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AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererGesamtkeimzahl, Entkeimungseffekt und mikrobielle LagerstabilitätDie Bestimmung der Gesamtkeimzahl der Milchproben erfolgte mittels Agarplattenmethode nach § 35LMBG (L 01.00-5) und somit entsprechend VDLUFA. Die Milch wurde hierbei (in unterschiedlichenVerdünnungsstufen) im Spatelverfahren auf Plate-Count-Magermilch-Agar (PCM) ausgestrichen, dieAgarplatten dann bei 30 °C für mindestens 72 Stunden inkubiert und anschließend die Kolonie bildendenEinheiten (KbE) pro ml ermittelt bzw. ausgezählt.Wird die Gesamtkeimzahl (KbE/ml) der behandelten Probe (N P ) auf die der rohen Ausgangsmilch (N 0 )bezogen, lässt sich daraus die dezimale Reduktion bzw. der Entkeimungseffekt entsprechend Gleichung(1) ermitteln:Dezimale Reduktion =logN PN 0(1)Die mikrobielle Lagerstabilität wurde durch die Bestimmung der Gesamtkeimzahl der verschiedenenMilchproben nach unterschiedlicher Lagerdauer (bis zu 40 Tage) erfasst. Die Haltbarkeitsgrenze wurdeauf ≥10 6 KbE/ml festgesetzt.Proteolytische und lipolytische CharakterisierungDie Analyse der (direkten) Aktivität [U/ml] der in den jeweiligen Proben vorhandenen Proteasen erfolgtemittels Azocasein (nach Christen&Marshall 1984), das enzymatisch zu farbigen Reaktionsproduktenumgesetzt wird. Die Färbung wurde spektrophotometrisch (Absorption bei 345 nm) erfasstund anhand einer Standardkurve entsprechend umgerechnet. Eine Proteaseaktivität von 1 U/ml entsprichtdabei der Freisetzung an 400 µmol Azotrichlor pro ml Milch (innerhalb von 15 Minuten bei35 °C).Darüber hinaus wurden die während der Lagerung stattfindenden, proteolytischen Veränderungenmittels Flourescamin-Methode (Beeby 1980; Kocak & Zadow 1985) detektiert. Primäre Amine undsomit die proteolytischen Spaltprodukte werden hierbei selektiv an einen Floureszenzfarbstoff gebunden.Die relative Floureszenzintensität (RFI) der Probe (bei λ= 390 nm Anregung und λ = 475 nmEmission) korreliert mit der Menge an darin vorhandenen Proteolyseprodukten bzw. freien Aminogruppen(FA). Die von bakteriellen Proteasen freigesetzten Spaltprodukte unterscheiden sich hinsichtlichihrer Moleküllänge und somit Löslichkeit von denen der originären proteolytischen Milchenzyme(wie Plasmin). Aufgrund dessen kann durch die Verwendung des Lösungsmittels (24%-) Trichloressigsäureeinerseits und die Einstellung des pH-Wertes der Proben auf 4,6 (mit 10%iger Essigsäure)andererseits die Proteolyse ursächlich erfasst werden. Die Menge an proteolytischen Spaltprodukten,die mit einem Fehlgeschmack in der Milch korreliert, liegt bei einer mittels Standardkurve ermitteltenÄquivalentkonzentration (an Tyrosin-Leucyl) von 2 mmol/ml.Die Ermittlung der direkten Lipaseaktivität erfolgte nach Humbert (1997) bzw. über die Zugabe einessynthetischen Substrats (p-Nitrophenylester). Die daraus (bei einer bestimmten Temperatur innerhalbeines definierten Zeitraums) zu p-Nitrophenol umgesetzte Menge wurde nach der Zugabe eines Klärungsreagenzspektrophotometrisch (Absorption bei 412 nm) bestimmt und ist ein direktes Maß fürdie Aktivität der in der Milchprobe vorhandenen bakteriellen und milcheigenen Lipasen. Anhand einerStandardkurve konnte die entsprechende Lipaseaktivität [U/ml] abgeleitet werden, wobei 1 U/ml derFreisetzung von 200 µmol p-Nitrophenol pro ml Probe (in 30 Minuten bei 37 °C) entspricht.Parallel dazu wurden auch die lipolytisch freigesetzten Spaltprodukte bzw. der Gehalt an freien Fettsäuren(FFA) mittels dem titrimetrischen IDF-Standardverfahren (Deeth 1975) bestimmt. Ab einemGehalt von etwa 3 µequiv./ml tritt nach Deeth 1990 ein Fehlgeschmack in der Milch auf.14