Überlebensfähigkeit von kryokonservierten ... - Dragon IVF

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a) b) Abb. 16:a) Schlüpfende Blastocyste, b) Geschlüpfte Blastocyste 3.11.2 Kombinierte FDA-Hoechst-Färbung zur Zytoplasmaaktivi- tätsbestimmung und Kernzählung Die FDA-Färbung (3,6-Diacetoxyfluoran, SIGMA-ALDRICH, Steinheim) ist eine Möglichkeit, tote von lebenden Embryonen zu unterscheiden. Lebende Embry- onen leuchten in einem sehr hellen Grün (Abb. 16a), während tote Embryonen keine oder nur noch kaum sichtbare Signale aussenden (Abb. 16b) (SCHIL- LING & DÖPKE, 1978; SCHILLING et al., 1979; SCHILLING & SMIDT, 1979). Die zu färbenden Embryonen wurden zunächst dreimal in 37°C warmen Medi- Cult Universal IVF Medium gewaschen und dann in FDA-haltiges MediCult Uni- versal IVF Medium gegeben. Für die FDA-Lösung wurde zunächst eine FDA- Stammlösung von 5mg FDA/ml Aceton (Merck, Darmstadt) angesetzt. Diese wurde auf eine Verdünnung von 2µl/2ml MediCult Universal IVF Medium ge- bracht (DIDION et al., 1990). Von der Verdünnung wurden anschließend 10µl abgenommen und in einen Mediumdrops von 50µl eingeben. Die Embryonen wurden darin für jeweils 1,5 Minuten auf der 37°C warmen Werkbank inkubiert. Daran anschließend erfolgte eine erneute dreimalige Waschung in MediCult U- niversal IVF Medium. Im nächsten Schritt wurden die Embryonen zur Anfärbung der mitotisch aktiven Kerne in eine Hoechst-Farbstoff H 33342 (Sigma-Aldrich, Steinheim) enthalten- de Lösung umgesetzt. Aktive Kerne strahlen daraus folgend in leuchtendem Hellblau. Inaktive tote Kerne zeigen keine Antwort mehr (Abb. 17) (VIUFF et al., 1991). Auch hier wurde zunächst eine Stammlösung in der Dosierung von 1mg Hoechst H 33342/ml Aqua dest. (PURSEL et al., 1985) angesetzt. Diese wurde 60
dann auf 10µl/50µl MediCult Universal IVF Medium verdünnt. Zum Inkubieren blieben die Embryonen im Hoechst-Farbstoff zwei Minuten auf der 37°C warmen Werkbank. An diesen Schritt schloss sich wiederum ein dreimaliges Wa- schen in MediCult Universal IVF Medium an. Zur nachfolgenden mikroskopischen Beurteilung wurden die Embryonen auf einen Objektträger, auf den vorher zwei Vaseline-Streifen (Weißes Vaselin Lich- tenstein DAB, Lichtenstein, Mülheim-Kärlich) aufgebracht waren, mittig positio- niert und mittels eines Deckgläschens fixiert. Dabei war darauf zu achten, dass die Embryonen nur leicht angequetsch wurden. Die FDA-Beurteilung wurde bei 100-facher (für Photographien) bzw. 400-facher Vergrößerung mit einem Axioskop (Axioskop, Zeiss, Göttingen), Filtersatz 09 (Zeiss, Göttingen), einer Anregung von 450-490nm (BP Erregerfilter) und einer Emission von 520nm (Interferenzfilter FT 510, Sperrfilter LP 520) vorgenom- men. Die Klassifizierung durch Hoechst-Färbung erfolgte ebenfalls bei 100-facher bzw. 400-facher Vergrößerung auf dem Axioskop (Axioskop, Zeiss, Göttingen) unter Verwendung des Filtersatzes 02 (Zeiss, Göttingen), der Anregung von 365nm (Erregerfilter G 365) und einer Emission von 420nm (Interferenzfilter FT 395, Sperrfilter LP 420). a) b) Abb. 17: Aktives (a) bzw. inaktives (b) Zytoplasma - Feststellung mittels FDA Abb. 18: Lebende und tote Kerne - Sichtbarmachung mittels Hoechst H 33342 61
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Aus dem Institut für Tierzucht und
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Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzei
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Verwendete Geräte und Verbrauchsma
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1 Einleitung Die Kryokonservierung
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2 Literatur 2.1 Grundlagen der Kryo
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men Abkühlung hingegen kann die W
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kann die Wasserstruktur dahingehend
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