AUFSTEIGENDE DILATATIONEN - Universität zu Lübeck

MATERIAL UND METHODEN 35
wurden durch Behandlung mit 0.3 % Wasserstoffperoxid-Lösung inaktiviert. Die Präparate
wurden blockiert (Blocking-Solution: CSA-Kit K1500; Dakocytomation, Carpenteria, CA) und
über Nacht mit dem Cx40 Antikörper (1:200; Chemicon, Temucula, USA) inkubiert. Zur
Visualisierung des primären Antikörpers wurde ein Signalverstärkungssystem (Catalyzed
Signal Amplifikation, CSA, DakoCytomation, Carpenteria, USA) verwendet. Es handelt sich
hierbei um eine empfindliche Färbemethode, die eine Signalverstärkung benutzt, welche auf
der Peroxidase katalysierten Ablagerung einer biotinylierten phenolischen Verbindung
beruht. Zur Verwendung des primären Cx40 Antikörpers, der aus Hasenserum stammte,
mußte ein 'CSA Rabbit Link' verwendet werden, um das System einsetzen zu können.
Dadurch konnte der zur Detektion des primären Antikörpers eingesetzte, biotinylierte
sekundäre Antikörper den primären Antikörper erkennen. Im nächsten Schritt wurde ein
Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex zugesetzt der an den biotinylierten sekundären
Antikörper bindet. Die so gebundene Peroxidase katalysiert die Präzipitation eines
biotinylierten Phenols. Peroxidase gekoppelte Antikörper wurden mit Diaminobenzidin braun
gefärbt. Bei Koimmunfärbungen wurde Double Stain Block (Dakocytomation, Carpenteria,
USA) zwischen der Inkubation mit zwei primären Antikörper verwendet. Bei der Detektion der
Antikörper gegen den endothelspezifischen Marker von Willebrand Faktor wurde das Enzym
Alkalische Phosphatase als Sonde eingesetzt. Das Enzym führt ebenfalls zur Bildung eines
lokalen gefärbten Niederschlags. Die Entwicklung erfolgte hier mit Fast Red. Die Betrachtung
der Zielstrukturen erfolgte auch hier mit dem Axioplan 2 Imaging Fluoreszenzmikroskop wie
unter 2.2.6.1, Immunfluoreszenz beschrieben.
2.2.7 Genotypisierung der Connexin40 defizienten Mäuse
Mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) läßt sich eine sehr kleine Menge eines
definierten DNA-Abschnitts so stark vervielfältigen, dass er problemlos nachgewiesen und
untersucht werden kann. Vorraussetzung hierfür ist, dass die Sequenzen am Anfang und am
Ende des DNA Fragments bekannt sind. Dann können spezifische Primer hergestellt
werden, die komplementär zu den Anfangs- und Endsequenzen sind und mit der Matritze
hybridisieren. Die Vervielfältigung erfolgt durch DNA-Polymerasen, die sich an je ein Ende
des hybridisierten Primers heften und den neuen DNA-Strang komplementär zur Matritze
synthetisieren.
Eine PCR besteht aus mehreren aufeinanderfolgenden Zyklen, wobei jeder Zyklus die DNA-
Menge verdoppelt. Ein Zyklus besteht aus drei Phasen, Erhitzung, einer Abkühlung und
erneutem Erwärmen. In der ersten Phase wird der Doppelstrang der DNA durch Erhitzen in
zwei Einzelstränge getrennt (Denaturierung). In der zweiten, kühleren Phase lagern sich die
Primer an die Bereiche der Einzelstränge mit ihrer komplementären Sequenz (Anlagerung)