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AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererZIEL - Abteilungen Technologie und MikrobiologieName der ForschungsstelleAiF/FEI-FV 15047 NAiF-Vorhaben-Nr.Januar 2007 - Juni 2009BewilligungszeitraumSchlussbericht für den Zeitraum: Januar 2007 - Juni 2009zu dem aus Haushaltsmitteln des BMWA über diegeförderten IGF-ForschungsvorhabenNormalverfahrenFördervariante ZUTECHForschungsthema:Prozessoptimierung zur Herstellung von länger haltbarerFrischmilch (ESL) unter Verwendung von thermischen undMembranverfahrenFreising, 31. August 2009Ort, DatumUnterschrift des Projektleiters2

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererInhaltsverzeichnis1 Forschungsthema .................................................................................................................. 42 Wissenschaftlich-technische und wirtschaftliche Problemstellung ............................................... 42.1 Ausgangssituation ............................................................................................................ 42.2 Motivation für den Forschungsgegenstand .......................................................................... 52.3 Kenntnisstand, Grundausstattung und Vorarbeiten .............................................................. 52.3.1 Kenntnisstand............................................................................................................ 52.3.2 Patentsituation .......................................................................................................... 82.3.3 Vorarbeiten und Ausstattung ...................................................................................... 83 Forschungsziel, Lösungsweg und Ergebnisse............................................................................ 93.1 Forschungsziel............................................................................................................... 93.1.1 Angestrebte Forschungsergebnisse.............................................................................. 93.1.2 Innovativer Beitrag und Bedeutung des Forschungsvorhabens....................................... 93.2 Lösungsweg, Arbeitsschritte und Ressourcen zum Erreichen des Forschungsziels ...............103.2.1 Lösungsweg .............................................................................................................103.2.2 Arbeitsschritte ..........................................................................................................103.2.3 Zeitplan und Ressourcen ...........................................................................................133.3 Erzielte Forschungergebnisse.........................................................................................133.3.1 ZIEL - Abteilung Technologie .....................................................................................133.3.2 ZIEL - Abteilung Mikrobiologie....................................................................................684 Wirtschaftliche Bedeutung des Vorhabens für kmU ..................................................................894.1 Nutzen der Forschungsergebnisse ..................................................................................894.2 Beitrag zur Steigerung der Leistungs- und Wettbewerbsfähigkeit der kmU .........................915 Literaturverzeichnis...............................................................................................................913

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererSchlussbericht zu AiF FV 15047 N1 ForschungsthemaProzessoptimierung zur Herstellung von länger haltbarer Frischmilch (ESL) unter Verwendung vonthermischen und Membranverfahren2 Wissenschaftlich-technische und wirtschaftliche Problemstellung2.1 AusgangssituationIn den vergangenen Jahren hat sich Trinkmilch mit verlängerter Haltbarkeit, die sog. Extended ShelfLife (ESL)-Milch, immer weiter etabliert. Das ESL-Milch-Konzept zeichnet sich insbesondere dadurchaus, dass im Vergleich zu herkömmlich pasteurisierter Milch bei Kühllagerung (≤10°C) eine Haltbarkeitvon einigen Wochen erzielt und darüber hinaus im Gegensatz zu H-Milch ein frischmilchähnlicher Geschmack- auch über den gesamten Haltbarkeitszeitraum hinweg - behalten werden soll. Voraussetzungdafür ist, dass neben dem eigentlichen Herstellprozess auch sämtliche vor- und nachgelagertenEinflussfaktoren wie Rohmilchqualität, Prozesshygiene und Verpackung oder Lager- und Distributionsbedingungendieses Ziel unterstützen.Als Herstellvarianten für ESL-Milch stehen unterschiedliche thermische Verfahren und damit kombinierteMembrantrennprozesse zur Auswahl. In Deutschland wird bisher zur Produktion von ESL-Milchüberwiegend die Hocherhitzung (HE) eingesetzt, wobei jedoch verschiedene Erhitzungsarten und -bedingungen Anwendung finden. Welche erwünschten (wie Inaktivierung von Mikroorganismen undEnzymen) oder unerwünschten (bspw. sensorischen) hitzeinduzierten Produktveränderungen bei derErhitzung im ESL-Bereich auch in Abhängigkeit von den jeweiligen ϑ/t-Bedingungen auftreten ist bislangnur unzureichend bekannt. Darüber hinaus bestehen nur unzureichende Kenntnisse darüber,welche Faktoren die Haltbarkeit der HE-Milch beeinflussen oder begrenzen.In den letzten Jahren wurden zunehmend auch nicht-thermische Verfahren wie die Mikrofiltration(MF) zur Haltbarkeitsverlängerung von Milch eingesetzt. Die Keimreduktion erfolgt hierbei vorwiegenddurch eine mechanische Abtrennung der Mikroorganismen mittels keramischer Membranen. Die Zielsetzungder Entkeimungsfiltration, eine möglichst effiziente und gleichzeitig selektive Mikroorganismenabtrennung(auch über längere Filtrationsdauern hinweg), ist dabei als konträr einzustufen. WelcheFaktoren sich auf das Filtrationsergebnis auswirken, ist – trotz industrieller Applikation – nichtausreichend eruiert. Da bei den zur Entkeimungsfiltration üblicherweise eingesetzten Porengrößen(0,8-1,4 µm) jedoch keine Sterilfiltration der Milch erfolgt, wird die MF zur sicheren Inaktivierung pathogenerKeime mit einer nachgeschalteten Pasteurisation und zur Gewährleistung der verlängertenHaltbarkeit (Kiesner 2006) mit einer Hocherhitzung der vorgängig abgetrennten Rahmfraktion kombiniert.Ob jedoch die mit dem ESL-Konzept verbundenen Ziele tatsächlich erreicht werden, hängt vom jeweiligenBetrachtungs- bzw. Lagerungszeitpunkt und von verschiedenen technischen Aspekten ab (Hülsen& Rademacher 2005b). Neben den Herstellverfahren und daraus resultierenden Produktveränderungenkönnten diesbezüglich auch die Verpackungsarten von Relevanz sein. Hinsichtlich des Einflussesvor- und nachgelagerter Faktoren ist zudem die (mikrobiologische und enzymatische) Beschaffenheitder Rohmilch sowie die jeweilige Lagertemperatur zu berücksichtigen.Insgesamt sind also weder Ausmaß oder Zusammenwirken all dieser Faktoren noch die Grenzeffekteund Einflussgrößen bekannt, die bei ESL-Milch als Qualitätskriterien herangezogen werden bzw. objektivzu einer Haltbarkeitsverlängerung führen können.4

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Scherer2.2 Motivation für den ForschungsgegenstandESL-Milch stellt ein spezielles Premium-Marktsegment dar, an das seitens Handel und Verbraucherhohe Erwartungen gerichtet werden. Es gilt daher, diesen Ansprüchen konsistent gerecht zu werden,wozu derzeit die Beurteilungsbasis fehlt. Weder Qualitäts- noch die Haltbarkeitskriterien für ESL-Produkte sind bislang eindeutig definiert. Wie geschildert, finden bei der Herstellung von ESL-Milch inder industriellen Praxis verschiedene Prozessvarianten Anwendung. Daraus resultieren Produkte mitunterschiedlichen Eigenschaften. Es ist allerdings fraglich, ob es sich bei den bekannten Verfahrensführungenbereits um optimierte Herstellprozesse handelt, mit deren Hilfe es gelingt, einerseits diemaximalen Effekte hinsichtlich Haltbarkeit und anderseits eine Minimierung unerwünschter Produktveränderungenzu erzielen. Eine Prozess- und Produktoptimierung erfordert zunächst die Ermittlungwert- und haltbarkeitsrelevanter Effekte und Einflussgrößen aus Sicht der empfundenen Qualität sowiefaktischer Kriterien unter Berücksichtigung von Herstelloption und vor- sowie nachgelagerten Faktoren.Daher ist aufzuklären, welche Faktoren sich auf spezifische Produkteigenschaften der „frischen“und gelagerten ESL-Milch auswirken und welche Verderbsreaktionen bzw. -vorgänge jeweils für eineBegrenzung der Haltbarkeit verantwortlich sind.2.3 Kenntnisstand, Grundausstattung und Vorarbeiten2.3.1 KenntnisstandHinsichtlich der genannten Verfahrenskonzepte zur Herstellung von ESL-Milch stellt sich der Kenntnisstandwie folgt dar:Hocherhitzung (HE)Bei der Herstellung von hocherhitzten ESL-Produkten wird die Milch entweder direkt mittels Dampfinfusionoder -injektion bzw. indirekt in Wärmetauschern für sehr kurze Heißhaltezeiten (2-4 s) aufTemperaturen von 125-127°C (bzw. optional 0,5 s/135°C) erhitzt und anschließend einer sofortigen(Entspannungs-) Kühlung unterzogen. Die dabei auftretenden hitzeinduzierten Veränderungen lassensich teilweise aus Arbeiten von Biewendt (1994a), Burton (1984), Datta et al. (2002) oder Horak(1980) ableiten und wurden bereits verschiedentlich untersucht (Biewendt 1994b; Fredsted et al.1996; Hülsen & Rademacher 2005a). Diese Untersuchungen zielten allerdings weitestgehend auf geeigneteNachweissubstanzen für eine HE ab. Es fehlen jedoch detaillierte Kenntnisse darüber, in wieweit sich die Variation von Erhitzungsbedingungen und -arten gerade im ESL-Bereich insbesondereauf verbraucherrelevante Produkt- sowie Lagereigenschaften der Milch auswirkt. Diesbezüglich sindsowohl mikrobiologische, enzymatische, chemisch-physikalische und sensorische Veränderungen währendder Herstellung und Lagerung zu berücksichtigen. Eine gezielte Prozess- und Produktoptimierungerfordert es demnach, neben den gängigen Erhitzungsindikatoren auch die haltbarkeitsrelevantenbzw. -begrenzenden Kriterien und Effekte zu eruieren.Die Angaben zur erreichbaren Haltbarkeit von hocherhitzter ESL-Milch variieren von 15 (Dyck 1999)bis hin zu 45 Tagen (Hoffman & Buchheim 2000; Hülsen & Rademacher 2005). Nicht dokumentiertsind jedoch die Produktveränderungen, welche im einzelnen Fall als Abbruchkriterien zum Tragenkamen. Verschiedene Autoren geben dazu Hinweise, jedoch nicht in zusammenhängender Weise undohne eindeutige Definition (Bishop & White 1985; Johns 1969; McMeekin & Ross 1996; White 1993;Wilbey 1997).Nach Blake et al. (1995) und Mayr et al. (2004) sind in kühlgelagerter HE-Milch vor allem hitzeresistente,aerobe Sporen und -bildner sowie insbesondere verschiedene Bacillus-Arten zu finden. Es feh-5

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererlen allerdings systematische Studien über die Korrelation zwischen Haltbarkeit von HE-ESL-Milch undder Zusammensetzung bzw. Entwicklung der Verderbsflora über den Lagerzeitraum hinweg. Eine detaillierteCharakterisierung von Rohmilch- und Verderbsflora zur Ermittlung von Zusammenhängenzwischen der Haltbarkeit und der Kombination einzelner Prozessparameter und/oder Produktionsverfahrenist allerdings gerade im Hinblick auf die Empfehlung und Festlegung eines realistischen undangemessenen MHDs sowie eine möglichst gute Kombination aus langer Haltbarkeit, hoher Sicherheitfür den Verbraucher und organoleptischer Wertigkeit unabdingbar.Eine enzymatische Charakterisierung von hocherhitzter Milch ergab nach Blake et al. (1995) keineproteolytische Aktivität. Dies steht im Widerspruch dazu, dass in UHT-Milch hitzestabile, bakterielleund zum Teil auch milcheigene Proteasen nachgewiesen werden konnten (Datta & Deeth 2003; Garcia-Riscoet al. 1999; Lopezfandino et al. 1993; Sorhaug & Stepaniak 1997; Stepaniak 2004). Blake etal. (1995) konnten zudem keine lipolytischen Veränderungen während der Lagerung von HE-ESL-Milch feststellen. Choi & Jeon (1993) oder auch Schmidt & Renner (1978) fanden dagegen heraus,dass sogar in UHT-Produkten mit zunehmender Lagerdauer der Gehalt und die Freisetzung an freienFettsäuren ansteigt, was auf eine Aktivität lipolytischer Enzyme schließen lässt.Diese biochemischen Faktoren müssen darüber hinaus in Zusammenhang mit möglicherweise im Verlaufder Lagerung auftretenden chemischen (Oxidations- und Hydrolysevorgänge) und physikalischen(z. B. Aufrahmen) Veränderungen betrachtet werden, um konkrete Aussagen zu haltbarkeitsbegrenzendenKriterien und Effekten bei ESL-Milch treffen zu können.Mikrofiltration (MF)Eine Entkeimungsfiltration, die üblicherweise bei Temperaturen von 50-55°C und Porengrößen von1,4 µm durchgeführt wird, ermöglicht bekanntermaßen die Abtrennung eines Großteils (ca. 3-4 log)der in der Magermilch enthaltenen Mikroorganismen und somit eine Haltbarkeitsverlängerung(Kosikowski & Mistry 1990; Maubois 1991; Pedersen 1992). Jedoch existieren widersprüchliche Aussagendarüber, welche letztendlich den Entkeimungseffekt und damit den mikrobiellen Status des Filtratesbeeinflussen (Boor 2001). Neben Membrancharakteristika sind diesbezüglich auch produktspezifische(Anzahl, Morphologie der Mikroorganismen) und prozesstechnische (Temperatur ϑ, TransmembrandruckΔp TM , Wandschubspannung τ W , Zeit) Faktoren zu nennen. Saboya & Maubois (2000)fanden heraus, dass sich die dezimale Keimreduktion durch eine Verringerung von Porengröße oder -größenverteilung steigern. Auch Eckner & Zottola (1990) gehen davon aus, dass die Permeation vorwiegendvon den Retentionseigenschaften der verwendeten Membran und weniger von den morphologischenEigenschaften der Mikroorganismen beeinflusst wird. Nach Bindith et al. (1996), Madec etal. (1992) und Trouve et al. (1991) hängt die Retention der Keime dagegen insbesondere von derenArt bzw. Zellvolumen ab. Eine Variation der MF-Temperatur zwischen 30 und 50°C hat nach Eckner &Zottola (1990) keinen Einfluss auf den Entkeimungserfolg, wohingegen nach Madec et al. (1992) mitErhöhung der Temperatur von 35 auf 50°C die Retention von Listeria und Salmonella verbessert werdenkonnte. Auch Beolchini et al. (2005) stellten bereits Untersuchungen zum Einfluss von MF-Temperatur und transmembraner Druckdifferenz bei der Filtration von Ziegen- und Schafsmilch an,die sich jedoch weitgehend auf Permeatflux und dezimale Reduktion beschränken. Olesen & Jensen(1989) fanden heraus, dass MF-Druck und Konzentrierungsgrad zwar keine Auswirkung auf den Gehaltan Bacillus cereus im Endprodukt haben, wohl aber auf den Kaseingehalt. Nach Pafylias et al.(1996) und Pedersen (1992) lässt sich eine Verringerung der Kaseinkonzentration im Permeat auf dieBildung einer Deckschichtschicht zurückführen, deren Minimierung auch aus dieser Sicht größte Bedeutunghat. Nach Ripperger & Altmann (2002) oder Kersten (2000) hängt die Deckschichtbildung6

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererkönnen auch andere Modalitäten wie die Verpackungsoption von Bedeutung sein (Mestdagh et al.2005; Rademacher & Hülsen 2005b; Rysstad & Kolstad 2006; Simon & Hansen 2001; Vassila et al.2004). Fink (1984) hat beispielsweise festgestellt, dass das Vorhandensein von der Sauerstoff bzw.Kopfraum in der Verpackung den unerwünschten Kochgeschmack von UHT-Milch durch Reduktionvon SH-Gruppen im Laufe der Lagerung verringert. Ob und inwieweit sich diese Erkenntnisse auchauf ESL-Milch übertragen lassen, ist bislang nicht eruiert.Demnach kann festgestellt werden, dass sich aus den bisherigen Untersuchungen und Erkenntnissenweder der Einfluss von Verfahrensoption, -führung und -parametern noch von dem Herstellungsprozessvor- und nachgelagerten Faktoren auf die Produkteigenschaften und haltbarkeitsrelevanten Veränderungenvon ESL-Milch ableiten lassen.2.3.2 PatentsituationHinsichtlich HE sind bei vielen Herstellern Verfahren etabliert, die von keinen Schutzrechten berührtsind bzw. die mit dem Kauf einer Erhitzungsanlage genutzt werden können. Auch zur Entkeimungsfiltrationvon Milch existieren wie bei der HE nur Schutzrechte, deren Nutzungsrechte entweder über dieModulhersteller oder über Anlagenbauunternehmen erworben werden. Zudem ist festzustellen, dassdieses Vorhaben keine spezifischen, eng ausgewählten Bedingungen untersucht, sondern ein breitesFeld aus thermischen und Filtrationsbedingungen und zudem den Fokus auf vor- und nachgelagerteAspekte legt, so dass zur Umsetzung der Erkenntnisse kaum Einschränkungen, sondern eher Ausweitungendes Arbeitsfeldes zu erwarten sind.2.3.3 Vorarbeiten und AusstattungDas Vorhaben wird von zwei Forschungsstellen getragen: Abteilung Technologie des ZIEL (ZIEL T)sowie Abteilung Mikrobiologie (ZIEL M). Vorarbeiten, Kompetenzen und Infrastruktur für das Vorhabensind an beiden Forschungsstellen langjährig geleistet worden bzw. uneingeschränkt vorhanden.Beide Institutionen sind jeweils durch entsprechende Vorläufervorhaben und durch wissenschaftlichePublikationen im Bereich thermischer, membrantechnischer bzw. mikrobiologischer Kompetenzenausgewiesen.ZIEL T hat beispielsweise sowohl die thermische Verfahrenstechnik wie die Membrantrenntechnik inkürzlich abgeschlossenen Vorhaben eingesetzt. Daraus lassen sich auch für das ESL-Projekt wertvolleErkenntnisse ableiten. Die bestehenden Iso-Effekt-Linien (Kessler 1997) der thermischen Behandlunggrenzen den HE-ESL-Bereich hinsichtlich der minimalen und maximalen ϑ/t-Bedingungen ab. Bezüglichder Entkeimungsfiltration und insbesondere im Hinblick auf die Selektivität der Mikroorganismenabtrennungbei unterschiedlichen Porengrößengeben Vorarbeiten beispielsweise Aufschlussdarüber, dass, wie die nebenstehende Abbildung2.3.3 zeigt, erst ab einer nominalenTrenngrenze von 1,4 µm eine vollständigePermeation der vergleichs-weise kleinenMolkenproteine erfolgt. Der Einsatz vonMembranen mit geringeren cut-offs würdedemnach zwar möglicherweise zu einerSteigerung des Entkeimungseffektes, abergleichzeitig zu einer erhöhten Retention anderernominale Porengröße [µm]Milchbestandteile, insbesondere der Proteine,Abb. 2.3.3: Molkenproteinpermeation bei der MFmit unterschiedlichen Porengrößen8Permeation [%]100806040200α-LaColβ-LgColMF:Magermilchϑ = 50 °C0,1 0,16 0,2 0,8 1,4

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererführen. Auch das im September 2008 erfolgreich abgeschlossene membrantrenntechnische AiF-Vorhaben FV 14740 N zur Eruierung von Milchinhaltstoff-Membran-Wechselwirkungen hat einen infrastrukturellenund teilweise methodischen Bezug zu diesem Vorhaben.ZIEL M wurde soeben für die Leistungen auf dem Gebiet der mikrobiologischen Keimdifferenzierungmittels FTIR-Spektroskopie mit dem Otto von Guericke-Forschungspreis ausgezeichnet. Diese Techniksoll in diesem Vorhaben für die Identifizierung der gewonnenen Isolate eingesetzt werden. ZweiSpektrometer und Referenzdatenbanken hierfür sind bereits vorhanden. Ferner verfügt ZIEL M überlangjährige Erfahrung in der Identifizierung von Mikroorganismen mit sowohl konventionellen als auchmolekularbiologischen Techniken und über umfangreiche Kenntnis der Keimfloren im Lebensmittelbereich.3 Forschungsziel, Lösungsweg und Ergebnisse3.1 ForschungszielForschungsziel ist, über eine Verknüpfung von mikrobiologischer, enzymatischer, chemischphysikalischerund sensorischer Analytik die thermischen und/oder membrantrenntechnischen Auswirkungenauf die Qualität und Stabilität von ESL-Milch zu eruieren. Damit soll die Möglichkeit geschaffenwerden, für gegebene Prozessparameter die resultierende Milchqualität vorhersagen unddiese durch gezielte Prozessauswahl und -führung, das Zusammenspiel von Verfahrensoptionen (HE,MF/KZE) und Rohmilchbeschaffenheit sowie Abfüll- und Lagerbedingungen (Verpackungsart, Temperatur)optimieren zu können.3.1.1 Angestrebte ForschungsergebnisseDurch gezielte Variation von Prozessart, -führung und -bedingungen werden Herstelloptionen für ESL-Milch geschaffen, die zur Maximierung der Haltbarkeit bei minimalen Produktveränderungen führen.Es werden analytisch erfassbare, für bestimmte Haltbarkeitsziele und -zeiträume (z.B. „ESL 30“-Tage)relevante bzw. begrenzende Produktveränderungen ermittelt und so ausgewertet, dass eine Optimierungvon Prozessbedingungen ableitbar und eine Korrelation von Prozess- bzw. Produktvariablenmöglich ist.3.1.2 Innovativer Beitrag der angestrebten ForschungsergebnisseDie unterschiedlichen ESL-Technologien fanden bisher ohne ausreichende Kenntnisse zum Einflussverfahrenstechnischer Optionen und/oder vor- und nachgelagerter Faktoren auf Produkteigenschaftenund -veränderungen Anwendung. Durch das Erfassen von Zusammenhängen und Gesetzmäßigkeitenzu den herstellungs- und lagerungsbedingten Veränderungen wird eine Weiterentwicklung der bestehendenESL-Verfahren und Produkte. Aus diesem Vorhaben erwächst demnach die Möglichkeit, mitdem für das jeweilige Unternehmenskonzept bestgeeigneten Herstellverfahren wert- und qualitätsoptimierteESL-Milchen mit vorhersagbaren, definierten Eigenschaften (z.B. organoleptische und nutritiveQualität) und Haltbarkeiten zu erzeugen.9

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Scherer3.2 Lösungsweg, Arbeitsschritte und Ressourcen zum Erreichen des Forschungsziels3.2.1 LösungswegIn Abbildung 3.2.1 ist zum besseren Überblick der experimentelle Gesamtplan schematisch dargestellt.Option 1Option 2RohmilchZur Optimierung der verschiedenen Ver-abfahrensoptionen an sich (ZIEL T) sollenMFPASTdie Prozessparameter von HE bzw.HE+ HEMF/PAST bei differenzierenden Rohmilch-PASTMFqualitäten variiert werden. Die Herstellversuchesollen sowohl mit frischer alsESL-Milchauch vorgestapelter/thermisierter Rohmilchdurchgeführt werden, die vorherUntersuchung derUntersuchung derhinsichtlich ihrer mikrobiologisch-physio-ProduktveränderungenProduktveränderungenwährend der Herstellungwährend der Lagerunglogischen Eigenschaften (Gesamtkeimzahl,enzymatische Beschaffenheit sowie ggf.Abb. 3.2.1: Lösungsweg und HerstellvariantenAnzahl bestimmter haltbarkeitsrelevanterKeimgruppen) genau charakterisiert wurde. Um eine definierte „worst-case“-Betrachtung zu ermöglichensoll optional eine gezielte Inokulation von möglicherweise haltbarkeitsrelevanten Keimgruppen inpraktisch bekannten Höchstdichten erfolgen.Danach sollen die bereits angepassten Herstellvarianten für ESL-Milch durch Einsatz von Rohmilchdesselben Tanks direkt miteinander verglichen werden.Die unterschiedlich thermisch bzw. membrantrenntechnisch behandelten Milchproben sollen jeweilssowohl gleich abgefüllt (unter einer Laminar-Flow-Box) und verpackt (in sterile Glasflaschen ohneKopfraum) als auch bei gleichen Bedingungen bzw. Temperaturen gelagert werden. Desweiteren sollenLagerbedingungen bzw. -temperaturen und in Einzelversuchen auch Verpackungsmodalitäten(Kopfraum, Material) variiert werden, um die Auswirkungen dieser nachgelagerten Größen auf Haltbarkeitund Produktqualität zu erfassen.Zur Korrelation von Prozess- und Produktvariablen sollen die Proben sowohl direkt im Anschluss andie Herstellungsversuche hinsichtlich ihrer mikrobiologischen, enzymatischen, chemisch-physikalischenund sensorischen Beschaffenheit charakterisiert werden und damit die verfahrensbedingtenUnterschiede in den Produkteigenschaften erfasst werden. Als Referenz dient dabei herkömmlichkurzzeiterhitzte Frischmilch. Zur Ermittlung der haltbarkeitsrelevanten und -begrenzenden Kriterienund Effekte sollen die während der Lagerung bzw. nach unterschiedlicher Lagerdauer auftretendenProduktveränderungen der verschiedenen Milchproben analytisch ermittelt und miteinander verglichenwerden. Die mikrobiologischen Charakterisierungen werden dabei von ZIEL M, die enzymatischen,chemischen, physikalischen Untersuchungen von ZIEL T und die sensorischen Tests teilweisegemeinsam durchgeführt.3.2.2 ArbeitsschritteAP I Planung, Vorarbeiten, AnalytikAP I umfasst die organisatorischen und technischen Vorarbeiten für die folgenden AP II-VI sowie dasEinarbeiten von Personal. Als Meilenstein von AP I soll das experimentelle und anlagentechnischeVorgehen einschließlich der umfangreichen Analytik bei ZIEL T festliegen und bei ZIEL M die methodischeBasis zur Keimidentifizierung auf das Vorhaben ausgerichtet sein.10

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererAP II Optimierung der ProzessoptionenAP II a Prozessoptimierung MFIm Rahmen dieses Arbeitspaketes soll zunächst der (cross-flow) MF-Prozess zur Entkeimung vonMilch optimiert werden, indem die transmembrane Druckdifferenz (Δp TM =0,05-1 bar), die Wandschubspannungbzw. Strömungsgeschwindigkeit (τ W =10-170 Pa) sowie die Filtertemperatur (ϑ=10-70°C) und Membrancharakteristika (Porengröße, Struktur, Hersteller) variiert werden. Auch über längereStandzeiten hinweg (bis zu 12 Stunden) soll dabei (im Umlauf- bzw. Durchlaufverfahren) Effizienzund Selektivität der Keimreduktion erfasst werden. Im Hinblick auf Deckschichtbildung bzw.(Bio-)Fouling soll die Zusammensetzung des Milchpermeats (Gehalt und Gleichgewicht an Molkenproteinenund Caseinen) sowie dessen mikrobielle (Keimzahl und -art) und enzymatische (originäre undbakterielle Proteasen, Lipasen) Beschaffenheit untersucht werden. Die MF-Versuche werden zunächstmit der typischen Mischflora der Milch bei unterschiedlichem Rohmilchstatus durchgeführt und die Ergebnisseggf. anhand spezifisch wichtiger möglicherweise haltbarkeitsrelevanter Teststämme bzw.durch Challenge-Tests weiter differenziert. Als Endresultat sollen die für eine Entkeimungsfiltrationoptimalen Bedingungen bekannt und spezifiziert sein, die dann als Basis für AP II a dienen.AP II b Kombinierte Verfahrensführung MF und PASTDieses Arbeitspaket umfasst die Prozessoptimierung des kombinierten Einsatz von MF und thermischerBehandlung. Vorwiegend sollen hierbei die bereits in AP II a vorgängig ermittelten, für eineEntkeimungsfiltration von Magermilch optimalen Bedingungen eingesetzt werden. Das keimarmePermeat soll anschließend mit der separat hocherhitzten (127°C/4 s) Rahmfraktion vermischt und einerzusätzlichen nachgeschalteten thermischen Behandlung (Pasteurisation; PAST) unterzogen werden.Neben der Variation der Erhitzungsbedingungen (herkömmliche Pasteurisation bis HE) soll dabei,wie in Abb. 3.2.1 als Option 2 a und b dargestellt, auch die Reihenfolge der Prozessschritte verändertbzw. die PAST der MF vor- und nachgeschaltet werden. Die aus den verschiedenen Verfahrensvariantenresultierenden Produkte sollen hinsichtlich wertgebender Eigenschaften und lagerungsbedingterVeränderungen charakterisiert werden. Als Endergebnis soll eine hinsichtlich Prozessparametern und -schrittreihenfolge optimierte Verfahrungsführung zur Herstellung qualitativ hochwertiger, mikrofiltrierter/pasteurisierterESL-Milch implementiert sein.AP II c Prozessoptimierung HEDurch Variation der Temperatur/Zeit-Kombinationen im Bereich der HE (120–127°C/2–4 s) soll ermitteltwerden, welche Erhitzungsbedingungen hinsichtlich Inaktivierung von Mikroorganismen (insbesondereSporen und -bildner) sowie originären und bakteriellen Enzymen (Lipasen, Proteasen) bzw.einer Verlängerung der Haltbarkeit die bestmöglichen Effekte erzielen bei gleichzeitiger Minimierungunerwünschter sensorischer und nutritiver Produktveränderungen. Die Charakterisierung der Milchhinsichtlich dieser verbraucherrelevanten Kriterien soll parallel zu den herstellungsbedingten thermisch-induziertenVeränderungen (Gehalt an Laktulose und nativen Molkenproteinen) erfolgen. Auchdiese Versuchsreihen sollen mit Rohmilch unterschiedlicher Qualität durchgeführt werden. Als Meilensteinsollen aus den qualitäts- bzw. haltbarkeitsrelevanten Merkmale von HE-ESL-Milch die jeweiligoptimalen konzeptrelevanten Prozessparameter abgeleitet werden können.AP III Analytische Erfassung herstellungsbedingter ProduktveränderungenZiel ist, die aus den unterschiedlichen Herstellungsprozessen resultierenden erwünschten (Keim- undEnzyminaktivierung) und unerwünschten (thermisch-induzierte Umlagerungen, Sensorik) Produktveränderungenanalytisch zu erfassen und entsprechend auszuwerten. Die Erfassung wertgebender Pro-11

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererAP VI WissenstransferDieses Arbeitspaket umfasst alle mit dem Forschungsprojekt verbundenen Tätigkeiten zur Durchführungvon Projektpräsentationen und Vorträgen sowie die Dokumentation der erzielten Ergebnisse einschließlichihrer Veröffentlichung, Abfassung von Zwischenberichten und direkte Information der Projektausschussmitglieder.3.2.3 Zeitplan und RessourcenEs ergeben sich folgende zeitlich aufeinander abgestimmte Arbeitsschritte:1. Jahr 2. Jahr 3. JahrArbeitspaket Monat 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30AP IAP II aProjektplanungImplementierung der AnalytikProzessoptimierung MFZIELTZIELMAP II bKombiverfahren MF/PASTAP II cProzessoptimierung HEAP IIIAP IVAP VHerstellungsbedingte ProduktveränderungenHaltbarkeitsrelevante Produktveränderungen;Einfluss vor- undnachgelagerter FaktorenMikrobiologische CharakterisierungAP VIWissenstransferDer für das Bearbeiten erforderliche Personaleinsatz umfasst bei ZIEL T eine(n) Wissenschaftler(in)für AP I-IV+VI, eine(n) FH-Angestellte(n) für AP II-IV, eine(n) technische(n) Angestellte(n) für AP II-IV sowie eine studentische Hilfskraft (9 h/Woche). Bei ZIEL M werden zur Durchführung von AP I, Vund VI ein(e) Wissenschaftler(in) benötigt.Die ursprünglich geplante Projektlaufzeit (24 Monate vom 01.01.2007 bis zum 31.12.2008) wurdeaufgrund einer unvorhersehbar höheren Versuchsanzahl (insbesondere im Bereich der MF) kostenneutralum weitere 6 Monate (bis zum 30.06.2009) verlängert.3.3 Erzielte Forschungsergebnisse3.3.1 ZIEL – Abteilung TechnologieArbeitspaket I: Projektplanung, Implementierung der AnalytikDie im Rahmen von AP I durchgeführten Versuchsreihen dienten der Festlegung und Verfestigung derVersuchsabläufe und Analysenmethoden. Die ausgewählten Methoden entsprechen meist internationalanerkannten Standardanalysen (z. B. nach IDF). Folgende Vorgehensweisen zur Charakterisierungvon (mikrobiologischen, enzymatischen, chemisch-physikalischen sowie sensorischen) herstellungsundlagerungsbedingten Produktveränderungen bei ESL-Milch wurden im ersten Projektabschnitt implementiert:13

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererGesamtkeimzahl, Entkeimungseffekt und mikrobielle LagerstabilitätDie Bestimmung der Gesamtkeimzahl der Milchproben erfolgte mittels Agarplattenmethode nach § 35LMBG (L 01.00-5) und somit entsprechend VDLUFA. Die Milch wurde hierbei (in unterschiedlichenVerdünnungsstufen) im Spatelverfahren auf Plate-Count-Magermilch-Agar (PCM) ausgestrichen, dieAgarplatten dann bei 30 °C für mindestens 72 Stunden inkubiert und anschließend die Kolonie bildendenEinheiten (KbE) pro ml ermittelt bzw. ausgezählt.Wird die Gesamtkeimzahl (KbE/ml) der behandelten Probe (N P ) auf die der rohen Ausgangsmilch (N 0 )bezogen, lässt sich daraus die dezimale Reduktion bzw. der Entkeimungseffekt entsprechend Gleichung(1) ermitteln:Dezimale Reduktion =logN PN 0(1)Die mikrobielle Lagerstabilität wurde durch die Bestimmung der Gesamtkeimzahl der verschiedenenMilchproben nach unterschiedlicher Lagerdauer (bis zu 40 Tage) erfasst. Die Haltbarkeitsgrenze wurdeauf ≥10 6 KbE/ml festgesetzt.Proteolytische und lipolytische CharakterisierungDie Analyse der (direkten) Aktivität [U/ml] der in den jeweiligen Proben vorhandenen Proteasen erfolgtemittels Azocasein (nach Christen&Marshall 1984), das enzymatisch zu farbigen Reaktionsproduktenumgesetzt wird. Die Färbung wurde spektrophotometrisch (Absorption bei 345 nm) erfasstund anhand einer Standardkurve entsprechend umgerechnet. Eine Proteaseaktivität von 1 U/ml entsprichtdabei der Freisetzung an 400 µmol Azotrichlor pro ml Milch (innerhalb von 15 Minuten bei35 °C).Darüber hinaus wurden die während der Lagerung stattfindenden, proteolytischen Veränderungenmittels Flourescamin-Methode (Beeby 1980; Kocak & Zadow 1985) detektiert. Primäre Amine undsomit die proteolytischen Spaltprodukte werden hierbei selektiv an einen Floureszenzfarbstoff gebunden.Die relative Floureszenzintensität (RFI) der Probe (bei λ= 390 nm Anregung und λ = 475 nmEmission) korreliert mit der Menge an darin vorhandenen Proteolyseprodukten bzw. freien Aminogruppen(FA). Die von bakteriellen Proteasen freigesetzten Spaltprodukte unterscheiden sich hinsichtlichihrer Moleküllänge und somit Löslichkeit von denen der originären proteolytischen Milchenzyme(wie Plasmin). Aufgrund dessen kann durch die Verwendung des Lösungsmittels (24%-) Trichloressigsäureeinerseits und die Einstellung des pH-Wertes der Proben auf 4,6 (mit 10%iger Essigsäure)andererseits die Proteolyse ursächlich erfasst werden. Die Menge an proteolytischen Spaltprodukten,die mit einem Fehlgeschmack in der Milch korreliert, liegt bei einer mittels Standardkurve ermitteltenÄquivalentkonzentration (an Tyrosin-Leucyl) von 2 mmol/ml.Die Ermittlung der direkten Lipaseaktivität erfolgte nach Humbert (1997) bzw. über die Zugabe einessynthetischen Substrats (p-Nitrophenylester). Die daraus (bei einer bestimmten Temperatur innerhalbeines definierten Zeitraums) zu p-Nitrophenol umgesetzte Menge wurde nach der Zugabe eines Klärungsreagenzspektrophotometrisch (Absorption bei 412 nm) bestimmt und ist ein direktes Maß fürdie Aktivität der in der Milchprobe vorhandenen bakteriellen und milcheigenen Lipasen. Anhand einerStandardkurve konnte die entsprechende Lipaseaktivität [U/ml] abgeleitet werden, wobei 1 U/ml derFreisetzung von 200 µmol p-Nitrophenol pro ml Probe (in 30 Minuten bei 37 °C) entspricht.Parallel dazu wurden auch die lipolytisch freigesetzten Spaltprodukte bzw. der Gehalt an freien Fettsäuren(FFA) mittels dem titrimetrischen IDF-Standardverfahren (Deeth 1975) bestimmt. Ab einemGehalt von etwa 3 µequiv./ml tritt nach Deeth 1990 ein Fehlgeschmack in der Milch auf.14

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererChemisch-physikalische VeränderungenUm die unterschiedlichen Verfahrensoptionen anhand thermisch induzierter, prozessbedingter Veränderungeneinzustufen, wurden die ESL-Milchproben auf gängige Hitzeindikatoren untersucht. Hierfürwurden insbesondere die durch RP-HPLC ermittelten Gehalte an nativem α-Laktalbumin und β-Laktoglobulinsowie Laktulose herangezogen.Zur Ermittlung weiterer herstellungs- und lagerungsbedingter Produktveränderungen wurde der Gehaltan freien Sulfhydryl (SH)-Gruppen, der nach Fink (1984) mit dem Kochgeschmack der Milch korreliert,mittels der allgemein üblichen Ellmans-Methode bestimmt (Ellmann 1959). DTNB (5,5’-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure)reagiert hierbei mit dem nachzuweisenden Thiol zu einem gelb gefärbtenFarbkomplex mit einem Absorptionsmaximum von 412 nm.Die bei ESL-Milch herstellungs- und lagerungsbedingt auftretenden Vitaminverluste an Thiamin, Pyridoxin,Cyanocobalamin und Folsäure wurden entsprechend der DIN Normen mittels mikrobiologischenAssays (VitaFast ® der Fa. R-Biopharm) eruiert.Zum Nachweis der Lipidoxidation wurde nach King (1962) Thiobarbitursäure (TBA) verwendet. DieKomplexbildung von TBA mit (Malon-)Aldehyden wurde nach 60-minütiger Inkubation bei 60 °Cspektrophotometrisch nachgewiesen (Absorption bei 532 nm). Der mit einer geschmacklichen Beeinträchtigungeinhergehende Absorptionswert an TBA-reaktiven Substanzen ist bei 0,08 einzustufen.Sensorik-TestsZur sensorischen Bewertung der ESL-Milchproben wurden Dreieckstests mit einem Testpanel aus jeweilsmind. fünf (geschulten) Personen durchgeführt. Dabei sollte aus drei Proben die eine geschmacklichabweichende ermittelt werden. Als Referenz wurde herkömmlich pasteurisierte Frischmilchherangezogen. Anschließend erfolgte eine statistische Auswertung der Testergebnisse (z.B.nach Kühlmeyer 2001). Evtl. auftretende Fehlgeschmacksausprägungen wurden zudem mittels einerbeschreibenden Prüfung bzw. über die numerische Einordnung der Ausprägung spezifischer Geschmackskomponentenerfasst.Die Ermittlung dieser spezifischen Produktcharakteristika wurden sowohl bei der rohen Ausgangsmilch,den frisch verarbeiteten als auch bei (unterschiedlich) gelagerten ESL-Proben durchgeführt.AP II a: EntkeimungsfiltrationIm Rahmen des AP II a wurden die prozesstechnischen (Anlagenkonzeption, Membrancharakteristika,Filtrationsbedingungen) und produktspezifischen (Keimzahl und -art) Einflussfaktoren auf das Filtrationsergebniseruiert und somit die Entkeimungsfiltration von Milch an sich optimiert.Versuchsaufbau und AnalytikFür die Filtrationsversuche wurde eine MF-Anlage im Technikumsmaßstab (7P19-40L der Fa. APV; vgl.Abb. 3.3- 1) eingesetzt, die zunächst im Uniform Transmembrane Pressure (UTP)-Prinzip betriebenund im weiteren Projektverlauf (permeatseitig) modifiziert wurde, um auch Filtrationen im Standard-Crossflow-Modus zu ermöglichen. Je nach Anlagenkonzeption wurden hierfür verschiedene MF-Module (mit bzw. ohne Hüllrohre) mit jeweils sieben Röhrenmembranen (Multi-Kanalelemente) eingesetzt.Die keramischen Membranen unterschieden sich dabei hinsichtlich Typ/Aufbau (Standard- bzw.Gradientenmembranen der Firmen PALL und Tami) und Porengrößen (0,8 und 1,4 µm).15

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererAbbildung 3.3- 1: Schema der (UTP-) MF-AnlageFür die MF-Versuche kann die zu filtrierende Flüssigkeit (Magermilch; Wasser) zunächst im Vorlaufbehälter(Fassungsvermögen von 140 l) durch einen Plattenwärmetauscher auf die jeweilige Filtrationstemperatur(ϑ) erwärmt/abgekühlt werden. Die Anlage ist sowohl mit Thermometern und Volumenstrommessernim Retentat- und Permeatkreislauf als auch mit Druckaufnehmern an den Ein- undAusläufen des Membranmoduls ausgestattet, um die Prozessbedingungen (Filtrationstemperatur ϑ,Transmembrandruck TMP = Δp TM und Wandschubspannung τ W ) eindeutig erfassen und regulieren zukönnen.Vor der eigentlichen Versuchsdurchführung wurde die Membran für 20 min mit Lauge (1%, Ultrasil11) bei 55 °C konditioniert, um eine für die Filtration von Magermilch vorteilhafte Modifizierung derMembranoberfläche zu erzielen (Nassauer 1985). Zur Entfernung von Reinigungsmittelrückständenwurde das Anlagensystem anschließend mit (warmem) Wasser gespült sowie auf Filtrationstemperaturgebracht und danach die Anlage mit dem bereits vorgewärmten Produkt (gegen Wasser) angefahren.Die MF-Versuche wurden unter Rückführung von Permeat und Retentat in den Vorlaufbehälterbzw. im Um-/Kreislaufverfahren durchgeführt.Während der Filtrationen (mit unterschiedlichem Rohmilchstatus, variierenden Prozessparameternund Membranen bzw. -konzepten) wurden nach unterschiedlichen Zeiten (zwischen t=0 und 12 h)Permeat- und Retentatproben gezogen und unter einer Laminar-Flow-Box in sterile Flaschen bzw.Röhrchen abgefüllt sowie Proben aus dem Vorlaufbehälter entnommen. Anhand der Gesamtkeimzahlender MF-Permeate (N P,t ) bezogen auf die der rohen Magermilch (N 0 ) ließen sich die jeweils erzieltendezimalen Reduktionsraten (=log N P,t /N 0 ) ermitteln. Bei längeren Filtrationszyklen (bzw. ab t≥1,5 h)wurde die Keimzahl im Permeat nicht auf die der Ausgangsmilch, sondern auf die der Milch im Vorlaufbehälter(N VL,t ) bezogen, um bei der Erfassung der Keimreduktion evtl. auftretende thermisch bedingteund/oder durch Scherung induzierte Veränderungen des Bakteriengehaltes mit zu berücksichtigen.Um nicht nur die Effizienz, sondern auch die Selektivität der Mikroorganismenabtrennung mittels MFzu erfassen, wurden Permeat- und zeitgleich entnommene Retentatproben auf die Gehalte an Gesamtprotein(mittels Protein-Stickstoff-Analysator/Leco) und (nativem) Molkenprotein (mittels RP-HPLC) untersucht. Die Permeation der verschiedenen Substanzen (in %) wurde anhand deren Konzentration(C) in Permeat und Retentat nach Gleichung (2) berechnet:CPermeatPermeation [%] = ( ⋅100%)( 2)CRetentat16

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererAus den Permeationsraten unterschiedlicher Milchkomponenten mit verschiedenen Molekülgrößen(Proteine, Mikroorganismen) und der zeitabhängigen Erfassung des jeweiligen Permeatvolumenstromskönnen Rückschlüsse auf die im Laufe der Filtration auftretenden Foulingeffekte (wie Porenverengungund -verblockung oder Bildung einer Sekundärschicht auf der Membran) gezogen werden.Zudem wurden die (in Langzeitversuchen) permeatseitig und aus dem Vorlaufbehälter entnommenenMilchproben bezüglich ihrer enzymatischen Beschaffenheit bzw. der Aktivität an proteolytischen undlipolytischen Enzymen charakterisiert, um beim Membrandurchtritt möglicherweise stattfindende Kontaminationender Filtrate mit bakteriellen Enzymen der an die Membran angelagerten, stoffwechselaktivenKeime zu detektieren.Die (mikrobielle) Lagerstabilität der aus den unterschiedlichen Filtrationsversuchen resultierenden MF-Permeate wurde anhand der zu unterschiedlichen Lagerzeiten (t=0 bis 21 Tage) vorliegenden Gesamtkeimzahlen(KbE/ml) bestimmt.Einfluss der FiltrationsbedingungenUm die Einflussfaktoren auf das Ergebnis der Entkeimungsfiltration zu ermitteln, wurden zunächstFiltrationsversuche mit Standardmembranen (1,4 µm; Membralox ® der Fa. PALL) im UTP-Prinzipdurchgeführt. Somit konnten auch die Faktoren Transmembrandruck (Δp TM ) und Wandschubspannung(τ W ) voneinander entkoppelt und die Auswirkungen der einzelnen Prozessparameter auf Flux,Keimreduktion sowie Proteinpermeation separat und gezielt erfasst werden.FiltrationstemperaturFür die Entkeimungsfiltration müssen die Temperaturen so gewählt werden, dass sie einerseits außerhalbder optimalen mikrobiologischen Wachstumsbedingungen und andererseits noch keine ausgeprägtenDenaturierungseffekte (der Milchproteine) zu erwarten sind. Um diese Effekte mit zu berücksichtigenwurde die Filtrationstemperatur ϑ im gesamten Bereich von 10 bis 70 °C variiert, aufgrundder praktischen Relevanz aber ϑ=10, 50 und 55 °C fokussiert.Wie aus Abbildung 3.3-2 ersichtlich, steigt mit zunehmender Filtrationstemperatur (bei gleichem Δp TMvon 0,2 bar und τ W von 150 Pa) der Flux an (von etwa 200 l/m²h bei ϑ=10 °C auf etwa 700 l/m²h beiϑ=50 bzw. 55 °C). Grundsätzlich lässt sich dieser Fluxanstieg mit temperaturabhängigen Viskositätsänderungendes Filtrationsfluids und/oder der dadurch bedingten Veränderungen der laminaren Unter-bzw. Grenzschicht an der Membran erklären.Bei einer Filtrationstemperatur von 70 °C kann zwar kurzfristig (t=0,5 h) ein vergleichsweise höhererFlux (>800 l/m²h) erzielt werden, der aber nur für kurze Zeit aufrechterhalten werden kann und beit=3 h nur noch ~450 l/m²h beträgt. Dahingegen bleibt bei ϑ≤55 °C der Permeatvolumenstrom auchüber längere Filtrationsdauern hinweg nahezu konstant, was auf eine verstärkte Verblockung derMembran bzw. -poren durch aufgefaltete Proteine oder -aggregate bei MF-Temperaturen von ≥60 °Crückschließen lässt.17

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Scherer1000800t=0,5 hFlux [lm -2 h -1 ]600400t=3 hUTP-MF (1,4 µm):200MagermilchΔ p TM = 0,2 barτ w = 150 Pa00 10 20 30 40 50 60 70 80Filtrationstemperatur [°C]Abbildung 3.3- 2: Einfluss der MF-Temperatur auf den Fluxnach unterschiedlichen Filtrationszeiten (t)Die Erhöhung der MF-Temperatur von 10 auf 50 bzw. 55 °C bringt eine Verbesserung der (Gesamt-)Proteinpermeation (von 96% auf 99,6%) mit sich, wie aus Abb. 3.3- 3 hervorgeht. Da die vergleichsweisekleinen Molkenproteine temperaturunabhängig nahezu ungehindert permeieren, handelt es sichbei dem (bei niedrigen ϑ) zurückgehaltenen Proteinanteil fast ausschließlich um Kaseinmizellen, dieihrerseits wiederum temperaturbedingten Veränderungen unterliegen.100MolkenproteinProteinpermeation [%]Gesamtprotein989694UTP-MF (1,4 µm):Magermilcht = 2 hΔ p TM = 0,2 barτ w = 150 Pa9210 30 50 55Filtrationstemperatur [°C]Abbildung 3.3- 3: Proteinpermeation in Abhängigkeit von der FiltrationstemperaturBei der Entkeimungsfiltration unterliegen nicht nur Flux und Proteinpermeation, sondern auch die dezimaleReduktion der Gesamtkeimzahl einem Temperatureinfluss (vgl. Abb. 3.3- 4). Bei gleicherKeimbelastung der rohen Magermilch lässt sich bei ϑ=55°C eine Reduktion von durchschnittlich etwalog 3,4 anstatt log 2,8 bei ϑ=10 °C erzielen, was jedoch kein rein mechanischer Effekt sein dürfte.18

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Scherer4t = 0,5 hDezimale Reduktion [-]321UTP-MF (1,4 µm):MagermilchΔ p TM = 0,2 barτ w = 150 Pa00 10 20 30 40 50 60Filtrationstemperatur [°C]Abbildung 3.3- 4: Dezimale Keimreduktion in Abhängigkeit von der FiltrationstemperaturDie vergleichsweise bessere dezimale Reduktion und somit geringere Keimbelastung im Permeat beihöheren Filtrationstemperaturen kann auf die beginnende thermische Inaktivierung einzelner (hitzelabiler)Keimgruppen zurückgeführt werden, die zusätzlich zur rein mechanischen Keimrückhaltung erfolgt.Wie die Untersuchungen zeigen, führt bereits die Erwärmung bzw. Warmhaltung der Magermilch(nach der Separation) auf bzw. bei ϑ≥50 °C zu einer (wenn auch geringfügigen) Reduktion dermikrobiellen Ausgangsbelastung des unfiltrierten Produktes einerseits und einer Floraverschiebung (inRichtung hitzestabiler, gram-positiver Keimgruppen) andererseits. Diese thermisch induzierten Veränderungender Keimflora und -zusammensetzung im unfiltrierten Produkt haben geringere Keimzahlenund andere -gruppen in den bei höheren Temperaturen filtrierten Permeaten zur Folge. Die vomZIEL-M vorgenommene Identifizierung der Keimflora in roher, auf Filtrationstemperatur erwärmterund mikrofiltrierter Milch bestätigt diese Untersuchungen (vgl. Kapitel 3.3.2).Die höhere Ausgangskeimzahl sowie die andersartige Florazusammensetzung direkt nach dem Herstellprozesshat bei der mit niedrigeren Temperaturen filtrierten Milch ein schnelleres Keimwachstumwährend der Kühllagerung zur Folge und somit ein früheres Erreichen des mikrobiellen Inakzeptanzlevelsvon 10 6 KbE/ml (siehe Abb. 3.3- 5). So wird die mikrobielle Haltbarkeitsgrenze im bei 10 °CfiltriertenProdukt bereits nach fünf Tagen Lagerung erreicht, wohingegen bei Filtrationstemperaturenvon ϑ=50 bzw. 55 °C entsprechend hohe Keimgehalte erst bei t=7 Tage zu verzeichnen sind.1e+710 7Gesamtkeimzahl [KbE/ml]1e+610 6ϑ=55°C1e+510 5ϑ=50°C1e+410 4ϑ =10°C1e+310 31e+210 2UTP-MF (1,4 µm):Magermilch 1e+1 10 1 (N 0 =7·10 3 KbE/ml)Δ p TM = 0,2 bargelagert bei 10°Cτ w = 150 Pa1e+000 2 4 6 8Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 5: Einfluss der Filtrationstemperatur auf die mikrobielle Lagerstabilität von MF-Milch19

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererMikrobieller Status und Lagerstabilität einer mikrofiltrierten Milch hängen demnach (bei einer Kühltemperaturvon 10 °C) von der MF-Temperatur ab.Sowohl die Ergebnisse zu Flux, Keim- und Proteinretention legen demnach den Schluss nahe, bei einerEntkeimungsfiltration zur Herstellung von ESL-Milch Filtrationstemperaturen im Bereich von ϑ=50-55 °C einzusetzen.Transmembrandruck und WandschubspannungDer TMP stellt die treibende Kraft der Filtration dar und die Überströmgeschwindigkeit korreliert mitdem Partikelabtrag an der Membranoberfläche. Demnach hängen die während der MF stattfindendenFoulingprozesse in entscheidendem Maße von diesen Prozessbedingungen ab (Ripperger&Altmann2002). Wie aus Abb. 3.3- 6 ersichtlich, führt auch bei Filtrationen im UTP-Prinzip sowohl eine Reduktionder transmembranen Druckdifferenz auf Δp TM

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererwährend längerer Filtrationszyklen treten somit bei höheren TMP verstärkt Foulingeffekte auf, die sichauf Flux, Keim- und Proteinrückhaltung auswirken können. Die entsprechenden Zusammenhängewurden im weiteren Projektverlauf durch die längenabhängige Erfassung von Filtrationseffekten näheruntersucht.Gesamtkeimzahl Permeat [KbE/ml]100t = 0,5 h80604020UTP-MF (1,4 µm):Magermilch (N 0 =7·10 3 KbE/ml)ϑ = 50°Cτ w = 150 Pa00,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0(Mittlere) Transmembrane Druckdifferenz [bar]10008006004002000Flux [lh -1 m -2 ]Abbildung 3.3- 7: Permeatkeimzahl und Fluxin Abhängigkeit von der transmembranen DruckdifferenzEs lässt sich somit ableiten, dass der optimale Δp TM bei einer Entkeimungsfiltration von Milch für dieuntersuchte Membran bei weniger als 0,6 bar liegt.Hinsichtlich der Wandschubspannung ist zu berücksichtigen, dass niedrige τ W (≤150 Pa) zu verstärkterPartikelan- und -ablagerung an der Membran führen. Aufgrund der besseren Partikelabtragung unddem geringeren Fouling ist somit bei größeren Überströmgeschwindigkeiten (auch über längere Filtrationszyklenhinweg) nicht nur ein konstanter Flux, sondern auch eine höhere Proteinpermeation festzustellen(siehe Abb. 3.3- 8).1004Proteinpermeation [%]98969492t = 2 hUTP-MF (1,4 µm):Magermilchϑ = 50°CΔ p TM = 0,2 bar50 100 1503210Dezimale Keimreduktion [-]Wandschubspannung [Pa]Abbildung 3.3- 8: Proteinpermeation und Keimreduktionin Abhängigkeit von der WandschubspannungDie Keimreduktion wird dahingegen kaum von der Wandschubspannung beeinflusst. So beträgt (ant=2 h) die dezimale Reduktion sowohl bei τ W =50, 100 und 150 Pa etwa 3. Die vor allem bei niedrigenÜberströmgeschwindigkeiten stärker ausgeprägten Foulingphänomene stellen somit eine Barriere fürdie Proteine dar, wirken sich aber nicht auf den Keimrückhalt aus. Dies lässt den Schluss zu, dass bei21

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererhohen τ W die Mikroorganismen eher durch die Strömung erfasst, durch hydrodynamische Effekte indie Kernströmung zurück und somit von der Membran weg transportiert werden, was (aufgrund derniedrigeren Konzentration der Mikroorganismen an der Membran) die Keimpermeation verringert.Demnach ist im Hinblick auf die Zielsetzung der Entkeimungsfiltration von Milch (möglichst effiziente,aber zugleich selektive Keimabtrennung bei konstant hohem Flux) eine hohe Wandschubspannung(τ w ≥150 Pa) bei einem relativ niedrigen Transmembrandruck Δp TM ≤0,5 bar und einer Filtrationstemperaturvon ϑ=50-55 °C zu wählen. Diesbezüglich ist jedoch zu berücksichtigen, dass diese „optimalen“Bedingungen für Filtrationen im UTP-Prinzip und somit basierend auf einer konstanten transmembranenDruckdifferenz entlang der gesamten Membran ermittelt wurden. Für andere Membranen bzw.Filtrationskonzepte können sich somit andere „Optimalbedingungen“ (insbesondere in Bezug auf Δp TMund τ w ) ergeben.FiltrationszeitAuch wenn die vorgängig ermittelten, „optimalen“ Prozessbedingungen (ϑ=55 °C, Δp TM =0,2 bar,τ W =150 Pa) für eine Entkeimungsfiltration im UTP-Prinzip eingesetzt werden, kann es - insbesondereim Laufe längerer Filtrationszyklen - durch Membranfouling zu einer Veränderung der Retentionseigenschaftendes Systems kommen, die bisher kaum quantifiziert und/oder berücksichtigt werdenkonnten. Wie aus der Abb. 3.3- 9 ersichtlich, bleibt zwar der Flux bei der Filtration (UTP mit oben genanntenParametern) während der gesamten Filtrationsdauer (bis zu zehn Stunden) konstant. DieProteinpermeation nimmt jedoch während des Filtrationszyklus kontinuierlich ab und beträgt beit=10 h nur noch etwa 98,6%. Die Verringerung der Proteinpermeation im Filtrationsverlauf bei annäherndgleich bleibendem Filtratvolumenstrom lässt darauf schließen, dass es sich bei den im UTP-Prinzip stattfindenden Foulingprozessen vor allem um eine An- und Ablagerung von Proteinen in denMembranporen handelt, die mit einer (geringfügigen) Porenverengung einhergeht. Nach Nakamura &Matsumoto (2006) oder Herrero et al. (1997) ist sowohl bei einer Porenverblockung als auch der Ausbildungeiner Deckschicht auf der Membran ein deutlich höherer Fluxrückgang zu verzeichnen. Folglichlagern sich in Abhängigkeit von der Filtrationszeit zwar immer mehr Proteine an und in denMembranporen bzw. den bereits adsorptierten Proteinen ab, diese Langzeit-Foulingeffekte beeinträchtigenjedoch den Flux und die Keimpermeation kaum.1001000Proteinpermeation [%]99989796UTP-MF (1,4 µm):Magermilchϑ = 50°CΔ p TM = 0,2 barτ w = 150 Pa950 2 4 6 8 10Filtrationszeit [h]8006004002000Flux [lm -2 h -1 ]Abbildung 3.3- 9: Proteinpermeation und Flux im LangzeiteffektWie in Abb. 3.3- 10 a und b gezeigt, verändern sich Keimbelastung im Permeat und dezimale Reduktionkaum im Filtrationsverlauf. In der Anfangsphase der MF permeieren zwar vergleichsweise mehr22

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererMikroorganismen, aber nach etwa 30min pendelt sich der Keimgehalt im Permeat auf ein im weiterenFiltrationsverlauf annähernd gleich bleibendes Niveau ein. Die zu Beginn der Filtration auftretenden(initialen) Foulingphänomene (Proteinadsorption) bringen demnach eine Verbesserung der Bakterienrückhaltungmit sich. Nach Mourouzidis-Mourouzis & Karabelas (2008) handelt es sich bei vergleichbarenVorgängen (bei Einsatz von 0,8 µm Membranen) um reversible Foulingvorgänge, die wie Herrerroet al. (1997) feststellten, innerhalb weniger Minuten stattfinden und abgeschlossen sind. Diesbezüglichist jedoch zu berücksichtigen, dass bei Filtrationen im UTP-Prinzip aufgrund der Permeatumwälzungentsprechende Effekte erst zeitlich verzögert detektiert werden können.Das im weiteren Verlauf der MF stattfindende Fouling wirkt sich (anders als bei den Proteinen) nichtweiter auf die Permeation der Mikroorganismen aus. Dies ist zum einen darauf zurückzuführen, dassdie Keime aufgrund ihrer durchschnittlichen Molekülgröße in der Filtratströmung anderen Kräften unterliegenals die verhältnismäßig kleineren Proteinpartikel (Altmann & Ripperger 1997) und zudemandere Oberflächengruppen und somit -eigenschaften aufweisen als die Proteine (van Oss 1989), wassich wiederum auf die Adsorption(-sneigung) auswirkt.Permeatkeimzahl [KbE/ml]15010050aUTP-MF (1,4 µm):Magermilch (5,3·10 4 KbE/ml)ϑ = 50°CΔ p TM= 0,2 barτ w= 150 Pa00 2 4 6 8 10Filtrationszeit [h]Dezimale Keimreduktion [-]4321bUTP-MF (1,4 µm):Magermilchϑ = 50°CΔ p TM= 0,2 barτ w= 150 Pa00 2 4 6 8 10Filtrationszeit [h]Abbildung 3.3- 10: Permeatkeimzahl (a) und dezimale Keimreduktion (b)in Abhängigkeit von der FiltrationszeitDennoch besteht prinzipiell die Möglichkeit, dass sich - insbesondere bei hoher bakterieller Ausgangsbelastungdes Produktes - vermehrt Mikroorganismen an die Membran bzw. daran adsorpierte organischeSubstanzen (Proteine) anhaften und/oder im Porensystem der Membran hängen bleiben (Flemming1988; Kang 2004). Infolge eines solchen Biofoulings kann es u.U. und bei langen Standzeitenzum Durchwachsen der Bakterien und somit zu einer (Re-)Kontamination des Permeats kommen(Leahy & Gabler 1983). Bei den im Rahmen dieses Projektes durchgeführten Versuchen konnte jedochauch nach Filtrationszeiten von mehr als zwölf Stunden keine Erhöhung des Keimgehaltes imFiltrat beobachtetet werden (vgl. Abb. 3.3- 10 a).Aus Abb. 3.3- 11 wird ersichtlich, dass in Abhängigkeit von der Filtrationszeit auch keine signifikanteZunahme der Aktivität an proteolytischen und lipolytischen Enzymen im MF-Permeat nachgewiesenwerden kann. Folglich tritt auch bei längeren Filtrationszyklen keine Kontamination des Filtrats beimMembrandurchtritt mit den mikrobiellen Enyzmen der an die Membran angelagerten Keimgruppenauf.23

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Scherer0,4Enzymaktivität [U/ml]0,30,20,1ProteaseUTP-MF (1,4 µm):Magermilchϑ = 50°CΔ p TM = 0,2 barτ w = 150 PaLipase0,00 2 4 6 8 10 12Filtrationszeit [Stunden]Abbildung 3.3- 11: Enzymaktivität im MF-Permeat in Abhängigkeit von der FiltrationszeitIm Laufe der (UTP-)Filtration treten somit Foulingeffekte auf, die insbesondere die Selektivität derKeimabtrennung beeinflussen, sich allerdings weniger auf den Flux oder die (für ESL-Milch haltbarkeitsrelevante)mikrobielle und enzymatische Belastung des Permeats auswirken. Entsprechend langzeitstabileFiltrationsergebnisse lassen sich allerdings, wie die weiteren Untersuchungen zeigen, nurbei Einsatz spezifischer Konzepte (UTP-Prinzip, Gradientenmembranen) erzielen.Einfluss von Rohmilchqualität und mikrobiellen CharakteristikaDie Rohmilchqualität kann die Produkthaltbarkeit entscheidend beeinflussen. Bei gleichen Filtrationsbedingungen(ϑ = 55 °C, Δp TM = 0,2 bar, τ W = 150 Pa) lassen sich mittels (Standard-)Membranen mitnominalen Trenngrenzen von 1,4 µm unabhängig von dem unfiltrierten Produkt vorhandenen Ausgangskeimzahlbzw. der mikrobiologischen Rohmilchqualität Keimreduktionen von etwa 3 – 3,5 Zehnerpotenzenerzielen (vgl. Abbildung 3.3- 12).4Dezimale Keimreduktion [-]321UTP-MF:Magermilchϑ = 50°CΔ p TM = 0,2 barτ w = 150 Pa00 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000Gesamtkeimzahl rohe Magermilch [KbE/ml]Abbildung 3.3- 12: Keimreduktion mittels MF bei unterschiedlicher RohmilchqualitätDie mikrobielle Belastung des Permeats hängt also von der Ausgangskeimzahl (N 0 ) der rohen Magermilchab. Wie aus Abbildung 3.3- 13 hervorgeht, resultieren (bei gleichen Filtrations- und Lagerbedingungen)höhere N 0 somit in höheren Keimzahlen im „frisch“ hergestellten MF-Produkt und infolgedessenauch in einem schnelleren Keimwachstum während der Lagerung. Das mikrobielle Inakzeptanzle-a24

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Scherervel (~10 6 KbE/ml) und somit die Haltbarkeitsgrenze der rein mikrofiltrierten Milch wird bei schlechtererAusgangsqualität der Rohmilch also zu einem vergleichsweise früheren Zeitpunkt erreicht.Gesamtkeimzahl [KbE/ml]1e+710 71e+610 61e+510 51e+410 41e+310 3gelagert bei 10°CN 0 = 2,4·10 3 KbE/mlN 0 = 5,1·10 5 KbE/ml1e+210 2UTP-MF:Magermilchϑ = 50°C1e+110 1 Δ p TM = 0,2 barτ w = 150 Pa1e+000 2 4 6 8 10 12Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 13: Einfluss der Rohmilchqualität (N 0 ) auf die Lagerstabilität mikrofiltrierter MilchBereits der Einsatz von qualitativ hochwertiger Rohmilch kann somit (selbst bei einer vergleichsweisehohen Kühltemperatur von 10 °C) eine Haltbarkeitsverlängerung der MF-Milch von bis zu vier Tagenmit sich bringen. Welche Keimgruppen sich dabei im Laufe der Lagerung gegenüber anderen Mikroorganismen„durchsetzen“ bzw. sich beim mikrofiltrierten Produkt als haltbarkeitsbegrenzend erweisen,wurde vom ZIEL-M ermittelt und wird in Kapitel 3.3.2 näher erläutert.Die möglichst effiziente Retention von für das MF(+PAST)-Produkt haltbarkeitsrelevanten Spezies erfordertjedoch weiterführende Erkenntnisse zum Einfluss der mikrobiellen Charakteristika auf den Abtrenneffekt.Die gezielte Inokulation der Rohmilch mit verschiedenen in der Milch vorhandenen bzw.aus MF+PAST-Milch isolierten Keimgruppen, die sich hinsichtlich ihrer Morphologie (Größe, Form,Gram-Eigenschaften) unterscheiden, ergab eindeutige Zusammenhänge zwischen den Charakteristikader Mikroorganismen und deren Retention. In Tabelle 3.3- 1 sind die eingesetzten Bakterienspeziesmit den jeweiligen Eigenschaften und dezimalen Reduktionen zusammengefasst.Tabelle 3.3- 1: Dezimale Reduktion und morphologische Eigenschaften spezifischer KeimgruppenKeimartDezimale Keimreduktion [-]*MorphologiePseudoxanthomonas mex.Citrobacter freundiiMicrobacterium lacticumBacillus cereus3,15 ± 0,234,37 ± 0,183,87 ± 0,264,6 ± 0,09*UTP-MF (1,4 µm): Magermilch; ϑ=50°C; Δp TM=0,2 bar; τ w=150 Pa- Stäbchen:1 - 2,2 x 0,6 - 0,8 µm- gram-negativ- Stäbchen:1,2 - 3,0 x 0,6 - 1 µm- gram-negativ- Kokken:Ø = 0,8 - 3,5 µm-gram-positiv- Stäbchen:1,2 - 10 x 0,5 - 2 µm-gram-positivDie kugelförmigen Microbacterium scheinen demnach vergleichsweise schlechter mittels MF zurückgehaltenzu werden als die Stäbchen und bei diesen wiederum kein Zusammenhang zwischen Retentionund Zellgröße zu bestehen. Wird dabei jedoch berücksichtigt, dass bereits das Vorwärmen des25

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererProduktes auf eine Filtrationstemperatur von ϑ=50 °C zu einer thermischen Inaktivierung von (hitzelabilen,gram-negativen) Bakterien führt, ergeben sich diesbezüglich andere Zusammenhänge. Wird,wie in Abbildung 3.3- 14 dargestellt, zur Ermittlung der dezimalen Reduktion nicht die Keimzahl imPermeat (N P ) auf die der Rohmilch (N 0 ), sondern auf die der vorgewärmten Milch im Vorlaufbehälter(N vL ) bezogen, lassen sich nämlich eindeutige Korrelationen zu den morphologischen Eigenschaftender Bakterien ableiten. Bei den gram-negativen Keimgruppen (Pseudomonas, Citrobacter) sind zwischenden verschiedenen Reduktionsraten (N P /N 0 und N P /N VL ) größere Unterschiede festzustellen alsbei den hitzestabilen Keimgruppen. Somit ist zusätzlich zur mechanischen Retention bei den hitzeempfindlichenKeimgruppen eine höhere thermische Inaktivierung zu verzeichnen. Unter Berücksichtigungdieses additiven thermischen Effekts wird deutlich, dass mit zunehmender Zellgröße die Retentioneines Bakteriums ansteigt. Folglich lassen sich auch sporenbildende Mikroorganismen (wie Bacillusssp.) aufgrund ihres Zellvolumens besser mittels MF abtrennen. Kokkenförmige Bakterien werdendahingegen (bei ähnlicher Größenverteilung) vergleichsweise schlechter zurückgehalten als Stäbchen.ZellgrößeDezimale Reduktion [-]54321UTP-MF (1,4 µm):Magermilchϑ=50°CΔp TM =0,2 barτ W =150 Pa= log (N p /N 0 )= log (N p /N VL )0Pseudoxanthomonasmex.CitrobacterfreundiiMicrobacteriumBacilluslacticumcereusgram-negativgram-positivAbbildung 3.3- 14: Dezimale Reduktion spezifischer MikroorganismenNeben der mechanischen Abtrennung erfolgt die Keimreduktion bei der MF also auch und insbesonderebei hitzelabilen Keimgruppen über thermische (Inaktivierungs-)Effekte. Die morphologischen Eigenschaftender Mikroorganismen und v.a. das Zellvolumen sind dabei entscheidende Kriterien fürderen Abreicherung. Eine vollständige oder selektive Retention bestimmter (haltbarkeitsrelevanteroder auch pathogener) Keimgruppen aus der Milch ist jedoch auch aufgrund der Größenverteilung innerhalbeiner Spezies nicht möglich. Dennoch lassen sich durch gezielte Prozessführung (ϑ≥50 °C)und/oder Membranauswahl (Porengröße; Struktur) einige für die Haltbarkeit der (ESL-)Milch „kritische“bspw. enzymbildende Keimgruppen (wie Pseudomonas, Bacillus) vergleichsweise gut durch eineEntkeimungsfiltration dezimieren.Einfluss von Membrancharakteristika und -konzeptenNeben Prozessbedingungen und Partikeleigenschaften beeinflussen auch die eingesetzten Membranenund -konzepte das Ergebnis der Entkeimungsfiltration. Entscheidend sind dabei, wie die Untersuchungenzeigen, nicht nur die Porengrößen der Membranen, sondern auch deren Aufbau/Struktur (Standard-bzw. Gradientenmembran) sowie die Betriebsmodi (Crossflow oder UTP-Prinzip).26

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererim Filtrationsverlauf nahezu konstant bleibenden Filtratvolumenstrom (~400 l/m²h). Proteinpermeationund Keimrückhalt unterliegen währenddessen nur geringfügigen Veränderungen und betragen ant=10 h noch 98% bzw. 4,3 log.Dahingegen ist bei der MF im Standard-Crossflow-Modus (mit einer 1,4 µm-Standardmembran der Fa.PALL) zwar zu Beginn der Filtration ein Flux von über 1200 l/m²h zu verzeichnen, der jedoch im weiterenVerlauf (stufenförmig) immer weiter absinkt und nach acht Stunden nur noch etwa 200 l/m²hbeträgt. Dieser Fluxabfall geht einher mit einer Verringerung der Proteinpermeation (um insgesamtetwa 8%) sowie einem (stufenförmigen) Anstieg der Keimreduktion (von anfangs etwa 2,5 auf 3 logbei t=8 h).Flux [lm -2 h -1 ]140012001000800600400aPALL - Standard (UTP)PALL - StandardTami- Gradient200MF (1,4 µm):Magermilchϑ = 50°C00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Filtrationszeit [h]Proteinpermeation [%]10098969492908886bMF (1,4 µm):Magermilchϑ = 50°CPALL - Standard (UTP)Tami - GradientPALL - Standard0 2 4 6 8 10Filtrationszeit [h][Stunden]Dezimale Reduktion [-]54321cMF (1,4 µm):Magermilchϑ = 50°CTami - GradientPALL - Standard (UTP)PALL - Standard00 2 4 6 8 10Filtrationszeit [h]Abbildung 3.3- 17: Einfluss von Membraneneigenschaften und -konzepten auf Flux (a),Proteinpermeation (b) und Keimreduktion (c)Folglich lassen sich nicht nur bei Filtrationen im UTP-Prinzip, sondern auch durch die Verwendung vonGradientenmembranen langzeitstabile Ergebnisse erzielen. Dahingegen treten bei der im Crossflow-Modus betriebenen MF mit Standardmembranen in Abhängigkeit von der Filtrationszeit (foulingbedingte)Veränderungen der Retentionseigenschaften auf. Der gleichermaßen stufenförmig abfallendeFlux sowie ansteigende Keim- und Proteinrückhalt lassen dabei auf verschiedene, aufeinanderfolgendeFoulingmechanismen schließen bzw. sich aus verschiedenen Modellen (Herrero 1997, Nakamura &Matsumoto 2006 oder Mourouzidis-Mourouzidis & Karabelas 2008) ableiten. Im ersten Schritt bzw. zuFiltrationsbeginn adsorpieren Proteine an und im Porensystem der Membran, was mit einer Porenver-29

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererengung und einem schnellen initialen Fluxabfall einhergeht, sich jedoch kaum auf die Keim- oder Proteinpermeationauswirkt. Weitere Proteinablagerungen und die damit einhergehenden Verringerungender Porendurchmesser resultieren im Filtrationsverlauf in einer zunehmenden Verblockung der Membran(durch immer kleinere Partikel), was (ab t=3 h) den Stofftransport durch die Membran immerweiter beeinträchtigt. Als Folge davon kommt es (ab t=5 h) zur Ausbildung einer externen (Deck-)Schicht auf der Membran und somit einem zusätzlichen Filtrationswiderstand, was Flux, Keim- undProteinpermeation nochmals gravierend reduziert. Um zu klären, wovon die Foulingmechanismen und-effekte bei der Entkeimungsfiltration von Milch abhängen, wurde das Filtrationsverhalten einer Standardmembranlängenabhängig betrachtet.Längenabhängige Erfassung der EffekteZur Erfassung der Längenabhängigkeit von Flux und Keim-/Proteinpermeation wurde die Standardmembran(1,4 µm; Fa. PALL;) in vier gleich große Stücke (S 1 – S 4) gesägt und diese Sektionen anschließendwieder zusammengeklebt. Der Klebstoff fungiert dabei auch als Barriere gegen den Stofftransportzwischen den Sektionen im porösen Stützkörper der Membran. Des Weiteren wurden diePermeaträume der einzelnen Sektionen mit O-Ring-Dichtungen gegeneinander abgedichtet, um Filtratund -volumenstrom für jede Sektion separat erfassen zu können. Die Filtrationsversuche wurden imherkömmlichen Crossflow-Verfahren mit der in Abbildung 3.3- 18 schematisch dargestellten Membrananlagedurchgeführt.TI01LIA-01V C,3VRWasserbadV FDoppelmantelV C,2V C,1Permeate BypassFeed BypassFI V B,402V P,4P 4V B,3V P,3P 3V B,2V P,2P 2V B,1V P,1P 1FI01PI02S 1S 2S 3S 4PI01DP01V P1 – 4: Probenhähne PermeatV B1 – 4: Umschalthähne zwischen Permeatbypass / Permeat über VolumenstrommesserV C1 – 3: Einstellventile zur Fluss- und DruckeinsetllungV R: Probennahme RetentatV F: Auslasshahn FeedP 1–P 4: Permeatproben 1 – 4S 1–S 4: Membransektion 1– 4TI: TemperaturfühlerFI: VolumenstrommesserPI: DruckaufnehmerDP: Differenzdruckaufnehmer zwischen Membraneingang und -ausgangAbbildung 3.3- 18: Schema der Technikumsversuchsanlagezur längenabhängigen Erfassung der FiltrationseffekteDer retentatseitige Druckabfall bei Membranen, die im Querstromprinzip betrieben werden, führt zuinhomogenen transmembranen Druckbedingungen (Annahme: linearer Druckabfall) und somit zu un-30

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererHintransports der Mikroorganismen zur Membran einerseits sowie des vermehrten Durchdrückens derKeime durch die Membran andererseits relativ viele Keime permeieren. Im Filtrationsverlauf ist dannin der ersten Sektion eine zunehmende Erhöhung der Keim- sowie der Proteinrückhaltung zu beobachten.Folglich werden durch den hohen (intialen) Flux nicht nur verstärkt Keime, sondern auchfoulingaktive Substanzen (Proteine) an die Membran transportiert und adsorpiert, was mit einer (gesteigerten)Porenverengung gefolgt von deren Verblockung und schließlich der Ausbildung einerDeckschicht auf der Membran einhergeht. Am Membranausgang (Sektion 4) sind dahingegen auchnach zehnstündiger Filtration kaum Veränderungen hinsichtlich der Keimretention oder Proteinpermeationfestzustellen. Folglich finden (bedingt durch den vergleichsweise niedrigeren Filtratvolumenstrom)in der Sektion 4 auch weniger bzw. kaum Foulingprozesse statt. In den mittleren Membransektionen2 und 3 überlagern sich die beschriebenen Effekte.MembranSektion 4 Sektion 3Sektion 2Sektion 1FeedMembranSektion 4 Sektion 3Sektion 2Sektion 1Feed54a10098bFiltrationsbeginnDezimale Reduktion [-]3210MF (1,4 µm):Magermilcht= 7 hFiltrationsbeginnProteinpermeation [%]969492908886MF (1,4 µm):Magermilcht = 7 hΔp TMΔp TMAbbildung 3.3- 21: Längenabhängige Erfassung von dezimaler Keimreduktion (a)und Proteinpermeation (b) nach unterschiedlichen Filtrationszeiten (t)Die entsprechenden Zusammenhänge spiegeln sich auch wieder in der in Abbildung 3.3- 22 dargestelltenlinearen Korrelation zwischen dem initialen Flux (J 0 ) und der Adsorptionskonstanten k, die einMaß für die zeitabhängige Fluxänderung und somit die Foulingprozesse darstellt. Diese Adsorptionskonstantek [1/s] lässt sich dabei aus der Veränderung des Porenradius r [µm] in Abhängigkeit vonder Filtrationszeit t [s] und nach folgender Gleichung (4) ableitenr() t = r − k ⋅(4)0 twobei r 0 dem Porenradius [µm] einer sauberen Membran entspricht.32

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Scherer0,0006Adsorptionskonstante k [1/s]0,00050,00040,00030,00020,0001y= 6·10 -8 x+10 -5R=0,94710,00000 2000 4000 6000 8000 10000Initialer Flux [l/hm²]Abbildung 3.3- 22: Adsorptionskonstante k in Abhängigkeit vom initialen FluxEin anfänglich hoher Flux hat somit bei der Entkeimungsfiltration von Milch (durch vermehrtenHintransport von foulingaktiven Substanzen zur Membran und deren Ablagerung) ein verstärktesMembranfouling und dadurch eine vergleichsweise größere Veränderung der Retentionseigenschaftendes Systems im weiteren Filtrationsverlauf zur Folge. Allerdings wirkt sich nicht nur der initiale Fluxauf das Foulingverhalten aus. Die längenabhängigen Untersuchungen haben gezeigt, dass bei einemFlux (J t ) von ≤500 l/m²h (auch ohne UTP-Prinzip) Fouling vermindert und eine langzeitstabile Filtrationerzielt werden kann. Der (initiale) Filtratvolumenstrom hängt dabei von Transmembrandruck undMembranwiderstand ab.FazitZusammenfassend kann festgestellt werden, dass bei der Entkeimungsfiltration von Milch eine Vielzahlvon Effekten durch die verschiedenen Einflussgrößen zu berücksichtigen sind. Die Effizienz undSelektivität der Keimabtrennung hängt neben den Filtrationsbedingungen und -konzepten, auch vondem Ausgangskeimgehalt oder der Zusammensetzung der Rohmilchflora (Mikroorganismenart/-morphologie) ab. Zudem ist - gerade bei längeren Filtrationszyklen - das Zusammenwirken zwischenMembraneigenschaften bzw. -widerständen und Prozessbedingungen (v.a. Δp TM ) entscheidend, danur bei einem relativ geringen (initialen) Flux (max. 500 l/m²h) eine langzeitstabile Filtration (ohnestärker ausgeprägte Foulingprozesse) realisiert werden kann. Vorhersagbare Filtrationsergebnisse lassensich (über die gesamte Membranlänge hinweg) bei der Entkeimung von Milch folglich nur durchden Einsatz von Gradientenmembranen oder mittels UTP-Prinzip erzielen.Unabhängig vom Filtrationsprozess gewährleistet die MF jedoch keine vollständige Abtrennen aller inder (Mager-)Milch enthaltenen Keime und somit weder eine Produktsicherheit noch eine (deutlich)verlängerte Haltbarkeit.AP II b: Kombiverfahren MF/PASTIm Rahmen des AP II b wurden die beim kombinierten Einsatz von MF und thermischer Behandlungauftretenden herstellungs- und lagerungsbedingten Produktveränderungen der ESL-Milchen unter Berücksichtigungvon prozesstechnischen (Filtrations- bzw. Erhitzungsbedingungen; Variation der Prozessschrittreihenfolge)sowie produktspezifischen (insbesondere der Rohmilchqualität) und lagerungsabhängigen(Kühltemperatur) Einflussfaktoren optimiert.33

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Scherer(Standardisierter) Versuchsaufbau und AnalytikDie (Mager-)Milch wurde zunächst mit 1,4 µm-Standardmembranen (Membralox ® der Fa. PALL) imUTP-Prinzip bei gleichen MF-Bedingungen (ϑ=50 °C; Δp TM =0,2 bar; τ w =150 Pa) filtriert und der Fettgehaltder MF-Milch mit separat hocherhitztem (117°C; 4 s) Rahm auf 1,5% eingestellt. Das im Fettgehaltstandardisierte, bereits teilentkeimte Produkt wurde anschließend im Röhrenwärmetauschereiner Pasteurisation (PAST) bei ϑ/t-Bedingungen von 73°C/25 s unterzogen und homogenisiert (bei150 und 50 bar im zweistufigen Homogenisator Typ 16.56 H; APV).Zur Ermittlung des Einflusses von Prozessvarianten auf die Qualität und Stabilität der MF+PAST-Milchwurden hierbei die Filtrationsparameter (ϑ=10 und 50 °C), Pasteurisationsbedingungen (ϑ/t=73-90 °C/10-30 s) sowie die Prozessschrittreihenfolge (vor- und nachgeschaltete MF) variiert.Direkt im Anschluss an die Kurzzeiterhitzung wurde die Milch auf 4 °C abgekühlt und unter einer Laminar-Flow-Boxin sterile (Glas-)Flaschen abgefüllt.Entsprechend dem AP III wurden die so produzierten ESL-Milchen direkt nach dem Herstellprozessund im Vergleich zur eingesetzten Rohmilch (mit variierender Qualität) auf Keimgehalt sowie Veränderungenin der Aktivität von lipolytischen und proteolytischen Enzymen untersucht. Darüber hinauswurden, wie in AP IV beschrieben, die mikrobiellen (Keimzahl), enzymatischen (Lipasen, Proteasen),chemisch-physikalischen (Lipidoxidation, freie SH-Gruppen) sowie sensorischen (Koch- und Fehlgeschmack)Produktcharakteristika während der Lagerung (t=0-30 Tage) der Milchproben (bei Kühltemperaturenvon 4, 8 und 10 °C) in regelmäßigen Abständen erfasst.Vergleich der mittels MF und MF+PAST erzielbaren EntkeimungseffekteDie Verknüpfung von MF und nachgeschalteter PAST ermöglicht neben der Gewährleistung der Produktsicherheitauch eine (schonende) Prozessintensivierung. Im Vergleich zur rein mikrofiltriertenMilch ist beim MF+PAST-Produkt ein deutlich langsamerer Anstieg der Gesamtkeimzahl während derKühllagerung zu verzeichnen (vgl. Abbildung 3.3- 23). Obwohl die MF im Hinblick auf den Entkeimungseffekt(Reduktion um etwa drei Zehnerpotenzen) auch beim Kombiverfahren den entscheidendenProzessschritt darstellt, führt folglich erst die zusätzliche Pasteurisation (trotz der vergleichsweisegeringen zusätzlichen Keimreduktion um 1-1,5 log) zu einer Verlängerung der (mikrobiellen) Haltbarkeitauf mehr als 20 Tage. Die kombinierte Verfahrensführung hat dabei nicht nur eine weitere Verringerungder Gesamtkeimzahl und somit ein vermindertes Keimwachstum während der Lagerung,sondern auch eine Veränderung der Florazusammensetzung zur Folge (vgl. Ergebnisse ZIEL-M bzw.Kapitel 3.3.2).1e+710 71e+610 6HaltbarkeitsgrenzeGesamtkeimzahl [KbE/ml]1e+510 51e+410 4RohmilchMFMF+PAST1e+310 31e+210 21e+110 1 MF (1,4 µm)+ PAST (73°C/25 s)gelagert bei 10°C1e+000 5 10 15 20 25Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 23: Vergleich der (mikrobiellen) Haltbarkeit von MF und MF+PAST-Milch34

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererHerstellungs- und lagerungsbedingte Produktveränderungen bei MF+PAST-MilchEine gezielte Prozess- und Produktoptimierung ist bei (ESL-)Milch erst durch Kenntnisse über dieherstellungs- und lagerungsbedingten/haltbarkeitslimitierenden Veränderungen möglich. Um diese beiMF+PAST-Milch zu ermitteln, wurden zunächst die unter Standard-Bedingungen (siehe vorheriger Abschnitt)produzierten Proben an t=0 und bis zu einer Lagerzeit von t=30 Tagen (Kühltemperatur von10°C) entsprechend charakterisiert.Direkt nach der Herstellung lässt sich hinsichtlich der gängigen Hitzeindikatoren, wie dem Gehalt annativem ß-Laktoglobulin oder der Peroxidaseaktivität kein signifikanter Unterschied zwischen dem reinkurzzeiterhitzten und dem MF+PAST-Produkt feststellen. Auch die sensorischen Eigenschaften von„frisch“ pasteurisierter und der nach dem Kombiverfahren hergestellten Milch gleichen einander.Wie aus Tabelle 3.3- 3 ersichtlich, verändert sich die sensorische Bewertung des MF+PAST-Produktsallerdings mit zunehmender Lagerdauer. Im Dreieckstest (n=8) lässt sich ab t=15 Tage ein signifikanterGeschmacksunterschied (α=0,05) zu frisch pasteurisierter Milch feststellen. Der dabei auftretendeFehlgeschmack wird von den Probanden meist als „ranzig“, „käsig“, „metallisch“, „kartonartig“und/oder „leicht bitter“ beschrieben.Tabelle 3.3- 3: Sensorische Abweichung der MF+PAST-Milchvom „frisch“ kurzzeiterhitzen Produkt (Dreieckstest mit n=8; α=0,05)Lagerdauer derMF+PAST-Milch[Tage]510151821AnzahlrichtigeAntworten33688SignifikanterUnterschiedzu FrischmilchneinneinjajajaDie Ausprägung eines Fehlgeschmacks stellt nach Boor (2001) und Fromm et al. (2004) bei herkömmlichpasteurisierter Milch die häufigste Verderbsursache dar und ist meist auf mikrobiellesWachstum sowie die damit verbundenen Stoffwechselvorgänge zurückzuführen. Diesbezüglich sindsowohl die nach der HTST-Erhitzung im Produkt verbleibenden gram-positiven Mikroorganismen alsauch Rekontaminationskeime relevant. Da es bei Einsatz des Kombiverfahrens jedoch gelingt, einevergleichsweise höhere dezimale Keimreduktion (log N P /N 0 ) von ca. 5 zu erzielen und zudem bei derESL-Technologie eine bessere Prozesshygiene im down-stream angelegt wird, kommen diese mikrobiellen(Verderbs-)Mechanismen bei MF+PAST-Milch nicht zum Tragen (vgl. auch Abbildung 3.3- 23).Nach der Mikrofiltration mit anschließender Pasteurisation verbleiben (je nach Rohmilchqualität) etwa10-100 KbE/ml im Produkt. Im Verlauf der Lagerung ist zwar ein weiterer Anstieg des Keimgehaltesfeststellbar. Der allgemein als mikrobielles Inakzeptanzlevel akzeptierte Wert von 10 6 KbE/ml wird imMF+PAST-Produkt aber i.d.R. bei einer Kühltemperatur von ≤10 °C auch nach einer Lagerzeit von 25Tagen nicht erreicht.Im Hinblick auf die Lagerstabilität der Milch erweist sich jedoch die bakterielle Freisetzung von Stoffwechselproduktenbzw. hitzestabilen proteolytischen und lipolytischen Enzymen als relevant. Allerdingsführen nicht nur diese bakteriell freigesetzten, sondern auch die in der Rohmilch originär vorhandenenEnzyme (insbesondere Proteasen) zu haltbarkeitslimitierenden Umsetzungen. Die enzymatischenReaktionen hängen dabei (z.B. nach Deeth 2006) prinzipiell von der Enzymkonzentration bzw.-aktivität oder der Substratverfügbarkeit/-zugänglichkeit ab.35

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererDie prozentuale Restenzymaktivität (RA) von Enzymen lässt sich aus der Korrelation der Enzymaktivitätim Endprodukt bzw. nach der MF+PAST zum Lagerzeitpunkt t (A P,t ) und der in der Rohmilch vorhandenen(A 0 ) ableiten bzw. nach folgender Gleichung (5) berechnenRAAP,t(%) = 100 ⋅(5)A0Die Enzymaktivität in der eingesetzten Rohmilch (A 0 ) kann dabei bedingt durch Laktationscharakteristika(wie Laktationsphase) oder die unterschiedliche bakterielle Belastung der Proben starkenSchwankungen unterliegen (siehe Abbildung 3.3- 24 a für proteolytische und b für lipolytische Aktivität).Lipaseaktivität [U/ml]0,250,200,150,100,05aGeschProteaseaktivität [U/ml]0,60,50,40,30,20,1b0,000,01 2 3 4 50 1 2 3 4 5VersuchstagVersuchstagAbbildung 3.3- 24: Unterschiede der Enzymaktivität von Lipasen (a) und Proteasen (b) in RohmilchHöhere Aktivitäten der (hitzestabilen) Enzyme im Ausgangsprodukt (Rohmilch) resultieren dabei auchin einer höheren Enzymaktivität im End- bzw. MF+PAST-Produkt. Die enzymatischen Restaktivitätender unterschiedlichen Versuchsreihen sind somit direkt vergleichbar, die Absolutwerte der Enzymaktivitätkönnen dahingegen (in Abhängigkeit vom Rohmilchstatus) variieren. Die in den folgenden Diagrammenangegebenen Mittelwerte und Standardabweichungen zur direkten Enzymaktivität oder enzymatischfreigesetzten Produkten resultieren deshalb aus der parallelen Analyse mehrerer Proben einesVersuchs und nicht aus in unterschiedlichen Versuchsreihen ermittelten Werten. Die ausgewähltenDarstellungen im Folgenden spiegeln somit beispielhaft die tendenziellen enzymatischen Veränderungender in verschiedenen Versuchsreihen hergestellten und analysierten Milchen wieder.Die im Produkt vorhandene Restaktivität nach der (unter Standardbedingungen durchgeführten)MF+PAST liegt bei den proteolytischen Enyzmen noch bei über 80% und die der lipolytischen beträgtetwa 65%. Bakteriell freigesetzte Proteasen und Lipasen weisen eine ähnlich hohe Hitzestabilität auf(Chen 2003). Die vergleichsweise höhere proteolytische Restaktivität lässt sich somit auf die thermischeStabilität der originär in der Rohmilch vorhandenen Proteasen (v.a. Plasmin) zurückzuführen,zumal die originäre Milch-Lipoproteinlipase bereits durch eine HTST vollständig inaktiviert ist (Farkye1995). Bei der grafischen Darstellung der Protease- und Lipaseaktivität werden deshalb im Folgendenzur besseren Veranschaulichung unterschiedliche Skalierungen der y-Achsen gewählt.36

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererIn Abbildung 3.3- 25 ist die Veränderung der lipolytischen (a) und proteolytischen (b) Aktivität imMF+PAST-Produkt in Abhängigkeit von der Lagerzeit dargestellt. Während der Lagerung ändert sich(bei einer Kühltemperatur von ≤10 °C und unter Abwesenheit bestimmter Keime) die Enzymaktivitätim MF+PAST-Produkt i.d.R. kaum. Somit werden von den üblicherweise im Endprodukt vorhandenenKeimgruppen (wie Microbacterium ssp. → vgl. Ergebnisse ZIEL-M) meist keine Enzyme freigesetzt.Die Anwesenheit spezifischer, psychrotropher Keimgruppen (wie Paenibacillus ssp) kann jedoch in einerFreisetzung von extrazellulären bakteriellen Enzymen und deren Anreicherung im Produkt resultieren(siehe Abschnitt zum Einfluss vorgelagerter Faktoren).0,15a0,4bLipaseaktivität [U/ml]0,100,050,00MF (1,4 µm)+ PAST (73°C/25 s)Proteaseaktivität [U/ml]gelagert bei 10°Cgelagert bei 10°C0,00 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25Lagerzeit [Tage]Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 25: Veränderung der lipolytischen (a) und proteolytischen (b) Enzymaktivitätwährend der Lagerung von MF+PAST-Milch0,30,20,1MF (1,4 µm)+ PAST (73°C/25 s)Die (Rest-)Aktivität der Proteasen und Lipasen bringt im Lagerungsverlauf eine Zunahme an enzymatisch(hydrolytisch) freigesetzten Spaltprodukten mit sich. Diese Spaltprodukte (freie Aminogruppenund freie Fettsäuren) bzw. deren weitere physiko-chemische (oxidative) Umsetzung haben ab bestimmtenKonzentrationen im Produkt sensorische Veränderungen zur Folge. Die in den folgendenDiagrammen angegebenen Grenzen detektierbarer sensorischer Veränderungen (Grenze d. sens. Veränd.)spiegeln dabei die Schwellenwerte wieder, ab denen von einem ungeschulten Testpanel geschmacklicheAbweichungen vom frisch pasteurisierten Produkt (signifikant) festgestellt werden können.Von geschulten Testpersonen kann jedoch bereits bei niedrigeren Gehalten an diesen Spaltproduktenein entsprechender „off-flavour“ im Produkt wahrgenommen werden.Abbildung 3.3- 26 zeigt den Anstieg an lagerungsabhängig, proteolytisch freigesetzten Aminogruppenim MF+PAST-Produkt, aufgetragen als Äquivalentkonzentration des Dipeptides Tyrosyl-Leucin. DieProteasereaktion führt in Milch bekanntermaßen zur Freisetzung von Tyrosin/-derivaten und nachJuffs (1975) oder Adams (1975) korreliert insbesondere der Tyrosingehalt mit der Ausprägung einesFehlgeschmacks wie bitter oder sauer. Bei (kühlgelagerter) MF+PAST-Milch wird jedoch bis t=30 Tageder Gehalt an insgesamt enzymatisch freigesetzten Aminogruppen, der mit einem bitteren Fehlgeschmackkorreliert, meist nicht erreicht. Die detektierbare Menge an von bakteriellen Enzymen freigesetztenProteolyseprodukten beträgt dabei nur etwa 25% der insgesamt im Produkt vorliegendenfreien Aminogruppen. Die während der Lagerung stattfindenden proteolytischen Umsetzungen inMF+PAST-Milch sind folglich hauptsächlich durch die originär in der Milch vorhandenen Proteasen(Plasmin) verursacht.37

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererFreie Aminogruppen [equiv mmol/ml]2,52,01,51,00,5Grenze Fehlgeschmack detektierbarersensorischer VeränderungenMF (1,4 µm)+ PAST (73°C/25 s)gelagert bei 10°C0,00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]insgesamtenzymatischfreigesetztbakteriellAbbildung 3.3- 26: Proteolytische Veränderungen während der Lagerung von MF+PAST-MilchDie Spaltprodukte der enzymatischen Lipolyse (freie Fettsäuren; FFA) nehmen während der Lagerungvon MF+PAST-Milch ebenfalls zu (vgl. Abbildung 3.3- 27) und oftmals wird bereits nach etwa 18-21 Tagen eine Menge an FFA erreicht, die geschmackliche Beeinträchtigungen mit sich bringt. Die lipolytischeFreisetzung v.a. kurz- und mittelkettiger Fettsäuren hat in Milch ranzige, käsige oder auchleicht bittere Geschmackskomponenten zur Folge (Deeth&Fitz-Gerald 1995).6Freie Fettsäuren [µequiv/ml]5432Grenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.1MF (1,4 µm)gelagert bei 10°C+ PAST (73°C/25 s)00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 27: Lipolytische Veränderungen während der Lagerung von MF+PAST-MilchIm Hinblick auf die Haltbarkeit erweist sich bei MF+PAST-Milch folglich meist die (Rest-)Aktivität der(hitzestabilen) bakteriellen lipolytischen Enzyme als problematisch. Darüber hinaus führen die bei diesemVerfahrensmodus erforderliche separate Hocherhitzung der Rahmfraktion und/oder auch dieScherung beim Umpumpen zu einer Veränderung der Fettkugeloberfläche (Deeth & Duncan 2005)und somit zueiner besseren Zugänglichkeit der Fettphase für den Enzymangriff.Die lipolytisch freigesetzten (ungesättigten) Fettsäuren unterliegen zudem verstärkt der Lipidoxidation,was mit der Bildung von Ketonen oder Aldehyden einhergeht und eine weitere (sensorische) Beeinträchtigungder Produktqualität mit sich bringt. Nach Shipe (1980) oder Barrefors (1995) treten alsFolge der Lipidoxidation kartonartige oder metallische (Fehl-)Geschmacksrichtungen auf. InMF+PAST-Milch ist (leicht zeitversetzt) zur Lipolyse häufig eine fortlaufende Zunahme der Lipidoxidationbzw. der TBA(Thiobarbitursäure)-reaktiven sekundären Oxidationsprodukte detektierbar und als38

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererFolge davon tritt nach t≥20 Tage ein kartonartiger und/oder metallischer Fehlgeschmack im Produktauf (vgl. Abbildung 3.3- 28).→ TBA-reaktive SubstanzenAbsorption 532nm [-]0,100,08Grenze d. sens. Veränd.0,060,040,02MF (1,4 µm)gelagert bei 10°C+ PAST (73°C/25 s)0,000 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 28: Lipidoxidation bei MF+PAST-Milch in Abhängigkeit von der LagerzeitDie Haltbarkeit der MF+PAST-Milch ist somit auch bei einer Kühllagerung (ϑ≤10 °C) durch Beeinträchtigungder sensorischen Wertigkeit und somit Genussfähigkeit auf etwa 18-21 Tage begrenzt. Diesensorischen Veränderungen sind dabei auf enzymatische (v.a. lipolytische) Reaktionen gefolgt voneiner Umsetzung der daraus resultierenden Spaltprodukte (Fettoxidation) und somit auf ein Zusammenwirkenbiochemischer und physiko-chemischer Veränderungen im Produkt zurückzuführen.Die enzymatisch bedingten Veränderungen sind in sämtlichen der untersuchten MF+PAST-Milchen detektierbar,allerdings oftmals in unterschiedlich starker Ausprägung. Diesbezüglich sind nicht nur Unterschiedezwischen den an unterschiedlichen Versuchstagen hergestellten Proben feststellbar, sondernz.T. besteht auch eine Diversität zwischen den am selben Tag und unter denselben Bedingungenproduzierten Milchen.Abbildung 3.3- 29 a zeigt dies beispielhaft für die lipolytische Freisetzung der FFA bei an verschiedenenVersuchstagen (1-3) hergestellten MF+PAST-Milchen. Die Zunahme an FFA verläuft bei den verschiedenenVersuchsreihen unterschiedlich schnell und die Fehlgeschmacks- und Haltbarkeitsgrenzewird folglich zu unterschiedlichen Lagerzeitpunkten (zwischen t=15 und 20 Tagen) erreicht. AnfangsundEndgehalt (an t=0 bzw. 21 Tagen) der jeweilig im Produkt detektierbaren lipolytischen Spaltproduktekorrelieren dabei nicht. Entsprechendes ist, wie aus Abbildung 3.3- 29 b ersichtlich, für diewährend der Lagerung stattfindenden proteolytischen Veränderungen und daraus resultierenden(u.U. haltbarkeitsbegrenzenden) geschmacklichen Beeinträchtigungen feststellbar.39

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererFreie Fettsäuren [µequiv/ml]5432aGrenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.Versuchsreihe 2Versuchsreihe 3Versuchsreihe 11MF (1,4 µm)+ PAST (73°C/25 s)gelagert bei 10°C00 5 10 15 20 25Lagerzeit [Tage]0,5MF (1,4 µm)+ PAST (73°C/25 s)gelagert bei 10°C0,00 5 10 15 20Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 29: Vergleich der Lipolyse (a) und Proteolyse (b) von MF+PAST-Milchunterschiedlicher Versuchreihen (1-3)Folglich lässt die Ausgangskonzentration (bei t=0) an enzymatischen Spaltprodukten bzw. die imRohprodukt vorhandene Enzymaktivität keine eindeutigen, quantitativen Rückschlüsse auf die Lagerstabilitätder MF+PAST-Milch zu. Im Lagerungsverlauf können durch die Freisetzung (extrazellulärer)bakterieller Enzyme weitere Veränderungen der in der Milch vorliegenden Enzymaktivität auftreten,die sich dann wiederum auf die proteolytischen und lipolytischen Umsetzungen und somit die Haltbarkeitauswirken. In den Milchproben der Versuchsreihe 2 waren beispielsweise ab einer Lagerzeitvon 10 Tagen vergleichsweise höhere Aktivitäten an (bakteriellen) Lipasen und Proteasen detektierbar.Solche haltbarkeitsrelevanten Enzymen werden dabei im Endprodukt allerdings nur von bestimmtenKeimgruppen freigesetzt.Ähnliche produktspezifische Abweichungen in den haltbarkeitslimiterenden, enzymatischen Veränderungenkonnten auch bei industriell hergestellten MF+PAST-Milchen festgestellt werden.Abbildung 3.3- 30 zeigt beispielhaft die unterschiedlichen Gehalte an während der Lagerung lipolytisch(a) und proteolytisch (b) freigesetzten Stoffgruppen von industriellen Milchproben (1-4) derselbenCharge. Eine Proben (4) weist (ab einer Lagerzeit von t= 15 Tage) vergleichsweise höhere Gehaltean enzymatischen Spaltprodukten auf und unterliegt somit einem frühzeitigeren (sensorischen)Produktverderb als die anderen Milchen (1-3) derselben Charge.Freie Aminogruppen [equiv mmol/ml]2,52,01,51,0bGrenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.Versuchsreihe2Versuchsreihe 1Versuchsreihe 3Freie Fettsäuren [µequiv/ml]6543a4132Grenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.21MF (1,4 µm)+ PAST (73°C/25 s)gelagert bei 10°C00 5 10 15 20Lagerzeit [Tage]Freie Aminogruppen [equiv. mmol/ml]2,5b42,0FehlgeschmackGrenze d. sens. Veränd.1 321,5MF (1,4 µm)1,0+ PAST (73°C/25 s)gelagert bei 10°C0,54 312 0,00 5 10 15 20Lagerzeit [Tage]enzymatischfreigesetzt:insgesamtbakteriellAbbildung 3.3- 30: Vergleich der Lipolyse (a) und Proteolyse (b)bei industriell hergestellten MF+PAST-Milchen (1-4) einer Charge40

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererIn den vorzeitig nicht mehr genusstauglichen Proben konnten im Vergleich zu den anderen Milchen(1-3) nicht nur höhere und im Lagerungsverlauf ansteigende Enzymaktivitäten der Lipasen (vgl.Abbildung 3.3- 31 a) und/oder Protesen (Abbildung 3.3- 31 b), sondern auch eine abweichende Zusammensetzungder Keimflora (vgl. Ergebnisse ZIEL-M) nachgewiesen werden. Die Freisetzung bakteriellerEnzyme durch bestimmte im Endprodukt vorliegende Keimgruppen und deren Umsetzungsreaktionenkann folglich die Haltbarkeit der MF+PAST-Milch entscheidend beeinflussen bzw. beeinträchtigen.Einige Bakteriengruppen setzen dabei gleichzeitig proteolytische und lipolytische Enzyme frei, anderewiederum produzieren nur spezifische extrazelluläre Enzyme (Priest 1977).Lipaseaktivität [U/ml]0,120,100,080,060,04a0,02MF (1,4 µm)gelagert bei 10°C+ PAST (73°C/25 s)0,000 5 10 15 20 25Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 31: Vergleich der Lipase- (a) und Proteaseaktivität (b)industriell hergestellter MF+PAST-Milch einer ChargeDa insbesondere bei den industriell hergestellten und aseptisch abgefüllten Milchen Rekontaminationenwährend der Abfüllung und Verpackung weitestgehend ausgeschlossen werden können, ist davonauszugehen, dass die hierfür relevanten, enzymbildenden Spezies bereits in der Rohmilch vorliegen,durch die MF+PAST nicht inaktiviert werden und sich im Laufe der Lagerung im Produkt anreichernkönnen.Weiterführende Untersuchungen haben gezeigt, dass es insbesondere beim Vorliegen von Paenibacillusssp. zu einem Anstieg der Enzymaktivität im Lagerungsverlauf kommt. Ab Proteaseaktivitäten von≥0,32 U/ml und/oder einer Lipaseaktivität von mehr als 0,09 U/ml resultieren die enzymatischen Umsetzungsreaktionenunmittelbar in verstärkten Beeinträchtigungen der Produktqualität (Fehlgeschmack)und haben eine deutliche Verringerung der Haltbarkeit (um bis zu fünf Tage) zur Folge.Welche prozesstechnischen oder dem eigentlichen Herstellprozess vor-/nachgelagerten Faktoren(Rohmilch, Lagerbedingungen) die Enzymaktivität und/oder die Lagerstabilität von MF+PAST-Milchbeeinflussen, wird im Folgenden näher erläutert.Einfluss vorgelagerter Faktoren (Rohmilchqualität)34120,00 5 10 15 20 25Lagerzeit [Tage]Die mikrobielle und enzymatische Qualität der eingesetzten Rohmilch wirkt sich ursächlich auf diespätere Lagerstabilität des MF+PAST-Produkts aus. Höhere Ausgangskeimzahlen (v.a. an bestimmtenKeimgruppen) in der Rohmilch und/oder eine stärke Belastung mit lipolytischen und/oder proteolytischenEnzymen (z.B. aufgrund längerer Vorstapelung der unbehandelten Milch vor der Verarbeitung)können dabei die mikrobielle und/oder die sensorische Haltbarkeit beeinträchtigen.Proteaseaktivität [U/ml]0,40,30,20,1bgelagert bei 10°C3MF (1,4 µm)+ PAST (73°C/25 s)41241

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererZum einen können höhere Keimzahlen (v.a. an hitzestabilen, gram-positiven Mikroorganismen) imRohprodukt in einer stärkeren Keimbelastung der Milch nach der MF+PAST resultieren. Eine schlechteremikrobielle Ausgangsqualität der „frisch“ hergestellten MF+PAST-Milch (an t=0) resultiert wiederumin einem vergleichsweise schnelleren Keimwachstum während der Lagerung und somit demfrüheren Erreichen der (mikrobiellen) Haltbarkeitsgrenze von 10 6 KbE/ml (siehe Abbildung 3.3- 32).Bei guter Rohmilchqualität wirken sich hingegen (ohne Rekontaminationen im down-stream-Prozess)die lagerungsabhängigen mikrobiellen Veränderungen nicht haltbarkeitslimitierend aus.1e+7 10 7Gesamtkeimzahl [KbE/ml]1e+6 10 61e+5 10 51e+4 10 41e+3 10 31e+2 10 210MF (1,4 µm)+ PAST (73°C/25 s)gelagert bei 10°C00 5 10 15 20 25Lagerzeit [Tage]1e+11e+0HaltbarkeitsgrenzeN 0 = 7,3·10 5 KbE/mlN 0 = 3,1·10 3 KbE/mlAbbildung 3.3- 32: Mikrobielle Lagerstabilität von MF+PAST-Milchbei unterschiedlicher Ausgangskeimzahl (N 0 )Im Hinblick auf die Lagerstabilität ist es jedoch nicht nur relevant, wie viele Keime, sondern zum anderenauch, welche (hitzestabilen) Spezies sich im Produkt befinden bzw. wie sich die Keimflora zusammensetzt(vgl. Ergebnisse ZIEL-M). Manche Mikroorganismengruppen (wie Microbacterium ssp.)erweisen sich beispielsweise aufgrund ihres vergleichsweise langsamen Wachstums (bei Kühllagerung)als weniger haltbarkeitslimitierend, andere Spezies (v.a. Bacillus ssp.) hingegen können sich(auch bei anfänglich geringen Keimkonzentrationen) verhältnismäßig schnell in dem keimarmenMF+PAST-Produkt (→ Fehlen der Konkurrenzflora) vermehren, durchsetzen und dadurch die mikrobielleHaltbarkeit stark limitieren. Besonders stoffwechselaktive (enzymbildende) Keimgruppen (wiePaenibacillu ssp.) können sich zudem nicht nur durch ihre Vermehrung im, sondern auch durch dieFreisetzung extrazellulärer Proteasen und Lipasen an das Produkt negativ auf die Haltbarkeit auswirken.Nicht nur die Freisetzung bakterieller Enzyme im Laufe der Lagerung kann die Haltbarkeit beeinträchtigen,sondern diesbezüglich ist auch die enzymatische Qualität der jeweilig eingesetzten Rohmilchentscheidend. Die lagerungsbedingte, enyzmatische Freisetzung von Fettsäuren oder Aminogruppenkorreliert somit mit der Aktivität der Lipasen und Proteasen im MF+PAST-Produkt. Bei hoher enzymatischerAusgangsbelastung bzw. Aktivität (A 0 ) in der Rohmilch (z.B. durch längere Vorstapelung →Wachstum und Stoffwechselaktivität psychrotropher Keime wie Pseudomonas ssp.) sind bereits im„frisch“ hergestellter MF+PAST-Milch höhere (Rest-)Enzymaktivitäten und infolgedessen vermehrtbiochemische Umsetzungen während der Lagerung detektierbar. Abbildung 3.3- 33 zeigt diese Zusammenhängezwischen enzymatischer Rohmilchqualität (A 0 ) und lipolytischen (a) sowie proteolytischen(b) Veränderungen im Lagerungsverlauf.42

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererFreie Fettsäuren [µequiv/ml]5432aGrenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.1MF (1,4 µm)+ PAST (73°C/25 s)gelagert bei 10°C00 5 10 15 20 25Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 33: Lipolytische (a) und proteolytische (b) Veränderungen während der Lagerungvon MF+PAST-Milch bei unterschiedlicher enzymatischer Qualität der Rohmilch (A 0 )Die für ESL-Milch eingesetzte Rohmilch sollte also nicht länger vorgestapelt werden, um sowohl haltbarkeitslimitierendehohe Keimzahlen als auch hohe Enzymaktivitäten im Endprodukt zu vermeiden.Darüber hinaus stellt im Hinblick auf die Lagerstabilität der ESL-Milch die (aseptische) Abfüllung bzw.die Vermeidung von Rekontaminationen im Downstream-Prozess einen wesentlichen Aspekt dar. Inden keimarmen ESL-Produkten können sich rekontaminierende Mikroorganismen (aufgrund der fehlendenenKonkurrenzflora) schnell anreichern bzw. vermehren und durch Wachstum oder Stoffwechselaktivitäteinen frühzeitigen Produktverderb induzieren. Risiko und Zeitpunkt des Verderbs hängendabei von Spezies/Art und Keimzahl des Rekontaminationskeims ab (Weber 1996).Prozesstechnische EinflussfaktorenFiltrationsbedingungenA 0 = 0,1 U/mlA 0 = 0,08 U/mlFreie Aminogruppen [equiv mmol/ml]2,52,01,51,00,5Grenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.MF (1,4 µm)+ PAST (73°C/25 s)gelagert bei 10°C0,00 5 10 15 20 25Lagerzeit [Tage]A 0 = 0,33U/mlA 0 = 0,28 U/mlIm Rahmen des AP II a wurde bereits festgestellt, dass sich unter anderem die Filtrationsbedingungenund dabei insbesondere die Filtrationstemperatur auf den Entkeimungseffekt auswirkt. Aufgrundadditiv zur mechanischen Keimrückhaltung auftretender thermischer Effekte konnten bei höheren MF-Temperaturen geringere Permeatkeimzahlen festgestellt werden. Unterschiede in den Gesamtkeimzahlennach der MF wirken sich jedoch nicht unmittelbar auf Keimgehalt und -wachstum imMF+PAST-Produkt aus. Häufig können in Milchproben, die bei unterschiedlichen Temperaturen mikrofiltriert(ϑ=10 und 55 °C) und anschließend bei gleichen ϑ/t-Bedingungen pasteurisiert wurden, ähnlicheKeimgehalte und lagerungsabhängige Entwicklungen detektiert werden (vgl. Abbildung 3.3- 34),da nach dem Kombiverfahren nur hitzestabile Keime (z.B. Bacillu ssp. oder Microbacterium ssp.) imProdukt verbleiben. Divergierende Gehalte an in der MF-Milch enthaltenen gram-negativen, hitzelabilenMikroorganismengruppen können somit durch den Pasteurisierungsprozess kompensiert werden.benzymatischfreigesetzt:insgesamtbakteriell43

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Scherer100004Gesamtkeimzahl [KbE/ml]10003MF bei ϑ=10°CMF bei ϑ=55°C100210 1 MF (1,4 µm)Abbildung 3.3- 34: Einfluss der Filtrationsbedingungen (ϑ) auf mikrobiologische Veränderungenwährend der (Kühl-)Lagerung von MF+PAST-MilchFür die Haltbarkeit der MF+PAST-Milch sind somit weniger die Keimgehalte nach der MF als vielmehrdie im Produkt vorhandenen Keimspezies entscheidend. Eine spezifische Abtrennung bestimmter(haltbarkeitsrelevanter bzw. enzymbildender) Keimgruppen mittels MF ist jedoch nicht möglich (vgl.AP II a).Der Filtrationsprozess wirkt sich zudem (unabhängig von den eingesetzten Bedingungen) nicht auf dieim Endprodukt vorhandenen Enzymaktivitäten aus. Die Restaktivitäten der Proteasen und Lipasenwerden durch den MF-Prozess nicht verringert und betragen in mikrofiltrierter Milch mehr als 99,5%.Einfluss der Pasteurisationsbedingungen+ PAST (73°C/25 s)gelagert bei 10°C10 5 10 15 20Lagerzeit [Tage]Die haltbarkeitslimitierenden Veränderungen hängen von der Restaktivität der Enzyme nach derMF+PAST ab. Folglich stellt sich die Frage, ob und in wie weit eine Variation der Pasteurisationsbedingungen(im Bereich von ϑ=70-90 °C und t=15-30 s) die Enzymaktivität und somit die Haltbarkeitbeeinflussen kann.Abbildung 3.3- 35 a und b zeigt die Restenzymaktivitäten von gleich mikrofiltrierten, aber bei unterschiedlichenϑ/t-Bedingungen pasteurisierten Proben. Die Enzyminaktivierung in Milch erfolgt nacheiner Reaktion 1.Ordnung (Chen 2003). Die milcheigene Lipoproteinlipase ist bei Temperaturen imPAST-Bereich bereits nach wenigen Sekunden vollständig inaktiviert, wohingegen die originären Proteasen(Plasmin) eine hohe Hitzestabilität aufweisen und nach einer HTST kaum Aktivitätsverlusteauftreten (Alichanidis 1986). Somit wirken sich die ϑ/t-Bedingungen im PAST-Bereich v.a. auf die Inaktivierungder bakteriell freigesetzen Enzyme aus. Eine Variation der Erhitzungsbedingungen im Bereichder herkömmlichen Kurzzeiterhitzung (ϑ/t=70-75 °C/10-30 s) beeinflusst die Restaktivität derLipasen (von ~65%) und Proteasen (von ~80%) dabei nicht signifikant (Abbildung 3.3- 35). Durcheine Erhöhung der Pasteurisationstemperatur auf 90 °C lassen sich im Vergleich dazu bei Heißhaltezeitenvon mehr als 10 s die Enzymaktivitäten auf weniger als 60% bei den Lipasen bzw. 70% beiProteasen verringern.44

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererRestaktivität Lipasen [%]10080604020MF (1,4 µm)+ PAST00 5 10 15 20 25 30 35Heißhaltezeit [s]90°C70°C75°Ca73°CRestaktivität Proteasen [%]1008060402070°C73°CMF (1,4 µm)+ PAST00 5 10 15 20 25 30 35Heißhaltezeit [s]90°C75°CbAbbildung 3.3- 35: (Rest-)Enzymaktivitäten der Lipasen (a) und Proteasen (b)in Abhängigkeit von den PasteurisationsbedingungenGeringere Enzymaktivitäten im „frisch“ hergestellten Produkt resultieren (falls während der anschließendenLagerung keine weiteren bakteriellen Enzyme an die Milch abgegeben werden) in einer vergleichsweiselangsameren Freisetzung der lipolytischen und proteolytischen Spaltprodukte im Lagerungsverlauf.Aufgrund der ähnlich hohen Restaktivitäten direkt nach der MF+PAST (an t=0) bestehenallerdings keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich lagerungsbedingter, enzymatischer Veränderungenzwischen den bei unterschiedlichen Bedingungen (d.h. ϑ=70-75 °C/t=10-30 s) kurzzeiterhitztenMilchen.Die Kombination aus MF und einer klassischen Hocherhitzung (HE; ϑ>85 °C bei t≥10 s) kann allerdingsdurch die vergleichsweise stärkere Reduktion der Enzymaktivitäten und daraus resultierendengeringfügigeren hydrolytischen Umsetzungen während der Lagerung zu einer weiteren Haltbarkeitsverlängerung(um etwa vier Tage) führen. In Abbildung 3.3- 36 sind die Unterschiede in der Freisetzungvon Fettsäuren (a) und Aminogruppen (b) bei MF+PAST- und MF+HE-Milch grafisch verdeutlicht.Freie Fettsäuren [µequiv/ml]6543aMF+PAST (73°C/25 s)Grenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.MF+HE (90°C/15 s)21gelagert bei 10°C00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Freie Aminogruppen [equiv mmol/ml]2,52,01,5bGrenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.MF+PAST (73°C/25 s)MF+HE (90°C/15 s)1,00,5gelagert bei 10°C0,00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 36: Enzymatisch (lipolytisch a und proteolytisch b) bedingte Veränderungenin MF+PAST- und MF+HE-MilchDiesbezüglich ist jedoch zu berücksichtigen, dass eine Erhitzung der (MF-)Milch im klassischen Bereichder HE bereits zur Ausprägung eines (wenn auch geringfügigen) Kochgeschmacks im Produkt45

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererführt. Die vergleichsweise längere Haltbarkeit von MF+HE-Milch geht also mit einer Beeinträchtigungder sensorischen Wertigkeit („frischer“ Milchgeschmack) einher.Die im Vergleich zum herkömmlichen MF+PAST-Milch verlängerte Haltbarkeit nach der MF+HE beiwird zudem nur erreicht, falls im Produkt keine (hitzestabilen) enzymbildenden Keimgruppen vorliegenund/oder auskeimen. Gerade Bacillus ssp. oder Paenibacillus ssp. bzw. deren Sporen weisen jedocheine hohe Hitzestabilität auf und lassen sich folglich auch durch eine klassische HE nicht vollständiginaktivieren.Die enzymatische Ausgangsbelastung der Rohmilch einerseits und die Veränderungen der enyzmatischenAktivität während der Lagerung (durch Freisetzung bakterieller Enzyme) andererseits sind somitauch bei und im Zusammenwirken mit einer Variation der Pasteurisationsbedingungen entscheidendfür die Lagerstabilität des ESL-Produkts.Einfluss der Prozessschrittreihenfolge von MF und PASTNach Flemming (1997) oder Defrise & Gekan (1988) können sich stoffwechselaktive Mikroorganismenauf Membranoberflächen ablagern und – insbesondere bei längeren Anlagenstandzeiten – Biofilmeausbilden. Um das Kontaminationsrisiko des Permeats beim Membrandurchtritt mit den Stoffwechselproduktenund somit proteolytischen/lipolytischen Enzymen dieser biofilmbildenden Mikroorganismenzu reduzieren, stellte die Umkehrung der Prozessschrittreihenfolge bzw. eine der MF vorgeschalteteKurzzeiterhitzung einen möglichen Lösungsansatz dar.Bei der Filtration der vorgängig pasteurisierten Magermilch ist im Vergleich zum vorher nicht thermischbehandelten Rohprodukt eine Fluxverringerung um etwa 30% sowie einen rascher Fluxabfall(Halbierung innerhalb von 90 Minuten) zu verzeichnen (vgl. Abbildung 3.3- 37). Die Ursache für dendeutlich verringerten bzw. mit zunehmender Filtrationsdauer immer weiter stagnierenden Flux beipasteurisierter im Vergleich zu roher Milch ist die thermisch induzierte Denaturierung bzw. Veränderungder Reaktivität der Molkenproteine (freie SH-Gruppen), die eine erhöhte Proteinadsorption ander Membran bei PAST-Milch zur Folge hat.800rohFlux [lm -2 h -1 ]600400200MF-UTP (1,4 µm):ϑ=50°CΔp TM =0,2 barτ W =150 Papasteurisiert+ PAST (73°C/25s)00 1 2 3 4 5Filtrationszeit [h]Abbildung 3.3- 37: Fluxverlauf während der Entkeimungsfiltrationvon roher und pasteurisierter MagermilchHinsichtlich der Keimgehalte unterscheiden sich die mittels verschiedener Prozessschrittreihenfolgenhergestellten ESL-Milchen im Wesentlichen nicht voneinander. Die Reihenfolge von MF und PASTwirkt sich unabhängig von der (mikrobiologischen) Rohmilchqualität auch nicht auf die Enzymaktivitätim Endprodukt aus. Auch während längerer Filtrationszyklen (im Kreislauf) ist, wie in Abbildung46

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererAbbildung 3.3- 38 beispielhaft für die Proteaseaktivität dargestellt, keine signifikante Zunahme derEnzymaktivität im MF-Permeat nachweisbar. Ein geringfügiger Anstieg der enzymatischen Aktivität innerhalblanger Filtrationszeiten ist jedoch nicht nur im Permeat, sondern auch im Retentat und in ausdem Vorlaufbehälter entnommenen Milch zu detektieren. Dies lässt den Rückschluss zu, dass es auchwährend der Filtration von roher Magermilch nicht zu einer Kontamination des Filtrates mitbakteriellen Enzymen beim Membrandurchtritt kommt.0,25Proteaseaktivität [U/ml]0,200,150,100,05MFPAST+MFMF+PASTMF (1,4 µm):ϑ=55°CΔp TM =0,2 barτ W =150 Pa+ PAST (73°C/25s)0,000 2 4 6 8 10 12Filtrationszeit [h][Stunden]Abbildung 3.3- 38: Proteolytische Aktivität in MF(+PAST)-Milchin Abhängigkeit von Filtrationszeit und ProzessschrittreihenfolgeDarüber hinaus gleichen sich die Enzymaktivitäten (in den nach unterschiedlicher Filtrationszeitenentnommenen) MF/PAST- und PAST/MF-Proben.Folglich bringt die Umkehrung der Prozessschrittreihenfolge von MF und PAST (auch bei längeren Filtrationszyklen)keine Zugewinne hinsichtlich der Lagerstabilität und -qualität der Milch mit sich underweist sich aufgrund der Fluxeinbußen auch im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens alsnachteilig.Einfluss nachgelagter Faktoren (Lagertemperatur)Enzymatische Umsetzungen hängen nicht nur von der Konzentration bzw. Restaktivität der im Produktvorhandenen Enzyme ab, sondern finden zudem temperaturabhängig statt (Töpel 2000). Somitspielt im Hinblick auf die Haltbarkeit der MF+PAST-Milch auch die (Kühl-)Lagertemperatur eine entscheidendeRolle.In Abbildung 3.3- 39 sind die lipolytischen (a) und proteolytischen (b) Veränderungen während derLagerung von MF+PAST-Milch (derselben Versuchsreihe) bei unterschiedlichen Kühltemperaturen von4, 8 und 10 °C dargestellt. Obwohl die verschiedenen Proben weder in Abhängigkeit von der Kühltemperaturnoch von der Lagerdauer signifikante Unterschiede in den Enzymaktivitäten und jeweilsmit dem „frisch“ hergestellten Produkt vergleichbare Proteaseaktivitäten von etwa 0,28 U/ml bzw. Lipaseaktivitätenvon 0,08 U/ml aufweisen (Daten nicht gezeigt), hängt die enzymatische Freisetzungvon Fettsäuren und Aminogruppen von der Lagertemperatur ab. Bei niedrigeren Lagertemperaturensind sowohl Lipolyse als auch Proteolyse verlangsamt. Bei MF+PAST-Milch erweisen sich dabei unabhängigvon der Lagertemperatur v.a. die lipolytischen Veränderungen als als geschmacks- und somithaltbarkeitsbeeinträchtigend. Liegen bei einer Kühltemperatur von ϑ=10 °C bereits nach einer Lagerzeitvon etwa 18-21 Tagen die Mengen an FFA in den Milchproben vor, die mit der Ausprägung einesranzigen oder käsigen Fehlgeschmacks einhergehen, werden die entsprechenden (sensorischen)47

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererGrenzwerte bei einer Lagertemperatur von ϑ=8 °C erst nach ca. 22 Tagen und bei 4 °C nach etwa24-25 Tagen erreicht.Freie Fettsäuren [µequiv/ml]65432aGrenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.10°C4°C8°C1MF (1,4 µm)+ PAST (73°C/25 s)00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Freie Aminogruppen [equiv mmol/ml]2,52,01,51,00,5bGrenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.0,00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]10°C8°C4°CMF (1,4 µm)+ PAST (73°C/25 s)enzymatischfreigesetzt:insgesamtbakteriellAbbildung 3.3- 39: Lipolyse (a) und Proteolyse (b) bei MF(+PAST)-Milchin Abhängigkeit von der LagertemperaturEine Erhöhung der Lagertemperatur (im Bereich von 4 bis 10 °C) wirkt sich nicht nur steigernd aufdie biochemischen Umsetzungen, sondern auch auf die (darauf folgenden) physiko-chemischen Reaktionen(Lipidoxidation) aus. Je höher die Lagertemperaturen, umso mehr an diesen Folgereaktionenfinden statt (vgl. Abbildung 3.3- 40) und umso eher werden die mit einem kartonartigen oder metallischen„off-flavour“ korrelierenden Gehalte an TBA-reaktiven Substanzen erreicht. Dies ist zum einendarauf zurückzuführen, dass die Menge an FFA bzw. der Ausgangsprodukte dieser oxidativen Veränderungenin den unterschiedlich gelagerten Proben variiert und andererseits auch diese chemischphysikalischenUmsetzungen stark temperaturabhängig sind (Heedegard 2003).→ TBA-reaktive SubstanzenAbsorption 532nm[-]0,100,080,060,04FehlgeschmackGrenze d. sens. Veränd.10°C0,02MF (1,4 µm)+ PAST (73°C/25 s)0,000 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]8°C4°CAbbildung 3.3- 40: Lipidoxidation bei MF+PAST-Milch in Abhängigkeit von der LagertemperaturFolglich lässt sich (bei gleicher Rohmilchqualität und Prozessführung) lediglich durch Verringerung derLagertemperatur eine Verlangsamung der biochemischen sowie deren Folgereaktionen erzielen undsomit die Haltbarkeit von MF+PAST-Milch weiter (um bis zu sechs Tage) verlängern. Hierfür ist jedochdie konsequente Aufrechterhaltung der Kühlkette bei den entsprechend niedrigen Temperaturen unerlässlich.48

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererFazitDie Haltbarkeit von MF+PAST-Milch wird durch enzymatische (v.a. lipolytische) Reaktionen gefolgtvon der Umsetzung der daraus resultierenden Spaltprodukte (Fettoxidation) begrenzt. Dieses Zusammenwirkenbiochemischer und physiko-chemischer Produktveränderungen beeinträchtigt die sensorischeQualität der Milch (Ausprägung eines Fehlgeschmacks). Die (Rest-)Aktivität der Proteasenund Lipasen und somit die während der Lagerung stattfindenden enzymatischen Umsetzung hängendabei weniger von Prozessbedingungen und -schrittreihenfolge, als viel mehr von der (mikrobiologischenund enzymatischen) Qualität der eingesetzten Rohmilch und den Lagerbedingungen ab. Darüberhinaus spielt diesbezüglich auch der mikrobielle Status des Endproduktes (Florazusammensetzungbzw. Anwesenheit und Stoffwechselaktivität bestimmter enzymbildender Keimgruppen) eineentscheidende Rolle. Ohne Berücksichtigung all dieser Faktoren und deren Zusammenwirken lässtsich die Lagerqualität und -stabilität der (auch unter standardisierten Bedingungen hergestellten)MF+PAST-Milch weder eindeutig definieren noch vorhersagen. Diese Faktoren (und insbesondere dieZusammensetzung der Milchflora) sind jedoch nur zum Teil kontrollierbar bzw. nur durch aufwändigeAnalysenmethoden messbar und somit die aus der MF+PAST resultierenden ESL-Produkte kaumstandardisierbar. Die Angabe der Mindesthaltbarkeit von MF+PAST-Milch sollte unter Berücksichtigungdieser Aspekte bei max. 18-20 Tagen liegen, um auch im Hinblick auf die Verbraucherakzeptanz eindurchwegs qualitativ hochwertiges Produkt zu gewährleisten.Arbeitspaket II c: Prozessoptimierung HEVersuchsaufbau und AnalytikWie beim MF+PAST-Produkt erforderte auch die Prozessoptimierung der HE zunächst die Eruierunghaltbarkeitsbegrenzender oder -beeinflussender Faktoren. Deshalb wurde im Rahmen dieses Arbeitspaketesdie Hocherhitzung zunächst unter standardisierten Bedingungen (Einstellung des Fettgehaltesder Milch auf 1,5%, Vorerhitzung der Milch auf 80 °C gefolgt von der HE auf 127 °C für 2 s, Homogenisierung(zweistufig bei 150 und 50 bar) und Abfüllung unter der Laminar-Flow-Box) durchgeführtund die daraus resultierenden Proben (entsprechen AP III und IV) direkt nach der Herstellung sowiewährend der Lagerung bei einer Kühltemperatur von 10 °C auf ihre mikrobiologischen, enzymatischen,chemisch-physikalischen und sensorischen Eigenschaften untersucht. Im Anschluss an dieseVersuchsreihen wurden die vor- und nachgelagerten sowie prozesstechnischen Einflüsse auf die Produkteigenschaftenund -veränderungen bei HE-Milch eruiert.Herstellungs- und lagerungsbedingte ProduktveränderungenDie (im Vergleich zur MF+PAST) höher thermische Behandlung der HE induziert gleichermaßen beabsichtigte(Keim- und Enzyminaktivierung), wie auch unerwünschte (geschmackliche) Veränderungenim Produkt.So ergibt die sensorische Bewertung des HE-Produktes im Dreieckstest (n=8; α=0,05) bereits an t=0eine signifikante Abweichung von pasteurisierter Milch, v. a. hinsichtlich des Kochgeschmacks. Auchdie Erhebungen von Blake (1995), Rankin (2003) oder Rademacher & Hülsen (2005) weisen auf einen(insbesondere im direkten Vergleich zum HTST-Produkt) wahrnehmbaren Kochgeschmack in „frischer“HE-ESL-Milch hin. Nach einer Lagerzeit von 4-5 Tagen ist jedoch eine deutliche Verringerungund mit fortschreitender Lagerdauer eine weitere Reduktion des Kochgeschmacks zu verzeichnen.Nach Fink (1984) korreliert der Kochgeschmack in (UHT-)Milch mit dem Gehalt an freien SH-Gruppen.Wie aus Abbildung 3.3- 41 ersichtlich, findet beim HE-Produkt innerhalb der ersten Lagertage (bist=14 Tage) ein schneller Abbau an solchen, während des Herstellprozesses hitzeinduziert gebildeten,49

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererfreien Thiolgruppen bis unterhalb der Geschmacksschwelle (von ~20 µmol/l) statt. Hinsichtlich desKochgeschmacks kommt es somit im Lagerungsverlauf zu einer sensorischen Aufwertung des HE-Produktes. Diesbezüglich ist jedoch zu berücksichtigen, dass eine oxidative Umsetzung der freien SH-Gruppen nur bei Vorhandensein von (ausreichend) Sauerstoff im Produkt selbst oder im Kopfraum derVerpackung erfolgt. Zu hohe Sauerstoffgehalte können jedoch (oftmals in Verbindung mit Licht) imLagerungsverlauf zu weiteren unerwünschten Oxidationen (beispielsweise von Vitaminen oder Fettsäuren)führen. Die verpackungstechnischen Faktoren (Material bzw. Licht- und Luftdurchlässigkeit)können somit die Produktqualität der HE-Milch entscheidend beeinflussen.→ KochgeschmackFreie SH-Gruppen [µmol/l]8070605040302010HE (127°C/2 s)gelagert bei 10°CGrenze Geschmacksschwelled. sens. Veränd.00 5 10 15 20 25 30 35 40 45Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 41: Nachweis freier SH-Gruppen in HE-Milch in Abhängigkeit von der LagerdauerUnabhängig von den Verpackungsmodalitäten tritt jedoch nach einer Lagerzeit von etwa 25-30 Tagenim HE-Produkt ein Fehlgeschmack auf, der sich als „fruchtig/fermentiert“, „schal“, „adstringierend“und „säuerlich-bitter“ beschreiben lässt und die sensorische Wertigkeit des Produktes stark einschränktbzw. dessen Genussfähigkeit und Haltbarkeit begrenzt. Nach Shipe (1980) oder Bassette etal. (1982) können solche Geschmackskomponenten in Milch beispielsweise auf hohe Keimgehalte(≥10 5 KbE/ml) und/oder mikrobielle Stoffwechselvorgänge bzw. -produkte zurückgeführt werden. Inkühlgelagerter HE-Milch sind jedoch über die gesamte Lagerdauer hinweg (mittels Agarplattenmethode)keine vegetativen Keime nachweisbar. Sporen (wie Bacillus ssp.) können zwar durch eine ESL-HEnicht komplett inaktiviert werden (vgl. Ergebnisse ZIEL-M), keimen aber i.d.R. unter Kühllagerungnicht aus und sind somit nicht (stoffwechsel-)aktiv. Die Beeinträchtigung der sensorischen Wertigkeitder HE-Milch im Lagerungsverlauf kann somit nicht auf mikrobiologische bzw. muss auf andere (z.B.enzymatische) Verderbsmechanismen zurückgeführt werden.Die enzymatische Charakterisierung der HE-Milchproben direkt nach der Herstellung ergibt eine Restaktivitätder Proteasen von etwa 60-65% und 40% bei den lipolytischen Enzymen. Wie aus Abbildung3.3- 42 a und b ersichtlich, ist im Verlauf der Lagerung kein Anstieg der Enzymaktivitäten feststellbar.50

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererLipaseaktivität [U/ml]0,200,150,100,05aHE (127°C/2 s)gelagert bei 10°C0,000 10 20 30 40Lagerzeit [Tage]Proteaseaktivität [U/ml]0,50,40,30,20,1bHE (127°C/2 s)gelagert bei 10°C0,00 5 10 15 20 25 30 35 40 45Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 42: (Direkte) Enzymaktivität von Lipasen (a) und Proteasen (b)in HE-Milch in Abhängigkeit von der LagerdauerAufgrund der relativ niedrigen Proteaseaktivität ist während der Kühllagerung (sogar bis t≥30 Tage)nur eine geringfügige Zunahme an freien Aminogruppen (um etwa 20%) detektierbar, die zudem weitunterhalb des Fehlgeschmackslevels abläuft (vgl. Abbildung 3.3- 43). Untersuchungen von Jaspe &Sanjose (2008) haben zudem gezeigt, dass bei höher thermischen Behandlungen und somit auch imHE-Bereich denaturierte Molkenproteinen an die Oberfläche der Caseinmizelle binden, was mit einerBlockade der eigentlich für die Proteasen zugänglichen Peptidbindungen bzw. Angriffsstellen einhergehtund die Proteolyse verhindert bzw. verlangsamt. So steigt beispielsweise der Gehalt an insgesamtfreigesetzten (und somit pH 4,6-löslichen) proteolytischen Spaltprodukte von anfangs1,2 equiv mmol/ml innerhalb von vier Wochen Lagerung nur auf etwa 1,4 equiv mmol/ml an. Die Umsetzungder Proteine erfolgt dabei hauptsächlich durch das originär in der Milch vorhandene Plasminund ist nur zu etwa 30% auf die auch nach der HE im Produkt verbleibenden bakteriellen Proteasenzurückzuführen.2,5Freie Aminogruppen [equiv mmol/ml]2,0 Grenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.1,51,00,5insgesamtHE (127°C/2 s)enzymatischfreigesetztgelagert bei 10°Cbakteriell0,00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 43: Proteolytische Veränderungen während der Lagerung von HE-MilchWie aus Abbildung 3.3- 44 ersichtlich, findet bei HE-Milch auch eine lagerungsbedingte Lipolyse aufgrundder vergleichsweise niedrigen (Rest-)Enzymaktivität nur in geringem Maße statt. Da die HEhierbei (im Gegensatz zur Proteolyse) die Substratverfügbarkeit bzw. die Zugänglichkeit der Enzymean entsprechende Angriffsstellen beeinträchtigt, finden jedoch vergleichsweise mehr lipolytische als51

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererproteolytische Veränderungen während der Lagerung statt, die sich dabei allerdings (im Gegensatzzum Mf+PAST-Produkt) nicht als haltbarkeitslimitierend erweisen. Während der Lagerung steigt derGehalt an freien Fettsäuren um etwa 30% und liegt bis t≥30 Tage deutlich unterhalb derFehlgeschmacksgrenze von 3 µequiv/ml an (siehe Abbildung 3.3- 44).5Freie Fettsäuren [µequiv/ml]43 Grenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.21HE (127°C/2 s)gelagert bei 10°C00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 44: Lipolytische Veränderungen während der Lagerung von HE-MilchPhysiko-chemische Reaktionen hängen u.a. von den Konzentrationen der im Produkt vorhandenenAusgangsprodukte (Substrate) ab. Die über die gesamte Lagerdauer hinweg vergleichsweise niedrigenGehalte an FFA resultieren somit in einer geringfügigen Zunahme an oxidierten Fettsäuren (vgl.Abbildung 3.3- 45). Die entsprechenden Absorptionswerte (bei 532 nm) für die TBA-reaktiven Substanzenbetragen an t=30 Tage durchschnittlich 0,04 und der Schwellenwert für ein sensorisches Defizit(von 0,08) wird nicht erreicht.→ TBA-reaktive SubstanzenAbsorption 532nm0,120,100,080,060,04Grenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.HE (127°C/2 s)gelagert bei 10°C0,020,000 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 45: Lipidoxidation während der Lagerung von HE-MilchDie bei HE-Milch haltbarkeitslimitierenden Beeinträchtigungen der sensorischen Produktqualität sindfolglich (im Unterschied zu MF+PAST-Milch) i.d.R. nicht unmittelbar durch lipolytisch oder proteolytischbedingte Veränderungen zu erklären und/oder auf die physiko-chemische Umsetzung von enzymatischfreigesetzen Spaltprodukten zurückzuführen. Die sensorischen Veränderungen lassen sich jedochdurch spezifische (z.T. hitzeinduzierte) Veränderungen von Milchbestandteilen in Zusammenwirkenmit enyzmatischen Reaktionen erklären und ursächlich aus der Literatur ableiten. Die mit zunehmenderLagerdauer immer stärker ausgeprägten „fruchtig-fermentierten“ (Fehl-) Geschmackskompo-52

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Scherernenten sind dabei auf die Bildung von Ethylestern aus spezifischen Fettsäuren durch (hitzestabile)bakterielle Esterasen zurückzuführen [Hosono et al. 1974; Reddy et al. 1969]. Diese speziellen Enyzmewerden insbesondere von bestimmten Pseudomonas- (z.B. Pseudomonas fragi) oder Bacillus-Arten freigesetzt [Hosono & Elliot 1976]. „Adstringierende“ Komponenten in Milch resultieren nachLemieux & Simard (1994) oder Harwalker (1972) aus der thermisch induzierten Proteindenaturierung(im Zusammenspiel mit Milchsalzen) und deren proteolytischer Umsetzungen während der Lagerung(Bildung spezifischer Peptidverbindungen). Das Auftreten eines „schalen“ Geschmacks nach dem Abklingendes Kochgeschmacks lässt sich nach Thomas (1975) und Jeon et al. (1978; 1983) bei UHT-Milch auf die verschiedenen Produkte der Maillard-Reaktion und/oder deren oxidative Umsetzung zuflüchtigen Aldehyden zurückführen. Ein Zusammenspiel dieser verschiedenen (sensorischen) Veränderungenist bei HE-Milch zu vermuten.Weiterführende Untersuchungen haben gezeigt, dass sich (unter bestimmten Umständen) neben diesenspezifischen Produktveränderungen allerdings auch die proteolytischen und lipolytischen Umsetzungenals haltbarkeitsrelevant erweisen können. Welche prozesstechnischen oder dem eigentlichenHerstellprozess vor-/nachgelagerten Faktoren (Rohmilch, Lagerbedingungen) dabei die Enzymaktivitätund/oder die Lagerstabilität von HE-Milch beeinflussen, wird im Folgenden näher erläutert.Einfluss vorgelagerter Faktoren (Rohmilchqualität)Mittels ESL-HE können dezimale Keimreduktionen (N P /N 0 ) von ≥8 log und somit i.d.R. eine thermischeInaktivierung sämtlicher in der Rohmilch enthaltenen vegetativen (enzymbildenden) Keime erzieltwerden. Sporen werden durch eine HE zwar nicht komplett inaktiviert, keimen bei Kühllagertemperaturenjedoch i.d.R. nicht aus und sind somit nicht stoffwechselaktiv. Im Lagerungsverlauf erfolgt (abgesehenvon einer Rekontamination des Produktes) also keine weitere Kontamination der HE-Milchmit (extrazellulären) bakteriellen Enzymen. Die jeweilig erzielbare thermische Inaktivierung der Enzymeerfolgt jedoch auch im HE-Bereich weitestgehend unabhängig von deren Ausgangskonzentration.Höhere Enzymkonzentrationen/-aktivitäten in der eingesetzten Rohmilch haben somit höhere Enyzmaktivitätenund eine gesteigerte Substratumsetzung im Endprodukt zur Folge.Die mikrobiologische Qualität des Ausgangsprodukts wirkt sich folglich weniger aufgrund des darinenthaltenen Keimgehalts (KbE/ml), als vielmehr aufgrund der Zusammensetzung der Keimfloren aufdie Lagerstabilität der HE-Milch aus. Liegen bestimmte, enzymbildende Keimgruppen (wie Pseudomonas,Bacillus oder Paenibacillu ssp.) in der Rohmilch vor, können diese - insbesondere während längererVorstapelung der unbehandelten Milch vor der Weiterverarbeitung - durch die Sekretion bakteriellerEnzyme die enzymatische Rohmilchqualität (A 0 ) beeinträchtigen. Welche und wie viele u.U.hitzestabile Enzyme dabei an das Produkt abgegeben werden, hängt wiederum von den vorhandenenKeimspezies und deren Konzentration ab. Wie bereits im vorherigen Abschnitt beschrieben, erweisensich bei HE-Milch u.a. spezifische enzymatische Umsetzungen durch bakterielle Esterasen oder Proteasenals haltbarkeitsrelevant. Je mehr an diesen spezifischen, hitzestabilen bakteriellen Enzymen inder Rohmilch vorliegen bzw. aktiv sind, umso mehr sind auch im HE-Produkt aktiv und umso frühzeitigersind im Lagerungsverlauf sensorische Beeinträchtigungen wahrnehmbar. Die Aktivitäten undUmsetzungen dieser speziellen Enzymgruppen sind jedoch nur und auch durch aufwändige Analysenmethodenschwer erfassbar.Ähnliche Tendenzen bzw. Abhängigkeiten sind jedoch auch bei höheren Aktivitäten von (bakteriellen)Lipasen und Proteasen in der Roh- und somit auch in der hocherhitzten Milch feststellbar. Höhere lipolytischeEnzymaktivitäten in der Rohmilch (A 0 ) resultieren in höheren Aktivitäten direkt nach derHocherhitzung (an t=0) und einer gesteigerten Lipolyse (vgl. Abbildung 3.3- 46 a) im Lagerungsver-53

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererlauf, wirken sich jedoch insgesamt aufgrund der geringeren Restaktivität weniger stark aus als imMF+PAST-Produkt. Unter Umständen werden so auch im HE-Produkt die mit einem Fehlgeschmackkorrelierenden Grenzwerte an FFA erreicht. Für die Proteolyse lassen sich dementsprechende Zusammenhängezur Proteaseaktivität ableiten (Abbildung 3.3- 46 b). Bei den proteolytischen Enyzmenist zudem zu berücksichtigen, dass nicht nur die Konzentration/Aktivität der von Mikroorganismenfreigesetzten Proteasen, sondern auch die originär im Produkt vorhandenen (Plasmin) Schwankungenunterliegen können (je nach Laktationscharakteristika).Freie Fettsäuren [µequiv/ml]543210aGrenze Fehlgeschmackd. sens. Veränd.A 0 =0,14 U/mlHE (127°C/2 s)gelagert bei 10°Cgelagert bei 10°C0,00 5 10 15 20 25 300 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 46: Lipolyse (a) und Proteolyse (b) während der Lagerung von HE-Milchbei unterschiedlicher enzymatischer Rohmilchqualität (A 0 )Die enzymatische und mikrobiologische (über die Anwesenheit und Stoffwechselaktivität bestimmterKeimgruppen) Rohmilchqualität wirkt sich auch auf die Lagerqualität und -stabilität der HE-Milch ganzentscheidend aus. Gerade die haltbarkeitsrelevanten Enzymgruppen, wie (bakterielle) Esterasen, Lipasenoder Proteasen, weisen eine hohe Hitzestabilität und somit (Rest-)Aktivität im Endprodukt derHE auf. Hohe Enzymgehalte bzw. -aktivitäten in der Rohmilch resultieren in einem vorzeitigen (sensorischen)Produktverderb. Folglich ist es im Hinblick auf die Haltbarkeit der HE-Milch entscheidend, bereitsdie Sekretion und Akkumulierung (bestimmter) bakterieller Enzyme an die Rohmilch zu verhindernund möglichst keine (länger) vorgestapelte Milch zur Herstellung von ESL-Milch einzusetzen.Eine (wenn auch methodisch relativ aufwändige) enzymatische Charakterisierung der eingesetztenRoh- bzw. der „frisch“ hergestellten HE-Milch könnte zudem Aufschluss über die Lagerstabilität desESL-Produktes geben (da im zeitlichen Verlauf der Kühllagerung unabhängig vom Produktstatus keineweitere Veränderung der Enzymaktivitäten mehr erfolgt). Im HE-Endprodukt sollten die (mittels Azocasein-Methodebestimmte) Proteaseaktivitäten nicht mehr ≥0,35 U/ml und bei der Lipase ≥0,1 U/ml(ermittelt mit p-Nitrophenylcaprylat) betragen, um einen vorzeitigen Produktverderb zu verhindern.Prozesstechnische EinflüsseErhitzungsart (direkt/indirekt)A 0 = 0,08 U/mlFreie Aminogruppen [equiv mmol/ml]Die Erhitzungsart und somit das Aufheizprofil und die unterschiedliche thermische Belastung wirktsich im HE-Bereich insbesondere auf die sensorische Bewertung des Kochgeschmacks und die Gehaltean nativem ß-Laktoglobulin oder Laktulose aus, beeinflusst aber weniger die Restaktivitäten von Enzymenoder deren Umsetzungen (siehe auch Tabelle 3.3- 5).2,52,01,51,00,5bGrenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.HE (127°C/2 s)A 0 =0,4 U/mlA 0 = 0,28 U/ml54

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererIm direkt erhitzten Produkt (127 °C/2 s) liegen noch >2 g/l an ß-Laktoglobulin nativ vor, im (bei dengleichen Bedingungen) indirekt erhitzten hingegen weniger als 1,8 g/l. Die Laktulosegehalt variierenzwischen

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererFreie Fettsäuren [µequiv/ml]54321aGrenze Fehlgeschmackd. sens. Veränd.indirekt erhitztdirekt erhitztHE (127°C/2 s)gelagert bei 10°C00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Freie Aminogruppen [equiv mmol/ml]2,52,01,51,00,5bGrenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.indirekt erhitztdirekt erhitztHE (127°C/2 s)gelagert bei 10°C0,00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 48: Vergleich der Lipolyse (a) und Proteolyse (b)in direkt und indirekt erhitzter HE-MilchAuch auf die weiteren während der Lagerung stattfindenden (haltbarkeitsbegrenzenden) Produktveränderungenbzw. die Ausprägung eines Fehlgeschmacks wirkt sich die Art der Erhitzung nicht in entscheidendemMaße aus.Daraus lässt sich zudem ableiten, dass die im Technikumsmaßstab produzierten indirekt erhitzten HE-Milchen annähernd gleiche Charakteristiken aufweisen wie die industriell hergestellten i.d.R. direkterhitzten Produkte und somit die im Rahmen dieses Forschungsprojektes ermittelten Ergebnisse auf(industriell hergestellte) Produkte übertragbar sind.ErhitzungsbedingungenDie Erhitzungsbedingungen bei der HE-ESL liegen üblicherweise in dem ϑ/t-Bereich von 125-127 °C/2-4 s. Bei niedrigeren Erhitzungstemperaturen (ϑ≤120 °C) gelingt es nur durch eine Verlängerungder Heißhaltezeit (t≥10 s) ähnliche Entkeimungseffekte und eine Inaktivierung aller in der Milchenthaltenen vegetativen Keime zu erzielen. Die (bei einer Reduktion der Temperatur erforderliche)Verlängerung der Heißhaltezeit im HE-Bereich geht jedoch wiederum mit einer Zunahme des Kochgeschmackseinher. Folglich sind die bisher eingesetzten Bedingungen mit geringen Heißhaltezeiten (2-4 s) bei vergleichsweise hohen Temperaturen (ϑ=127 °C) zu bevorzugen.Die Variation der ϑ/t-Bedingungen im Bereich der ESL-HE bringt dabei, wie aus Abbildung 3.3- 49 ersichtlich,keine signifikante Änderung der Restenzymaktivität von Lipasen (a) und Proteasen (b) mitsich. Die Restaktivität der (bakteriellen) Lipasen beträgt somit weitestgehend unabhängig von denProzessbedingungen etwa 40% und die der Proteasen etwas um die 60%. Die originär vorhandeneLipoproteinlipase wird bereits durch eine Erhitzung im HTST-Bereich vollständig inaktiviert, folglich liegenim HE-Produkt nur noch bakteriell freigesetzte lipolytische Enzyme vor. Die vergleichsweise höhereEnzymaktivität der Proteasen ist wiederum auf die Hitzestabilität der originären Milchenzyme bzw.des Plasmins zurückzuführen. Nach Humbert & Alais (1974) ist Plasmin in Milch bei ϑ=120 °C erstnach 15 Minuten Erhitzung vollständig inaktiviert. Diesbezüglich ist jedoch zu berücksichtigen, dassdie tatsächliche im Endprodukt vorhandene Enzymaktivität anders als die Restaktivität wiederum vonder enzymatischen Qualität der eingesetzten Rohmilch abhängt.56

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Scherer100a100bRestaktivität Lipasen [%]80604020125°C126°C127°CRestaktivität Proteasen [%]80604020125°C126°C127°CHE00 2 4 6 8 10Heißhaltezeit [s]HE00 2 4 6 8 10Heißhaltezeit [s]Abbildung 3.3- 49: Restenzymaktivität der Lipasen (a) und Proteasen (b) nach der HEin Abhängigkeit von den ErhitzungsbedingungenDie Restaktivität der (bakteriellen) Lipasen beträgt somit weitestgehend unabhängig von den Prozessbedingungenetwa 40% und die der Proteasen etwas um die 60%. Die originär vorhandene Lipoproteinlipasewird bereits durch eine Erhitzung im HTST-Bereich vollständig inaktiviert, folglich liegenim HE-Produkt nur noch bakteriell freigesetzte lipolytische Enzyme vor. Die vergleichsweise höhereEnzymaktivität der Proteasen ist wiederum auf die Hitzestabilität der originären Milchenzyme bzw.des Plasmins zurückzuführen. Nach Humbert & Alais (1974) ist Plasmin in Milch bei ϑ=120 °C erstnach 15 Minuten Erhitzung vollständig inaktiviert. Diesbezüglich ist jedoch zu berücksichtigen, dassdie tatsächliche im Endprodukt vorhandene Enzymaktivität anders als die Restaktivität wiederum vonder enzymatischen Qualität der eingesetzten Rohmilch abhängt.Ähnliche Enzymaktivitäten im HE-Produkt resultieren wiederum in vergleichbaren enzymatischen Veränderungenwährend der Lagerung. Die Lipolyse und Proteolyse im Lagerungsverlauf bei Milchproben,die bei gleicher Heißhaltezeit (2 s) auf unterschiedliche Temperaturen (125-127 °C) erhitzt wurden,ist in Abbildung 3.3- 50 a und b vergleichend dargestellt. Daraus lassen sich im HE-Bereich (wieauch die ergänzenden Untersuchungen mit variierenden Heißhaltezeiten bestätigen) keine unmittelbarenEinflüsse der Prozessbedingungen auf die Lagerstabilität der Produkte ableiten.Freie Fettsäuren [µequiv/ml]54321a125°C/2 sGrenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.126°C/2 s127°C/2 sHEgelagert bei 10°C00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Freie Aminogruppen [equiv mmol/ml]2,52,0bGrenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.125°C/2 s126°C/2 s1,51,0HEgelagert bei 10°C0,5127°C/2 s0,00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]enzymatischfreigesetzt:insgesamtbakteriellAbbildung 3.3- 50: Vergleich der Lipolyse (a) und Proteolyse (b)in bei unterschiedlichen ϑ/t-Bedingungen erhitzter HE-Milch57

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererAuch hinsichtlich der Ausprägung von „adstringierenden“ oder „fruchtig-fermentierten“ Geschmackskomponentenlassen sich in Abhängigkeit von den Erhitzungsbedingungen bei der HE keine signifikantenUnterschiede feststellen.Unabhängig von der Erhitzungsvariante lassen sich durch eine ESL-HE die haltbarkeitsrelevanten(bakteriellen) Enzyme nicht vollständig und in ähnlichen Anteilen inaktivieren. Folglich sind im HE-ESL-Bereich weniger die prozesstechnischen Einflüsse wie Erhitzungsart und/oder -bedingungen alleineentscheidend für die Haltbarkeit, sondern eher im Zusammenspiel mit der Rohmilchqualität zu betrachten.Im Hinblick auf weitere thermisch induzierte Produktveränderungen (Kochgeschmack) istjedoch eine (direkte) Erhitzung auf 127 °C für 2 s zu bevorzugen.Einfluss nachgelagerter Faktoren (Lagertemperatur)Im HE-Produkt erfolgt während der Kühllagerung (ϑ≤10 °C) kein Keimwachstum oder -stoffwechselund somit ist im Lagerungsverlauf keine Veränderung der Enzymaktivität feststellbar. Zudem liegenvergleichsweise niedrige Restenzymaktivitäten vor, resultierend in entsprechend geringfügigen enzymatischenUmsetzungen. Folglich stellt sich die Frage, ob HE-Milch ohne Verringerung der Lagerqualitätoder -stabilität bei Raumtemperatur gelagert werden kann.Diesbezüglich ist zunächst zu erwähnen, dass enzymatische Reaktionen temperaturabhängig stattfinden.Folglich müssten (bei gleicher Enzymkonzentration) unter höheren Lagertemperaturen auchmehr lipolytische und proteolytische Umsetzungen im HE-Produkt erfolgen. Aus Abbildung 3.3- 51wird jedoch ersichtlich, dass Lipolyse (a) und Proteolyse (b) sowohl bei niedrigen (ϑ=4 °C), herkömmlichen(ϑ=10°C) als auch bei vergleichsweise hohen (ϑ=20 °C) Lagertemperaturen ähnlichbzw. nicht signifikant unterschiedlich verlaufen. Ein Erklärungsansatz hierfür ist die ohnehin relativgeringe Restenzymaktivität der Lipasen und Proteasen nach der HE und insbesondere in dieser Versuchsreihe.Freie Fettsäuren [µequiv/ml]54a3 Grenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.21HE (127°C/2 s)20°C10°C4°Cgelagert bei 10°C00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Freie Aminogruppen [equiv mmol/ml]2,52,0bGrenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.1,51,0HE (127°C/2 s)0,50,00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]enzymatischfreigesetzt:20°C10°Cinsgesamt4°CbakteriellAbbildung 3.3- 51: Vergleich der Lipolyse (a) und Proteolyse (b) bei HE-Milchin Abhängigkeit von der LagertemperaturAuch die physiko-chemischen Veränderungen der enzymatisch freigesetzten Spaltprodukte (Lipidoxidation)können bei höheren Temperaturen prinzipiell vergleichsweise schneller stattfinden und zeigensomit eine deutliche Abhängigkeit von der Lagertemperatur, laufen aber bei HE-Milch aufgrund derbegrenzten Verfügbarkeit der Substrate bzw. FFA sogar bei ϑ=20 °C im Bereich weit unterhalb derFehlgeschmacksgrenze ab. In Abbildung 3.3- 52 sind die Absorptionsänderungen der bei unterschied-58

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererlichen Temperaturen gelagerten Milchproben basierend auf der Zunahme an während der Lipidoxidationfreigesetzten TBA-reaktiven Substanzen in Abhängigkeit von der Lagerzeit dargestellt.→ TBA-reaktive SubstanzenAbsorption 532nm0,120,100,080,060,040,02Grenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.HE (127°C/2 s)0,000 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 52: Lipidoxidation bei HE-Milch in Abhängigkeit von der LagertemperaturObwohl sich aus diesen Untersuchungen zunächst keine direkte Korrelation zwischen der Lagertemperaturund -stabilität der HE-Milchen ableiten lässt, hat sich im Projektverlauf gezeigt, dass nur beiKühllagerung (ϑ≤15 °C) das Erreichen einer Mindestprodukthaltbarkeit von mehr als 20 Tagen gewährleistetwerden kann. Im Gegensatz zur H-Milch liegen im HE-Produkt noch lebensfähige Sporenvor und mit ansteigender Lagertemperatur (ϑ≥15 °C) besteht eine erhöhte Gefahr der Sporenauskeimung.Bereits das Auskeimen einzelner Spezies (wie z.B. Bacillus ssp.) kann dann entweder durchdas ungehinderte Keimwachstum (aufgrund des Fehlens der Konkurrenzflora) zu einem frühzeitigen(mikrobiologischen) Produktverderb führen oder durch die bakterielle Stoffwechselaktivität (→ Freisetzungvon lipolytischen bzw. proteolytischen Enzymen → Umsetzungsreaktionen) die sensorischeLagerstabilität der HE-Milch beeinträchtigen. In Tabelle 3.3- 4 sind die Produktcharakteristika von beiRaumtemperatur gelagerter HE-Milch am MHD unter und ohne Auskeimung von Sporen vergleichendzusammengestellt. Nach der Sporenauskeimung (Milch 1) sind an t=25 Tage nicht nur vegetativeKeime in hohen Gehalten im Produkt nachweisbar, sondern es können auch deutlich höhere Aktivitätenan Proteasen und/oder Lipasen sowie größere Mengen an enzymatischen Spalt- oder deren Folgereaktionsproduktenvorliegen.20°CTabelle 3.3- 4: Sporenauskeimung, Produktcharakteristika und Haltbarkeit von HE-Milch(gelagert bei Raumtemperatur)4°C10°CKeimzahl [KbE/ml]Enzymaktivität Protease [U/ml]Enzymaktivität Lipase [U/ml]Freie Aminogruppen [equiv mmol/ml]FFA [µequiv/ml]Absorption 532nm [-] → TBARS(Sensorische) Haltbarkeit [Tage]*HE (127°C/2 s); t= 25 Tage; gelagert bei 20°CMilch 1*→ Sporenauskeimung7,8*10 50,300,121,984,820,078≤20Milch 2*00,1820,0741,472,320,038≤3059

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererDas (bei höheren Lagertemperaturen begünstigte) Auskeimen der Sporen hat im HE-Produkt folglicheinen vorzeitigen Produktverderb zur Folge und ist im Hinblick auf die Produktsicherheit unbedingt zuvermeiden. Neben der Lagertemperatur kann sich diesbezüglich auch der mikrobielle Status der HE-Milch als problematisch erweisen. Liegen nach der HE vergleichsweise mehr an Sporen in der Milchvor, besteht (wiederum in Abhängigkeit von der Lagertemperatur) eine höhere Wahrscheinlichkeit desAuskeimens. Die Lagerstabilität und -qualität der HE-Milch hängt also von dem Zusammenwirken vonvor- (Rohmilchqualität) und nachgelagerten (Lagertemperatur) Faktoren ab. Folglich ist auch bei HE-Milch eine Kühllagerung unerlässlich, wobei Lagertemperaturen von ϑ≤12 °C aufgrund des deutlichverringerten Risikos der Sporenauskeimung zu bevorzugen sind, und für die Herstellung von ESL-Milch sollte qualitativ hochwertige Rohmilch (möglichst geringer Gehalt an Sporen oder -bildnern)eingesetzt werden.FazitFür die Lagerstabilität und -qualität der HE-ESL-Milch sind weniger die mikrobiellen oder (und im Gegensatzzu MF+PAST-Milch) die proteolytisch und lipolytisch bedingten Produktveränderungen entscheidend.Die ESL-HE führt unabhängig von Erhitzungsart (direkt/indirekt) oder -bedingungen (imBereich von 125-127 °C für 2-4 s) zu einer vollständigen Abtötung der vegetativen Keime, aber keinerkompletten Sporeninaktivierung und resultiert in vergleichsweise geringen (Rest-)Enzymaktivitäten.Die niedrigere Aktivität der Lipasen und Proteasen hat wiederum weniger an geschmacks- bzw. haltbarkeitslimitierendenlipolytischen und proteolytischen Umsetzungen im Lagerungsverlauf zur Folge,allerdings nur bei Einsatz qualitativ hochwertiger Rohmilch und Kühllagerung der Produkte.Als unmittelbar haltbarkeitsbegrenzend erweisen sich bei HE-Milch dann spezifische (z.T. hitzeinduzierte)Veränderungen von Milchbestandteilen (Proteine) in Zusammenwirken mit komplexen, biochemischenReaktionen, die ihrerseits zu einer Beeinträchtigung der sensorischen Produktwertigkeitführen. Diese Reaktionen sind jedoch analytisch nur sehr aufwändig erfassbar und lassen sich (u.a.aufgrund der Hitzestabilität der involvierten Enzyme) nur sehr bedingt durch prozess- oder verpackungstechnischeGrößen beeinflussen. Entscheidend hierbei ist dahingegen vielmehr die Ausgangsbelastungder zur Herstellung des ESL-Produktes eingesetzten Rohmilch mit spezifischen Keimgruppen(vgl. Ergebnisse ZIEL-M) und/oder von diesen freigesetzten bakteriellen Enzymen.Die Herstellung von HE-Produkten mit definierten, vorhersagbaren Charakteristika und Haltbarkeitenist folglich (auch bei standardisierten Herstellverfahren) nur bedingt und unter Berücksichtigung desZusammenspiels der verschiedenen Einflussfaktoren möglich.Arbeitspaket III: Analytische Erfassung herstellungsbedingter ProduktveränderungenVersuchsaufbau und AnalytikIm Rahmen dieses Arbeitspaketes wurde Rohmilch (desselben Tanks) zum einen der HE (127 °C/2 s;direkt und indirekt) unterzogen und zum anderen mittels Kombiverfahren aus MF+PAST haltbar gemacht.Die aus den unterschiedlichen Verfahrensvarianten resultierenden ESL-Milchen wurden zunächstdirekt nach der Produktion (t=0) auf spezifische Hitzeindikatoren und Produktcharakteristika(Vitamingehalt, Sensorik) untersucht und mit der herkömmlich pasteurisierten Frischmilch verglichen.Vergleich der herstellungsbedingten Veränderungen von MF+PAST- und HE-MilchAus dem direkten (analytischen) Vergleich ergeben sich die in Tabelle 3.3- 5 zusammengefassten Unterschiedein herstellungsbedingten Veränderungen bzw. Produkteigenschaften von herkömmlichkurzzeiterhitzter, MF+PAST- und HE-Milch.60

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererTabelle 3.3- 5: Vergleich herstellungsbedingter Veränderungen bei ESL-MilchPASTMF+ PASTHE direkt(127°C/2 s)HE indirekt(127°C/2 s)Phosphatase----Peroxidase++--Natives ß-Laktoglobulin [g/l]3,1 - 3,43,0 - 3,3> 2,2< 1,8Laktulose [mg/l]15 - 2015 - 20< 25< 30(Rest-)Enzymaktivität Protease [%]> 8081±465±5(Rest-)Enzymaktivität Lipase [%]> 6564±440±3Keimreduktion [log N/N 0 ]1,55 - 6> 8Kochgeschmack--+ → -Bezüglich der gängigen Indikatoren zur Hitzebehandlung lässt sich zunächst prinzipiell feststellen,dass die unterschiedlichen Herstellvarianten für ESL-Milch in Produkten mit jeweils spezifischen Eigenschaftenresultieren.So entspricht beispielsweise das MF+PAST-Produkt sowohl hinsichtlich der Peroxidaseaktivität alsauch des Gehaltes an Laktulose oder nativem ß-Laktoglobulin dem rein kurzzeiterhitzten. Auch die beidiesem Kombinationsverfahren erforderliche separate Hocherhitzung des vorgängig abgetrenntenRahms bringt, wie Hoffmann et al. (2006) feststellten, keine signifikant nachweisbare zusätzliche Produktbeeinträchtigungmit sich und lässt sich analytisch, wenn überhaupt, nur durch eine aufwändigeFurosinbestimmung im Proteinanteil der Fettkugelmembran erfassen.HE-Milch weist dahingegen einen negativen Peroxidasetest sowie einen vergleichsweise höheren Denaturierungsgradan ß-Laktoglobulin (von etwa 30% bei direkter und 40% bei indirekter Erhitzung)auf und grenzt sich somit - insbesondere im direkten Vergleich - deutlicher von der herkömmlich pasteurisiertenFrischmilch ab. Auch sind die mittels HE erzielbaren Reduktionen von Keimgehalt und Enzymaktivitätvergleichsweise höher als bei der (MF+)PAST und resultieren somit in anderen (haltbarkeitslimitierenden)Produktveränderungen während der Lagerung (vgl. AP IV).Solche Indikatorsubstanzen eignen sich zwar zur analytischen Produktcharakterisierung, haben jedochkeine unmittelbaren Auswirkungen auf verbraucherrelevante Eigenschaften (wie die sensorische Qualität)oder die ernährungsphysiologische Wertigkeit (Gehalt an Mineralstoffen oder Vitaminen) derMilch. Nach Kessler (1996) bleiben die ernährungsphysiologisch relevanten Mineralstoffe (wie Kalziumund Phosphor) sowie die in der Milch vorhandenen fettlöslichen Vitamine (A und D) von einer Hitzebehandlung(oder Lagerung) nahezu unbeeinflusst. Als vergleichsweise (hitze-)labil sind dahingegenvor allem Vitamin B 1 (Thiamin), B 6 (Pyridoxin, B 12 (Cyanocobalamin) und Folsäure einzustufen. Deshalbwurden im Rahmen dieses Forschungsvorhabens auch die herstellungs- und lagerungsbedingteVerluste von Thiamin, Pyridoxin, Cyanocobalamin und Folsäure verfahrensspezifisch für ESL-Milch(mittels mikrobiologischer Testverfahren bzw. VitaFast ® -Testkits der Fa. R-Biopharm) eruiert. Die inTabelle 3.3- 6 zusammengefassten prozentualen Verlustraten ergeben sich dabei aus folgender Gleichung(5)Vitaminver lustt[%] = (1 − ) ⋅100(%) (5)ccRoh61

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererbzw. den im MF+PAST- bzw. HE-Produkt jeweilig nachweisbaren Vitamingehalten zu einem bestimmtenLagerzeitpunkt (c t ) bezogen auf den Gehalt in der entsprechenden unbehandelten Rohmilch(c Roh ).Tabelle 3.3- 6: Herstellungs- und lagerungsbedingte Vitaminverluste in MF+PAST- und HE-MilchVerlust [%]MF+PAST-MilchHE-MilchVitaminlagerungsbedingt(t=30 Tage)herstellungsbedingt(t=0)herstellungsbedingt(t=0)lagerungsbedingt(t=30 Tage)Thiamin (B 1 )< 2< 15< 2< 15Pyridoxin (B 6 )< 5< 15< 15< 15Cyanocobalamin (B 12 )< 1< 10< 1< 10Folsäure< 3< 15< 15< 15Demnach fallen (unabhängig von der Verfahrensvariante) die durch die Herstellung von ESL-Milchverursachten Vitaminverluste insgesamt sehr gering aus und unterscheiden sich nicht signifikant vonder herkömmlichen Pasteurisierung. Die aus der MF+PAST-resultierenden Verluste betragen für allevier untersuchten Vitamine zwischen 0,5% und 3%, wobei Vitamin B 12 am geringsten und Folsäurevergleichsweise am stärksten geschädigt wird. Ähnliche herstellungsbedingte Verluste lassen sich fürdie Vitamine B 1 und B 12 auch bei (direkt und indirekt erhitzter) HE-Milch feststellen. Vitamin B 6 undFolsäure werden allerdings (mit einem Abbau von bis zu 15%) durch eine Hocherhitzung vergleichsweiseetwas stärker beeinträchtigt als durch eine (MF+)PAST. Die Vitamingehalte in den untersuchtenESL-Milchen weisen jedoch bereits an t=0 eine große Schwankungsbreite auf (bei Thiamin von 0,20 –0,36 mg/l, bei Cyanocobalamin von 0,00064 – 0,0037 mg/l, bei Pyridoxin von 0,34 – 0,52 mg/l oderbei Folsäure von 0,004 – 0,02 mg/l), was zum einen auf natürliche Schwankungen der Ausgangsgehaltein der Rohmilch und zum anderen auf die Analysenmethoden zurückzuführen ist. Selbst dienach der HE ermittelten Werte liegen somit noch in derselben Größenordnung wie die in der Literatur(z.B. bei Anderson & Öste 1996 oder Burton 1988) angegebenen Vitamingehalte nach einer herkömmlichenKurzzeiterhitzung.Die weiteren, lagerungsbedingten Vitaminverluste (an t=30 Tage) betragen bei kühlgelagerter ESL-Milch weniger als 5% und bis zu 20%. Durch die Lagerung der verschiedenen ESL-Produkte werdenfolglich im Vergleich zum Herstellprozess z.T. größere Vitaminverluste verursacht. Ähnliche Vitaminverlustetreten jedoch auch bei der Lagerung von traditionell pasteurisierter Milch auf. Zudem weisenauch die im Lagerungsverlauf ermittelten Vitamingehalte z.T. größere Schwankungen auf. InMF+PAST- und indirekt erhitzter HE-Milch unterliegen die Vitamine (insbesondere Folsäure und Cyanocobalamin)im Lagerungsverlauf tendenziell einem etwas stärkeren Abbau als im direkt erhitztenHE-Produkt, was auf die unterschiedlichen Gehalte an im Produkt gelösten Sauerstoff bzw. den damitkorrelierenden oxidativen Vitaminabbau zurückzuführen ist. Auch Thiamin wird nach Eberhard (2003)je nach der Menge an in der Milch gelöstem Sauerstoff im Verlauf der Lagerung unterschiedlichschnell abgebaut. Pyridoxin weist grundsätzlich und unabhängig von den Erhitzungsbedingungen einevergleichsweise eher geringe Lagerstabilität auf (Oamen 1989). Inwiefern die Vitaminverluste währendder Lagerung von Verpackungsbedingungen (Kopfraum, Material, Lichtdurchlässigkeit) oder spezifischenProdukteigenschaften (gelöster O 2 -Gehalt) abhängen wurde im Rahmen dieser Studie jedochnicht spezifischer untersucht.62

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererDie lagerungsbedingten Vitaminverluste bei ESL-Milchen sind jedoch prinzipiell als geringfügig einzustufenund zudem vergleichbar mit bzw. nicht signifikant unterscheidbar von denen im herkömmlichpasteurisierten Produkt.Neben dem Nährstoffgehalt stellt auch der („frische“) Milchgeschmack ein wichtiges Bewertungskriteriumfür ESL-Milch dar. Hinsichtlich des (Koch-)Geschmacks grenzen sich die ESL-Produkte (unabhängigvom Herstellverfahren) zunächst deutlich von H-Milch ab. Herkömmlich pasteurisierte und daszusätzlich mikrofiltrierte ESL-Produkt lassen sich direkt nach der Herstellung (und bis zu einer Lagerzeitvon 16 Tagen) geschmacklich nicht signifikant unterscheiden und weisen ähnlich niedrige Gehaltean freien SH-Gruppen auf. Die HE-Variante geht, wie bereits in AP II c beschrieben, mit geringfügigenund v. a. im direkten Vergleich (Dreieckstest) zu traditioneller „Frischmilch“ wahrnehmbaren sensorischenVeränderungen einher. Tendenziell ist der Kochgeschmack in den indirekt erhitzten HE-Produkten zu Beginn der Lagerzeit vergleichsweise etwas stärker ausgeprägt als in den direkt erhitzten.Dieser anfänglich (t=0 bis 10 Tage) in HE-Milch vorhandene Kochgeschmack lässt sich auf diethermisch induzierte Bildung von freien SH-Gruppen während der Herstellung zurückführen. Im Verlaufder Lagerung werden die freien SH-Gruppen unter Vorhandensein von Sauerstoff (im Produktoder im Kopfraum der Verpackung) jedoch oxidiert und somit auch der Kochgeschmack in der HE-Milch immer weiter abgebaut. In Abbildung 3.3- 53 sind in Abhängigkeit von der Lagerzeit die (mitdem Kochgeschmack korrelierenden) Gehalte an freien SH-Gruppen im MF+PAST- und HE-Produktvergleichend dargestellt.Freie SH-Gruppen Freie SH-Gruppen [µmol/ml] [µmol/l]→ Kochgeschmack100gelagert bei 10°C806040HE (127°C/2s)20 Grenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.MF(1,4 µm) +PAST (73°C/25s)00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 53: Freie SH-Gruppen und Kochgeschmack in MF+PAST- und HE-MilchUnabhängig vom Kochgeschmack treten dann sowohl bei MF+PAST-Milch als auch beim HE-Produktnach längerer Lagerzeit jeweilig spezifische, sensorische Abweichungen vom „frisch“ kurzzeiterhitztenProdukt auf, die sich als haltbarkeitsbegrenzend erweisen (siehe AP IV).Arbeitspaket IV: Analytische Erfassung haltbarkeitsrelevanter ProduktveränderungenVersuchsaufbau und AnalytikErgänzend zu AP III wurden die (aus Rohmilch desselben Tanks hergestellten) MF+PAST- und HE-Milchen bei einer Kühltemperatur von 10 °C gelagert und währenddessen die jeweilig (verfahrensabhängig)charakteristischen haltbarkeitsrelevanten bzw. -begrenzender Produktveränderungen erfasst.63

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererVergleich der haltbarkeitsrelevanten Veränderungen von MF+PAST- und HE-MilchDie Mindesthaltbarkeit von MF+PAST-Milch wird von den industriellen Herstellern (bei einer Lagertemperaturvon ≤8 °C) mit 18-22 Tagen angegeben und beim hocherhitzten Produkt wird diesbezüglichmeist von 24-30 Tagen ausgegangen. Die verfahrenstechnischen Einflüsse wirken sich dabei abernicht nur auf die letztendliche Haltbarkeit und die Produkteigenschaften (vgl. AP III) sondern, wie dieim Rahmen dieses Projektes ermittelten Ergebnisse zeigen, auch auf die jeweilig haltbarkeitsbegrenzendenKriterien und Faktoren aus.Im Gegensatz zur traditionell kurzzeiterhitzten Milch erweisen sich bei den ESL-Produkten (unabhängigvon der Herstellvariante) die mikrobiologischen Veränderungen (Keimwachstum) i.d.R. nicht alshaltbarkeitslimitierend. In HE-Milch liegen (unabhängig von der Rohmilchqualität) sowohl direkt nachder Herstellung als auch nach einer Kühllagerung von 30 Tagen keine stoffwechselaktiven, vegetativenKeime, sondern nur einzelne Sporen vor (vgl. auch AP IIc). In „frisch“ hergestellter (t=0)MF+PAST-Milch können zwar einzelne vegetative, gram-positive Mikroorganismen nachgewiesen undim Lagerungsverlauf ein stetiger Keimzahlanstieg festgestellt werden, mikrobielles Wachstum undStoffwechselaktivität wirken sich aber nur bei einigen wenigen, spezifischen Keimgruppen (wie Paenibacillusssp. oder Bacillus ssp.) auf die Lagerqualität und -stabilität.Insbesondere bei MF+PAST-Milch finden im Lagerungsverlauf unerwünschte biochemische (hydrolytische)Umsetzungen durch in der Rohmilch originär vorhandene sowie bakteriell freigesetzte proteolytischeund lipolytische Enzyme statt, welche die (sensorische) Produktqualität zunehmend beeinträchtigen.Die lagerungsbedingten Zunahmen an enzymatisch freigesetzten Fettsäuren (a) und Aminogruppen(b) bei MF+PAST- und HE-Milch sind in Abbildung 3.3- 54 vergleichend dargestellt.Nach einer Lagerzeit von etwa 18-21 Tagen wird beim MF+PAST-Produkt oftmals ein Gehalt an freienFettsäuren überschritten, der mit geschmacklichen Veränderungen („ranzig“, „käsig“) einhergeht.Diese von lipolytischen Enzymen freigesetzten Fettsäuren unterliegen zudem einer (konzentrationsabhängig)verstärkten Lipidoxidation (vgl. Abbildung 3.3- 54 c), was eine weitere (sensorische) Beeinträchtigungder Produktqualität bzw. „kartonartige“ und/oder „metallische“ Geschmackskomponentenmit sich bringt.64

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererFreie Fettsäuren [µequiv/ml]5432agelagert bei 10°CMF(1,4 µm) +PAST (73°C/25s)Grenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.HE (127°C/2s)100 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Freie Aminogruppen [equiv mmol/ml]2,52,0bGrenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.gelagert bei 10°CMF(1,4 µm) +PAST (73°C/25s)1,5HE (127°C/2s)1,00,50,00 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]→ TBA-reaktive Substanzen0,100,080,060,04cGrenze Fehlgeschmack d. sens. Veränd.gelagert bei 10°CMF(1,4 µm) +PAST (73°C/25s)Absorption 532nm0,02HE (127°C/2s)0,000 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]Abbildung 3.3- 54: Vergleich von Lipolyse (a), Proteolyse (b) und Lipidoxidation (c)in MF+PAST- und HE-MilchDie Haltbarkeit der MF+PAST-Milch wird folglich aus einem Zusammenspiel von biochemischen Umsetzungenund physiko-chemischen Folgereaktionen begrenzt. Dabei erweisen sich sowohl die vergleichsweisehohe (Rest-)Aktivität der Lipasen nach der MF+PAST als auch die bei dieser Herstelloptionerforderliche separate thermische Behandlung der Rahmfraktion, die zu einer Veränderung derFettkugeloberfläche und einer besseren Zugänglichkeit der Fettphase für den Enzymangriff führt(Chen 2005), als problematisch und somit haltbarkeitslimitierend. Bei den proteolytisch freigesetztenSpaltprodukte werden (zumindest bei guter Rohmilchqualität) entsprechende mit einem (bitteren)Fehlgeschmack korrelierende Grenzwerte i.d.R. nicht erreicht.In HE-Milch sind im direkten Vergleich herstellungsbedingt bzw. aufgrund der höher thermischen Behandlungdeutlich geringere Aktivitäten der Lipasen und Proteasen detektierbar und folglich werdendie mit einem „off-flavor“ einhergehenden Grenzwerte an enzymatisch freigesetzten Spalt- und/oderderen physiko-chemisch umgesetzten Folgeprodukten (bei guter Rohmilchqualität) auch nacht=30 Tage nicht erreicht. Die in HE-Milch nach einer Lagerzeit von etwa 24-30 Tagen auftretenden„fruchtig-fermentierten“, „adstringierenden“ oder „schalen“ Fehlgeschmackskomponenten sind dahingegenauf spezifische (biochemische) Reaktionen (z.B. durch Esterasen) z.T. auch in Zusammenwirkenmit thermisch induzierten Veränderungen zurückzuführen (vgl. AP II c).65

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererAus diesen verfahrensabhängig differenzierenden Verderbsmechanismen ergeben sich am Mindesthaltbarkeitsdatum(MHD) für MF+PAST- und HE-Milch die in Abbildung 3.3- 55 dargestellten, jeweiligspezifischen und unterschiedlich stark ausgeprägten(Fehl-) Geschmackskomponenten.bitterkäsigadstringierendranzigMF+PAST → t=21 TageHE → t = 28 TageschalLichtgeschmack21kartonartigsüßlich35säuerlich4fruchtig-fermentiertmetallischBewertung:1 = kaum/gering ausgeprägt…5 = stark ausgeprägtAbbildung 3.3- 55: Sensorische Bewertung von MF+PAST- und HE-Milch am MHDDie verschieden hergestellten ESL-Milchen unterscheiden sich folglich nicht nur direkt nach der Herstellung(Kochgeschmack), sondern auch im Lagerungsverlauf und am MHD hinsichtlich ihrer sensorischenProduktcharakteristika.Zusammenfassend lassen sich für die (sensorische) Qualität der mittels unterschiedlicher Verfahrensvariantenhergestellten ESL-Produkte im Lagerungsverlauf die in Abbildung 3.3- 56 dargestellten Zusammenhängeableiten.(Sensorische) ProduktqualitätMF+PASTHEgelagert bei 10°C0 5 10 15 20 25 30Lagerzeit [Tage]KochgeschmackFehlgeschmackAbbildung 3.3- 56: Vergleich der (sensorischen) Qualität von ESL-Milch im LagerungsverlaufZwar wirkt sich bei HE-Milch der anfangs (t=0) noch vergleichsweise ausgeprägte Kochgeschmacknegativ auf die (sensorische) Produktbewertung aus, dieser wird jedoch im Lagerungsverlauf immerweiter reduziert, bis es dann (nach etwa 26-30 Tagen Lagerung) zur Ausprägung eines Fehlgeschmackskommt. Bei „frischer“ MF+PAST-Milch lässt sich dahingegen kein Kochgeschmack, allerdingsbereits nach etwa 18-20 Tagen ein „off-flavour“ detektieren. Beide ESL-Verfahrenskonzepte66

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererbzw. die daraus resultierenden Produkte weisen somit im Hinblick auf die (sensorische) Milchqualitätund -lagerstabilität spezifische Vor- und Nachteile auf.Obwohl die Beeinträchtigung der Genussfähigkeit bzw. der sensorischen Wertigkeit (unabhängig vonder Herstellvariante) bei ESL-Milch das haltbarkeitslimitierende Kriterium darstellt, kann somit dieProdukt- und Prozessoptimierung nur verfahrensspezifisch erfolgen.Dabei ist jedoch zu berücksichtigen, dass die Lagerqualität und -stabilität einer ESL-Milch nicht nurvon der Herstellvariante, sondern auch (in entscheidendem Maße) von Rohmilchqualität sowie Lagerbzw.Distributionsbedingungen abhängen.FazitDie Charakteristika von ESL-Milchen resultieren aus einem komplexen Zusammenwirken der verschiedenenvor- sowie nachgelagerten und prozesstechnischen Einflussfaktoren. ESL-Produkte sind demnachdifferenzierter zu betrachten, als dies derzeit der Fall ist.Zum einen resultieren aus den verschiedenen Herstellverfahren (MF+PAST und HE) Produkte mit jeweiligspezifischen Eigenschaften und Haltbarkeiten. Als haltbarkeitslimitierend erweisen sich bei beidenVerfahrensvarianten die (unterschiedlichen) im Lagerungsverlauf stattfindenden biochemischen/enzymatischenUmsetzungen, die vor allem die sensorische Qualität der ESL-Milchen beeinträchtigen.Diese enzymatisch bedingten Veränderungen und somit auch die Produkthaltbarkeiten hängen dabeizum anderen und je nach Verfahrensvariante unterschiedlich stark von weiteren sich wiederum auchwechselseitig beeinflussenden Faktoren (mikrobiologische/enzymatische) Rohmilchqualität, Keimfloraim Endprodukt sowie Lagerbedingungen) ab. Als Beispiel hierfür ist das Zusammenwirken zwischenHerstellvarianten und Kühllagertemperaturen auf die Milchhaltbarkeit ist in Abbildung 3.3- 57 dargestellt.604020KZEMF+PASTHE(ESL)Haltbarkeitsdauer [d]10864212 4 6 8 10 12 14Lagertemperatur [°C]Abbildung 3.3- 57: Haltbarkeit von (ESL-)Milch (modifiziert nach Kessler 1996)Entsprechende Haltbarkeiten (vgl. Abbildung 3.3- 57) lassen sich jedoch wiederum nur bei guterRohmilchqualität erzielen. Folglich beeinflussen innerhalb einer (standardisierten) Herstellvarianteauch und insbesondere bei höheren Lagertemperaturen der mikrobiologische und enzymatische Statusder Milch die Produktqualität und -stabilität.Die ESL-Technologie resultiert also (auch bei standardisierten Herstellverfahren) nicht unmittelbar inProdukten mit gleichen, eindeutig vorhersagbaren Eigenschaften oder Haltbarkeiten. Um den gehobenenAnsprüchen (der Verbraucher) an diese Milchen und gleichermaßen den Produktspezifikationen67

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Scherergerecht zu werden, ist somit eine systematische Prozesskontrolle sowie Charakterisierung und Überwachungder Roh-/Endprodukte erforderlich.Im Vergleich zum herkömmlich pasteurisierten Produkt bringt das ESL-Konzept (insbesondere unterBerücksichtigung der im Rahmen dieses Forschungsprojektes eruierten Zusammenhänge) entscheidendeVorteile hinsichtlich der Haltbarkeit der Milch mit sich, wirkt sich dabei aber kaum oder nur geringfügigauf die für den Verbraucher entscheidenden, wertrelevanten Produkteigenschaften (Sensorik,Vitamingehalt) aus. Dass gerade die Produktcharakteristika der ESL-Milch den Wünschen derVerbraucher entgegenkommen, zeigt sich zudem an der stetig steigenden Nachfrage nach diesenProdukten.3.3.2 ZIEL – Abteilung MikrobiologieArbeitspaket I: Projektplanung, Implementierung der AnalytikUntersuchung der Mikrobiota von RohmilchUm den Entkeimungserfolg von Milch durch Behandlungen wie Erhitzung oder Mikrofiltration beurteilenzu können, sind Informationen über die Zusammensetzung der mikrobiellen Flora der eingesetztenRohmilch unabdingbar. Deshalb wurden vor der Untersuchung der Floren von ESL-Milchen zunächstvier Rohmilchfloren untersucht. Während Milch im gesunden Euter noch steril vorliegt, tretenwährend des Melkprozesses und der nachfolgenden Lagerung vielfältige und variable Rekontaminationenauf. Die in der Literatur verfügbaren Daten zur Rohmilchzusammensetzung sind jedoch vor über30 Jahren erhoben worden (Kurzweil und Busse, 1973). Seitdem konnte die Qualität aufgrund stetigverbesserter Melkhygiene und modifizierter Melkverfahren kontinuierlich gesteigert werden. Dadurchwurde die Erfassung neuer Daten zur Zusammensetzung von Rohmilchfloren erforderlich.Neben derBestimmung der Zusammensetzung der mikrobiellen Flora von vier Milchproben, entnommen ausdem Sammeltank einer Molkerei, wurden die aeroben Gesamtkeimzahlen auf Plate Count (PC)-Agarmit 1 % Magermilch bestimmt. (Tabelle 3.3- 7).Tabelle 3.3- 7: Aerobe Keimzahlen von vier MilchprobenProbeKbE/mlVollfettstufe (11.April 2007) 8x10 4Vollfettstufe (16.April.2007) 1x10 6Vollfettstufe (23. April 2007) 1x10 6Magerstufe (23. April 2007) 3x10 2Keimzahlen ermittelt auf Plate Count (PC)-Agar mit 1% Magermilchnach fünftägiger Bebrütung bei 30°C.KbE/ml = Koloniebildende Einheiten pro mlDie Keimzahlen der Milchen mit Vollfettstufe variieren zwischen 8x10 4 bis 1x10 6 KbE/ml und liegendamit in dem Bereich, der auch in der Literatur zu finden ist (Rea et al., 1992; Barbano et al., 2006;Elwell und Barbano, 2006). Der geringere Keimgehalt der Magermilch lässt sich auf die mit der Entrahmungverbundene Abtrennung der im Milchfett gebundenen Mikroorganismen zurückführen.Drei der vier untersuchten Floren stammten aus Milch mit Vollfettstufe, da aber Magermilch als Ausgangsproduktfür die Mikrofiltration eingesetzt wird, wurde auch ein Vergleich der Floren von Milchvor und nach der Entrahmung durchgeführt (Abbildung 3.3- 58 ). Pro Probe wurden 100 Isolatequantitativ von bei 30°C aerob bebrütetem Plate Count (PC)-Agar ausgewählt und mittels FTIR-Spektroskopie identifiziert. Anhand der Ergebnisse wurden die Isolate einer der folgenden taxonomi-68

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererschen Gruppen zugeordnet: strikt aerobe oder fakultativ anaerobe gramnegative Bakterien, Milchsäurebakterien,Bazillen, High GC Grampositve, andere grampositive Bakterien und nicht identifizierbareIsolate. Die Floren der drei Vollfett-Milchen weisen alle einen Anteil von ca. 90% gramnegativen Bakterienauf, hauptsächlich repräsentiert durch die Gattungen Acinetobacter, Pseudomonas und Chryseobacterium,wobei das Verhältnis von fakultativ anaeroben zu strikt aeroben Gramnegativen zwischenden einzelnen Proben variiert (ca. 1:1,5 bis 1:3). Der Vergleich der Floren von Milch mit Vollfett- undMagerstufe zeigt auf, dass die Entrahmung zu einer Verschiebung der Flora von gramnegativen zugrampositiven Bakterien führt, so dass in der Magermilch Grampositive und Gramnegative in ungefährgleichen Anteilen vorliegen. Die Milchsäurebakterien, dominiert von den Gattungen Lactococcus,Streptococcus und Vagococcus, erreichten in den vier Proben Anteile von drei bis 34 Prozent, die detektiertenHigh GC Grampositiven (0-9 %) waren fast ausschließlich Corynebacterium und Microbacteriumzuzuordnen. Bazillen wurden in allen vier Proben nur in sehr geringem Anteil von 1-3 % detektiert.Um Rückschlüsse von der Florazusammensetzung der eingesetzten Rohmilch auf die Mikroflora der zuproduzierenden ESL-Milch zu ziehen, muss der Tatsache Rechnung getragen werden, dass gramnegativeund grampositive Bakterien eine unterschiedliche Toleranz gegenüber Temperatureinwirkungaufweisen. Grampositive, darunter insbesondere High GC Grampositive, besitzen aufgrund ihres Zellwandaufbauseine geringere Hitzesensitivität als Gramnegative und können deshalb Pasteurisationsbedingungenüberleben, Gramnegative werden dabei vollständig abgetötet. Die von letzteren produziertenEnzyme, darunter v.a. von der Gattung Pseudomonas gebildete Proteasen und Lipasen, könnenjedoch hitzestabil sein und Pasteurisationsbedingungen überleben und so zu einem vorzeitigenVerderb der mikrofiltrierten und pasteurisierten ESL-Milchen führen (Sørhaug und Stepaniak, 1997).69

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Scherer3%3%6%2% 2%20%2% 1%4%1%85%73%Vollfettstufe (11. April)Vollfettstufe (16. April)2%1%2%5%20%3%3%44%36%55%21%10%Vollfettstufe (23. April)Magerstufe (23. April)Strikt aerobe GramnegativeMilchsäurebakterienAndere GrampositiveFakultativ anaerobe GramnegativeHigh GC GrampositiveBazillenAbbildung 3.3- 58: Darstellung der Mikroflora von vier verschiedenen Rohmilchproben mit Vollfett- bzw. Magerstufe.Graphiken basieren jeweils auf 100 Isolaten, quantitativ von Plate-Count (PC)-Agar isoliert und mittelsFTIR-Spektroskopie identifiziert.AP II a / b: Prozessoptimmierung MF und Kombiverfahren MF / KZEMikrobiologische Charakterisierung mikrofiltrierter MilchVor einer kombinierten Behandlung aus Mikrofiltration und Pasteurisation sollten zunächst die Auswirkungeneiner isolierten Mikrofiltrationsanwendung auf die Florazusammensetzung von Milch untersuchtwerden. Die beiden Mikrofiltrationstemperaturen orientieren sich an den in der Milchindustrieüblichen Temperaturen von 50 bzw. 55°C.Die Floren der beiden mikrofiltrierten Milchen direkt nach der Mikrofiltration sowie nach zweitägigerLagerung bei 10°C setzen sich aus den gleichen Mikroorganismengruppen mit jeweils ähnlichen Antei-70

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererlen zusammen (Abbildung 3.3- 59). Zu beiden Zeiten ist die Flora von grampositiven Bakterien derGruppen High GC Grampositive bzw. Milchsäurebakterien dominiert. Direkt nach der Mikrofiltrationsetzen sich die Floren zu 83% (55°C) bzw. 66% (50°C) aus High GC Grampositiven, nach zwei TagenLagerung zu 96% bzw. 93% aus Milchsäurebakterien zusammen. Die Verringerung der Anteile Gramnegativerbei höheren Mikrofiltrationstemperaturen ist nicht auf den Temperatureffekt zurückzuführen,sondern beruht vermutlich auf einer besseren Abtrennbarkeit dieser Mikroorganismen bei höherenTemperaturen. Dieser Effekt wird verdeutlicht bei Vergleich der Floren von bei 55°C mikrofiltrierterMilch mit der Flora von alleinig auf 55°C erwärmter Milch (Abbildung 3.3- 60).Direkt nach der Mikrofiltration führt die um 5°C höhere Mikrofiltrationstemperatur zu einem um 17Prozentpunkte höheren Anteil High GC Grampositiver. Nach fünftägiger Lagerdauer unterscheidet sichdie mikrobielle Zusammensetzung der beiden Filtrationstemperaturen, d.h. die bei 50°C mikrofiltrierteMilch ist zu gleichen Teilen aus Grampositiven in Form von Milchsäurebakterien und strikt aerobenGramnegativen zusammengesetzt. Die bei 55°C mikrofiltrierte Milch ist zwar aus den gleichenMikroorganismengruppen aufgebaut, jedoch entfällt auf die strikt aeroben Gramnegativen lediglichein Anteil von 10%. Acht Tage nach der Mikrofiltration bestehen die beiden Floren zu 81% (55°C)bzw. 51% (50°C) aus Gramnegativen Bakterien. Daneben sind als dritte Gruppe in der bei 50°C mikrofiltriertenMilch Bazillen mit einem Anteil von 32% nachweisbar. Da sowohl Bazillen wie auch diedetektierten Gramnegativen den psychrotoleranten Mikroorganismen angehören und auch bei kühlenTemperaturen über kurze Generationszeiten verfügen, können sich diese Bakterien bei der Lagertemperaturvon 10°C gegenüber der Begleitflora durchsetzen (Sorhaug und Stepaniak, 1997). Zusammenfassendlässt sich feststellen, dass die um fünf Grad höheren Mikrofiltrationstemperaturen unmittelbarnach der Filtration zu einem höheren Anteil Grampositiver in der Milch führen. Jedoch lässt dieZusammensetzung dieser Anfangsflora aufgrund komplexer Populationsdynamiken während der Lagerdauerkeine Rückschlüsse auf den späteren Verderbserreger zu. So sind trotz ähnlicher Mikroflorendirekt nach der Mikrofiltration für die beiden Temperaturen, die Verderbsfloren nicht aus den gleichenMikroorganismengruppen aufgebaut.71

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererMikrofiltration(55°C)8% 5% 4%1%1% 1%10%19%83%96%90%81%Direkt nachMikrofiltrationNach 2 TagenNach 5 TagenNach 8 Tagen15%11%8%1%Mikrofiltration(50°C)4%2%1% 1%32%66%93%50%48%17%51%Strikt aerobe GramnegativeHigh GC GrampositiveBazillenFakultativ anaerobe GramnegativeMilchsäurebakterienNicht identifizierbarAbbildung 3.3- 59: Vergleich der Mikrobiota von bei 50 bzw. 55°C mikrofiltrierter Milch, unmittelbar nach derMikrofiltration während der Lagerung bei 10°C bis zum Verderb der Milchen nach 8 Tagen, indiziert durch Keimzahlenvon ≥ 10 6 KbE/ml (KbE / ml = Koloniebildende Einheiten pro Milliliter).Um den Einfluss der Temperatur vom Mikrofiltrationseffekt abzugrenzen, wurde zusätzlich zur Floraanalysevon bei 55 bzw. 50°C mikrofiltrierter Milch die Flora von auf 55°C erhitzter Milch der gleichenCharge analysiert (Abbildung 3.3- 60). Dabei lässt sich neben den um zwei bzw. drei log-Einheitenverringerten Keimzahlen in den mikrofiltrierten Milchen auch eine selektive Wirkung des Filtrierungsprozessesauf die Florazusammensetzung feststellen. Die Hefen werden aufgrund ihrer Zellgrößedurch den Mikrofiltrationsprozess vollständig abgetrennt. Die detektierten grampositiven Nichtsporenbildnerder mikrofiltrierten Milchen gehören alle in die Gruppe der High GC Grampositiven, wohingegendie grampositive Flora der erhitzten Milch sich neben Bazillen und High GC Grampositiven auchaus Milchsäurebakterien und anderen Grampositiven der Gattung Staphylococcus zusammensetzt.Des Weiteren ist der Anteil Gramnegativer in den mikrofiltrierten Milchen mit neun (bei 55°C mikrofiltrierteMilch) bzw. 19% (bei 50°C mikrofiltrierte Milch), nur ungefähr ein Viertel bzw. halb so groß wiein der erhitzten Milch.72

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererMikrofiltration bei55°CMikrofiltration bei50°CErhitzung auf55°C8%5%4%11%8%15%8%24%15%10%10%83%66%21%12%4x10 1 KbE/ml3x10 2 KbE/ml3x10 4 KbE/mlStrikt aerobe GramnegativeMilchsäurebakterienAndere GrampositiveHefenFakultativ anaerobe GramnegativeHigh GC GrampositiveBazillenNicht identifizierbarAbbildung 3.3- 60: Vergleich der Mikrobiota von bei 55 bzw. 50°C mikrofiltrierter und auf 55°C erhitzter Magermilch.Werte unter den Diagrammen geben jeweils die aeroben Gesamtkeimzahlen an, ermittelt nach fünftägigerKultivierung auf Plate-Count Agar mit Magermilchzusatz (1%) bei 30°C.Vergleich der Mikrobiota von Rohmilch, mikrofiltrierter Milch sowie mikrofiltrierter undpasteurisierter MilchDas Ziel dieses Versuchs war der Vergleich der Flora von Rohmagermilch mit Milchen nach der Behandlungin Form von Mikrofiltration bei 10°C bzw. 50°C sowie von Mikrofiltration bei 10 bzw. 50°Cund anschließender Pasteurisation. Neben Floraanalysen unmittelbar nach der Behandlung (Abbildung3.3- 61), wurden die behandelten Milchen bei 10°C gelagert und im Abstand von drei bis sieben Tagenbis zum Verderb, indiziert durch Keimzahlen ≥10 6 KbE/ml, untersucht (Abbildung 3.3- 62). Vonjeder Behandlungsvariante wurden mehrere Probenbehälter befüllt. Dadurch sollte sichergestellt werden,dass zu jedem Untersuchungszeitpunkt eine noch nicht geöffnete und damit nicht durch vorherigeProbenentnahme potentiell rekontaminierte Milch zur Verfügung stand.Der Vergleich der mikrobiellen Floren zum Zeitpunkt direkt nach der Behandlung (Abbildung 3.3-61)zeigt, dass sich die Florazusammensetzung von der Rohmagermilch über die mikrofiltrierte Milch bishin zur mikrofiltrierten und pasteurisierten Milch von den gramnegativen in Richtung der grampositivenBakterien verschiebt, d.h. in der Magermilch beträgt der Anteil Grampositiver 54%, in den bei10°C bzw. 50°C mikrofiltrierten Milchen 65% bzw. 71%, und steigt in den Milchen mit kombinierterBehandlung aus Mikrofiltration und Pasteurisation auf 100% (Mikrofiltration bei 10°C) bzw. 92% (Mikrofiltrationbei 50°C) an. Der Anteil der Bazillen, vertreten durch die Genera Bacillus bzw. Paenibacillusnimmt dabei von 4% in der Rohmagermilch über 11% bzw. 7% in den mikofiltrierten zu 43%bzw. 24% in den mikrofiltrierten und pasteurisierten Milchen zu, wohingegen Milchsäurebakterien imGegensatz zum Anteil von 11% in der Rohmagermilch in den mikrofiltrierten und pasteurisierten Milchennicht mehr detektiert werden können. Die beiden Proben direkt nach der Mikrofiltration sindähnlich zusammengesetzt. Der um 20 Prozentpunkte höhere Anteil High GC Grampositiver und umsechs Prozentpunkte geringere Anteil Gramnegativer in der bei 50°C im Vergleich zu der bei 10°Cmikrofiltrierten Probe lässt sich vermutlich, wie bereits beim Vergleich der Mikrofiltrationstemperaturen50°C bzw. 55°C beschrieben, auf die bessere Abtrennbarkeit Gramnegativer bei höheren Tempe-73

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererraturen zurückführen. Die unterschiedliche Mikroflora der mikrofiltrierten und pasteurisierten Probenkönnte mit der Inhomogenität der Mikroorganismenverteilung innerhalb der Proben gleicher Behandlungsartzusammenhängen, die durch die geringen Keimzahlen nach einer kombinierten Behandlungaus Mikrofiltration und Pasteurisation deutlicher ins Gewicht fällt.Rohmagermilch4%9%11%38%30%1x10 4 KbE/mlNach Mikrofiltration(10°C)7%7%24%11%11%40%5x10 1 KbE/ml4%60%Nach Mikrofiltration(50°C)7%7x10 1 KbE/ml27%2%Nach Mikrofiltration(10°C)+ PasteurisationNach Mikrofiltration(50°C)+ Pasteurisation43%57%8%10%2%56%24%2x10 1 KbE/ml2x10 1 KbE/mlStrikt aerobe GramnegativeMilchsäurebakterienAndere GrampositiveFakultativ anaerobe GramnegativeHigh GC GrampositiveBazillenNicht identifizierbarAbbildung 3.3- 61: Vergleich von Rohmagermilch/ mikrofiltrierter (10 bzw.50°C)/ mikrofiltrierter (10 bzw. 50°C)und pasteurisierter Milch unmittelbar nach der Behandlung. Für jede der fünf Graphiken wurden 50 Isolate vonPlate Count (PC)-Agar mit Magermilchzusatz (1%) quantitativ ausgewählt und mittels FTIR-Spektroskopie identifiziert.Während der Lagerung der unterschiedlichen Milchproben bei 10°C bilden in den mikrofiltrierten Milchennach zwei (10°C) bzw. fünf Tagen (50°C) Gramnegative der Gattung Pseudomonas die persistierendeFlora bis zum Verderb nach 12 Tagen mit Keimzahlen in der bei 10°C mikrofiltrierten Milchvon 10 7 KbE/ml (Abbildung 3.3- 62). Die bei 50°C mikrofiltrierte Milch wurde aufgrund gleicher Mikro-74

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererflora und ähnlichen Keimzahlen wie die bei 10°C mikrofiltrierte Milch nur bis fünf Tage nach Herstellunguntersucht.Die Floren der mikrofiltrierten und pasteurisierten Milchen nach zwei bis fünf Tagen Lagerzeit werdenvon Grampositiven, d.h. fast ausschließlich von High GC Grampositiven, vor allem vertreten durch dieGattung Microbacterium mit Anteilen von 72% bis 88% dominiert. Des Weiteren sind in einigen FlorenGramnegative in geringerer Anzahl von 3% bis 6% detektierbar, wobei aufgrund der geringerenAnteile nicht festgelegt werden kann, ob die Mikroorganismen durch Rekontamination nach der Pasteurisationin die Milch gelangt sind oder ob diese Bakterien den Erhitzungsprozess überlebt haben.Die nicht identifizierbaren Isolate in den mikrofiltrierten Milchen nach zwei Tagen Lagerung könnenaufgrund ihres schwachen Wachstums nicht mittels FTIR-Spektroskopie identifiziert werden. Nachzwölf bis 30 Tagen Lagerung bestehen fast alle Floren der mikrofiltrierten und pasteurisierten Milchenzu einem Großteil aus Bazillen (83% bis 99%), repräsentiert durch die Genera Bacillus und Paenibacillus, wobei der Anteil der Bazillen ab 19 Tagen Lagerung stetig ansteigt und die High GC Grampositivenzunehmend verdrängt werden. Die Zusammensetzung der Verderbsflora von bei 50°C mikrofiltrierterund pasteurisierter Milch nach 30 Tagen Lagerzeit aus den strikt aeroben Gramnegativen derGattungen Acinetobacter und Pseudomonas, lässt sich wahrscheinlich dadurch erklären, dass aufgrundder zu geringen Anzahl an Probenflaschen dieser Milch ein bereits geöffneter Probenbehälterverwendet worden ist, der aber durch die vorige Probenentnahme rekontaminiert worden war. Nach30 Tagen Lagerung bei 10°C sind beide mikrofiltrierten und pasteurisierten Milchen mit Keimzahlenvon 10 6 und 10 7 KbE/ml verdorben. Die in der Literatur angegebene Haltbarkeitsdauer von mikrofiltrierterund pasteurisierter ESL-Milch von bis zu 35 Tagen bezieht sich auf eine Lagertemperatur von 4- 6°C (Saboya und Maubois, 2000). Dass die in diesem Versuch erzielte Haltbarkeit trotz guter Rohmilchqualitätvon 10 4 KbE/ml weniger als 30 Tage betragen hat, lässt sich auf die höhere Lagertemperaturvon 10°C zurückführen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass eine isolierte Mikrofiltrationsbehandlungfür die Herstellung von ESL-Milch nicht ausreichend ist, da gramnegative Bakterienüberleben, deren psychrotolerante Vertreter auch bei tiefen Temperaturen wachsen und die Haltbarkeitbeschränken.Da, wie dargestellt, Rekontaminationen bei der Abfüllung der Milch nach erfolgreicher Pasteurisationnicht vollständig ausgeschlossen werden können und eine Inhomogenität der Mikroorganismenverteilungzwischen den Proben derselben Behandlungsart besteht, wurden für die nachfolgend aufgeführtenVersuche pro Untersuchungszeitpunkt mindestens zwei Proben parallel analysiert.75

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererNach Mikrofiltration(10°C)Nach Mikrofiltration(50°C)Nach Mikrofiltration(10°C)+ PasteurisationNach Mikrofiltration(50°C)+ PasteurisationNach 2 Tagen10%88%11%72%9%79%7x10 2 KbE/ml4x10 1 KbE/ml8 KbE/ml2x10 1 KbE/ml11%17%Nach 5 Tagen2x10 5 KbE/ml1x10 5 KbE/ml1x10 1 KbE/ml89%8 KbE/ml76%Nach 8 Tagen82%88%7x10 4 KbE/ml8x10 1 KbE/ml5x10 1 KbE/ml53%Nach 12 Tagen99%40%1x10 7 KbE/ml4x10 2 KbE/ml10%9 KbE/mlNach 19 Tagen23% 67%2x10 1 KbE/ml1x10 3 KbE/ml95%16%Nach 23 Tagen94%7x10 2 KbE/ml82%5x10 4 KbE/mlNach 30 Tagen99%Strikt aerobe GramnegativeMilchsäurebakterienAndere GrampositiveFakultativ anaerobe GramnegativeHigh GC GrampositiveBazillen1x10 6 KbE/mlNicht identifizierbar4x10 7 KbE/mlAbbildung 3.3- 62: Vergleich der Mikrobiota von mikrofiltrierter (10°C bzw.50°C) mit mikrofiltrierter (10°C bzw.50°C) und pasteurisierter Milch während der Lagerung bei 10°C.76

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererAP V Mikrobiologische CharakterisierungIm Rahmen der mikrobiologischen Charakterisierung wurden Floraanalysen von industriell produziertermikrofiltrierter und pasteurisierter (MF+PAST) sowie hocherhitzter (HE) ESL-Milch durchgeführt.Mikroflora mikrofiltrierter und pasteurisierter ESL-MilchUm den Einfluss der MF+PAST-Behandlung auf die Milchflora zu eruieren, wurden Keimzahlen undFlorazusammensetzung der Rohmagermilch, der mikrofiltrierten (MF) Milch sowie der MF+PAST-Milchdirekt nach der Behandlung und am MHD-Ende nach einer Lagerung bei 10°C untersucht.Der Vergleich der Rohmagermilch und der MF-Milch direkt nach der Behandlung (Abbildung 3.3- 63)zeigt, dass die Mikrofiltration mit einer Reduktion um 2,8-log Einheiten, d.h. von 1x10 5 in der Rohmagermilchzu 3x10 2 KbE/ml in der MF-Milch, eine deutliche Verringerung der koloniebildenden Einheitenbewirkt. Die in der Rohmagermilch enthaltenen Hefen, anderen Grampositiven und Milchsäurebakterien(siehe Speziesübersicht Tabelle 3.3- 8) können nach der Mikrofiltration nicht mehr detektiert werden,jedoch bleibt der Anteil gramnegativer Bakterien, vertreten durch die Gattungen Brevundimonas,Pseudoxanthomonas und Stenotrophomonas gleich. Einige psychrotolerante Vertreter dieser gramnegativenBakterien können jedoch bei Kühlschranktemperaturen wachsen und somit zu einem vorzeitigenVerderb der Milch führen (Stevenson et al., 2003; Ternström et al., 1993). Somit stellt die derMikrofiltration nachgeschaltete Pasteurisation einen essentiellen Behandlungsschritt dar, da dadurchdie gramnegativen Bakterien aufgrund ihrer vergleichsweise geringen Hitzetoleranz, zurückzuführenauf einen geringeren Anteil an Murein in ihrer Zellwand, vollständig eliminiert werden. Die in diesemVersuch mittels Pasteurisation erzielte Mikroorganismen-Abnahme um 0,1 log-Einheiten ist im Vergleichmit Literaturwerten, d.h. Reduktionen um ein bis zwei Log-Einheiten (Damerow, 1989; Weber,2006), gering, jedoch ist der Anteil Gramnegativer Bakterien in der MF-Milch mit 20% vergleichsweiseniedrig und die außerdem in der MF-Milch enthaltenen, thermoduren High GC Grampositiven, d.h. v.a.Microbacterium spp. können Pasteurisationsbedingungen überstehen. Somit setzt sich die mikrobielleFlora der MF+PAST-Milch ausschließlich aus hitzetoleranten Grampositiven Bakterien d.h. Milchsäurebakterien(Streptococcus thermophilus, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus casei/paracasei)und High GC Grampositiven (v.a. Microbacterium sp. und Brachybacterium nesterenkovii) zusammen(Abbildung 3.3- 63).77

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererRohmagermilchMikrofiltrierte Milch(50-55°C)Mikrofiltrierte + pasteurisierteMilch1x10 5 KbE/ml 3x10 1 KbE/ml 2x10 1 KbE/ml4%5%3%19%20%24%33%36%80%76%Strikt aerobe Gramnegative High GC Grampositive MSB Bazillen Andere Grampositive HefenAbbildung 3.3- 63: Darstellung der Keimreduktion durch Mikrofiltration und Pasteurisation und Auswirkungen derMF+PAST-Behandlung auf die Milchflora. Graphiken basieren auf 100 (Rohmagermilch) bzw. 50 (MF-Milch,MF+PAST-Milch) Isolaten, gewonnen nach aerober Bebrütung der Agarplatten bei 30°C. Identifizierung erfolgtemittels FTIR-Spektroskopie und ggf. mittels DNA-Sequenzanalyse.Nach 20-tägiger Lagerung bei 10°C bis zum MHD-Ende der MF+PAST-Milch wurden Proben aus zweiaseptisch abgepackten Milchkartons (I und II) der gleichen Charge untersucht. Die zwei Floren sindsehr ähnlich bzgl. ihrer Keimzahlen (2x10 5 KbE/ml bzw. 3x10 5 KbE) und der mikrobiellen Zusammensetzung.Beide bestehen ausschließlich aus hitzetoleranten Grampositiven Bakterien, d.h. v.a. Microbacteriumlacticum (High GC Grampositive) und in geringen Anteilen von 3% (Karton I) bzw. 0.1%(Karton II) dem Sporenbildner Bacillus pumilus (Bazillen). Ein mikrobieller Verderb am MHD-Ende, indiziertdurch Keimzahlen von 10 6 , wird in beiden Milchpackungen nicht erreicht.Der Vergleich der MF+PAST-Milch direkt nach der Behandlung mit der Milch am MHD-Ende zeigt nebeneinem Anstieg der Keimzahlen um 4 log-Einheiten während der Kühllagerung auch eine Floraverschiebung(Abbildung 3.3- 64). Die direkt nach der Behandlung zu 24% detektierten Milchsäurebakterien(Streptococcus thermophilus, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus casei/paracasei) sind amMHD-Ende nicht mehr nachweisbar und von den psychrotoleranten High GC Grampositiven Microbacteriumlacticum verdrängt worden. Des Weiteren konnten in den direkt nach der Pasteurisation imGegensatz zu der am MHD-Ende analysierten Milch keine sporenbildenden Bakterien detektiert werden,da sie unterhalb der Nachweisgrenze lagen. Bacillus pumilus, ein häufig Milch assoziierter Sporenbildner,kann jedoch bei der Lagertemperatur von 10°C wachsen (Nissen et al., 2001; Ruiz et al.,78

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchDirekt nachMikrofiltration+PasteurisationMHD-EndeKulozik u. Kaufmann/SchererDirekt nach2002) und sich gegenüber Mikrofiltration+der Begleitflora insoweit durchsetzen, MHD-Ende dass er am MHD-Ende in detektierbarerAnzahl vorliegt. Pasteurisation24%3%24%2x10 1 KbE/ml76%2x10 5 KbE/ml3%97%MSBHigh GC 76% Grampositive Bazillen2x10 1 KbE/ml2x10 5 KbE/ml97%MSBHigh GC GrampositiveBazillenAbbildung 3.3- 64: Vergleich der Florazusammensetzung von MF+PAST-Milch direkt nach der Behandlung undnach einer Lagerung bei 10°C bis zum MHD-Ende.Zusammenfassend gibt Tabelle 3.3- 8 einen Überblick über die Bakterien- und Hefenspezies, die inder Rohmagermilch, der MF- und der MF+PAST-Milch direkt nach der Behandlung sowie am MHD-Ende detektiert wurden. Die zugehörigen Keimzahlen sind in Abbildung 3.3- 65 dargestellt.79

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererTabelle 3.3- 8: MF+PAST-Milch: Übersicht über detektierte SpeziesRohmagermilchMF-Milch direktnach BehandlungMF+PAST-Milchdirekt nachBehandlungMF+PAST-MilchMHD-EndeStrikt aerobeGramnegativeChr. sp.Psexan. sp. nov.Pse. aeruginosa Ste. maltophilaPse. jessenii/fluorescens R. sp.Pse. putida/cepacia Bre. spPse. sp.nov.Pse. synxantha/reactansHigh GC GrampositiveArt. ilicisArt. sp.Cor. glutamicumCor. variabilisKoc. rhizophilaMac. caseolyticusMb. lacticumMic. luteusPla. sp.Rot. mucilaginosaA. mediolanusMb. lacticumMb. liquefaciensBra. nesterenkoviiMb. lacticumMb. lacticumMilchsäurebakterien(MSB)Lb. casei / paracaseiLeu. mesenteroidesSc. thermophilusLb. casei/paracaseiLeu. mesenteroidesSc. thermophilusBazillenB. licheniformisB. pumilusB. subtilisB. pumilusAndere GrampositiveS. xylosus/saprophyticusS. xylosus/kloosiiS. xylosus/ equorumHefenY. lipolyticaA. = Agromyces; Art. = Arthrobacter; B = Bacillus; Bra. = Brachybacterium; Bre. = Brevundimonas; Chr. = Chryseobacterium;Cor. = Corynebacterium; Koc. = Kocuria; Lb. = Lactobacillus; Leu.= Leuconostoc; Mac. =Macrococcus; Mb. = Microbacterium;Mic. = Micrococcus; Pla. = Plantibacter; Pse. =Pseudomonas; Psexan = Pseudoxanthomonas; R. =Rhizobium; Rot. = Rothia;S. = Staphylococcus; sp. nov. = species novum (nicht beschriebene Spezies); Ste. = Stenotrophomonas; Sc. =Streptococcus;Y. = Yarrowia.1,0E+06Verderbsgrenze ≥ 10 6 KbE/ml1,0E+05KbE/ml1,0E+041,0E+031,0E+021,0E+011,0E+00RohmagermilchMF-Milch direktnach BehandlungMF+PAST- Milchdirekt nachBehandlungMF+PAST- MilchMHD-EndeAbbildung 3.3- 65: MF+PAST-Milch: Keimzahlverlauf während des Herstellungsprozesses und nach einer 20-tägigen Lagerung bei 10°C.80

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererIn zwei weiteren Versuchen (April 09 bzw. Mai 09) sollte der Einfluss der Lagertemperaturen 4°C, 8°Cund 10°C auf die Mikroflora von MF+PAST-Milch untersucht werden. Die Milchproben stammen vomselben Hersteller wie im oben dargestellten Versuch. Neben Flora- und Keimzahlanalysen der Rohmagermilch,der mikrofiltrierten Milch sowie der MF+PAST-Milch unmittelbar nach der Behandlung wurdedie MF+PAST-Milch während der Lagerung bis sieben Tage nach MHD-Ende an definierten Zeitpunktenanalysiert. Pro Untersuchungszeitpunkt und –temperatur wurden zwei jeweils vorher ungeöffnetePackungen untersucht. Am MHD-Ende wurden fünf Packungen je Temperatur analysiert, um die Floradiversitätzwischen den einzelnen Packungen darzustellen. Diese Floradiversität ist durch die niedrigenKeimzahlen der MF+PAST-Milch direkt nach der Behandlung und der zufallsbedingten Verteilungder Mikroorganismen auf die verschiedenen Packungen bei der Abfüllung bedingt. Die Keimzahlennach der Mikrofiltration bzw. nach der Mikrofiltration und Pasteurisation sind mit 0,5 bis 30 KbE/mlsehr gering und somit liegen gramnegative Bakterien in der MF-Milch bzw. Sporenbildner in derMF+PAST-Milch teilweise unter der Detektionsgrenze. Information über Arten und Anzahl gramnegativerund sporenbildender Bakterien sind jedoch entscheidend, da beide Gruppen eine maßgeblicheRolle im Milchverderb spielen. Deshalb wurden neben dem direkten Ausplattieren der MF- bzw. derMF+PAST-Milchen, von beiden Proben je 100ml à 1ml in Reagenzröhrchen abgefüllt und diese Aliquotebei 30°C für drei Tage angereichert. Anschließend wurde pro Röhrchen eine Öse Material auf PlateCount Agar mit 1% Magermilch ausgestrichen und, falls Wachstum vorhanden, wurden die Bakterienmittels FTIR-Spektroskopie identifiziert.Der Vergleich der Rohmagermilchen vom April und Mai 09 (Abbildung 3.3- 66) zeigt einen Keimzahlunterschiedvon 1,5 log Einheiten (7x10 4 KbE/ml vs. 2x10 6 KbE/ml). Neben den höheren Keimzahlenweist die Milch vom Mai mit 95% einen höheren Anteil gramnegativer Bakterien auf als die vom April(52%). Nach der Mikrofiltration, welche eine Keimzahlreduktion von 3 bzw. 5 log Einheiten bewirkt,sind nach dem direkten Ausplattieren keine gramnegativen Bakterien detektierbar, d.h. die Floren bestehenneben den dominierenden Mikrobakterien (High GC Grampositven) zu 20% aus Milchsäurebakterien(April 09) bzw. Staphylokokken (Mai 09). Nach Anreicherung dieser beiden mikrofiltriertenMilchproben sind in beiden Proben Gramnegative nachweisbar. In der Probe vom April 09 mit einemAnteil von 18% die Art Stenotrophomonas maltophilia, in der Probe vom Mai 09 mit einem Anteil von11% Chryseobacterium sp., Brevundimonas sp. sowie ebenfalls Stenotrophomonas maltophilia. Inden direkt ausplattierten MF+Past-Milchproben sind keine (April 09) bzw. nur 1% (Mai 09) Bazillendetektierbar, die Untersuchung der angereicherten Milchen zeigt dagegen einen Anteil von 18% Bazillenals Brevibacillus agri, Bacillus licheniformis, Paenibacillus amylolyticus (April 09) bzw. als B. licheniformis,Bacillus sonorensis und Bacillus subtilis (Mai 09). Von der MF-Milch mit Keimzahlen von 1KbE/ml (April 09) bzw. 0,5 KbE/ml (Mai 09) zur MF+PAST-Milch lässt sich entgegen der Erwartung einAnstieg auf 2 (April 09) bzw. 20 KbE/ml (Mai 09) feststellen. Dies ist wahrscheinlich auf eine Rekontaminationmit Microbacterium spp. in der Produktionsanlage zurückzuführen.81

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererRohmagermilch Mikrofiltrierte Milch Mikrofiltrierte +(50-55°C)pasteurisierte MilchApril 09DirektesAusplattieren1%14%30%2%47%22%5%78%7x10 4 KbE/ml 1 KbE/ml 2 KbE/mlAnreicherung:29%18%18%jeweils 100* 1ml53%ca. 77 KbE/100ml82%ca. 98 KbE/100mlMai 09DirektesAusplattieren10%4% 1%20%85%80% 99%2x10 6 KbE/ml 0,5 KbE/ml 20 KbE/mlAnreicherung:15%1%11%jeweils 100* 1ml73%Strikt aerobe GramnegativeMilchsäurebakterienAndere Grampositiveca. 69 KbE/100 mlFakultativ anaerobe GramnegativeHigh GC GrampositiveBazillenAbbildung 3.3- 66: Darstellung der Mikroflora von zwei MF+PAST-Milchchargen (April 09 bzw. Mai 09).Abgebildet sind die Mikroflora von Rohmagermilch, mikrofiltrierter Milch bzw. mikrofiltrierter und pasteurisierterMilch, ermittelt nach direktem Ausplattieren auf Plate Count Agar mit Magermilchzusatz (1%) bzw. nach Aliquotierungund dreitägiger Anreicherung bei 30°C. Diagramme der Rohmagermilch beruhen auf 100 quantitativausgewählten Isolaten, für die direkt nach dem Ausplattieren durchgeführten Floraanalysen von MF- bzw.MF+PAST-Milchen wurden alle in 10ml detektierten Isolate herangezogen.82

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererApril 091,E+08MHD-EndeKeimzahlen KbE/ml1,E+071,E+061,E+051,E+041,E+031,E+021,E+011,E+00Verderbsgrenze7 14 16 18 20 22 29Lagerdauer in Tagen [d]10°C04/098°C04/094°C04/09Mai 09Keimzahlen [KbE/ml]1,E+071,E+061,E+051,E+041,E+031,E+021,E+01VerderbsgrenzeMHD-Ende10°C05/098°C05/094°C05/091,E+007 14 16 18 20 22 29Lagerdauer in Tagen [d]Abbildung 3.3- 67: Keimzahlverläufe von MF+PAST-Milch während der Lagerung bei 4°C, 8°C bzw. 10°C direktnach der Behandlung bis 7 Tage nach MHD-Ende anhand von zwei Milchchargen (April 09 bzw. Mai 09).Während der Lagerung der Milchproben vom April 09 bzw. Mai 09 kommt es erwartungsgemäß bei allendrei Lagertemperaturen zu einem stetigen Anstieg der Keimzahlen über die Lagerzeit. Der Anstiegbei der 10°C Lagerung verläuft dabei am stärksten, der Anstieg bei den 4°C Proben ist am geringsten(Abbildung 3.3- 67). Am Ende des vom Hersteller vergebenen Mindesthaltbarkeitsdatums (22 Tagenach Abfüllung) beträgt der Keimzahlunterschied bei beiden untersuchten Milchchargen zwischen denbei 4°C und den bei 10°C gelagerten Milchpackungen drei log- Einheiten. Mit Keimzahlen von 3x10 1bis 3x10 5 KbE/ml wird bei keiner Probe am MHD-Ende die mikrobiologische Verderbsgrenze von 10 6KbE/ml überschritten. Sieben Tage nach MHD-Ende sind alle bei 10°C aufbewahrten Proben verdorben(4x10 6 KbE/ml - 9x10 6 KbE/ml), die bei 8°C gelagerten Milchen sind mit 4x10 5 KbE/ml – 4x10 6KbE/ml im Grenzbereich oder verdorben. Am Untersuchungsende kann in der Mai 09 Charge keinKeimzahlunterschied zwischen der 8°C und der 10°C Lagerung festgestellt werden. Sämtliche 4°C83

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererProben sind mit Keimzahlen von 2x10 2 KbE/ml (April 09) bis 6x10 3 KbE/ml (Mai 09) aus mikrobiologischerSicht einwandfrei.Der jeweils direkte Vergleich der 4°C, 8°C bzw. 10°C Keimzahlverläufe der Milchchargen April 09 bzw.Mai 09 (Abbildung 3.3- 68) zeigt, dass direkt nach der Abfüllung der Keimzahlunterschied zwischenbeiden Chargen eine log Einheit beträgt (2 vs. 20 KbE/ml). Im Lagerungsverlauf bleibt dieser Keimzahlunterschiedbei allen drei Temperaturen durchgängig bis zum MHD-Ende bestehen, d.h. eine geringereKeimbelastung direkt nach der MF+PAST-Behandlung führt zu einer besseren Milchqualität amMHD-Ende.In Milchpackungen vom Mai 09 können bei allen drei Lagertemperaturen „Ausreißer“ beobachtet werden(Tabelle 3.3- 9). In diesen Fällen weichen die Keimzahlwerte um 1-3 log Einheiten vom durchschnittlichenKeimzahlverlauf nach oben ab, so dass zwei der drei betroffenen Milchpackungen Keimzahlenvon 3x10 5 KbE/ml (10°C, 16 Tage nach Abfüllung) bzw. 3x10 6 KbE/ml (8°C, 16 Tage nach Abfüllung)aufweisen und somit ein Verderb vor Ende des MHD resultiert. Die isolierten sporenbildendenBakterien der Art Paenibacillus amylolyticus/ glucanolyticus liegen direkt nach der Behandlung unterder Detektionsgrenze, sind bei der Abfüllung in einzelne Packungen gelangt und können aufgrund ihrerpsychrotoleranten Eigenschaften auch bei kühlen Lagerbedingungen wachsen. Bei der 10°C Lagerungwurde bereits nach 16 Tagen eine Ausreißer-Packung detektiert d.h. sechs bzw. vier Tage früherals bei der 8°C und der 4°C Lagerung. Somit lässt sich feststellen, dass höhere Temperaturen dasHochwachsen dieser unerwünschten Sporenbildner unter Verdrängung der in MF+PAST-Milchen dominierendenMikrobakterien-Begleitflora begünstigen. Über Paenibacillus spp. und ihre ökonomischeBedeutung als psychrotolerante Verderbniserreger von Milch ist bereits berichtet worden (Fromm undBoor, 2004; Huck et al., 2008).Tabelle 3.3- 9: Übersicht über milchverderbende Sporenbildner in der Milchcharge vom Mai 09Probe Detektierte Sporenbildner KeimzahlenMai 09 10°C 16 Tage Lagerung Paenibacillus amylolyticus/ glucanolyticus 3x10 5 KbE/mlMai 09 8°C 20 Tage Lagerung Paenibacillus amylolyticus/ glucanolyticus 3x10 6 KbE/mlMai 09 4°C 22 Tage Lagerung Paenibacillus amylolyticus /glucanolyticus 5x10 3 KbE/ml84

1416182022AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-Milch10°CKeimzahlen [KbE/ml]1,E+081,E+071,E+061,E+051,E+041,E+031,E+021,E+01MHD-EndeKulozik u. Kaufmann/Scherer10°C04/0910°C05/098°CKeimzahlen [KbE/ml]1,E+001,E+071,E+061,E+051,E+041,E+031,E+021,E+017 14 16 18 20 22 29Lagerdauer in Tagen [d]8°C05/098°C04/094°C1,E+007 14 16 18 20 22 29Lagerdauer in Tagen [d]Keimzahlen [KbE/ml]1,E+041,E+031,E+021,E+014°C05/094°C04/091,E+00Lagerdauer in Tagen [d]Abbildung 3.3- 68: Direkter Vergleich der 10°C, 8°C und 4°C Keimzahlverläufe der April 09 und Mai 09 Milchchargen.Die Analyse von fünf Milchpackungen pro Lagertemperatur am MHD-Ende zeigt, dass bei der mikrobiologischgeringer belasteten Milchcharge vom April 09 die Florazusammensetzung unabhängig vonder Lagertemperatur in allen Packungen sehr ähnlich ist. Abgesehen von vereinzelt detektierten SporenbildnernBacillus pumilus, Paenibacillus amylolyticus / glucanolyticus (in den 4°C und 8 °C Proben),Staphylokokken (in einer 8°C Probe) und Microoccus luteus (in einer 4°C Probe) setzen sich alle Mikroflorenausschließlich aus Mikrobakterien, d.h. v.a. Microbacterium lacticum zusammen. In der Chargevom Mai 09 bestehen die meisten MHD-Ende Floren ebenfalls vollständig aus Microbacterium spp.,85

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererd.h. alle fünf 8°C Milchproben, vier der fünf 4°C Proben, sowie in drei der fünf 10°C Proben. In zweider 10°C Proben sind aber zusätzlich B. cereus bzw. B. cereus und Paenibacillus amylolyticus/glucanolyticusnachweisbar, in einer der 4°C Proben Paenibacillus amylolyticus/glucanolyticus(Tabelle 3.3- 10). Über die Bedeutung von Paenibacillu spp. als Lebensmittelverderber ist bereits imoberen Abschnitt berichtet worden. Das sporenbildende Bakterium B. cereus ist in der Lage hitzestabileProteasen zu bilden, welche die Süßgerinnung auslösen und so häufig zu einem vorzeitigen Verderbvon pasteurisierter Milch (Cromie, 1991; Ternström et al., 1993) führen. Zum anderen gibt esunter den B. cereus Stämmen pathogene Vertreter, die ein emetisches bzw. ein Diarrhöe Toxin bildenund infolgedessen lebensmittelbedingte Krankheiten auslösen können. Die in den beiden Milchpackungendetektierten B. cereus - Keimzahlen erreichten Werte von 3x10 3 KbE/ ml bzw. 2x10 4 KbE/ml.Tabelle 3.3- 10 : Übersicht über detektierte Sporenbildner in der Milchcharge vom Mai 09ProbeDetektierte Sporenbildner10°C Probe 1 Paenibacillus amylolyticus/glucanolyticusBacillus cereus (3x10 3 KbE/ml)10°C Probe 5 Bacillus cereus (2x10 4 KbE/ml)4°C Probe 1 Paenibacillus amylolyticus/glucanolyticusNachweis von Bacillus cereus in industriell erzeugter, mikrofiltrierter und pasteurisierterMilchDa im Rahmen des oben dargestellten Lagerversuchs von MF+PAST-Milch in zwei Milchpackungen dersporenbildende und potentiell pathogene Lebensmittelverderber B. cereus detektiert wurde, sollte imnachfolgend dargestellten Versuch die Inzidenz von B. cereus in industriell erzeugter MF+PAST-Handelsmilch untersucht werden. Hierzu wurden Milchpackungen von zwei verschiedenen Herstellern(A bzw. B) im Einzelhandel erworben, wobei pro Charge zehn Packungen untersucht wurden. Je fünfPackungen wurden bei 8°C bis zum MHD-Ende gelagert, die anderen fünf Packungen wurden bei30°C für drei Tage angereichert, um das Vorhandensein des mesophilen Sporenbildners B. cereus,nachzuweisen, welcher sich eventuell nach der 8°C-Lagerung nicht nachweisen lässt, da er sich gegenüberder psychrotoleranten Begleitflora nicht durchsetzen kann. Von jeder Probe wurde nach derBebrütung die aerobe Gesamtkeimzahl bestimmt und die Bazillen wurden mittels FTIR- Spektroskopieidentifiziert (Tabelle 3.3- 11). Die Identifizierung als B. cereus wurde zusätzlich mittels der SelektivnährbodenMYP (Mannitol-Eigelb-Polymyxin) Agar und PEMBA (Polymyxin-Pyruvat-Eigelb-Mannit-Bromthymolblau-Agar) bestätigt. Die Keimzahlen der bei 8°C bis zum MHD-Ende gelagerten Milchchargenliegen zwischen 2x10 3 KbE/ml und 9x10 7 KbE/ml. Die letztgenannte Keimzahl überschreitetsomit die Verderbsgrenze von 10 6 KbE/ml. In dieser Milchcharge sind in allen zehn untersuchten Packungengramnegative Bakterien nachweisbar, d.h. in der bei 8°C gelagerten Milch Chryseobacteriumsp. und Psychrobacter glacincola, in den bei 30°C angereicherten Packungen Chryseobacterium sp..Gramnegative Bakterien werden durch Pasteurisation abgetötet und müssen somit durch Rekontaminationnach der Hitzebehandlung in die Milch gelangt sein. In den bei 30°C angereicherten Milchprobensind in jeder Charge sporenbildende Bakterien nachweisbar (v.a. Bacillus pumilus und Brevibacillusagri) in den bei 8°C gelagerten Milchen dominieren jedoch fast ausschließlich die relativ stoffwechselinaktivenpsychrotoleranten Microbacterium spp., welche typische Vertreter nicht rekontaminierter,pasteurisierter Milchen darstellen (Weber, 1996) und aufgrund ihrer geringen Zellgröße durchMikrofiltration vergleichsweise schlechter abgetrennt werden können. Außerdem weisen sie aufgrundihres hohen Mureinanteils in der Zellwand eine relativ große Hitzetoleranz auf und überleben Pasteurisationsbedingungen.In Charge 3 des Herstellers A wurde in allen zehn Milchpackungen B. cereus86

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererdetektiert, d.h. sowohl nach Anreicherung bei 8°C als auch bei 30°C. Während die durchschnittlicheGesamtkeimzahl aller fünf Packungen nach 8°C Lagerung 7x10 5 KbE/ml beträgt, erreicht die B. cereusKeimzahl im Mittel 3x10 5 KbE/ml, d.h. B. cereus konnte sich in diesem Fall auch bei Kühllagerung gegenüberder Begleitflora durchsetzen. Somit kann weder von einer sicheren Abtrennung dieses Sporenbildnersdurch die Mikrofiltration noch von einer Unterdrückung des Wachstums von B. cereusdurch die Begleitflora bei Kühllagerung von MF+PAST-Milch ausgegangen werden. Das Wachstumvon aus Milch isolierten B. cereus - Stämmen bei kühlen Temperaturen von 6-8°C ist bereits in mehrerenPublikationen bestätigt worden (Christiansson et al., 1989; Granum et al., 1993; in`t Veld,2001; Larsen et al., 1999).Tabelle 3.3- 11: Übersicht über sporenbildenden Bakterien in MF+PAST Milch nach Kühllagerung der Milchprobenbei 8°C bzw. nach 3tägiger Anreicherung bei 30°C. Untersucht wurden je 10 Milchpackungen von drei bzw. zweiMilchchargen von zwei Herstellern (A bzw. B).GKZ= Gesamtkeimzahl, KbE= Koloniebildende EinheitenAnreicherung bei 8°C bis MHD-EndeAnreicherung bei 30°C, 3 TageHersteller Charge GKZ (KbE/ml) Sporenbildner GKZ (KbE/ml) Sporenbildner3*10 4 nicht detektiert 2*10 6 Brevibacillus agriBacillus subtilisA1Brevibacillus agri/parabrevisBacillus pumilusBacillus circulans2 2*10 3 nicht detektiert 2*10 9 Bacillus pumilus37*10 5 B. cereus(alle 5 Proben)Paenibacillus sp.(in 1 Probe)5*10 6 B. cereus(alle 5 Proben)8*10 3 nicht detektiert 2*10 8 Bacillus pumilusB 1B 2Bacillus subtilisBacillus sonorensisBrevibacillus agri9*10 7 nicht detektiert 8*10 7 Bacillus flexusBacillus pumilusMikroflora hocherhitzter ESL-MilchDie Floraanalyse hocherhitzter ESL-Milch kann nicht ausgehend von direktem Ausplattieren der Milchprobenauf Agarplatten durchgeführt werden, da nur einige sporenbildende Bakterien die Hocherhitzungsbehandlungüberleben und somit geringe Keimzahlen resultieren (Biewendt et al., 1994b; Mayret al., 2004b). Deshalb wurden Keimzahlbestimmung und Floraanalyse mittels Anreicherungsverfah-87

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererren durchgeführt. Dazu wurde hocherhitzte Milch in kleinere, jeweils gleiche Teilmengen abgefüllt. DieGröße der Teilmengen wurde dabei so gewählt, dass statistisch in jedem Aliquot maximal eine koloniebildendeEinheit an Bakterien enthalten war. Die Aliquots wurden anschließend bei 30°C bzw. 55°Cinkubiert, die Bakterien aus den angereicherten Probenröhrchen isoliert und mittels FTIR-Spektroskopie und ggf. DNA-Sequenzanalyse identifiziert.Industriell produzierte HE-Milch wurde auf diese Weise unmittelbar nach der Behandlung und amMHD-Ende, d.h. nach einer Lagerung von 33 Tagen bei 10°C untersucht. Die Aliquote der Milch amMHD-Ende wurden allerdings nur bei 30°C, nicht bei 55°C angereichert, da sich thermophile Bakterienwährend der Lagerung bei 10°C nicht vermehren.Unmittelbar nachder HE-BehandlungMHD-Ende3%38%20%59%80%29 KbE/Liter 20 KbE/LiterBacillus licheniformis Brevibacillus agri Brevibacillus sp.nov.Abbildung 3.3- 69: Vergleich der mesophilen Florazusammensetzung hocherhitzter ESL-Milch unmittelbar nachder HE-Behandlung und nach einer Lagerung bei 10°C bis zum MHD-Ende.Direkt nach der Hocherhitzungsbehandlung der Milch sowie am MHD-Ende konnten in den bei 30°Cangereicherten Milchaliquoten lediglich die sporenbildenden Bakterienspezies Brevibacillus agri , Bacilluslicheniformis, sowie direkt nach der Hocherhitzung zusätzlich ein Vertreter einer bisher nicht beschriebenenBrevibacillus-Art detektiert werden (Abbildung 3.3- 69). In einer anderen Milchpackungder gleichen Charge wurde direkt nach der Behandlung zusätzlich Bacillus subtilits in geringen Anteilenvon 6% an der Gesamtflora detektiert. Direkt nach der Hocherhitzung dominerte Brev. agri mit59%, am MHD-Ende wurde dagegen v.a. B. licheniformis mit einem Anteil von 80% nachgewiesen.Bacillus licheniformis, Brevibacillus agri und Bacillus subtilis sind typische Vertreter rekontaminationsfreier,hocherhitzter ESL-Milch (Mayr et al., 2004). Ein Vergleich der Keimzahlen direkt nach derBehandlung (29 KbE/Liter) und am MHD-Ende (20 KbE/Liter) zeigt, dass die Lagerung bei 10°C nichtzu einer Vermehrung der Bakterien in der hocherhitzten Milch führte, wie bereits von Mayr et al.(2004a) beobachtet, und somit kein bakteriell verursachter Verderb der hocherhitzten ESL-Milch biszum MHD-Ende eintrat.88

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererIn den unmittelbar nach der HE-Behandlung aliquotierten und bei 55°C inkubierten Probenröhrchenwurde ausschließlich der thermophile Sporenbildner Anoxybacillus flavithermus mit Keimzahlen vonca. 10 KbE/Liter detektiert.Vergleich der mikrobiellen Floren und der Keimzahlen von MF+PAST und HE MilchSowohl MF+PAST- als auch HE-Milchfloren waren direkt nach der Behandlung ausschließlich ausgrampositiven Bakterien zusammengesetzt, bei der HE-Milch jedoch ausschließlich aus sporenbildendenBakterien der Gattungen Bacillus und Brevibacillus, während in der MF+PAST-Milch aufgrund dervergleichsweise geringeren Hitzeeinwirkung v.a. hitzetolerante Nichtsporenbildner aus der Gruppe derHigh GC Grampositiven, d.h. v.a. Microbacterium spp. enthalten waren. Als Konsequenz der stärkerenAbtötungswirkung sind die Keimzahlen der HE Milch nach der Behandlung auch um den Faktor 100 -1000 geringer (29 KbE/Liter in der HE Milch vs. 2- 2x10 1 KbE/ml in der MF+Past Milch). Des Weiterenlässt sich feststellen, dass es bei einer Lagerung der HE- bzw. der MF+PAST-Milch bei 10°C bis zumMHD-Ende (33 bzw. 20/22 Tage), nur in der MF+PAST Milch zu einem Keimzahlanstieg um 4 log Einheitenauf 4x10 4 - 4x10 5 KbE/ml kam, die Keimzahlen der HE-Milch dagegen blieben konstant. Somitkönnen sich mikrobiologische Faktoren nur bei MF+PAST- und nicht bei HE-Milch als haltbarkeitsrelevanterweisen.4 Wirtschaftliche Bedeutung des Forschungsvorhabens für kleine und mittlere Unternehmen(kmU)4.1 Nutzen der ForschungsergebnisseDas bessere Verständnis der (verfahrensspezifischen) herstellungsbedingten und haltbarkeitslimiterendenProduktveränderungen bei ESL-Milch ermöglicht eine gezielte Prozess- und Produktoptimierung.Folgende Kernergebnisse sind für die praktische Applikation von besonderer Bedeutung:• Der (mikrobielle und enzymatische) Status und somit die Haltbarkeit der ESL-Produkte hängt(unabhängig vom Herstellverfahren) von der Rohmilchqualität ab. Die Keimbelastung sowie Zusammensetzungder Rohmilchflora und somit auch deren Belastung mit haltbarkeitsrelevanten(bakteriellen) Enzymen unterliegt dabei (z.B. jahreszeitlichen) Schwankungen. Um generell dieProduktspezifikation erfüllen und/oder -haltbarkeit gewährleisten zu können, ist folglich einestetige Prozesskontrolle durch (systematische) Erfassung der (mikrobiologischen und enzymatischen)Beschaffenheit/Qualität der zur Herstellung von ESL-Milch eingesetzten Rohmilch sowieder daraus gewonnenen Endprodukte erforderlich.Auch sollte bei ESL-Produkten im Hinblick auf deren Qualität und Stabilität eine (längere) Vorstapelungdes unbehandelten Produkts vermieden werden.• Verfahrensabhängig ergeben sich nicht nur (v.a. thermisch induzierte) Unterschiede in den(sensorischen) Produkteigenschaften von „frisch“ hergestellten MF+PAST- und HE-Produkten,sondern auch bezüglich deren Lagerstabilitäten sowie haltbarkeitsbegrenzenden Kriterien undFaktoren.• Hinsichtlich der prozesstechnischen Einflüsse ist zu berücksichtigen, dass sich die MF+PASTzunächst bezüglich der (ungewollten) hitzeinduzierten Produktveränderungen (v.a. Kochgeschmack)im Vergleich zur HE als die schonendere Herstellvariante erweist.• Die HE resultiert jedoch in vergleichsweise geringeren Keimgehalten (aber keiner vollständigenSporeninaktivierung) sowie (Rest-)Aktivitäten der lipolytischen/proteolytischen Enzyme. Lipolyse89

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Schererund Proteolyse sowie deren physiko-chemische Folgereaktionen, die sich beim MF+PAST-Produkt (bei einer Kühltemperatur von 10 °C nach etwa 18-21 Tagen) als haltbarkeitslimitierenderweisen, finden bei HE-Milch im Lagerungsverlauf kaum statt. Die Haltbarkeit des kühlgelagertenHE-Produkts wird (nach etwa 26-30 Tagen Lagerung) durch spezifische, biochemische(z.T. in Zusammenwirken mit thermisch induzierten) Reaktionen bzw. durch die damit einhergehenden,sensorischen Produktveränderungen begrenzt.• Beide ESL-Verfahrenskonzepte bzw. die daraus resultierenden Produkte weisen somit im Hinblickauf die (sensorische) Milchqualität und -lagerstabilität spezifische Vor- und Nachteile auf.• Beim Kombinationsverfahren ermöglicht erst die der MF nachgeschaltete PAST eine schonendeProzessintensivierung bzw. (verlängerte) Haltbarkeiten von mehr als 20 Tagen und gewährleistetzudem die gesundheitliche Unbedenklichkeit des ESL-Produkts, da mittels einer Entkeimungsfiltration(unabhängig von verfahrentechnischen oder produktspezifischen Einflüssen)keine vollständige Abtrennung aller (möglicherweise pathogenen) Mikroorganismen aus der rohen(Mager-)Milch erfolgen kann.Die Effizienz der MF an sich hängt von den Filtrationsbedingungen, dem Ausgangskeimgehaltsowie der Zusammensetzung der Rohmilchflora und den Membrancharakteristika ab. Geradebei längeren Filtrationszyklen ist zudem das Zusammenwirken zwischen Membraneigenschaftenbzw. -widerständen und Transmembrandruck zu berücksichtigen, da nur bei einem Flux von≤500l/m²h langzeitstabile Filtrationen (ohne stärker ausgeprägte Foulingprozesse) erzielt werdenkönnen. Solche Filtratvolumenströme und somit vorhersagbare Filtrationsergebnisse lassensich (über die gesamte Membranlänge hinweg) bei der Entkeimungsfiltration von Milch bislangnur durch den Einsatz von Gradientenmembranen oder des UTP-Prinzips realisieren.• Eine Variation der Erhitzungsbedingungen im HE-ESL-Bereich (125-127 °C/2-4 s) wirkt sichnicht signifikant auf Milcheigenschaften aus und beim Kombinationsverfahren lassen sich erstdurch ϑ/t-Bedingungen oberhalb der herkömmlichen Kurzzeiterhitzung (z.B. mittels nachgeschalteter„klassischer“ HE bei 90 °C/10 s) weitere Haltbarkeitsverlängerungen erzielen, die jedochunvermeidbar zu weiteren thermisch induzierten Veränderungen (Kochgeschmack) führen.• Unabhängig von der Herstellvariante sind bei ESL-Produkten Rekontaminationen (imDownstream-Prozess) sind zu vermeiden. Aufgrund der niedrigen Keimgehalte bzw. der fehlendenKonkurrenzflora können Wachstum und/oder Stoffwechselaktivität der rekontaminierendenMikroorganismen die Produktsicherheit und -haltbarkeit stark limitieren. Eine aseptische Abfüllungder ESL-Milch ist folglich unerlässlich.• Mit Erhöhung der Lagertemperaturen ist beim MF+PAST-Produkt eine gesteigerte mikrobiellesowie enzymatische Aktivität und somit eine verringerte Lagerqualität und -stabilität zu erwarten.Bei HE-Milch besteht mit zunehmender Lagertemperatur (und v.a. ab ϑ≥15 °C) eine erhöhteGefahr der Sporenauskeimung und damit einhergehender Haltbarkeitseinbußen. Bei niedrigenKühltemperaturen lässt sich somit die (Mindest-)Haltbarkeit zuverlässiger definieren. Folglichsind bei ESL-Milch Kühltemperaturen von ϑ≤10 °C zu bevorzugen und eine ununterbrocheneAufrechterhaltung der Kühlkette unerlässlich.• Die Charakteristika der ESL-Produkte lassen sich derzeit (trotz standardisierter Herstellverfahren)nicht unmittelbar definieren und/oder vorhersagen. Die Berücksichtigung des im Rahmendieses Vorhabens eruierten komplexem Zusammenspiels der verfahrenstechnischen mit den90

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/Scherervor- und nachgelagerten Einflussfaktoren ermöglicht es jedoch, die jeweiligen Produkteigenschaftenund -haltbarkeiten der Milch spezifischer abzuleiten.• Unter Berücksichtigung dieser Zusammenhänge weisen die ESL-Milchen deutlich längere Haltbarkeiten(von bis zu 30 Tagen) und somit weitreichende Vorteile gegenüber der herkömmlichpasteurisierten Frischmilch auf, zumal bei den ESL-Verfahrenskonzepten keine bzw. nur geringfügigeEinbußen in der ernährungsphysiologischen (Vitamine) und sensorischen (Kochgeschmack)Produktwertigkeit auftreten.4.2 Beitrag zur Steigerung der Leistung und Wettbewerbsfähigkeit der kmUESL-Produkte werden, wie die Marktanalysen vermuten lassen, auch in Zukunft einen immer wichtigerenWirtschaftsfaktor für Molkereibetriebe darstellen. Die im Rahmen dieses Forschungsprojektes gewonnenErkenntnisse befähigen gerade kmU, die Eigenschaften sowie Haltbarkeiten der produziertenESL-Milchen besser ab- und/oder einzuschätzen und daraus entsprechende (prozesstechnische oderproduktspezifische) Maßnahmen abzuleiten. Die Berücksichtigung der im Vorhaben ermittelten Zusammenhängezwischen den verschiedenen haltbarkeitsbeeinflussenden Faktoren ermöglicht dabeigleichermaßen eine höhere Sicherheit sowie (Verbraucher-)Akzeptanz der Produkte und bringt somitinsbesondere den kmU einen deutlichen Wettbewerbsvorteil.Der (versuchstechnisch und analytisch aufwändige) direkte Vergleich der verschiedenen ESL-Herstelloptionen sowie der daraus resultierenden Produkte ist für kmU zudem kaum realisierbar.Durch dieses Vorhaben kann somit neben der Optimierung bereits bestehender, auch eine Implementierungneuer ESL-Verfahrenskonzepten zukünftig von kmU (unternehmens-)spezifischer gestaltetwerden.Die kmU unter den Maschinen- und Anlagenherstellern können zudem die Anlagen für die verschiedenenESL-Verfahrensvarianten gezielter auslegen und in optimierter Form anbieten oder die bereitsbestehenden Anlagen systematisch verbessern.Basierend auf den Projektergebnissen lassen sich auch innovative (ESL-)Verfahrensansätze und Produktkonzepteeinfacher bewerten und somit entwickeln.5 LiteraturverzeichnisAdams DM, Barach JT, Speck ML (1975). Heatresistent proteases in milk produced by psychrotrophicbacteria of dairy origin. J Dairy Sci,58 (6), 828-834.Andersson I, Öste R (1996) Nutritional quality ofpasteurized milk. Vitamin B12, folate and a-scorbic acid content during storage. Int DairyJ, 4, 161-172.Alichanidis E, Wrathall JHM, Andres AT(1986). Heat stability of plasmin (millkproteinase)and plasminogen. J Dairy Res, 53(2), 259-269.Altmann J, Ripperger S (1997). Beitrag zur Modellierungder Deckschichtbildung bei derQuerstromfiltration. Chem Ing Tech, 69, 468-472.Avalli A, Povolo M, Carminati D, Contarini G(2004). Significance of 2-heptanone in evaluatingthe effect of microfiltration/pasteurisationapplied to goats' milk. IntDairy J, 14, 915-921.Barach JT, Adams DM, Russel HL (1976). Lowtemperature inactivation in milk of heatresistantproteases from psychrotrophic bacteria.J Dairy Sci, 59, 391-396Barbarno D, Ma Y, Santos M (2006). Influenceof raw milk quality on fluid milk shelf life. JDairy Sci, 89 (E.Suppl.), E 15-19.Barrefors P, Granelli K, Appelqvist LA. (1995).Chemical characterization of raw milk sampleswith and without oxidative off-flavor. J DairySci, 78 (12), 2691-2699.Bassette R, Fung D, Mantha VR (1982). Offflavorsin milk. CRC, 24 (1), 1-52.Beeby R (1980). The use of flourescamine at pH6.0 to follow the action of chymosin on kappacaseinand to estimate this protein in milk.N.Z.J. Dairy Sci. Technology, 15, 99.Biewendt HG (1994a). Die Bedeutung von Sterili-sationswertenfür das Ultrahocherhitzen vonMilch. Die Nahrung, 38, 233-252.91

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererBiewendt HG (1994b). Hochpasteurisierte Konsummilch- eine neue Milchsorte? dmz, 115,688-692.Bindith O, Cordier JL, Jost R (1996). Cross-flowmicrofiltration of skim milk: Germ reductionand effect on alkaline phosphatase and serumproteins. In Heat treatments and alternativemethods, (pp.222-231). Brussels: IDFBishop JR, White CH (1985). Estimation of potentialshelf-life of pasteurized fluid milk utilizingbacterial numbers and metabolites. J FoodProtection, 48, 663-667.Blake MR, Weimer BC, McMahon DJ, Savello PA(1995). Sensory and microbial quality of milkprocessed for extended shelf life. J Food Protection,58, 1007-1013.Boekel van M (1996). Statistical aspects of kineticmodeling for food science problems. JFood Sci, 61, 477-489.Boor KJ (2001). Fluid dairy product quality andsafety: Looking to the future. J Dairy Sci, 84(1), 1-11Brans G, Schroen CG, van der Sman RG, BoomRM (2004). Membrane fractionation of milk:state of the art and challenges. J Membr Sci,243, 263-272.Burton H (1984). Reviews of the progress ofdairy science - the bacteriological, chemical,biochemical and physical changes that occur inmilk at tem-peratures of 100-150 °C. J DairyRes, 51, 341-363.Carlin F, Fricker M, Pielaat A, Heisterkamp S,Shaheen R, Salonen S, Svensson B, Ngyen-theC, Ehling-Schulz M (2006). Emetic toxinproductionof Bacillus cereus show distinctcharacteristics within the Bacillus cereus group.Int J Food Microbio, 109, 132-138.Choi IW, Jeon IJ (1993). Patterns of fatty-acidsreleased from milk-fat by residual lipase duringstorage of ultra-high temperature processedmilk. J Dairy Sci, 76, 78-85.Chen L, Daniel RM, Coolbear T (2003). Detectionand impact of protease and lipase activities inmilk and milk powders. Int Dairy J, 13 (4), 255-275.Christiansson, A, Naidu, A S, Nilsson, I, Wadstrom,T, Pettersson, H E (1989).Toxin production by Bacillus cereus dairy iso -lates in milk at low temperatures.Appl. Environ. Microbiol. (55) 2595-2600.Christen GL, Marshall RT (1984). Selected proptertiesof lipase and protease of pseudomonasflourescens produced in four media. J Dairy Sci,67, 1680-1687.Clawin-Rädecker I, Kiesner C, Martin D (2000).Furosine and Ribonucleosides: Indicators forthe heat treatment of milk. Milchwissenschaft,55, 679-682.Collins SJ, Bester BH, Mcgill AEJ (1993). Influenceof psychrotrophic bacterial-growth in rawmilkon the sensory acceptance of UHT skimmilk. J Food Protection, 56, 418-425.Cromie, S. J. (1991). Microbiological aspects ofextended shelf life products. Aust J DairyTech,101-104.Dainty RH (1996). Chemical/biochemical detectionof spoilage. Int J Food Microbiol, 33, 19-33.Damerow H (1989). Die Anwendung der Mikrofiltrationfür Konsummilch, Kesselmilch, Molke.Deutsche Molkereizeitung, 110, 1602-1608.Datta N, Deeth HC (2003). Diagnosing the causeof proteolysis in UHT milk. Lebensm-Wiss-Technol-Food Sci Technol, 36, 173-182.Datta N, Elliott AJ, Perkins ML, Deeth H C(2002). Ultra-high-temperature (UHT) treatmentof milk: comparison of direct and indirectmodes of heating. Austral J Dairy Technol, 57,211-227.Defrise D, Gekas V (1988). Microfiltration membranesand the problem of microbial adhesion -a literature survey. Proc Biochem, 23 (4), 105-116.Degen PJ, Alex T, Dehn JW (1994). Manufacturingmethod for producing sterile milk using dynamicmicrofiltration. Patent US 5356651.Deeth HC (1975). A convenient method for determingthe extent of lipolysis in milk. Austral JDairy Technol, 30, 109-111.Deeth HC (2006). Lipoprotein lipase and lipolysisin milk. Int Dairy J , 16 (6), 555-562.Deeth HC (2006). Lipoprotein lipase and lipolysisin milk. Int Dairy J , 16 (6), 555-562.Dyck B (1999). ESL-Milch - Herstellung undChanchen. DMW, 50, 638-639.Dyck B (2004). Neue Marktchanchen durch ESLtechnologie.dmz, 20, 22-25.Eckner K, Zottola E (1989). Behavioral responseof spoilage and pathogenic microorganisms inoculatedinto reconstituted skim milk concentratedby ultrafiltration. Milchwissenschaft, 44,208-212.Eckner K, Zottola E (1990). Potential for the lowtemperaturepasteurization of dairy fluids usingmembrane processing. J Food Protection, 45,793 -797.Eino MF (1997). Lessons learned in commercializationof microfiltered milk. Bull IDF, 320, 32-36.Elwell M, Barbano D (2006). Use of microfiltrationto improve fluid milk quality. J Dairy Sci,89 (E.Suppl.), E10-E30.Ellman GL (1959). Tissue sulfhydryl groups. ArchBiochem & Biophys, 82 (1), 70-77.Flemming HC, Schaule G, Griebe T, Schmitt J,Tamachkiarowa A (1997). Biofouling - theachilles heel of membrane processes. Desalination,113, 215-225.Fredsted LB, Rysstad G, Eie T (1996). Pure-Lac:The new milk with protected freshness and ex-92

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-Milchtended shelf life. In Heat treatment and alternativemethods, (pp.104-125). Brussels: IDF.Frommand, H. I., and K. J. Boor. (2004). Characterizationof pasteurized fluid milk shelf-lifeattributes. J. Food Sci. (69) 207–214.Fink R (1984). Über lagerungsbedingte Veränderungenvon UHT-Vollmilch und deren reaktionskinetischeBeschreibung. Diss. TU München.Fox, PF (1981). Proteinases in dairy technology.Neth Milk Dairy J, 35, 233-253.Gallmann P, Eberhard P, Sieber R (2001). VorundNachteil der ESL (Extended Shelf Life)Milch. Agrarforschung, 8, 112-117.Garcia-Risco MR, Ramos M, Lopez-Fandino R(1999). Proteolysis, protein distribution andstability of UHT-milk during storage at roomtemperature. J Sci Food Agric, 79, 1171-1178.Glaeser H (1996). Alternative methods: Legaland control aspects. In Heat treatments and alternativemethods, (pp.438-447). Brussels:IDF.Goodno CC (1981). A flourometric assay foravailable lysine in proteins. Analy Biochem,115, 203-211.Granum, P. E., Brynestad, S.; J. M. Kramer, J.M.(1993): Analysis of enterotoxin production byBacillus cereus from dairy products, food poisoning incidents and nongastrointestinal infections. Int. J. Food Microbiol. 17, 269-279.Gruetzmacher TJ, Bradley RL (1999). Identificationand control of processing variables that affectthe quality and safety of fluid milk. J FoodProtection, 62, 625-631.Guerra A, Jonsson G, Rasmussen A, Nielsen,EW, Edelsten D (1997). Low cross-flow velocitymicrofiltration of skim milk for removal of bacterialspores. Int Dairy J, 7, 849-861.Harwalker VR (1972). Isolation and partial characterisationof an adstringent fraction from milkand nonfat dry milk. J Dairy Sci, 55, 1400-1404.Hasting A (1985). High-temperature treatmentof liquids. Patent US 4534986.Henyon DK (1999). Extended shelf-life milks inNorth America: a perspective. Int J Dairy Technol,52, 95-101.Herrero C, Pradanos JI, Calvo F, Tejerina F,Hernandez A (1997). Flux decline in proteinmicrofiltration: influence of operative parameters.JColl Sci, 187, 344-351.Hoffman W, Buchheim W (2000). Haltbarkeitvon hocherhitzter pasteurisierter Konsummilch.DMW, 51, 1036-1038.Hoffmann W, Klobes H, Kiesner C, Suhren G,Krusch U, Clawin-Rädecker I, Larsen PH(1996). Use of micro-filtration for the productionof pasteurized milk with extended shelflife. In Advances in membrane technology forbetter dairy products, (pp.45-47). Brussels:IDF.Kulozik u. Kaufmann/SchererHoffmann W, Kiesner C, Clawin-Rädecker I, MartinD, Einhoff K, Lorenzen PC, Meisel H, HammerP, Suhren G, Teufel P (2006). Processingof extended shelf life milk using microfiltration.Int J Dairy Technol, 59 (4), 229-235.Horak FP (1980). Über die Reaktionskinetik derSporenabtötung und chemischer Veränderungenbei der thermischen Haltbarmachung vonMilch zur Optimierung von Erhitzungsverfahren.Diss TU München.Hosono A, Elliot JA (1974). Properties of crudeethyl esters forming enzyme preparations fromsome lactic acid and psychrotrophic bacteria. JDairy Sci, 57, 1432-1450.Huck JR, Sonnen M, Boor KJ (2008). TrackingHeat-Resistant, Cold-Thriving Fluid Milk SpoilageBacteria from Farm to Packaged Product.J DairySci, 91, 1218-1228.Hülsen U (2000). Method for producing highlypasteurized milk and/or milk products havingthe propterties of fresh milk and a prolongedshelf-life. Patent WO 00/2137883.Hülsen U, Rademacher B (2005a). Länger haltbareTrinkmilch - Teil 1. dmz, 19, 22-26.Hülsen U, Rademacher B (2005b). Länger haltbareTrinkmilch - Teil 2. dmz, 20, 24-27.Humbert G (1997). Method for the measurementof lipase activity in milk. J Dairy Research, 64,465-469.in't Veld, P. H., Ritmeester, W. S., Delfgou-vanAsch, E. H. M., Dufrenne, J. B., Wernars, K.,Smit, E. & van Leusden, F. M. (2001). Detectionof genes encoding for enterotoxins anddetermination of the production of enterotoxinsby HBL blood plates and immunoassays ofpsychrotrophic strains of Bacillus cereus isolatedfrom pasteurised milk. Int J Food Microbiol 64, 63-70.Janzen JJ, Bishop JR, Bodine AB, Caldwell CA(1982). Shelf life of pasteurized fluid milk as affectedby age of raw milk. J Dairy Sci, 65,2233-2236.Jensen JA (1997). A plant for continuously sterilisingfluids, such as milk and cream. Patent EP0792 104.Jeon IJ, Thomas EL, Reineccius GA (1978). Productionof volatile flavor compounds in ultrahigh temperature processed milk during asepticstorage. J Agri Food Chem, 26, 1183-1189.Juffs HS (1975). Proteolysis detection in milk - 3.Relationship between bacterial population, thyrosinevalue and organoleptic quality during extendedcold storage of milk and cream. J DairyRes, 42 (1), 31-41.Kang ST, Subramani A, Hoek EMV, DeshussesMA, Matsumoto MR (2004). Direct observationof biofouling in cross-flow microfiltration:mechanisms of deposition and release. JMembr Sci, 244, 151-165.93

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKelly PM, Tuohy JJ (1997). The effectiveness ofmicrofiltration for the removal of microorganisms.Bull IDF, 320, 26-31.Kersten M (2000). Proteinfraktionierung mittelsMembrantrennverfahren. Diss TU München.Kessler HG (2002). Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik- Molkereitechnologie. 4. München:Kessler.Kiesner G, Hoffmann W, Lorenzen P, Clawin-Rädecker I, Martin D, Meisel H, Einhoff K,Hammer P, Teufel P, Suren G (2005). Anwendungvon Mikrofiltration bei der Herstellung vonKonsummilch mit verlängerter Haltbarkeit. KielerMilchwirtsch Forsch Ber, 57, 139-190.King RL (1962). Oxidation of milk fat globulemembrane material. I. Thiobarbituric acid reactionas a measure of oxidized flavor in milk andmodel systems. J Dairy Sci, 45, 1165-1171.Kirschenmann B (2006). Drei Wochen Haltbarkeit- voller Trinkmilchgeschmack. dmw, 4,143-144.Kocak HR, Zadow, JG (1985). Age gelation ofUHT whole milk as influenced by storage temperature.Austral J Dairy Technol, 46, 14-21.Kosikowski FV, Mistry VV (1990). Microfiltration,ultrafiltration and centrifugation separation andsterilization processes for improving milk andcheese quality. J Dairy Sci, 73, 1411-1419.Krabsen E, Ottosen N, Knarrenborg L (1997).Plant and method of treating milk. Patent US5683733.Kühlmeyer M (2001). Statistische Auswertungsmethodenfür Ingenieure. 1. Berlin: VDIKurzweil R, Busse M (1973). Keimgehalt und Florazusammensetzungder frisch ermolkenerMilch. Milchwissenschaft, 28, 427 – 431.Larsen, H. D. & Jørgensen, K. (1999). Growth ofBacillus cereus in pasteurized milk products.Int J Food Microbiol 46, 173-176.Larsen PH (1996). Microfiltration for pasteurizedmilk. In Heat treatments and alternative methods,(pp. 232-239). Brussels: IDF.Larsen PH (1995). Method for producing consumermilk with good keeping quality. PatentWO 96/ 36238.Larsen PH (1992). Mikrofiltration zur Entfernungvon Bakterien und Sporen. DMW, 43, 46-50.Lavanchy P, Eberhard P, Bühler U (1995). Lesconsommateurs percoivent-ils les différencesdes traitement thermique du lait? Schweiz MilchwForschung, 24, 35-37.Leahy TJ, Gabler R (1984). Sterile filtration ofgases by membrane filters. Biotechnol Bioeng,26, 836-843.Lechner S, Mayr R, Francis K, Prüß B, Kaplan T,Wießner-Gunkel E, Stewart G, Scherer S(1998). Bacillus weihenstephanensi sp. nov. isa new psychrotolerant species of the Bacilluscereus group. Int J Syst Bact, 48, 1373-1382.Kulozik u. Kaufmann/SchererLebleu N, Roques C, Aimar R, Causserand C(2009). Role of the cell-wall structure in the retentionof bacteria by microfiltration membranes.J Mem Sci, 326 (1), 178-185.Lemieux L, Simard RE (1994). Astringency, atextural defect in dairy products. Lait, 74, 217-240.Lindquist A (1998). A method for the productionof sterile skimmed milk. Patent WO 98/57549.Lopezfandino R, Olano A, Corzo N, Ramos M(1993). Proteolysis during storage of UHT milk- differences be tween whole and skim milk. JDairy Res, 60, 339-347.Madec MN, Mejean S, Maubois JL (1992). Retentionof listeria and salmonella cells contaminatingskim milk by tangential membrane microfiltration(bactocatch process). Lait, 72, 327-332.Malmberg M, Holm S (1988). Low bacteria skimmilk by microfiltration. North Europ Food DairyJ, 54, 30-32.Maubois JL (2002). Membrane microfiltration: atool for a new approach in dairy technology.Austral J Dairy Technol, 57, 92-96.Maubois JL (1991). New applications of membranetechnology in the dairy-industry. AustralJ Dairy Technol, 46, 91-95.Matsumoto K, Nakamuro K (2006). Protein adsorptionproperties on a microfiltration membrane:A comparison between static and dynamicadsorption methods. J Mem Sci, 258 (1-2), 126-136.Mayr R, Gutser K, Busse M, Seiler H (2004a).Indigenous aerobic sporeformers in high heattreated (127 °C, 5 s) German ESL (extendedshelf life) milk. Milchwissenschaft, 59, 143-145.Mayr R, Gutser K, Busse M, Seiler H (2004b).Gram po-sitive non-sporeforming recontaminantsare frequent spoilage organisms of Germanretail ESL (Extended Shelf Life) milk.Milchwissenschaft, 59, 262-266.McMeekin TA, Ross T (1996). Shelf life prediction:status and future possibilities. Int J FoodMicrobiol, 33, 65-83.Mestdagh F, Meulenaer de B, Clippeleer de J,Devlieghere F, Hugyhebaert A (2005). Protectiveinfluence of several packaging materials onlight oxidation of milk. J Dairy Sci, 88, 499-510.Mittelman M (1998). Structure and functionalcharacteristics of bacterial biofilms in fluidprocessing operations. J Dairy Sci, 81, 2760-2764.Mourouzidis-Mourouzis SA, Karabelas AJ (2008).Whey protein fouling of large pore-size ceramicmicrofiltration membranes at small cross-flowvelocity. J Mem Sci, 323, 17-27.Nakamuro K, Matsumoto K, (2006). Properties ofprotein adsorption onto pore surface during microfiltration:Effects of solution environmentand membrane hydrophobicity. J Mem Sci, 280(1-2), 363-374.94

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-MilchKulozik u. Kaufmann/SchererNissen H., Holo H., Axelsson L., Blom H. (2001).Characterization and growth of Bacillus spp. inheat-treated cream with and without nisin. JAppl Microbiol, 90, 530-534.Oamen, E, Hansen AP, Swartzel KR (1989). Effectof ultra-high temperature steam injectionprocessing and aseptic storage on labile watersolubelvitamins in milk. J Dairy Sci, 72, 614-619.Olesen N, Jensen F (1989). Microfiltration - theinfluence of operation parameters on the process.Milchwissenschaft, 44, 476-479.Owusu RK, Makhzoum A, Knapp J (1991). Thethermodynamic stability of lipases and proteasesfrom psychrotrophic bacteria. Food Chem,39, 187-195.Oss v C (1989). Energetics of cell-cell and cellbiopolymerinteractions. Cell Biophys, 14, 1-16.Pafylias I, Cheryan M, Mehaia MA, Saglam N(1996). Microfiltration of milk with ceramicmembranes. Food Res Int, 29, 141-146.Pedersen PJ (1992). Microfiltration for the reductionof bacteria in milk and brine. New Applicationof Membrane Processes, Bull IDF9201, 33-50.Pedersen PJ, Poulsen O, Knarreborg L, KjaerulffGB, Castberg HB (1993). A method of heattreatingliquid milk products. Patent WO93/08697.Priest FG (1977). Extracellular enzyme-synthesisin genus bacillus. Bact Rev, 41 (3), 711-753.Puhan Z (2000). Dairy technology on the term ofthe millenium. Zootehnika, 76, 31-40.Rajmohan S, Dodd CER, Waites WM (2002). Enzymesfrom isolates of pseudomonas fluorescensinvolved in food spoilage. J Appl Microbiol,93, 205-213.Rankin SA (2003). Super-Pasteurized Milk. InEncyclopedia of Dairy Sciences, pp.1633-1637.Academic Press.Rea MC, Cogan TM, et al. (1992). Incidence ofpathogenic bacteria in raw milk in Ireland. JAppl Bacteriol, 73, 331-336.Richardson GH, Newstead DF (1979). Effect ofheat stable proteases on storage life of UHTmilk. New Zeal J Dairy Sci Technol, 14, 273.Ripperger S, Altmann J (2002). Crossflow microfiltration- state of the art. Separation and PurificationTechnol, 26, 19-31.Ruiz P, Ocio M.J., Cardonna F., Ferndández A.,Rodrigo M., Martìnez A. (2002). Nature of theinactivation curves of Bacillus pumilus sporesheated using non-isothermal and isothermaltreatments. J Food Sci, 67, 776-779.Saboya LV, Maubois JL (2000). Current developmentsof microfiltration technology in thedairy industry. Lait, 80, 541-553.Schlimme E, Clawin-Rädecker I, Einhoff K, KiesnerC, Lorenzen P, Martin D, Meisel H, MolkentinJ, Precht D (1996). Untersuchung der Unterscheidungsmerkmalezur Bewertung derWärmebehandlung von Milch. Kieler MilchwirtschForsch Ber, 48, 5-36.Schlimme E, Buchheim W, Heeschen W (2002).Beurteilung verschiedener Erhitzungsverfahrenund Hitzeindikatoren für Konsummilch. dmz,115, 64-69.Schmidt D, Cromie SJ, Dommett TW (1989). Effectof pasteurization and storage-conditions onthe shelf-life and sensory quality of asepticallypackaged milk. Austral J Dairy Technol, 44, 19-24.Schmidt R, Renner E (1978). Sensoric andchemical changes during storage of sterilizedmilk kinds:2. Che-ical changes. Lebensm-WissTechnol, 11, 244-248.Shipe W, Senyk GF, Ledford RA, Bandler DK,Wolf ET (1980). Flavor and chemical evaluationof fresh and aged market milk, J Dairy Sci, 63(43).Simon M, Hansen A (2001). Effect of variouspackaging materials on the shelf life and flavorof ultrapasteurized milk. J Dairy Sci, 84, 784-791.Sorhaug T, Stepaniak L (1997). Psychrotrophsand their enzymes in milk and dairy products:quality aspects. Trends in Food Sci Technol, 8,35-41.Stepaniak L (2004). Dairy Enzymology. Int JDairy Technol, 57, 153-171.Stevenson, R.G.; Rowe, M.T.; Wisdom G.B.;Kilpatrick, D. (2002). Growth kinetics and hydrolyticenzyme production of Pseudomonasspp. isolated from pasteurized milk. J DairyRes, 70, 293-296.Suchecka T, Piatkiewicz W, Sosnowski (2005). Isthe cell retention by MF membrane absolutelysafe - a hypothetical model for cell deformationin a membrane pore, J Mem Sci, 250, 135-140.Ternström, A.; Lindberg, A.-M.; Molin, G. (1993)Classification of the spoilage flora of raw andpasteurized bovine milk, with special referenceto Pseudomonas and Bacillus. J Appl Bacteriol,75, 25-34.Thomas EL, Burton H, Ford JE, Perkin AG(1975). The effect of oxygen on flavour andchemical changes during aseptic storage ofwhole milk after ultra-high-temperature processing.J Dairy Res, 42, 285-297.Tolkach A, Kulozik U (2005). Fractionation ofwhey proteins and caseinomacropeptide bymeans of enzymatic crosslinking and membraneseparation techniques. J Food Eng, 67,13-20.Töpel A (2004). Chemie und Physik der Milch.Hamburg: Behr's.Trouve E, Maubois JL, Piot M, Madec MN, FauquantJ, Rouault A, Tabard J, Brinkman G(1991). Retention of various microbial species95

AIF/FEI SCHLUSSBERICHT ESL-Milchduring milk epuration by cross-flow MF. Lait,71, 1-13.Vasseneix A (1987). Apparatuses for the hightemperature thermal treatment of liquid foods,such as milk, in order to provide them with along preservation span. Patent EP 02/10887.Vassila E, Badeka A, Kondyli E, Savvaidis I, KontominasM (2002). Chemical and microbiologicalchanges in fluid milk as affected by packagingconditions. Int Dairy J, 12, 715-722.Wallhäuser KH (1988). Praxis der Sterilisation,Desinfektion, Konservierung. 4. Stuttgart: Thieme.Kulozik u. Kaufmann/SchererWeber H (1996). Mikrobiologie der Lebenmittel -Milch und Milchprodukte. 2. Hamburg: Behr`s.Weber H (2006). Mikrobiologie der Lebenmittel -Milch und Milchprodukte. 2. Hamburg: Behr`s.White CH (1993). Rapid methods for estimationand prediction of shelf-life of milk and dairyproducts.J Dairy Sci, 76, 3126-3132.Wilbey RA (1997). Estimating shelf-life. Int JDairy Technol, 50, 64-67.Wiles R, Prentice G, Brown J (1984). Storage offresh liquid milk products. Patent EP 00/43276.96