AUFSTEIGENDE DILATATIONEN - Universität zu Lübeck
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MATERIAL UND METHODEN 41<br />
2.2.9 Cholesterinbestimmung<br />
Das Gesamtcholesterin wurde im Plasma von hypercholesterinämischen Mäusen (ApoE-/-,<br />
LDL-R-/-) nach Standardfutter oder einer fett- und cholesterinreichen Diät und von Wildtyp-<br />
Kontrollen (C57BL/6) bestimmt. Hier<strong>zu</strong> wurde in den Mäusen nach Abschluß des<br />
durchgeführten Versuches die A. carotis freipräpariert. Das Gefäß wurde mit zwei<br />
Baumwollfäden aufgespannt und katheterisiert. Über diesen Zugang wurde die Maus<br />
exsanguiniert. Das entnommene Blutvolumen variierte zwischen 600 - 1000 µl. Die <strong>zu</strong>r<br />
Entnahme verwendete Spritze sowie der kurze Katheterschlauch waren mit 100µl<br />
heparinisierter NaCl befüllt, so dass eine Endkonzentration von 12 – 30 IE / ml Heparin in der<br />
Blutprobe erreicht wurde. Die Probe wurde sofort zentrifugiert (3000 rcf, 15 min,<br />
Microzentrifuge MC-13, Amicon, Witten), das Plasma abgenommen und <strong>zu</strong>r späteren<br />
Cholesterinbestimmung eingefroren (-20 °C).<br />
Die Cholesterinbestimmung erfolgte in Kooperation mit Dr. Dibbelt, Institut für Klinische<br />
Chemie, <strong>Universität</strong> <strong>zu</strong> <strong>Lübeck</strong>. Es wurde ein kommerziell erwerblicher Kit <strong>zu</strong>r<br />
Cholesterinbestimmung verwendet (Cholesterol, Abbott Clinical Chemistry, Ludwigshafen).<br />
Zunächst wurde die Probe mit Cholesterinesterasen versetzt, um Cholesterinester <strong>zu</strong><br />
Cholesterin und freien Fettsäuren <strong>zu</strong> hydrolisieren. Das freie Cholesterin und die<br />
ursprünglich vorhandenen Menge an ungebundenem Cholesterin wird, durch das Enzym<br />
Cholesterinoxidase <strong>zu</strong> Cholest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid oxidiert.<br />
Wasserstoffperoxid reagiert dann mit Hydroxybenzoesäure und 4-Aminophenazon <strong>zu</strong> einem<br />
Chinonimin-Farbstoff. Die Quantifizierung des Chromophors erfolgte photometrisch bei<br />
500nm.<br />
2.2.10 Mikropipetten<br />
Alle verwendeten Mikropipetten wurden aus Borosilikatglaskapillaren mit internem Filament<br />
(Aussendurchmesser 1 mm, Innendurchmesser 0,58 mm, Länge 100 mm) mit einem<br />
Mikropipettenpuller (Model P-20 Sutter Instrument Co., Novato, CA, USA) gezogen. Da die<br />
verwendeten Pipetten unterschiedlichen Anforderungen entsprechen mußten, wurden<br />
verschiedene Programme, die in Tabelle 2.6 <strong>zu</strong>sammengefaßt sind, <strong>zu</strong>m Ziehen der<br />
Kapillaren verwendet.
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