AUFSTEIGENDE DILATATIONEN - Universität zu Lübeck

MATERIAL UND METHODEN 31
einem Potentialverstärker (SEC 1L, NPI Advanced Electronics, Tamm) gemessen, an dem
das Membranpotential auch digital abgelesen werden konnte. Zur Orientierung im Gewebe
wurde ein repetitiver Stromimpuls erzeugt. Da mit der Elektrode das gesamte Potential und
nicht nur das Membranpotential gemessen wird, ist es schwierig den generierten
wechselnden Spannungsabfall über die Elektrode von dem auf Zellpenetration beruhenden
Spannungsabfall zu unterscheiden. Daher werden spezielle Kompensationskreisläufe des
Verstärkers verwendet, die das durch den Verstärker erzeugte Signal subtrahieren. Der
generierte Stomimpuls interferiert somit nicht mit der Messung. Durch einen Impulsgenerator
(Anapulse Stimulator Model 302-T, W-P Instruments, New Haven, USA) wurde ein
rechteckförmiges Signal mit einer Dauer von 25 ms, einer Verzögerung von 10 ms und
einem Intervall von 65 ms erzeugt. Der Impulsgeber steuerte den Verstärker der einen
Stromimpuls von 0.3 nA erzeugte, der dann entlang der Meßelektrode floß. Der
Spannungsabfall, der sich aus dem Produkt von Stromfluß durch die Pipette und
Pipettenwiderstand ergibt, wurde mit einem externen Oszilloskop dargestellt und konnte nun
durch manuellen Abgleich über einen Drehregler am Verstärker aus der Aufzeichnung
eliminiert werden. Gleichzeitig wurde über eine Anzeige am Drehregler der
Pipettenwiderstand abgelesen.
Die Membranpotentialmessung wird durch die Kapazität am Verstärkereingang
beeinträchtigt. Deshalb mußte die Kapazität ebenfalls kompensiert werden. Die Kapazität hat
verschieden Ursachen, z.B. die Kapazität über die Glaswand des Teils der Mikroelektrode
der in die Superfusionslösung taucht, die Streukapazität des übrigen Teils der Mikropipette
oder die Streukapazität des Mikroelektodenhalters. Der Kapazitätsausgleich erfolgte mit
einem speziellen Kreislauf zur Neutralisation der Kapazität und konnte am Verstärker
eingestellt werden. Eine Überkompensation der Kapazität wurde in manchen Fällen zur
Penetration von Zellen genutzt. Der Kontakt der Elektrodenspitze mit einer Zellmembran
konnte durch die auftretende Widerstandsänderung erkannt werden, die als
Spannungsänderung auf dem Oszilloskop beobachtet werden konnte. Die Zellpenetration
erfolgte dann mit Hilfe eines Piezo-Steppers durch schnelle kurze (1 µm Schritte)
Vorwärtsbewegung der Mikropipette. Um die Zellpenetration zu erleichtern wurde zeitweise
ein kurzer hochfrequent oszillierender Stromstoß über die Mikroelektrode appliziert. Das
Membranpotential wurde dann über einen Analog-Digitalwandler (Elektronikwerkstatt der
LMU München) mit Open Source Software (XmAD) auf der Festplatte eines Rechners mit
einer Frequenz von 500 Hz aufgezeichnet. Vor der Messung erfolgte eine Kalibrierung des
Messprogramms.