten Tieren, dass SK Ca und IK Ca spezifische Funktionen<br />
ausüben, da die Aktivität von IK Ca durch SK Ca nicht kompensiert wird. Die Aktivierung von<br />
Kanälen, welche in Mikrodomänen mit anderen Proteinen funktionell gekoppelt vorliegen und<br />
somit spezifische Funktionen ausüben, ist ein faszinierendes Konzept, das der Komplexität<br />
der in vivo beobachteten Vorgänge gerecht werden kann.<br />
Die Beteiligung von IK Ca - und SK Ca -Kanälen bei der Fortleitung von lokal induzierten<br />
Dilatationen wurde ebenfalls in IK Ca -defizienten Tieren und nach pharmakologischer<br />
Blockade von SK Ca mit UCL1684 im Wildtyp untersucht. Lokale Applikation des IK Ca -Öffners<br />
DCEBIO induzierte im Wildtyp eine sich ausbreitende Dilatation, aber wie erwartet nicht in<br />
IK Ca -defizienten Tieren. Da die lokale selektive Aktivierung von IK Ca eine fortgeleitete<br />
Dilatation auslöst, ist möglicherweise auch die fortgeleitete Dilatation nach ACh von IK Ca<br />
abhängig. Tatsächlich war auch die ACh-Antwort bei Deletion des IK Ca an der<br />
Stimulationsstelle deutlich abgeschwächt, jedoch war die Fortleitung dieser verminderten<br />
Antwort entlang der Arteriole nicht von IK Ca -Aktivität abhängig. Blockade von SK Ca mit<br />
UCL1684 hatte weder einen Effekt an der lokalen noch an den entfernten Positionen. Im<br />
Cremastermuskel des Hamsters ist die EDHF-Aktivität an der lokalen Stelle für die<br />
Auslösung einer sich ausbreitenden Dilatationen notwendig, während die lokalisierte<br />
Blockade von BK Ca mit Iberiotoxin oder IK Ca und BK Ca mit Charybdotoxin an der entfernten<br />
Position keine Abschwächung der Dilatation <strong>zu</strong>r Folge hatte (99). Die Befunde in IK Ca -
DISKUSSION 113<br />
defizienten Mäusen ergänzen dies, denn auch hier war IK Ca nur an der lokalen Stelle, nicht<br />
jedoch bei dem Ausbreitungsprozess, von Bedeutung. SK Ca -Kanäle sind, <strong>zu</strong>mindest bei<br />
Vorhandensein von IK Ca , für die Auslösung und Ausbreitung von lokal induzierten ACh-<br />
Dilatationen nicht relevant. Zusammengefasst lassen diese Daten den Schluß <strong>zu</strong>, dass die<br />
Aktivierung von K Ca -Kanälen bei der Initiierung des Signals, welches sich entlang des<br />
Gefäßes ausbreitet, nicht aber bei dem Ausbreitungsprozess selbst beteiligt ist.<br />
4.2.3 Charakterisierung der Effektoren lokal induzierter Adenosin Dilatationen<br />
Adenosin-induzierte Dilatationen wurden in unserer Präparartion bisher nicht genauer<br />
charakterisiert und sind in dieser Arbeit untersucht worden. Es ist jedoch bekannt, dass<br />
Adenosin über unterschiedliche Mechanismen <strong>zu</strong>r Dilatation führen kann. Unterschiedliche<br />
Adenosinrezeptoren, welche Vasodilatation vermitteln können, werden in vaskulären Zellen<br />
exprimiert. Bisher wurden A 1 , A 2A , A 2B und A 3 Adenosinrezeptoren, die sowohl auf<br />
Endothelzellen als auch auf glatten Muskelzellen lokalisiert sein können, beschrieben (203).<br />
In der Mikrozirkulation vermitteln insbesondere A 1 - und A 2 -Rezeptoren die Vasodilatation.<br />
Die Mechanismen, über die Adenosin eine Dilatation induzieren kann, zeigen in Abhängigkeit<br />
vom untersuchten Gefäßbett und von der Spezies eine hohe Variabilität. Die Dilatation kann<br />
nicht nur über die Aktivierung unterschiedlicher Rezeptoren erfolgen, sondern die durch<br />
Rezeptoraktivierung ausgelösten Signalkaskaden sind <strong>zu</strong>sätzlich abhängig vom jeweiligen<br />
Ort der Expression. So kann die Aktivierung von endothelialen A 2A -Rezeptoren <strong>zu</strong> einem<br />
Ca 2+ Anstieg führen, der dann die endotheliale NO-Synthase aktiviert (204). Die Erhöhung<br />
der endothelialen Calciumkonzentration könnte jedoch ebenfalls eine vermehrte Bildung von<br />
Prostazyklin oder die Aktivierung von K Ca -Kanälen <strong>zu</strong>r Folge haben. Eine Aktivierung von A 2A<br />
Rezeptoren auf glatten Muskelzellen kann hingegen über einen anderen Mechanismus <strong>zu</strong>r<br />
Dilatation führen. An kleinen isolierten koronaren Arteriolen wurde gezeigt, dass Adenosin<br />
A 2A -Rezeptoren in glatten Muskelzellen aktiviert und die Dilatation auf Öffnung von K ATP -<br />
Kanälen beruht (205). Adenosin kann also eine Öffnung von Kaliumkanälen induzieren, was<br />
<strong>zu</strong> einer Hyperpolarisation führt und somit auch eine fortgeleitete Vasomotorantwort<br />
auslösen könnte. In der Mikrozirkulation der Backentasche des Hamsters führte die<br />
lokalisierte Applikation von Adenosin <strong>zu</strong> einer fortgeleiteten Dilatation, die sowohl lokal als<br />
auch in der Entfernung von einem endothelialen Calciumanstieg abhängig war (206). Die<br />
beteiligten Kaliumkanäle sowie die Rolle von NO wurden in dieser Arbeit jedoch nicht<br />
untersucht.<br />
Die lokalisierte Applikation von Adenosin zeigte, dass auch in der Mikrozirkulation der Maus<br />
eine fortgeleitete Dilatation induziert wurde. Sowohl die lokale als auch die entfernte
DISKUSSION 114<br />
Gefäßantwort war unabhängig von NO und Prostazyklin. Dies läßt vermuten, dass die<br />
Aktivierung von Kaliumkanälen und eine Hyperpolarisation beteiligt ist. Allerdings waren<br />
Dilatationen nach globaler Stimulation mit Adenosin unabhängig von der Aktivierung von K Ca -<br />
Kanälen, wie in 4.2.1 und 4.2.2 dargestellt. Da vor allem die lokale Stimulation mit Adenosin<br />
mit einem Anstieg der endothelialen Ca 2+ -Konzentration assoziiert ist (206), wurde dennoch<br />
der Effekt der pharmakologischen Blockade von IK Ca - und BK Ca -Kanälen mit Charybdotoxin<br />
untersucht, hatte aber weder einen Effekt auf die lokale Adenosin induzierte Dilatation noch<br />
auf deren Fortleitung. Die pharmakologische Blockade war effektiv, denn Charybdotoxin<br />
führte an der lokalen sowie den entfernten Positionen <strong>zu</strong> einer fast vollständigen Aufhebung<br />
der ACh-Dilatation. Dies bestätigt die Bedeutung von K Ca -Kanälen und einer<br />
Hyperpolarisation bei ACh-Dilatationen. Eine Aktivierung von K ATP -Kanälen durch Adenosin<br />
(205) könnte ebenfalls eine Hyperpolarisation auslösen, die sich entlang der Gefäßwand<br />
ausbreitet. Tatsächlich führte die lokalisierte Aktivierung von K ATP -Kanälen mit dem K ATP -<br />
Öffner Cromakalim <strong>zu</strong>r Auslösung einer fortgeleiteten Dilatation. Die Superfusion des K ATP -<br />
Blockers Glibenclamid zeigte weiterhin, dass diese Kanäle essentiell für die Auslösung<br />
Adenosin-induzierter Dilatationen sind. Demgegenüber hatte K ATP -Blockade keinen Einfluß<br />
auf Gefäßantworten nach Stimulation mit ACh. Dies zeigt, dass in Abhängigkeit vom<br />
Agonisten unterschiedliche K + -Kanäle beteiligt sind, um eine Hyperpolarisation und Dilatation<br />
an der lokalen Stelle aus<strong>zu</strong>lösen. Dennoch wird in beiden Fällen eine koordinierte<br />
Gefäßreaktion beobachtet und dies verdeutlicht den gemeinsamen Nenner, die<br />
Membranpotentialänderung, bei sich ausbreitenden Gefäßantworten.<br />
Der Vergleich von fortgeleiteten Adenosin- und ACh-Dilatationen zeigt, dass die<br />
Gefäßantwort nach Adenosin in einer Entfernung von 1100 µm bereits reduziert war,<br />
während sich die Amplitude der Dilatation nach ACh in derselben Entfernung nicht<br />
vermindert hatte. Somit breiten sich Dilatationen nach Adenosin weniger effizient in die<br />
Entfernung aus. Wie in Abschnitt 4.1 gezeigt, breiten sich Dilatationen nach ACh v.a. entlang<br />
des Endothels aus. Möglicherweise steht bei der Ausbreitung von Adenosin-induzierten<br />
Dilatationen die glattmuskuläre Zellschicht als Leitungsweg im Vordergrund und diese<br />
Zellschicht ist weniger gut gekoppelt, wie die Ausbreitung von KCl-induzierten Konstriktionen<br />
zeigt (s. Abschnitt 4.1). Weiterhin könnte die bessere Ausbreitung von ACh-induzierten<br />
Dilatationen auch auf einer spezifischen Eigenschaft des Agonisten beruhen. Emerson und<br />
Mitarbeiter zeigten an isolierten Arterien des Retraktormuskels von Hamstern, dass<br />
Hyperpolarisationen, die durch ACh induziert wurden, sich effizienter ausbreiteten, als dies<br />
durch elektrische Stimulation der Gefäße erreicht werden konnte (207). Die Autoren<br />
postulierten, dass die durch ACh induzierte Erhöhung des endothelialen Calciumspiegel<br />
nicht nur die Aktivierung von K Ca -Kanälen induziert, sondern gleichzeitig eine Steigerung der
DISKUSSION 115<br />
Synthese von NO und Arachidonsäuremetaboliten stimuliert und hierdurch die<br />
Offenwahrscheinlichkeit von Gap Junctions erhöht wird. Da jedoch die Hemmung der NOund<br />
Prostazyklin-Synthese die Ausbreitung von ACh-induzierten Dilatationen in unserer<br />
Präparation nicht beeinträchtigt, scheint die Ausbreitung von ACh Dilatationen über große<br />
Entfernungen in dieser Präparation auf anderen Mechanismen <strong>zu</strong> beruhen. Dennoch ist die<br />
Beteiligung eines aktiven Mechanismus als Signalverstärker wahrscheinlich.<br />
4.3 Verstärkungsmechanismen fortgeleiteter Dilatationen<br />
Die lokale Stimulation von Gefäßen führt bei einer Reihe von Agonisten, wie auch in dieser<br />
Arbeit gezeigt, nicht nur <strong>zu</strong> einer lokalen Dilatation, sondern <strong>zu</strong> einer instantanen<br />
Ausbreitung der Gefäßantwort über eine Strecke von mehreren Millimetern entlang der<br />
Arteriole. Diese Ausbreitung ermöglicht eine Koordination des Gefäßverhaltens innerhalb<br />
des Netzwerks. Die Entfernungen, über die sich diese Dilatationen erstrecken, sind jedoch<br />
größer als durch rein passive elektrotonische Ausbreitung des Signals erklärt werden kann<br />
und impliziert einen aktiven Mechanismus, der das Signal bei seiner Ausbreitung verstärkt<br />
bzw. regeneriert. Hierbei könnten besonders K + -Kanäle eine Rolle spielen, die eine<br />
Hyperpolarisation verstärken. Da die Ausbreitung in Abhängigkeit vom Agonisten (Adenosin,<br />
ACh) unterschiedlich war, sind eventuell auch differente Verstärkungsmechanismen beteiligt.<br />
Die an der Ausbreitung der Dilatation beteiligten Kanäle wurde durch Superfusion<br />
verschiedener Ionenkanalblocker untersucht. Die unselektive Blockade von Na + - und K + -<br />
Kanälen (BK Ca , K V und eventuell K IR ) mit dem Lokalanästhetikum Bupivacain (208-211)<br />
zeigte bereits deutliche Unterschiede der Mechanismen, die der Auslösung und Fortleitung<br />
von Adenosin, Bradykinin- und ACh-induzierten Dilatationen <strong>zu</strong>grunde liegen. Während die<br />
Blockade dieser Kanäle nach Stimulation mit ACh oder Bradykinin zwar <strong>zu</strong> einer Reduktion<br />
der lokalen Gefäßantwort führte, war die Fortleitung nicht beeinträchtigt. Vermutlich führt vor<br />
allem die Blockade von BK Ca <strong>zu</strong>r Abschwächung der lokalen Antwort, da dieser Kanal an der<br />
Auslösung der Dilatation auf ACh und Bradykinin, wie oben dargelegt wurde, beteiligt ist. Im<br />
Gegensatz da<strong>zu</strong> war die lokale Dilatation nach Adenosin nicht beeinträchtigt, aber die<br />
Fortleitung des Signals vollständig aufgehoben. Somit wird die lokale Aktivierung von K ATP -<br />
Kanälen durch Bupivacain nicht gehemmt, jedoch sind die Kaliumkanäle, die eine<br />
Ausbreitung des Signals ermöglichen, sensitiv gegenüber Bupivacain. Offensichtlich werden<br />
durch Bupivacain ebenfalls Kanäle beeinflußt, die basal aktiv sind, denn die Substanz<br />
erhöhte den Gefäßtonus. Dies ist jedoch nicht als unspezifische Ursache für die reduzierte<br />
lokale Antwort nach ACh oder die eingeschränkte Ausbreitung nach Adenosin <strong>zu</strong> betrachten,
DISKUSSION 116<br />
da umgekehrt die lokale Dilatation nach Adenosin bzw. die Ausbreitung nach ACh nicht<br />
beeinträchtigt war. Weiterhin blockiert Bupivacain auch nicht Gap Junctions, wie die intakte<br />
Ausbreitung der Konstriktion nach lokaler Applikation von KCl aufzeigt. Allerdings wurde die<br />
dilatatorische Komponente der biphasische Gefäßantwort nach Bupivacain nicht mehr<br />
beobachtet. Dies ist am ehesten durch die Blockade der K IR -Kanäle bedingt, die diese<br />
Dilatation induzieren (159).<br />
Die Ausbreitung von Adenosin induzierten Dilatationen könnte allerdings durch nervale<br />
Aktivität vermittelt sein, da Bupivacain nicht nur K + -, sondern auch spannungsabhängige<br />
Na + -Kanäle blockiert. Die Fortleitung von Vasomotorantworten sind in der Literatur aber als<br />
weitgehend unabhängig von der Aktivität perivaskulärer Nerven beschrieben (212) und nur in<br />
wenigen Studien wurden sie als beteiligter Mechanismus identifiziert. So wurde die nervale<br />
Fortleitung von Vasomotorantworten in Arterien von Hasen gezeigt (213). Diese Gefäße<br />
hatten jedoch einen Durchmesser von 1 - 2 mm und waren somit nicht vergleichbar mit der<br />
Mikrozirkulation. Üblicherweise wird die Rolle nervaler Mechanismen durch die Blockade von<br />
Na + -Kanälen mit dem spezifischen Hemmer Tetrodotoxin untersucht (214) und in vielen<br />
Untersuchungen fand sich keinerlei Effekt dieses spezifischen Blockers (109, 116, 121, 215,<br />
216). Kürzlich wurde die Beteiligung von Tetrodotoxin-insensitiven Na + -Kanälen in<br />
sensorischen Nervenfasern bei der Fortleitung von Metacholin-induzierten Dilatationen in der<br />
Mikrozirkulation des Hamsters beschrieben (117). Die Aktivierung sensorischer<br />
Nervenfasern an der Stimulationsstelle führte <strong>zu</strong> einer Freiset<strong>zu</strong>ng des Transmitters CGRP<br />
(Calcitonin-gene related peptide) aus perivaskulären Nervenendigungen, die dann an<br />
entfernten Positionen <strong>zu</strong> einer Dilatation führte. Die Differenzierung zwischen einem Effekt<br />
des Bupivacain auf nervale Na + - bzw. vaskuläre K + -Kanäle ist möglich durch die Verwendung<br />
eines Lokalanästhetikums, welches Na + -Kanäle mit einer höheren Selektivität blockiert und<br />
K + -Kanäle erst bei höheren Konzentration beeinflußt, wie es für Mepivacain beschrieben ist<br />
(217). Tatsächlich ließ Mepivacain den Gefäßtonus unverändert und damit bleibt<br />
offensichtlich die Aktivität der K + -Kanäle, die durch Bupivacain noch beeinflußt wurde und <strong>zu</strong><br />
einer Konstriktion führte, unverändert. Weiterhin hatte Mepivacain keinen Einfluß auf die<br />
Ausbreitung des Signals nach Stimulation mit ACh oder Adenosin. Somit kann die<br />
Beteiligung perivaskulärer Nervenfasern und spannungsabhängiger Na + -Kanäle am<br />
Fortleitungsprozess ausgeschlossen werden. Dies bedeutet, dass die differentielle<br />
Beeinflußung der sich ausbreitenden Dilatation nach Adenosin und Acetylcholin durch die<br />
Beteiligung unterschiedlicher K + -Kanäle verursacht wird.<br />
Um diese K + -Kanäle eindeutiger <strong>zu</strong> charakterisieren, wurden unterschiedliche Blocker<br />
eingesetzt. K Ca -Kanäle sind bei der Ausbreitung des Signals wohl nicht beteiligt, wie im
DISKUSSION 117<br />
Abschnitt 4.2.1 und 4.2.2 dargelegt wurde. Dagegen kommen K IR -Kanäle als<br />
Verstärkungsmechanismus besonders in Frage, da diese Kanäle durch eine<br />
Hyperpolarisation aktiviert werden. Bereits 1979 wurde im muskulösen Pharynx von<br />
Nematoden ein Kaliumstrom gemessen, der durch Hyperpolarisation aktiviert wurde und<br />
hierdurch den initialen Stimulus verstärkte (218). Die Beteiligung von K IR -Kanälen bei der<br />
Ausbreitung von Dilatationen nach Adenosin und Bradykinin wurde in Koronararterien von<br />
Schweinen (44) sowie nach Stimulation mit ACh in Arteriolen des Retraktormuskels von<br />
Hamstern (219) und Mesenterialarterien von Ratten gezeigt (220). Die Blockade von K IR -<br />
Kanälen mit Barium führte in dieser Arbeit <strong>zu</strong> einer Erhöhung des Gefäßtonus und zeigt die<br />
basale Aktivität der Kanäle und die Beteiligung an der Einstellung des<br />
Ruhemembranpotentials. Dies könnte den Blutdruck erhöhen und ist mit der Beobachtung,<br />
dass Hypertension mit einer verminderten K IR -Kanal-Aktivität assoziiert sein kann (32),<br />
vereinbar. Interessanterweise ist die Fortleitung von Vasomotorantworten in hypertensiven<br />
Tieren bedingt durch den Verlust des Beitrags von K IR -Kanälen gestört (220). Die hier<br />
erhobenen Daten zeigen, dass K IR -Kanäle differentiell beteiligt sind. Die Ausbreitung der<br />
Dilatation nach Bradykinin wurde nicht beeinträchtigt und nach ACh war eine geringe<br />
Reduktion an der entferntesten Position <strong>zu</strong> beobachten. Im Gegensatz da<strong>zu</strong> haben K IR -<br />
Kanäle als Verstärkungsmechanismus der fortgeleiteten Dilatation nach Adenosin eine große<br />
Bedeutung. Da das Signal sich nach Adenosin wie oben erläutert wahrscheinlich entlang des<br />
glatten Muskels ausbreitet, könnte der K IR -Kanal vor allem in dieser Zellschicht für eine<br />
Verstärkung sorgen (Abb. 4.1). Die Blockade von K V -Kanälen mit 4-Aminopyridin zeigte ein<br />
umgekehrtes Bild. Nach Applikation dieses Blockers war die Ausbreitung der Dilatation nach<br />
ACh, jedoch nicht nach Adenosin reduziert. Allerdings war der Effekt auch bei Stimulation mit<br />
ACh nur begrenzt, weshalb noch weitere, bisher nicht identifizierte<br />
Verstärkungsmechanismen <strong>zu</strong> vermuten sind. Hierbei sind besonders K + -Kanäle der K 2P -<br />
Familie <strong>zu</strong> nennen, die im vaskulären Gewebe exprimiert werden (48, 49). Unterschiedliche<br />
Subtypen werden durch Bupivacain (210, 221, 222) aber auch Barium (223) inhibiert.<br />
Momentan sind jedoch keine spezifischen Blocker dieser Kanäle bekannt.<br />
Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, warum und wie die Ausbreitung einer gleichartigen<br />
lokal induzierten Hyperpolarisation in Abhängigkeit vom Agonist unterschiedliche<br />
Verstärkungsmechanismen aktiviert. Die einfachste Erklärung wäre die Beteiligung jeweils<br />
unterschiedlicher Zellschichten, entlang derer sich das Signal ausbreitet: Nach ACh dient die<br />
Endothelzellschicht, nach Adenosin die glattmuskuläre Schicht als Ausbreitungsweg.<br />
Dennoch sollen auch andere Möglichkeiten betrachtet werden. So ist die Ausbreitung<br />
einerseits calciumabhängig andererseits calciumunabhängig möglich. Duling und Mitarbeiter
DISKUSSION 118<br />
lokal 1100 µm<br />
K +<br />
Acetylcholin<br />
K Ca<br />
Bupivacain<br />
insensitiv<br />
K V K IR ?<br />
K +<br />
Bradykinin<br />
K Ca<br />
K ATP<br />
K +<br />
Adenosin<br />
NO<br />
Bupivacain<br />
insensitiv<br />
Bupivacain<br />
sensitiv<br />
K IR<br />
Abb. 4.1: Auslösung und Verstärkung fortgeleiteter Dilatationen<br />
Verschiedene Agonisten induzieren lokale und fortgeleitete Dilatationen durch Aktivierung<br />
unterschiedlicher K + -Kanäle. Acetylcholin (ACh) und Bradykinin aktivieren lokal calciumabhängige<br />
Kaliumkanäle (K Ca ), Adenosin dagegen K ATP -Kanäle. Die Dilatation breitet sich entlang des Gefäßes<br />
aus (dargestellt als Durchmesseränderung über die Zeit). Hierbei sind Verstärkungsmechansimen<br />
beteiligt: ACh ist abhängig von der Aktivierung spannungsabhängiger Kaliumkanäle (K V ) und in<br />
geringerem Ausmaß einwärts gleichrichtender Kaliumkanäle (K IR ), während Adenosin die Aktivität von<br />
K IR -Kanälen benötigt. Die beteiligten Kanäle sind auch differentiell sensitiv gegenüber Bupivacain.<br />
Bradykinin induziert eventuell eine NO-Welle (159). Möglicherweise sind unterschiedlicher<br />
Fortleitungswege beteiligt (Endothel: ACh; glatter Muskel: Adenosin).<br />
zeigten vor kurzem in Arteriolen der Backentasche von Hamstern, dass Acetylcholininduzierte<br />
Dilatationen lediglich lokal mit einem Anstieg des endothelialen Calciumspiegels<br />
assoziiert sind (224). Dagegen waren fortgeleitete Dilatationen nach Adenosin sowohl lokal<br />
als auch in der Entfernung von einem endothelialen Calciumanstieg abhängig (206). Es ist<br />
jedoch unwahrscheinlich, dass die Fortleitung selbst auf der Ausbreitung einer Calciumwelle<br />
beruht. In der Zellkultur breiten sich Calciumwellen nur mit einer Geschwindigkeit von etwa<br />
11 µm / s entlang der Endothellzellen aus (225) und damit ist die Geschwindigkeit deutlich<br />
langsamer als bei einer fortgeleiteten Dilatation (> 1000 µm/s). Dies macht deutlich, dass<br />
nicht nur unterschiedliche K + -Kanäle beteiligt sind, sondern auch Calcium different beteiligt<br />
ist. Ob die funktionelle Kolokalisation von Effektorproteinen in Mikrodomänen, die eine<br />
spezifische Aktivierung unterschiedlicher Fortleitungsmechanismen ermöglichen würde,<br />
hier<strong>zu</strong> beiträgt, muß <strong>zu</strong>r Zeit noch offen bleiben.
DISKUSSION 119<br />
4.4 Membranpotential vaskulärer Zellen<br />
Die Ausbreitung von lokal induzierten Gefäßantworten beruht auf Membranpotentialänderungen,<br />
die sich entlang der Arteriole ausbreiten. Obwohl die Kopplung innerhalb einer<br />
Zellschicht sehr ausgeprägt ist, wurde in unserer Arbeitsgruppe durch die Messung des<br />
Membranpotentials gezeigt, dass die heterozelluläre myoendotheliale Kopplung in vivo nicht<br />
sehr ausgeprägt oder stark reguliert ist (160). Es ist daher möglich, dass fortgeleitete<br />
Dilatationen nach Adenosin sich im Gegensatz <strong>zu</strong> ACh überwiegend entlang der<br />
glattmuskulären Zellschicht ausbreiten. Daher sollten Potentialänderungen nach<br />
Adenosinapplikation direkt gemessen werden. Die elektrophysiologisch gemessenen Zellen<br />
konnten nach Farbstoffanfärbung fluoreszenzmikroskopisch anhand ihrer Ausrichtung<br />
identifiziert werden. Endothelzellen sind parallel und glatte Muskelzellen quer <strong>zu</strong>r<br />
Längsachse des Gefäßes angeordnet (59, 108). Die Messung des Ruhemembranpotentials<br />
in den beiden Zelltypen in dieser Arbeit bestätigte das negativere Membranpotential der<br />
Endothelzellen im Vergleich <strong>zu</strong> glatten Muskelzellen, wie bereits publiziert (160) und zeigt<br />
erneut eine nur schwach ausgeprägte myoendotheliale Kopplung. Während in vitro in fast<br />
allen Untersuchungen identische Membranpotentiale in Endothel- und glatten Muskelzellen<br />
gefunden wurden (22, 106, 226), zeigen die wenigen Untersuchungen, die in vivo<br />
durchgeführt wurden, dass die myoendotheliale Kopplung nicht vorhanden oder nur schwach<br />
ausgeprägt ist (63, 159, 160) . Es ist noch ungeklärt, ob dies durch die Untersuchung<br />
unterschiedlich großer Gefäße oder durch differente Regulationsmechanismen in vivo und in<br />
vitro bedingt ist.<br />
Beide Agonisten, ACh und Adenosin induzierten in der vorgelegten Arbeit eine<br />
Hyperpolarisation in glatten Muskelzellen, deren Amplitude mit steigender Stimulationsdauer<br />
<strong>zu</strong>nahm. Im Gegensatz da<strong>zu</strong> führte Adenosin nicht <strong>zu</strong> einer Hyperpolarisation der<br />
Endothelzellen, während ACh auch die Endothelzellen hyperpolarisierte. Diese Beobachtung<br />
ist mit der oben formulierten Hypothese, dass Adenosin ein sich entlang der glatten<br />
Muskelzellschicht ausbreitendes Signal auslöst, vereinbar. Allerdings muß einschränkend<br />
bemerkt werden, dass die Anzahl der Beobachtungen bisher nur gering ist. Insbesondere die<br />
Messung des Membranpotentials an entfernten Positionen ist notwendig, um diese Frage<br />
abschließend <strong>zu</strong> beantworten.
DISKUSSION 120<br />
4.5 Endotheliale Funktion in hypercholesterinämischen Mausmodellen<br />
Das Endothel reguliert den Kontraktions<strong>zu</strong>stand glatter Muskelzellen durch die Freiset<strong>zu</strong>ng<br />
verschiedener vasoaktiver Substanzen. Die Vasodilatation wird durch NO, Prostazyklin und<br />
EDHF induziert, wobei der Beitrag der einzelnen Mediatoren in Abhängigkeit vom Gewebe<br />
und vor allem von der Gefäßgröße variiert. Die Freiset<strong>zu</strong>ng der Autakoide kann durch<br />
Agonisten wie Acetylcholin induziert werden, welches daher oft <strong>zu</strong>r Untersuchung der<br />
endothelialen Funktion verwendet wird. Eine endotheliale 'Dysfunktion' wird bereits im<br />
Frühstadium der Atherosklerose beobachtet und tritt interessanterweise auch in<br />
morphologisch unveränderten Gefäßabschnitten auf. In Mausmodellen der Atherosklerose<br />
und Hypercholesterinämie war die endothelabhängige NO-mediierte Dilatationen in großen<br />
Arterien wie Aorta (128-131), A. carotis (132, 133) und Mesenterialarterien (134)<br />
abgeschwächt. Da die Dilatation in großen Gefäßen überwiegend durch NO, in der<br />
Mikrozirkulation aber durch EDHF mediiert ist (186, 227), können diese Ergebnisse nicht<br />
unmittelbar auf die Mikrozirkulation übertragen werden. Obwohl in der Mikrozirkulation bei<br />
Hypercholsterinämie keine morphologischen Veränderungen beobachtet werden, beeinflußt<br />
oxidiertes LDL dennoch die Kontraktilität glatter Muskelzellen in kleinen Arterien (228). Daher<br />
wurde der Effekt von Hypercholesterinämie auf endothelabhängige Dilatationen in<br />
Widerstandsgefäßen untersucht.<br />
In zwei Modellen der Hypercholesterinämie in der Maus (LDL-Rezeptor- und ApoE-defiziente<br />
Tiere) war die endothelabhängige Dilatation nur wenig beeinträchtigt und die maximale<br />
Dilatation intakt. Auch die weitere Erhöhung der Plasmacholesterinspiegel auf das 10-fache<br />
der Spiegel im Wildtyp hatte keine <strong>zu</strong>sätzliche Wirkung. Lediglich in ApoE-defizienten Tieren<br />
war eine Verschiebung der Konzentrationswirkungskurve <strong>zu</strong> 3 bis 4-fach höheren Werten <strong>zu</strong><br />
beobachten. Eine solche geringe Verschiebung konnte im Wildtyp durch Hemmung der NO-<br />
Synthase reproduziert werden, während dies in ApoE-defizienten Tieren <strong>zu</strong> keiner weiteren<br />
Verschiebung führte. Hieraus läßt sich folgern, dass in hypercholesterinämischen Tieren eine<br />
verminderte NO-Verfügbarkeit ursächlich ist, denn die Effektivität von NO, eine Dilatation<br />
au<strong>zu</strong>lösen, war nicht beeinträchtigt. Die verminderte Verfügbarkeit von NO ist vermutlich<br />
auch die Ursache des erhöhten Gefäßtonus in den großen Arteriolen der<br />
hypercholesterinämischen Mäuse. Der Mangel an NO könnte auf einer vermehrter<br />
Inaktivierung durch Superoxidradikale und oxidierte Lipoproteine (229, 230) oder auf einer<br />
verminderter Verfügbarkeit des Substrats der NO-Synthase L-Arginin beruhen (231, 232). Im<br />
Gegensatz da<strong>zu</strong>, war die EDHF-vermittelte Dilatation, die in der Mikrozirkulation von<br />
besonderer Bedeutung ist, durch Hypercholesterinämie nicht beeinträchtigt. Dies weist<br />
daraufhin, dass nicht das Endothel selbst durch die Hypercholesterinämie geschädigt wird,
DISKUSSION 121<br />
sondern dass Mechanismen in Gang gesetzt werden, die spezifisch mit dem NO-Signalweg<br />
interagieren. Ähnlich wurde eine Reduktion der endothelialen Funktion in Koronargefäßen<br />
hypercholesterinämischer Mäuse auf eine selektive Abschwächung der NO-vermittelten<br />
Antwort <strong>zu</strong>rückgeführt (233). Die Beeinträchtigung des durch NO-mediierten Anteils ist<br />
jedoch im Vergleich <strong>zu</strong>r intakten EDHF-Dilatation von untergeordneter Bedeutung, so dass<br />
die Gesamtdilatation in den Arteriolen der hypercholesterinämischen Tiere weitgehend<br />
unbeeinträchtigt war.<br />
Neben der Regulation des Gefäßtonus durch Freiset<strong>zu</strong>ng von vasoaktiven Substanzen<br />
ermöglicht das Endothel als Leitungsweg eine Koordination des Gefäßverhaltens, wie in<br />
Kapitel 4.1 dargestellt. Diese wichtige endotheliale Funktion ist unter bestimmten<br />
pathophysiologischen Bedingungen beeinträchtigt. So ist die Ausbreitung der Dilatation nach<br />
ACh in chronisch hypertensiven Tieren in vivo (234) und in vitro (220, 235) beeinträchtigt,<br />
möglicherweise bedingt durch eine veränderte Expression von Connexinen (166) oder K + -<br />
Kanälen (220). Die Hypercholesterinämie führt ebenfalls <strong>zu</strong> einer Modifikation der<br />
Connexinexpression in großen Gefäßen. In der Aorta war die Expression von Cx40 und<br />
Cx37 nicht nur in atherosklerotischen Plaques (140), sondern interessanterweise auch in<br />
morphologisch normal erscheinenden Arealen modifiziert bzw. reduziert (139). Solche<br />
Umverteilungen könnten die Leitfähigkeit der Endothelzellschicht einschränken. Die lokale<br />
Stimulation mit ACh führte jedoch auch in hypercholesterinämischen Mäusen <strong>zu</strong> einer<br />
fortgeleiteten Dilatation, deren Amplitude sich bis in eine Entfernung von 1100 µm nicht<br />
verringerte. Somit war die Amplitude und Dauer der Dilatation entlang des Gefäßes in ApoEund<br />
LDL-R-defizienten Tieren nicht von den im Wildtyp beobachteten Antworten<br />
verschieden. Auch die weitere Erhöhung der Plasmacholesterinspiegel durch eine fett- und<br />
cholesterinreiche Diät über mehrere Monate hatte keine Reduktion der Ausbreitung der AChinduzierten<br />
Dilatationen <strong>zu</strong>r Folge. Mittels Immunhistochemie konnte in diesen Tieren Cx40<br />
im Endothel nachgewiesen werden, allerdings war eine exakte Quantifizierung in den<br />
Arteriolen mit dieser immunhistochemischen Nachweismethode nicht möglich. Auch eine<br />
semiquantitative Bestimmung der Expression von Cx40 mittels Westernblot war wegen der<br />
geringen Proteinmenge, die sich aus diesen kleinen Arteriolen isolieren läßt, nicht erfolgreich<br />
(Daten nicht gezeigt). Somit bleibt offen, ob die Connexinexpression in den Arteriolen<br />
tatsächlich alteriert war. Dennoch zeigen die Befunde, dass die Zellkopplung über Gap<br />
Junctions funktionell intakt ist und durch eine ausgeprägte Hypercholesterinämie weder die<br />
Fortleitung von lokal ausgelösten Dilatationen entlang der Arteriolen oder die hierbei<br />
beteiligten Verstärkungsmechanismen (s. Kapitel 4.3) noch die Freiset<strong>zu</strong>ng und Wirkung von<br />
EDHF, dessen Freiset<strong>zu</strong>ng die Antwort initiiert, beeinträchtigt wird.
DISKUSSION 122<br />
4.6 Magnetofektion in vivo<br />
Die funktionelle Untersuchung der Mechanismen, die bei lokalen und fortgeleiteten<br />
Dilatationen beteiligt sind, erfordert die gezielte Ausschaltung von Proteinen wie<br />
Ionenkanälen oder Rezeptoren. Es stehen jedoch nicht für alle Zielproteine spezifische<br />
Blocker <strong>zu</strong>r Verfügung, wie beispielsweise für Kaliumkanäle der K 2P -Familie. Andere Kanäle<br />
können nur mit relativ unspezifischen Blockern ausgeschaltet werden (z.B. K IR -Kanal mit<br />
Barium). Die spezifische Ausschaltung von Proteinen am Zielort würde das Spektrum der<br />
Möglichkeiten erweitern und wäre für die Untersuchung beteiligter Mechanismen von großer<br />
Bedeutung. Die Magnetofektion erschien als Methode geeignet, da hierbei Proteine gezielt<br />
ausgeschaltet werden können und sich die Methode in vitro, vor allem bei der Transfektion<br />
schwer transfizierbarer Zelllinien wie Primärkulturen ausgezeichnet hatte (143, 236, 237).<br />
Zunächst wurde die Src homology domain 2 (SH2)-Tyrosinphosphatase-1 (SHP-1) als<br />
Zielprotein untersucht. Diese Tyrosinphosphatase ist in menschlichen Endothelzellen der<br />
Nabelschnur ein wichtiger Regulator der NADPH-Oxidase abhängigen Superoxidproduktion<br />
und reduzierte in Endothelzellen sowohl die basale als auch die stimulierte Superoxidbildung<br />
(145). Eine Ausschaltung von SHP-1 sollte daher <strong>zu</strong>r vermehrten Bildung reaktiven<br />
Sauerstoffspezies führen und so vermehrt NO inaktivieren. Die funktionelle Untersuchung<br />
der mit der Antisense-Sequenz behandelten Tieren zeigte jedoch, dass die<br />
konzentrationsabhängige Dilatation, die durch exogen appliziertes NO induziert wurde, nicht<br />
wie erwartet abgeschwächt war. Auch die Dilatation nach ACh war im wesentlichen<br />
unverändert, was eine intakte Endothelfunktion aufzeigt. Somit ließ sich hier keine<br />
erfolgreiche Transfektion vaskulärer Zellen nachweisen.<br />
Um ein einfach <strong>zu</strong> untersuchendes Protein aus<strong>zu</strong>schalten, wurde für die weitere Etablierung<br />
des Verfahrens der muskarinische ACh-Rezeptor (M3), der die Effekte des ACh im Endothel<br />
vermittelt, als Target ausgewählt. In Keratinozyten führte das verwendete Gemisch aus<br />
Antisenseoligonukleotiden <strong>zu</strong> einer Reduktion des M3-Rezeptors um 80% (146). Drei Tage<br />
nach Transfektion war jedoch in diesen Tieren die Gefäßantwort weder nach Stimulation mit<br />
ACh, SNP noch nach Adenosin abgeschwächt. Da die Halbwertszeit des Rezeptors sich in<br />
der Mikrozirkulation in vivo von der Zellkultur unterscheiden könnte, wurde die vaskuläre<br />
Funktion auch <strong>zu</strong> früheren Zeitpunkten untersucht, ohne jedoch deutliche Hemmeffekte <strong>zu</strong><br />
beobachten. Die Applikation mit fluoreszenzmarkierten Antisenseoligonukleotiden unter<br />
visueller Kontrolle mit einem Fluoreszenzmikroskop zeigte eine un<strong>zu</strong>reichende Anreicherung<br />
der Oligonukleotide am Zielort in der Arteriole. Das Magnetfeld war offensichtlich nicht<br />
ausreichend, um die Partikel <strong>zu</strong>rück<strong>zu</strong>halten, denn die fluoreszierender Partikel zirkulierten
DISKUSSION 123<br />
überwiegend mit dem Blutstrom. Auch die manuelle Kompression der Aorta während der<br />
Applikation der Oligonukleotide blieb uneffektiv. Obwohl in vorhergehenden Versuchen<br />
fluoreszenzmarkierte Oligonukleotiden nach 48h im Gefäß <strong>zu</strong> lokalisieren waren (143), ist die<br />
transfizierte Menge nicht ausreichend, um eine funktionell relevante Reduktion des<br />
Zielproteins <strong>zu</strong> erreichen. Eine komplette Ausschaltung von Proteinen ist auch in der<br />
Zellkultur nicht möglich und es ist an<strong>zu</strong>nehmen, das die Transfektionseffiziens in vivo<br />
deutlich geringer ist. Daher läßt sich nicht entscheiden, ob die Ausschaltung eines<br />
Zielproteins nicht gelang oder dieses Protein funktionell irrelevant ist. Die Methode muß<br />
daher für die Transfektion in vivo, um die funktionelle Beteiligung bestimmter Proteine <strong>zu</strong><br />
untersuchen als ungeeignet eingestuft werden.
ZUSAMMENFASSUNG 124<br />
5 Zusammenfassung<br />
Die Organdurchblutung ist ein dynamischer Vorgang, der kontinuierlich dem Sauerstoff- und<br />
Nährstoffbedarf der Gewebe angepaßt werden muss. Diese lokale Regulation beinhaltet die<br />
Freiset<strong>zu</strong>ng gefäßwirksamer metabolischer Substanzen, die endotheliale Bildung von<br />
Autakoiden (NO, PGI 2 , EDHF) und eine aufsteigende Dilatation, um auch <strong>zu</strong>führende Gefäße<br />
<strong>zu</strong> erweitern und eine maximale Perfusion <strong>zu</strong> erreichen. Diese koordinierte Gefäßantwort hat<br />
eine Schlüsselrolle bei der Durchblutungsregulation des Skelettmuskels und wird ausgelöst<br />
durch Membranpotentialänderungen, die sich entlang des Gefäßes ausbreiten, da vaskuläre<br />
Zellen über von Connexinen gebildete Gap Junctions gekoppelt sind. Experimentell kann<br />
eine solche fortgeleitete Antwort durch eine lokale Stimulation der Arteriole initiiert werde,<br />
wobei eine Depolarisation <strong>zu</strong>r Konstriktion und eine Hyperpolarisation <strong>zu</strong>r Dilatation führt. In<br />
dieser Arbeit wurden die Mechanismen, die fortgeleiteten Gefäßantworten ausgelöst durch<br />
lokale Applikation der endogenen Substanzen Acetylcholin (ACh), Adenosin und Bradykinin<br />
<strong>zu</strong>grunde liegen, unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen untersucht.<br />
Die Untersuchungen wurden mittels intravitaler Beobachtung von Arteriolen ergänzt durch<br />
Membranpotentialmessung und Immunhistochemie im Skeletmuskel der Maus durchgeführt.<br />
Die endothelabhängige Dilatation ist in der Mikrozirkulation vor allem durch einen<br />
endothelabhängigen hyperpolarisierenden Faktor (EDHF) vermittelt. Die ACh-induzierte<br />
Dilatation war in Mäusen mit einer Deletion des calciumabhängigen Kaliumkanals (K Ca )<br />
mittlerer Leitfähigkeit (IK Ca ) selektiv reduziert. Die verbleibende Antwort war nach<br />
pharmakologischer Blockade der K Ca kleiner Leitfähigkeit (SK Ca ) aufgehoben. Da IK Ca und<br />
SK Ca endothelial exprimiert werden, ist die EDHF Dilatation somit von der Aktivität dieser<br />
Kanäle und einer endothelialen Hyperpolarisation abhängig. Der Verlust des IK Ca kann nicht<br />
durch die Aktivität des SK Ca kompensiert werden, was auf eine differente Funktion dieser<br />
Kanäle deutet. Der vor allem im glatten Muskel exprimierte K Ca großer Leitfähigkeit (BK Ca ) ist<br />
ebenfalls notwendig, denn die pharmakologische Blockade hebt die ACh-Dilatation selektiv<br />
auf. Die intakte Dilatation in Mäusen mit einer Deletion des BK Ca zeigt aber, dass spezifische<br />
Unterschiede zwischen Mausstämmen bestehen, was die Vergleichbarkeit der Ergebnisse in<br />
verschiedenen Laboren von einer einheitlichen Rückkreu<strong>zu</strong>ng transgener Tiere abhängig<br />
macht. Die Koordination entlang des Gefäßes wurde durch lokalisierte Stimulation untersucht<br />
und zeigte, dass lokal ausgelöste Dilatationen sich rasch entlang der Arteriole ausbreiten.<br />
Die zellspezifische Deletion von Connexin40 (Cx40), welches im Endothel der Arteriolen<br />
nachgewiesen wurde, vermindert die Ausbreitung von ACh-induzierten Dilatationen ohne die<br />
Ausbreitung von Konstriktionen <strong>zu</strong> verändern. Als Auslöser der fortgeleiteten Antwort nach<br />
ACh wurde die lokale Aktivierung der K Ca -Kanäle identifiziert und selektive, lokalisierte<br />
Aktivierung von IK Ca kann den Fortleitungsmechanismus auslösen. Ebenso konnten
ZUSAMMENFASSUNG 125<br />
fortgeleitete Dilatationen durch Adenosin ausgelöst werden, die im Gegensatz <strong>zu</strong> ACh<br />
unabhängig von der Aktivierung von K Ca waren und auschließlich auf der Öffnung von K ATP -<br />
Kanälen beruhten. Obwohl die lokale Antwort abhängig vom Agonisten durch<br />
unterschiedliche K + -Kanäle hervorgerufen wurde, bewirkte sowohl ACh als auch Adenosin<br />
eine Hyperpolarisation des glatten Muskels, wie durch Membranpotentialmessung gezeigt<br />
wurde. Während ACh auch das Endothel hyperpolarisiert, ist Adenosin hier<strong>zu</strong><br />
möglicherweise nicht in der Lage. Die Mechanismen, die der Ausbreitung <strong>zu</strong>grunde liegen,<br />
zeigten weitere Unterschiede zwischen diesen Agonisten. Während die Amplitude der<br />
Dilatation nach Adenosin bis in eine Entfernung von 1100 µm abnahm, war dies bei ACh<br />
nicht der Fall. Lediglich die Fortleitung nach Adenosin war sensitiv gegenüber dem<br />
unspezifischen Kanalblocker Bupivacain. Spezifischere Blocker zeigten, dass an der<br />
Fortleitung beteiligte Verstärkungsmechanismen bei Adenosin den einwärts gleichrichten K + -<br />
Kanal (K IR ) und bei ACh spannungsabhängige K + -Kanäle (K V ) beinhalten. Diese Ergebnisse<br />
deuten darauf hin, dass die Ausbreitung des Signals entlang unterschiedlicher Leitungswege<br />
stattfindet. Adenosin verwendet vermutlich die glattmuskuläre Zellschicht und ACh das<br />
Endothel, was vereinbar mit den Ergebnissen der endothelzellspezifischen Deletion von<br />
Cx40 ist. Die Untersuchung der endothelialen Funktion in zwei Mausmodellen der<br />
Atherosklerose (ApoE- und LDL-R-defiziente Maus) zeigte, dass in der Mikrozirkulation eine<br />
Hypercholesterinämie die endothelabhängige ACh-Dilatation nicht beeinträchtigt. Diese<br />
intakte Endothelfunktion wird verständlich durch die Beobachtung, dass in der<br />
Mikrozirkulation das Endothel vor allem EDHF und nicht, wie in Leitungsgefäßen, NO<br />
freisetzt. Der marginale NO-Anteil war in der Mikrozirkulation ebenfalls beeinträchtigt.<br />
Weiterhin war die Auslösung und die Fortleitung von ACh-Dilatation komplett intakt und<br />
damit die Zellkopplung und die Koordination des Gefäßverhaltens trotz drastischer<br />
Hypercholesterinämie unbeeinträchtigt.<br />
Die vorgelegte Arbeit stellt die eminente Bedeutung von Membranpotentialänderungen, die<br />
endothelabhängig durch einen hyperpolarisierenden Faktor ausgelöst werden, heraus. In<br />
Abhängigkeit vom Stimulus und der physiologischen Funktion sind eine Reihe verschiedener<br />
K + -Kanäle beteiligt, deren Aktivität im Konzert eine Koordination des Gefäßverhaltens<br />
ermöglichen. Hierbei breiten sich lokal ausgelöste Membranpotentialänderungen (K ATP , K Ca<br />
im besonderen IK Ca ) entlang der über Connxine und Gap Junctions gekoppelten Zellen unter<br />
Zuhilfenahme spezifischer Verstärkungsmechanismen (K IR , K V ) über große Strecken entlang<br />
des Endothels (ACh) oder der glatten Muskulatur (Adenosin) aus und erlauben aufsteigende<br />
Gefäßantworten, die unbeeinträchtigt von einer Hypercholesterinämie eine maximale<br />
Perfusionssteigerung erst ermöglichen.
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ANHANG 140<br />
7 Anhang<br />
7.1 Verwendete Substanzen<br />
Substanz<br />
Hersteller<br />
4-Aminopyridin<br />
8-pc-cGMP<br />
Acetylcholin<br />
Adenosin<br />
Agarose<br />
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit (Polyclonal)<br />
Atipamezol (Antisedan)<br />
BaCl 2<br />
Blocking-Solution: CSA-Kit K1500;<br />
Borsäure<br />
Bovines Serumalbumin<br />
Bradykinin<br />
Bromphenolblau<br />
Bupivacain<br />
CaCl 2<br />
Carboxyfluorescein<br />
Catalyzed Signal Amplifikation, CSA<br />
Charybdotoxin<br />
Cholesterol Kit<br />
Cromakalim<br />
CSA Rabbit Link<br />
DABCO<br />
DCEBIO<br />
DEA NONOate<br />
DMSO<br />
DNA Ladder<br />
dNTP<br />
Double Stain Block<br />
EDTA<br />
Ethanol 96%<br />
Ethidiumbromid<br />
Fast Red<br />
Fentanyl<br />
Sigma, Deisenhofen<br />
BioLog, Bremen<br />
Sigma, Deisenhofen<br />
Fluka, Seelze<br />
Invitrogen, Karlsruhe<br />
Molecular Probes<br />
Pfizer, Karlsruhe<br />
Sigma, Deisenhofen<br />
Dakocytomation, Carpenteria, CA, USA<br />
Fluka, Seelze<br />
Sigma, Deisenhofen<br />
Bachem, Weil am Rhein<br />
Serva, Heidelberg<br />
Sigma, Deisenhofen<br />
Merck Darmstadt<br />
MOBiTec, Göttingen<br />
Dakocytomation, Carpenteria, CA, USA<br />
Bachem, Weil am Rhein<br />
Abbott clinical Chemistry, Abbott park IL, USA<br />
Tocris Bioscienc, Bristol, UK<br />
Dakocytomation, Carpenteria, CA, USA<br />
Sigma, Deisenhofen<br />
Tocris Bioscienc, Bristol, UK<br />
Alexis Biochemicals, Lausen, CH<br />
Merck, Darmstadt<br />
Invitrogen, Karlsruhe<br />
New England Biolabs, Frankfurt<br />
Dakocytomation, Carpenteria, CA, USA<br />
Amersham Biosciences, Braunschweig<br />
Fluka, Seelze<br />
Carl Roth, Karlsruhe<br />
Abcam, Cambridge, UK<br />
Curamed, Karlsruhe
ANHANG 141<br />
Flumazenil<br />
Formaldehyd<br />
Glibenclamid<br />
Glycerin<br />
Heparin, Liquimin N 25000<br />
Hoechst (Bisbenzimid Fluorochrom)<br />
Iberiotoxin<br />
Indomethacin<br />
Isopropanol<br />
KCl<br />
KH 2 PO 4<br />
L-Nitroarginin<br />
Medetomidin<br />
Mepivacain<br />
MgSO 4 x 7H 2 0<br />
Midazolam<br />
MOPS<br />
Mowiol<br />
NaCl<br />
NaHCO 3<br />
Naloxon<br />
Natriumcitrat<br />
Ouabain<br />
Pentobarbital (Narcoren)<br />
PolyMAG<br />
Proteinase K<br />
Rabbit Anti-Mouse Connexin40 (Polyclonal)<br />
SDS<br />
SNP (Sodium Nitroprussid)<br />
Sylgard<br />
Taq Polymerase<br />
Tris HCl<br />
Triton X 100<br />
UCL 1684<br />
vWF (H300) Rabbit (Polyclonal)<br />
Wasser (entionisiert) RS 90-4/US<br />
Wasserstoffperoxid<br />
Xylol<br />
Gasgemisch 5%CO 2 , 95% N 2<br />
Fluka, Seelze<br />
Roche, Grenzbach-Whyhlen<br />
Alexis Biochemicals, Lausen, CH<br />
Santa Cruz, Heidelberg<br />
Roche, Grenzbach-Whyhlen<br />
Molecular Probes, Leiden, NL<br />
Bachem, Weil am Rhein<br />
Dumex, Bad Vibel<br />
Merck, Darmstadt<br />
Merck, Darmstadt<br />
Merck, Darmstadt<br />
Sigma, Deisenhofen<br />
Pfizer, Karlsruhe<br />
Sigma, Deisenhofen<br />
Merck, Darmstadt<br />
Roche, Grenzbach-Whyhlen<br />
Roth Karlsruhe<br />
Calbiochem, Schwalbach<br />
Fluka, Seelze<br />
Merck, Darmstadt<br />
Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg<br />
Sigma, Deisenhofen<br />
Sigma, Deisenhofen<br />
Merial, Hallbergmoos<br />
Chemicell, Berlin<br />
Sigma, Deisenhofen<br />
Chemicon Int. Eastleigh, UK<br />
Porphyrin Systems, <strong>Lübeck</strong><br />
Sigma, Deisenhofen<br />
WPI, Berlin<br />
MBI Fermentas, St Leon Rot<br />
Roth, Karlsruhe<br />
Merck, Darmstadt<br />
Tocris Bioscience, Ellisville, USA<br />
Santa Cruz, Heidelberg<br />
SG Reinstwassersysteme, Hamburg<br />
Merck, Darmstadt<br />
Merck, Darmstadt<br />
Linde, München
ANHANG 142<br />
7.2 Lösungen und Puffer<br />
Lösungen und Puffer<br />
Agarosegel<br />
1% Agarose<br />
0.004% Ethidiumbromid<br />
TBE Puffer<br />
Blockierlösung 2% BSA<br />
0.2% Triton-X 100<br />
PBS<br />
Superfusionslösung<br />
(Krebs-Puffer)<br />
138 mM Na +<br />
5 mM K +<br />
2.5 mM Ca 2+<br />
1.2 mM Mg 2+<br />
-<br />
20 mM HCO 3<br />
2-<br />
1.2 mM SO 4<br />
-<br />
1.2 mM H 2 PO 4<br />
127.2 mM Cl -<br />
Aqua bidest<br />
die Lösung wurde <strong>zu</strong>r Einstellung des pH auf 7.4<br />
mit 5% CO 2 , 95% N 2 begast<br />
Laird Puffer 100 mM Tris –HCl (pH 8.5)<br />
0.2% SDS<br />
5 mM EDTA<br />
200 mM NaCl<br />
Aqua bidest<br />
Loading Dye<br />
30% Glycerin<br />
0.25% Bromphenolblau<br />
Aqua bidest
ANHANG 143<br />
PBS (phosphate buffered saline)<br />
137 mM NaCl<br />
2.7 mM KCl<br />
8.1 mM Na 2 HPO 4 x H 2 O<br />
1.5 mM KH 2 PO 4<br />
Aqua bidest<br />
Ringer<br />
147 mM NaCl<br />
4 mM KCl<br />
22 mM CaCl 2 x 2H2 0<br />
TBE Puffer 89 mM Tris<br />
89 mM Borsäure<br />
2 mM EDTA<br />
Aqua bidest<br />
TE Puffer 1 M Tris (pH 8)<br />
0.25 M EDTA<br />
Aqua bidest<br />
Waschlösung 1% Triton-X 100<br />
PBS<br />
7.3 Weitere Materialien<br />
Chirurgisches Nahtmaterial 6/0 (Prolene ® )<br />
Polyethylenkatheter PE 10 (venöser Katheter)<br />
(D i : 0.28mm; D a : 0.61mm)<br />
Polyethylenkatheter PE 50 (Tubus)<br />
(D i : 0.5mm; D a : 1.00mm)<br />
Magnet Neodelta<br />
Mikroloader<br />
Firma Ethicon, Hamburg<br />
Schubert, München<br />
Schubert, München<br />
IBS Magnet Berlin<br />
Eppendorf, Hamburg
ANHANG 144<br />
7.4 Abkür<strong>zu</strong>ngsverzeichnis<br />
Abkür<strong>zu</strong>ngsverzeichnis<br />
[Ca 2+ ] i<br />
4-AP<br />
8-pCPT-cGMP<br />
ACh<br />
Ado<br />
AgCl<br />
BaCl 2<br />
BK-/-<br />
BK+/+<br />
BK Ca<br />
cAMP<br />
cGMP<br />
Chtx<br />
COX<br />
Cromakalim<br />
Cx<br />
Cx40-/-<br />
Cx40+/+<br />
CYP450<br />
DCEBIO<br />
DEA-NONOate<br />
EC<br />
EDH<br />
EDHF<br />
EET<br />
eNOS<br />
eNOS-/-<br />
Glibenclamid<br />
Ibtx<br />
IK-/-<br />
IK+/+<br />
IK Ca<br />
Indo<br />
intrazelluläre Calciumkonzentration<br />
4-amino - Pyridin, K V Blocker<br />
8- (4- Chlorophenylthio)guanosine- 3', 5'- cyclic monophosphate,<br />
zellpermeables cGMP Analogon<br />
Acetylcholin<br />
Adenosin<br />
Silberchlorid<br />
K IR Blocker<br />
Maus defizient für BK Ca<br />
Wildtyp Maus (SV129/C57BL/6 Hintergrund)<br />
K Ca mit großer Leitfähigkeit<br />
zyklisches Adenosinmonophosphat<br />
zyklisches Guanosinmonophosphat<br />
Charybdotoxin, Blocker der IK Ca - und BK Ca -Kanäle<br />
Cyclooxygenase<br />
K ATP Öffner<br />
Connexin<br />
Maus defizient für Cx40<br />
Wildtyp Maus (C57BL/6)<br />
Cytochrom-P450-Epoxygenase<br />
IK Ca -Öffner<br />
2-(N,N-diethylamino)-diazenolat-2-oxid, nicht-enzymatischer NO Donor<br />
Endothelzelle<br />
Endothelium-Derived Hyperpolarization<br />
Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor<br />
Epoxyeicosatriensäure<br />
endotheliale NO-Synthase<br />
Mäuse, defizient für die endotheliale NO-Synthase<br />
K ATP Blocker<br />
Iberiotoxin, BK Ca Blocker<br />
Maus defizient für IK Ca<br />
Wildtyp Maus (129ola/C57BL/6 Hintergrund)<br />
K Ca mit mittlerer Leitfähigkeit<br />
Indomethacin, Cyclooxygenasehemmer
ANHANG 145<br />
IP 3<br />
K ATP<br />
K Ca<br />
K IR<br />
K V<br />
LNA<br />
n<br />
NOS<br />
PGI 2<br />
PKG<br />
PLC<br />
sGC<br />
SK Ca<br />
SMC<br />
SNP<br />
UCL1684<br />
Inositol-1,4,5-trisphosphat<br />
ATP-abhängiger Kalium-Kanal<br />
Calcium-abhängiger Kalium-Kanal<br />
einwärts gleichrichtender Kalium-Kanal<br />
spannungsabhängiger Kalium-Kanal<br />
N ω -nitro-L-Arginin, NO-Synthasehemmer<br />
Anzahl der Beobachtungen<br />
endotheliale NO-Synthase<br />
Prostazyklin<br />
cGMP-abhängige Proteinkinase<br />
Phospholipase C<br />
lösliche Guanylatzyklase<br />
K Ca mit geringer Leitfähigkeit<br />
glatte Gefäßmuskelzelle (smooth muscle cell)<br />
Nitroprussid-Natrium (sodium nitruprusside)<br />
selektiver SK Ca Blocker
ANHANG 146<br />
Publikationen<br />
ORIGINALARBEITEN<br />
1. Wölfle SE, de Wit C. Intact endothelium-dependent dilation and conducted responses in<br />
resistance vessels of hypercholesterolemic mice in vivo. J.Vasc.Res., 42: 475-482, 2005<br />
2. Siegl D, Koeppen M, Wölfle SE, Pohl U, de Wit C. Myoendothelial coupling is not prominent in<br />
arterioles within the mouse cremaster microcirculation in vivo. Circ.Res., 97: 781-788, 2005<br />
3. Si H, Heyken WT, Wölfle SE, Tysiac M, Schubert R, Grgic I, Vilianovich L, Giebing G, Maier T,<br />
Gross V, Bader M, de Wit C, Hoyer J, Köhler R. Impaired endothelium-derived hyperpolarizing<br />
factor-mediated dilations and increased blood pressure in mice deficient of the intermediateconductance<br />
Ca 2+ -activated K + channel. Circ Res (in press)<br />
4. Wölfle SE, de Wit C. Conducted responses initiated by acetylcholine and adenosine are<br />
amplified by different K + -channels. (in Vorbereitung)<br />
ÜBERSICHTSARBEITEN<br />
5. Hoepfl B, Wölfle S, Boettcher M, de Wit C. Conducted vasodilation. In: Proceedings of the 23th<br />
European Conference on Microcirculation. Eds.: Martins e Silva J, Saldanha C, Oliveira V, Pries<br />
A, Shore A. Monduzzi Editore, Bologna, Italy. pp. 15-20, 2004<br />
6. de Wit C, Hoepfl B, Wölfle SE. Endothelial mediators and communication through vascular gap<br />
junctions. Biol. Chem, 387: 3–9, 2006<br />
7. de Wit C, Wölfle SE, Hoepfl B. Connexin-dependent communication within the vascular wall:<br />
Contribution to the control of arteriolar diameter. Adv. Cardiol. 42: 268-283, 2006<br />
8. de Wit C, Wölfle SE. EDHF and gap junctions: Important regulators of vascular tone within the<br />
microcirculation. Curr Pharm Biotechnol (in press)
ANHANG 147<br />
KONGRESSBEITRÄGE MIT ABSTRACTPUBLIKATIONEN<br />
1. Wölfle SE, de Wit C. ACh-induced dilator and conducted responses remain largely intact in the<br />
microcirculation of hyperlipidemic mice J.Vasc.Res. 41: 460, 2004<br />
2. Wölfle SE, de Wit C. Intact endothelial function in the microcirculation of hypercholesterolemic<br />
mice in vivo. Pflügers Arch. 449 (Suppl 1): S26, 2005<br />
3. Wölfle SE, de Wit C. Hypercholesterolemia does not impair EDHF-mediated and conducted<br />
dilations in arterioles in vivo. FASEB J. 19 (Suppl): A724, 2005<br />
4. Wölfle SE, Sausbier M, Ruth P, de Wit C. Striking differences between mouse strains: Divergent<br />
role for BK Ca channel in ACh dilations. J.Vasc.Res. 43: 31, 2006<br />
5. Wölfle SE, de Wit C. Different mechanisms contribute to the conduction of locally induced<br />
acetylcholine and adenosine dilations. Acta Physiol. Scand. 168 (Suppl 1):102,2006<br />
6. Wölfle SE, de Wit C. Different mechanisms induce remote responses:acetylcholine versus<br />
adenosine. FASEB J. 20 (4): A276, 2006<br />
KONGRESSBEITRÄGE OHNE ABSTRACTPUBLIKATION<br />
1. Wölfle SE, de Wit C. Endotheliale Funktion in der Mikrozirkulation atherosklerotischer Mäuse. IX.<br />
Treffen der Ostseephysiologen, Greifswald, 2004<br />
2. Wölfle SE, de Wit C. Different mechanisms contribute to conducted vasodilation induced by<br />
varying agonists. Rostock workshop on smooth muscle function, 2005<br />
3. Wölfle SE, de Wit C. Die Koordination des arteriolären Verhaltens erfolgt durch verschiedene<br />
Mechanismen. XI. Treffen der Ostseephysiologen, <strong>Lübeck</strong>, 2006
ANHANG 148<br />
Lebenslauf<br />
ANGABEN ZUR PERSON<br />
Stephanie E Wölfle<br />
geboren am 09.01.1974 in München<br />
Staatsangehörigkeit: deutsch<br />
STUDIUM<br />
1995 – 2002 Studium der Pharmazie an der Ruprecht-Karls-<strong>Universität</strong> in<br />
Heidelberg<br />
2002 Approbation als Apothekerin<br />
2003 Beginn der Doktorarbeit am Institut für Physiologie an der<br />
<strong>Universität</strong> <strong>zu</strong> <strong>Lübeck</strong><br />
PREISE<br />
2006 Benjamin Zweifach Student Award der Microcirculatory Society<br />
DRITTMITTEL<br />
2006 DFG Zuschuss <strong>zu</strong> einer Kongressreise (1200 EUR)
ANHANG 149<br />
Danksagung<br />
Mein besonderer Dank gilt Dr. Cor de Wit für die Überlassung des faszinierenden Themas<br />
und die großartige Betreuung in experimentellen und theoretischen Belangen sowie die<br />
extensive Fortbildung am PC und insbesondere auch für die Einführung in die Welt der<br />
Shortcuts. Seine Unterstüt<strong>zu</strong>ng meiner Forschung in den letzten Jahren hat den Grundstein<br />
für das Gelingen dieser Arbeit gelegt. Die Möglichkeit der wissenschaftlichen Weiterbildung<br />
bei Vorträgen und nationalen und internationalen Kongressen hat entscheidend <strong>zu</strong> meiner<br />
beruflichen Weiterentwicklung beigetragen.<br />
Herrn Prof. Dr. Wolfgang Jelkmann danke ich für die freundliche Aufnahme im Institut, die<br />
mir vom ersten Tag an die Herzlichkeit und gute Zusammenarbeit an diesem Institut<br />
vermittelt hat. Des weiteren möchte ich mich für die Möglichkeit der Teilnahme an<br />
Kongressen und das <strong>zu</strong>r Verfügung gestellte Material sowie für seine kontinuierliche<br />
Unterstüt<strong>zu</strong>ng bedanken.<br />
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danke ich für die Finanzierung meines Projektes<br />
und der Gelegenheit Teile dieser Arbeit auf einem internationalen Kongress <strong>zu</strong> präsentieren.<br />
Allen Mitarbeitern des Institutes danke ich für die gute Stimmung, die stete Ansprechbarkeit<br />
und die selbstverständliche Hilfe bei großen und kleinen Problemen.<br />
Insbesondere danke ich Rita Meuer für Hilfestellung in unterschiedlichsten Belangen und die<br />
kompetente und engagierte Unterstüt<strong>zu</strong>ng im Labor und Dr. Reinhard Depping für unzählige<br />
konstruktive Diskussionen und seinen Rat in molekularbiologischen Fragestellungen.<br />
Susann Schindler und Inga Jensen danke ich für die Einführung in die Welt des Western-<br />
Blot, die stete Hilfsbereitschaft und die gute Stimmung.<br />
Anika Wagner und Kathrin Döge danke ich für für die vielen Gespräche über die Arbeit und<br />
auch darüber hinaus .<br />
Ferdinand Greitschuss danke ich für die Entwicklung des Auswertungsprogramms und die<br />
hervorragende Unterstüt<strong>zu</strong>ng bei allen 'Computer-Problemen'.<br />
Meiner 'Mitsitzerin' Uschi möchte ich ganz besonders für ihre Geduld, ihre konstruktive Kritik<br />
und ihre Freundschaft danken, die mir sehr viel bedeuten.<br />
Ich bedanke ich mich bei meiner Familie die mich in allen Vorhaben unterstützt hat und<br />
besonders bei meinen Eltern die mir die Promotion ermöglicht haben und immer für mich da<br />
waren.<br />
Mein ganz besonderer Dank gilt Roland, der mir während der letzten Jahre mit Rat und Tat<br />
<strong>zu</strong>r Seite stand und mir alles ermöglichte.