AUFSTEIGENDE DILATATIONEN - Universität zu Lübeck

MATERIAL UND METHODEN 43
2.3.2 Intermittierende Durchmesserbestimmung nach globaler Stimulation
Um die Bedeutung verschiedener Agonisten unter physiologischen und
pathophysiologischen Bedingungen sowie die Beteiligung verschiedener K + -Kanäle an der
lokalen Dilatation zu untersuchen, wurden die Durchmesser der Arteriolen während
unterschiedlicher Behandlungen im Wildtyp und transgenen Mäusen bestimmt. Hierzu
wurden mehrere Gefäße untersucht, die jeweils unmittelbar vor und nach Stimulation mit den
Agonisten betrachtet wurden. Um zu gewährleisten, dass über die gesamte Versuchsdauer
immer dieselben Gefäßabschnitte betrachtet werden konnten, wurde in der
Äquilibrationsphase eine detaillierte Skizze des Gefäßbaums angefertigt. Nerven, Venen und
besonders markante Verläufe der Arteriolen dienten als Orientierungshilfe. In einem Präparat
wurden 8 - 12 Arteriolen unterschiedlicher Gefäßgenerationen, unterschiedlichen
Kontraktionszustandes und unterschiedlicher Lage innerhalb des Gefäßbaumes zur
Durchmesserbeobachtung ausgewählt. Diese Arteriolen wurden im weiteren Versuchsablauf
in definierter Reihenfolge aufgesucht, jeweils etwa fünf Sekunden fokussiert und gleichzeitig
auf Videoband aufgenommen. Die Beobachtung aller ausgewählten Gefäße dauerte ca. eine
Minute und erfolgte sowohl unmittelbar vor Stimulation mit einem Agonisten als auch
während der Superfusion der vasoaktiven Substanz. Die Agonisten wurden dem Superfusat
wie bereits beschrieben mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe beigemischt. Die nächsthöhere
Konzentration oder eine weitere Substanz wurden erst untersucht, wenn die Gefäße den
Ausgangsdurchchmesser wiedererlangt hatten. Dies variierte je nach Agonist und
Kontraktionszustand der Arteriolen und dauerte etwa 1-5 Minuten.
2.3.3 Kontinuierliche Durchmesserbestimmung: fortgeleitete Vasomotorantworten
Die Arteriolen, an denen die Ausbreitung von lokal induzierten Dilatationen oder
Konstriktionen untersucht wurden, mussten mehreren Anforderungen entsprechen. Zum
einen war eine Gefäßlänge von mindestens 1.5 mm zwingende Voraussetzung um die
Durchmesseränderungen an den entfernten Positionen betrachten zu können. Zum anderen
sollte die Arteriole weder in Nachbarschaft zu einer Vene lokalisiert sein, um veno-arterielle
Diffusion der Agonisten ausschließen zu können, noch im Randbereich der Präparation
liegen. Des weiteren mußte die Arteriole einen ausreichenden Kontraktionszustand
aufweisen, um die Ausbreitung von lokal induzierten Dilatationen zu untersuchen. Die
Gefäßstimulation erfolgte über eine Mikropipette, welche mit Hilfe eines Mikromanipulators in
unmittelbarer Nähe des Gefäßes (Abstand < 15 µm) im Skelettmuskel positioniert wurde. Die
Mikropipette war mit der Stimulationssubstanz (Kaliumchlorid (3 M), Adenosin (10 mM),
Bradykinin (10 mM) oder Acetylcholin (10 mM) gefüllt und hatte einen Spitzendurchmesser
von ca. 2 µm. Durch Druckejektion (140 kPa, 50 - 800 ms) wurde ein sehr kleines Volumen