PDF 2 MB - Consilium Medicum

20
норов, взятой натощак в присутствии 1 мг/мл ЭДТА
в качестве антикоагулянта и антиоксиданта. Плазму
дважды центрифугировали в градиенте плотности
NaBr в течение 2 ч при 41 000 об/мин в угловом роторе
50Ti при 4°С в рефрижераторной ультрацентрифуге
Beckman L-8 (США) [47], а затем проводили
диализ против 2000 объемов изотонического фосфатного
буфера – ИФБ (80 г/л NaCl, 2 г/л KH 2 PO 4 ,
9 г/л Na 2 HPO 4 , 2 г/л KCl) pH 7,4 в течение 18 ч при 4°С.
Содержание белка в ЛПНП определяли по методу
Лоури, содержание апоВ – при помощи тест-наборов
фирмы Mabtech (Швеция).
Экспериментальную анемию с сопутствующим
ретикулоцитозом у кроликов вызывали путем подкожного
введения гемолитика фенилгидразина
(6,25 мг/кг) ежедневно в течение 4 сут. С-15 липоксигеназу
из лизата обогащенной ретикулоцитами
клеточной массы крови выделяли высаливанием
55% (NH 4 ) 2 SO 4 , как описано ранее [40], а затем подвергали
последовательной очистке до гомогенного
состояния (по данным электрофореза в полиакриламидном
геле), используя ионообменную хроматографию
на ДЭАЭ-сефадексе А50 в линейном градиенте
NaCl и препаративное изоэлектрофокусирование
в диапазоне рН 5–7 [40]. Очистка грубого
препарата С-15 липоксигеназы ретикулоцитов кролика
до гомогенного состояния была проведена в
Институте биохимии медицинского факультета
Университета А.Гумбольдта (Берлин, Германия).
Для приготовления модифицированных МДА
ЛПНП свежевыделенные ЛПНП обрабатывали
приготовленным ex tempore МДА, который получали
из 1,1,3,3-тетраэтоксипропана путем кислотного
гидролиза [48]. ЛПНП (100 мкг апоВ) инкубировали
с 1 мкмоль МДА в темноте при 37°С и pH
6,5 в течение 3 ч [49]. От избытка МДА после модификации
ЛПНП избавлялись при помощи диализа
против 2000 объемов ИФБ pH 7,4 в течение 18 ч
при 4°С.
В связи с самоинактивацией С-15 липоксигеназы
[45] ферментативное окисление ЛПНП инициировали
при 37°С трехкратным внесением порций (по
1 ед/мл) гомогенного препарата С-15 липоксигеназы
ретикулоцитов кролика в среду, содержащую
0,5 мг/мл белка ЛПНП, 0,154 М NaCl и 20 мМ трис-
НCl рН 7,4. Накопление первичных продуктов окисления
– липогидропероксидов определяли по увеличению
оптической плотности конъюгированных
диенов при 233 нм [16] (ε 233 =2,5×10 4 ×М -1 ×см -1 ),
накопление вторичных продуктов – по образованию
веществ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой
кислотой по поглощению при 532 нм [50] в пересчете
на МДА (ε 532 =1,56×10 5 ×М -1 ×см -1 ) на спектрофотометре
Hitachi 220A (Япония).
Для получения культуры макрофагов (мононуклеаров)
человека производили взятие крови доноров
в стерильных условиях и выделяли моноцитарно-лимфоцитарную
фракцию в градиенте фиколла-хипака
[33]. Подсчет полученного количества
клеток производили в счетной камере (Hemacytometer).
Клетки сажали в пластиковую стерильную
24-гнездную плашку для тканевых культур
(Nuclon, Дания) по 5×10 5 клеток в лунку и культивировали
в СО 2 -инкубаторе (95% воздуха/5% СО 2 )
при 37°С в течение 14 сут со сменой инкубационной
среды через каждые 48 ч. Затем культуральную
среду заменяли на свежую среду 199, содержащую
10% липопротеид-дефицитной сыворотки крови
здоровых доноров, полученную ультрацентрифу-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рис. 1. Содержание первичных – липогидропероксиды (темные
столбики) и вторичных – МДА (светлые столбики) продуктов
свободнорадикального окисления в неокисленных
ЛПНП (1), в ЛПНП, окисленных С-15 липоксигеназой ретикулоцитов
кролика (2), в тех же ЛПНП после 3-часовой аэроб -
ной инкубации (3) и в ЛПНП, модифицированных МДА (4).
гированием (d>1,215 г/мл) [51], а также по 100
ед/мл пенициллина и стрептомицина, 2,5 мкг/мл
фунгизона и 2 мМ L-глутамина, после чего вносили
исследуемые ЛПНП. Через 7 ч инкубирования в
СО 2 -инкубаторе при 37°С удаляли среду инкубации
с ЛПНП, а затем липиды из прикрепленных к
субстрату макрофагов трижды экстрагировали
смесью гексан-изопропанол (3:2, по объему) [52].
Экстракт выпаривали в вакууме и определяли содержание
общего ХС с помощью тест-наборов
Boehringer-Mannheim GmbH (Германия) на химическом
анализаторе Multiscan MCC Labsystems Oy
(Финляндия) при 492 нм. Все используемые реагенты
были получены от фирмы Sigma (США).
Результаты и их обсуждение
По данным анализа, исходный препарат ЛПНП
(неокисленные ЛПНП после диализа в тех же
условиях, что и модифицированные МДА ЛПНП)
содержал 0,2 нмоль липогидропероксидов
(LOOH) и 0,1 нмоль МДА на 1 мг белка (молярное
отношение LOOH/МДА=2). После окисления
ЛПНП С-15 липоксигеназой ретикулоцитов (как
описано в методической части статьи) содержание
липогидропероксидов в препарате возросло
до 48,1 нмоль/мг белка, а содержание МДА составило
0,6 нмоль/мг белка (молярное отношение
LOOH/МДА=80). «Старение» окисленных липо -
ксигеназой ЛПНП (инкубация в 0,154 М NaCl и
20 мМ трис-НCl рН 7,4 в течение 3 ч) приводило к
небольшому снижению содержания липогидропероксидов
(47,2 нмоль/мг белка), тогда как уровень
МДА в среде инкубации увеличивался более
чем в 15 раз (9,4 нмоль МДА/мг белка, молярное
отношение LOOH/МДА=5). Содержание липогидропероксидов
в препарате МДА-модифицированных
ЛПНП после диализа практически не отличалось
от их содержания в препарате неокисленных
ЛПНП (0,3 нмоль/мг белка), тогда как содержание
МДА возросло до 100,3 нмоль/мг белка (молярное
отношение МДА/LOOH =1/334) (рис. 1).
Таким образом, были получены следующие препараты
ЛПНП: неокисленные ЛПНП (ЛПНП без какой-либо
химической или ферментативной обработки)
с низким уровнем первичных и вторичных
КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК | ТОМ VII (XIX) | № 1 | 2012 www.cardioweb.ru