Riuc.bc.uc.edu.ve - Universidad de Carabobo

UNIVERSIDAD DE CARABOBO
AREA DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
FACULTAD DE INGENIERÍA
MAESTRÍA EN INGENIERÍA DE PROCESOS
“ESTUDIO COMPARATIVO DEL PROCESO DE OBTENCIÓN
DE UN ADITIVO ENZIMÁTICO MEDIANTE FERMENTACIONES
MICROBIANAS SÓLIDA Y SUMERGIDA DE AFRECHILLO DE
TRIGO”
VALENCIA, Febrero del 2011
Autora: Ing. Lenis Matute
Tutora: Ing. Annalisse Bertsch, MSc

UNIVERSIDAD DE CARABOBO
AREA DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
FACULTAD DE INGENIERÍA
MAESTRÍA EN INGENIERÍA DE PROCESOS
“ESTUDIO COMPARATIVO DEL PROCESO DE OBTENCIÓN
DE UN ADITIVO ENZIMÁTICO MEDIANTE FERMENTACIONES
MICROBIANAS SÓLIDA Y SUMERGIDA DE AFRECHILLO DE
TRIGO”
Autora: Ing. Lenis Matute
Trabajo presentado ante el Área de Estudios de
Postgrado de Universidad de Carabobo para
optar al Título de Magister en Ingeniería de
Procesos.
VALENCIA, Febrero del 2011

UNIVERSIDAD DE CARABOBO
AREA DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
FACULTAD DE INGENIERÍA
MAESTRÍA EN INGENIERÍA DE PROCESOS
VEREDICTO
Nosotros, Miembros del Jurado designado para la evaluación y aprobación del
trabajo titulado: “ESTUDIO COMPARATIVO DEL PROCESO DE OBTENCIÓN DE
UN ADITIVO ENZIMÁTICO MEDIANTE FERMENTACIONES MICROBIANAS
SÓLIDA Y SUMERGIDA DE AFRECHILLO DE TRIGO”, presentado por la Ing.
Lenis Del Carmen Matute Almeida para optar al Título de MAGISTER EN
INGENIERÍA DE PROCESOS consideramos que reúne los requisitos necesarios
para ser calificado como Aprobado.
Nombres y Apellidos, Firma y Fecha
VALENCIA, Febrero del 2011

“Nuestro miedo más profundo no es que seamos inadecuados.
Nuestro miedo más profundo es que somos poderosos más allá de cualquier
medida. Es nuestra luz, no nuestro lado oscuro lo que más nos da miedo.
Nos preguntamos a nosotros
mismos: ¿quién soy yo para ser
brillante, bello, con talento y fabuloso?
En realidad, ¿Quién eres tú para no
serlo?
Eres un hijo de Dios. El hecho de que
juegues a ser insignificante no le sirve de
nada al mundo. No hay nada de iluminado
en encogerse para que la gente a tu alrededor
no se sienta insegura.
Se supone que todos tenemos que brillar, tal
como lo hacen los niños. Hemos nacido para
manifestar la gloria del Dios que tenemos
dentro.
Y no, esto no está sólo en algunos de
nosotros: está en todos.
Y así cuando dejamos a nuestra luz brillar, inconscientemente estamos
dando permiso a otros para hacer lo mismo. Y así cuando nos liberamos de nuestro
miedo, nuestra presencia automáticamente libera a otros.”
Our Deepest Fear por Marianne Williamson en
A Return To Love:
Reflections on the Principles of A Course in Miracles
citado por Nelson Mandela en su discurso inaugural como
presidente electo de Sudáfrica (1994).

A Julia Mercedes y a Francisco, a quienes
siempre llevo en mi corazón.
A mis padres, Ysabel y Pablo, mis
mayores motivo de orgullo.

AGRADECIMIENTOS
Este trabajo no es el fruto del esfuerzo aislado de una sola persona, es el
resultado de muchos aportes, grandes o pequeños, deliberados o inconscientes,
pero todos extremadamente importantes. Muchas gracias a:
Annalisse Bertsch, por su colaboración, enseñanzas, guía, paciencia y sobre todo
por haberme honrado con su amistad.
Hazel Román, amiga de fácil sonrisa y siempre dispuesta a colaborar.
Antonio Bertsch, por sus consejos, enseñanzas y la confianza que depositó en mí.
Mi primer tutor.
Isabel Díaz, por su aporte en el diseño estadístico de esta investigación.
Claudio Mazzani y Odalis Luzón, responsables en el análisis de la OTA.
Shimazú Martínez Richards, quizás sin saberlo, sus palabras me dieron el impulso
necesario para comenzar este camino.
Lucía Graziani de Fariñas y Nereida Coello, por las oportunidades de aprendizaje
y crecimiento que me han brindado.
Andreína Álvarez, Gabriela Domínguez y Joel Alarcón, por su constante auxilio.
Julio Matute y Celina Yol de Matute, por su total apoyo e infinito amor y
paciencia.
Liseth, Alam, Isabel y Pablo, por soportarme todo este tiempo y amarme tanto.
Dios, por darme las fuerzas, las ganas, la oportunidad y el ingenio para alcanzar
esta meta.
Lenis Matute

INDICE
Pág
Indice de Tablas xii
Indice de Figuras xv
RESUMEN 21
ABSTRACT 22
CAPÍTULO I 23
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 23
1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 26
1.3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN 28
1.3.1. Objetivo general 28
1.3.2. Objetivos específicos 28
1.4. JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA 29
CAPÍTULO II 34
MARCO TEÓRICO 34
2.1. ANTECEDENTES 34
2.1.1. Aditivo enzimático 34
2.1.2. El proceso fermentativo 44
2.1.3. Afrechillo de trigo 52
2.1.4. Fermentación sumergida (FS) y en estado sólido (FES) 55
Diferencias entre la fermentación sumergida (FS) y la
fermentación en estado sólido (FES)
Ventajas de la fermentación en estado sólido (FES) 58
Desventajas de la fermentación en estado sólido (FES) 59
2.1.5. Microorganismos usados en las fermentaciones 60
2.1.6. Aspergillus niger 61
2.1.7. Usos del Aspergillus niger en la agroindustria. 64
CAPÍTULO III 69
MARCO METODOLÓGICO 69
56

Pág
3.1. Tipo de estudio y de investigación. 69
3.2. Diseño de la Investigación 70
3.2.1. Descripción de la Metodología de Trabajo 70
3.2.1.1. Caracterización fisicoquímica del afrechillo de trigo 71
3.2.1.2. Proceso de fermentación 72
A. Microorganismo 72
B. Fermentación sumergida en fiolas 76
C. Fermentación en estado sólido en fiolas 78
D. Fermentación sumergida en fermentador batch de siete litros 79
E. Fermentación en estado sólido en fermentador de bandejas 81
F. Preparación de las muestras 81
G. Estudio de la cinética de fermentación 83
G.1. Determinación de azúcares por el Método del ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS)
G.2. Determinación de azúcares por el Método de Nelson-Somogyi 84
G.3. Determinación de actividad enzimática amilásica 86
G.4. Determinación de actividad enzimática glucoamilasa 88
G.5. Determinación de actividad enzimática carboximetilcelulasa 89
3.2.1.3. Tratamiento de los productos de las fermentaciones 90
A. Determinación de actividad enzimática xilanasa 92
B. Determinación de actividad enzimática fitasa 93
C. Determinación de ocratoxina A por el método inmunoquímico 94
3.2.1.4. Cálculos parciales de los costos directos de manufactura 95
3.3. Población y muestra 96
83

Pág
CAPITULO IV 99
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 99
4.1. Proceso de fermentación. 99
4.1.1. Fermentación sumergida en fiolas. 99
4.1.2. Fermentación en estado sólido en fiolas. 103
4.1.3. Estudio comparativo de la actividad enzimática en el medio de cultivo
con afrechillo de trigo como único sustrato y en los medios de cultivos
suplementados con una fuente extra de carbono.
4.1.3.1. Alfa-amilasas 107
4.1.3.2. Glucoamilasas 112
4.1.3.3. Celulasas 116
4.1.4. Estudio del efecto del tipo de fermentación (FS/FES) y de la fuente de
carbono en el medio de cultivo en la producción de enzimas.
4.1.5. Fermentaciones en líquido (FS) y en estado sólido (FES) en
fermentadores batch.
4.1.5.1. Estudio de la cinética de la fermentación en sumergido en bioreactor
batch.
4.1.5.2. Estudio de la cinética de la fermentación en estado sólido en
bandejas.
4.1.6. Análisis de los aditivos enzimáticos obtenidos por fermentación del
afrechillo de trigo usando A. niger.
4.1.7. Comparación de las actividades enzimáticas presentes en los aditivos
enzimáticos obtenidos por fermentación líquida y en estado sólido del
afrechillo de trigo usando A. niger.
4.2. Cálculos parciales de los costos directos de manufactura. 145
4.2.1. Balance de materiales del proceso para obtener el aditivo enzimático
empleando A. niger en fermentación sumergida.
4.2.2. Requerimientos de energía para la obtención de un lote de caldo
fermentado por A. niger en fermentación sumergida.
107
122
128
128
132
137
141
147
150

4.2.3. Requerimientos de materiales para la obtención de un lote de caldo
fermentado por A. niger en fermentación sumergida.
4.2.4. Balance de materiales del proceso para obtener el aditivo enzimático
empleando A. niger en fermentación en estado sólido.
4.2.5. Requerimientos de energía para la obtención de un lote de sustrato
fermentado por A. niger en fermentación en estado sólido.
4.2.6. Requerimientos de materiales para la obtención de un lote de material
fermentado por A. niger en fermentación en estado sólido.
4.2.7. Costos primarios preliminares para los procesos de fermentación en
sumergido y en estado sólido.
Pág
V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 162
5.1. CONCLUSIONES
5.2. RECOMENDACIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 166
APÉNDICES 187
Apéndice 1. Pruebas de Rango Múltiples para la alfa-amilasa en
fermentación sumergida de acuerdo al sustrato empleado.
Apéndice 2. Pruebas de Rango Múltiples para la alfa-amilasa en
fermentación en estado sólido de acuerdo al sustrato empleado.
Apéndice 3. Pruebas de Rango Múltiples para la glucoamilasa en
fermentación sumergida de acuerdo al sustrato empleado.
Apéndice 4. Pruebas de Rango Múltiples para la glucoamilasa en
fermentación en estado sólido de acuerdo al sustrato empleado.
Apéndice 5. Pruebas de Rango Múltiples para la celulasa en
fermentación sumergida de acuerdo al sustrato empleado
152
153
155
157
158
162
165
188
189
190
191
192

Apéndice 6. Pruebas de Rango Múltiples para la celulasa en fermentación en
estado sólido de acuerdo al sustrato empleado.
Apéndice 7. Pruebas de Rango Múltiples para la Alfa-amilasa de acuerdo
con el tipo de proceso fermentativo empleado
Apéndice 8. Pruebas de Rango Múltiples para la Glucoamilasa de acuerdo
con el tipo de proceso fermentativo empleado
Apéndice 9. Pruebas de Rango Múltiples para la Celulasa de acuerdo con el
tipo de proceso fermentativo empleado
Pág
193
194
194
194

INDICE DE TABLAS
Tabla Pág
1.1. Evolución de los precios del trigo. Período 2004 a octubre 2007 31
2.1. Algunas de las principales aplicaciones actuales y potenciales de
enzimas en alimentos
2.2. Proyección del consumo de enzimas industriales en los Estados
Unidos por principal uso final hasta 2005 (en millones de dólares)
2.3. Composición proximal de la pasta húmeda y de los desechos de
papas
2.4. Composición proximal del afrechillo de trigo 53
2.5. Composición de diferentes sustratos fermentados usando
Aspergillus niger.
4.1. Resultados promedios de la actividad de la alfa-amilasa obtenidos
en los procesos fermentativos realizados en fiola.
4.2. Análisis de la Varianza de los Componentes. Alfa-amilasa en
fermentación líquida.
4.3. ANOVA para las fuentes de carbono. Alfa-amilasa en fermentación
líquida.
4.4. Análisis de la Varianza de los Componentes. Alfa-amilasa en
fermentación sólida.
4.5. ANOVA para las fuentes de carbono. Alfa-amilasa en fermentación
sólida.
4.6. Resultados promedios de la actividad de la glucoamilasa obtenidos
en los procesos fermentativos realizados en fiola.
4.7. Análisis de la Varianza de los Componentes. Glucoamilasa en
fermentación líquida.
4.8. ANOVA para las fuentes de carbono. Glucoamilasa en fermentación
líquida.
40
44
52
67
108
109
109
110
110
113
114
114

Tabla Pág.
4.9. Análisis de la Varianza de los Componentes. Glucoamilasa en
fermentación sólida.
4.10. ANOVA para las fuentes de carbono. Glucoamilasa en fermentación
sólida.
4.11. Resultados promedios de la actividad de la celulasa obtenidos en los
procesos fermentativos realizados en fiola.
4.12. Análisis de la Varianza de los Componentes. Celulasa en
fermentación líquida.
4.13. ANOVA para las fuentes de carbono. Celulasa en fermentación
líquida.
4.14. Análisis de la Varianza de los Componentes. Celulasa en
fermentación sólida.
4.15. ANOVA para las fuentes de carbono. Celulasa en fermentación
sólida.
4.16. Análisis de la Varianza de los Componentes. Alfa-amilasa.
4.17. Análisis de la Varianza para Alfa-amilasa. Suma de los cuadrados-
Tipo III.
4.18. Análisis de la Varianza de los Componentes. Glucoamilasa.
4.19. Análisis de la Varianza para Glucoamilasa. Suma de los cuadrados-
Tipo III.
4.20. Análisis de la Varianza de los Componentes. Celulasa.
4.21. Análisis de la Varianza para Celulasa. Suma de los cuadrados- Tipo
III.
4.22. Análisis bromatológico de los aditivos enzimáticos obtenidos y del
afrechillo de trigo usado como sustrato en los procesos fermentativos
114
115
117
118
118
119
119
122
122
124
124
125
126
138

Tabla Pág.
4.23. Actividades enzimáticas de los aditivos obtenidos 142
4.24. Costos totales en materiales empleados en el proceso de
fermentación líquida con A. niger.
4.25. Costos totales en materiales empleados en el proceso de
fermentación sólida con A. niger.
4.26. Fermentación en estado sólido vs. Fermentación líquida 161
152
157

INDICE DE FIGURAS
Figura Pág
2.1. Aspergillus niger. 63
2.2. Aspergillus niger. 63
3.1. Esquema de los estudios realizados al proceso fermentativo. 73
3.2. A. niger ANM-1 conservado en cuñas de PDA. 73
3.3. Esquema para la preparación de cuñas de PDA. 74
3.4. Esquema empleado para la conservación de A. niger. 75
3.5. Preparación de fiolas para fermentación en estado líquido. 76
3.6. Esquema empleado para la obtención del precultivo de A. niger
(caldo a partir de afrechillo de trigo).
3.7. Esquema empleado para la obtención del producto fermentado a
partir de fermentaciones sumergidas.
3.8. Esquema empleado para la obtención del producto fermentado a
partir de fermentaciones sólidas con A. niger.
3.9. Muestras almacenadas en tubos eppendorfs. 83
3.10. Esquema empleado para el análisis enzimático de los productos
fermentados.
3.11. Esquema empleado para la obtención de muestras. 91
3.12. Esquema resumen del diseño anidado. 98
4.1. Comportamiento del pH y de los azúcares reductores durante la
fermentación sumergida en fiolas.
4.2. Comportamiento de las actividades enzimáticas monitoreadas
durante la fermentación sumergida en fiolas.
4.3. Comportamiento del pH y de los azúcares reductores durante la
fermentación en estado sólido en fiolas.
4.4. Comportamiento de las actividades enzimáticas monitoreadas
durante la fermentación en estado sólido en fiolas.
77
80
82
87
101
102
103
105

Figura Pág
4.5. Diagrama de caja para la enzima alfa-amilasa en los tratamientos
(Fermentación sumergida).
4.6. Diagrama de caja para la enzima alfa-amilasa en los tratamientos
estudiados (Fermentación en estado sólido).
4.7. Diagrama de caja para la enzima glucoamilasa en los tratamientos
estudiados (Fermentación sumergida).
4.8. Diagrama de caja para la enzima glucoamilasa en los tratamientos
estudiados (Fermentación en estado sólido).
4.9. Diagrama de caja para la enzima celulasa en los tratamientos
estudiados (Fermentación sumergida).
4.10. Diagrama de caja para la enzima celulasa en los tratamientos
estudiados (Fermentación en estado sólido).
4.11. Actividad de la enzima alfa-amilasa en los procesos fermentativos. 123
4.12. Actividad de la enzima glucoamilasa en los procesos fermentativos.
4.13. Actividad de la enzima celulasa en los procesos fermentativos. 126
4.14. Proceso de fermentación en estado líquido del A. niger en
fermentador batch.
4.15. Desmontaje del fermentador batch y recolección del caldo
fermentado por A. niger (Fermentación líquida).
4.16. Cinética de la fermentación sumergida. Variación del pH y
producción de azúcares durante el tiempo de fermentación en
fermentador batch.
4.17. Cinética de la fermentación sumergida. Actividades enzimáticas
monitoreadas durante el tiempo de fermentación en fermentador
batch.
4.18. Aditivo enzimático (harina fermentada) obtenida en fermentación
sumergida.
4.19. Fermentación en estado sólido en bandeja a partir de A. niger
empleando como sustrato afrechillo de trigo.
4.20. Cinética de la fermentación en estado sólido. Variación del pH y
producción de azúcares durante el tiempo de fermentación en
bandeja.
111
112
115
116
120
120
125
129
129
130
131
132
133
133

Figura Pág
4.21. Cinética de la fermentación en estado sólido. Actividades
enzimáticas monitoreadas durante el tiempo de fermentación en
bandeja.
4.22. Aditivo enzimático (harina fermentada) obtenido mediante un
proceso de fermentación en estado sólido.
4.23. Actividades enzimáticas en el sustrato fermentado por A. niger en
Fermentación sólida y en Fermentación líquida.
4.24. Crecimiento en placas de PDA del A. niger. 139
4.25. Actividad cualitativa de la enzima alfa-amilasa de los aditivos
enzimáticos A) Fermentación líquida. B) Fermentación en estado
sólido
143
4.26. Actividad cualitativa de la enzima fitasa de los aditivos. 143
4.27. Esquema tecnológico de los procesos fermentativos empleados
para obtener un aditivo enzimático.
4.28. Esquema del proceso de fermentación en estado líquido incluyendo
el consumo energético
4.29. Esquema del proceso de fermentación en estado sólido incluyendo
consumo energético
135
136
136
146
151
156

RESUMEN
“ESTUDIO COMPARATIVO DEL PROCESO DE OBTENCIÓN DE UN ADITIVO
ENZIMÁTICO MEDIANTE FERMENTACIONES MICROBIANAS SÓLIDA Y
SUMERGIDA DE AFRECHILLO DE TRIGO”
Autora: Ing. Lenis Matute
Tutora: Ing. Annalisse Bertsch, MSc
Los procesos fermentativos que emplean hongos para la obtención de enzimas,
conforman una de las áreas en las que se han realizado mayores progresos. En
este trabajo se empleó Aspergillus niger ANM-1 y afrechillo de trigo para determinar
la actividad de las enzimas alfa-amilasas, glucoamilasas y celulasas, generadas a
través de dos tipos de procesos fermentativos: La fermentación sumergida (FS) y la
fermentación en estado sólido (FES), para así comparar las actividades enzimáticas
logradas y los costos primarios preliminares en cada proceso. Se llevó a cabo una
cinética en fiola para determinar el tiempo óptimo de fermentación para ambos tipos
de fermentación. Los análisis enzimáticos ofrecieron como resultado que las
actividades óptimas para el proceso de FS ocurrieron a las 64 horas, con una
respuesta enzimática en alfa-amilasas de 49,05 UA/mL, 36,68 UI/mL para las
glucoamilasas y en celulasas de 30,05 UI/mL. Mientras que en la FES, se observó
que al séptimo día de fermentación se reportan las más elevadas actividades
enzimáticas con 90,46 UA/mL para las alfa-amilasas, 524,50 UI/mL para las
glucoamilasas y 19,13 UI/mL para las celulasas. Con respecto a la evaluación del
efecto sobre la producción de enzimas, al adicionar al medio de cultivo diferentes
fuentes suplementarias de carbono, se observó que las mayores actividades
enzimáticas para alfa-amilasas, glucoamilasas y celulasas en FS, se presentaron en
el medio de afrechillo de trigo con residuos de papas (77,36 UA/mL), con CMC
(9,97 UI/mL) y sin suplementación (30,05 UI/mL), respectivamente. Mientras que en
la FES se obtuvieron actividades de 61,35 UA/mL en alfa-amilasas, y 20,85 UI/mL
en celulasas cuando no se suplementó el medio y 302,47 UI/mL en glucoamilasas
cuando el medio contenía celulosa. Se comprobó estadísticamente que el nivel de
suplementación no provocó efecto alguno en los procesos fermentativos estudiados
y que en la actividad amilásica y en la celulolítica, el factor de mayor influencia fue el
sustrato empleado en la fermentación. Por otra parte, se observó que el método
fermentativo empleado en la obtención de las glucoamilasas es altamente
significativo (P

ABSTRACT
"COMPARATIVE STUDY OF THE PROCESS FOR OBTAINING A ENZYME
ADDITIVE BY MICROBIAL WHEAT BRAN SOLID AND SUBMERGED
FERMENTATION"
Author: Ing. Lenis Matute
Tutor: Ing. Annalisse Bertsch, MSc
Fermentation processes that use fungi for the obtaining of enzymes, is one of the
areas which have made most progress. In this work was employed Aspergillus niger
ANM-1 and bran wheat to determine the activity of the enzyme alpha-amylases,
glucoamylases and cellulases, generated through two types of fermentation
processes: submerged fermentation (SF) and solid state fermentation (SSF) order to
compare the enzyme activities achieved and preliminary primary cost in each
process. It carried out a kinetic on Erlenmeyer flask to determine the most favorable
fermentation time for both types of fermentation. The enzyme assays result shows
that the best activities for the process SF occurred at 64 hours, with a
response alpha-amylase enzyme of 49.05 AU/mL, 36.68 IU/mL for cellulases and
glucoamylases of 30.05 IU/mL. While in the SSF, it was noted that the seventh
fermentation day is the highest reported activities enzymatic with 90.46 AU/mL for
alpha-amylase, 524.50 IU/mL for glucoamylases and 19.13 IU/mL cellulases. With
regard to the evaluation of the effect on the production of enzymes, when added to
medium different crop supplementary sources of carbon, noted that the highest
enzymatic activities alpha-amylase, glucoamylase and cellulase on SF, presented in
the middle of wheat bran plus potato waste (77.36 AU/mL) with CMC (9.97 IU/mL)
and without supplementation (30.05 IU/mL), respectively. While the activities
obtained SSF were 61.35 AU/mL in alpha-amylase, and 20.85 IU/mL cellulase
when not supplemented medium and 302.47 IU/mL in glucoamylases when the
medium contained cellulose. It was found statistically that the level of
supplementation did not caused effect on fermentation processes studied and that
the amylase and the cellulolytic activity, the most influential factor was the substrate
used in fermentation. On the other hand, noted that the method used in the
fermentation glucoamylases obtained is highly significant (P

CAPITULO I
EL PROBLEMA
1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La tecnología enzimática ocupa un lugar preponderante dentro de la
biotecnología y específicamente, dentro del sector alimentario mundial. Alrededor de
un 65 por ciento de las enzimas que se producen industrialmente están de una u
otra manera relacionadas con la industria alimentaria. Por lo que puede
considerarse que los procesos fermentativos, que emplean bacterias y hongos
para la obtención de enzimas, en los que se metabolizan sustratos para elaborar
aditivos destinados a la alimentación humana y animal, conforman una de las
áreas en las que se han realizado mayores progresos (The Business
Communications Company, Inc. (BCC), 2003; Durán., 2000; García et al., 2002).
La producción de enzimas utilizando microorganismos tiene como ventaja su
menor costo. Además de que es posible incrementar el rendimiento de la producción
enzimática, con sólo modificar las condiciones ambientales en las que se lleva a
cabo el proceso. Adicionalmente, las enzimas obtenidas por fermentaciones
microbianas, generalmente son excretadas al medio por el microorganismo lo que
facilita la extracción de las mismas (OEA, 2006).

Asimismo, a través de las fermentaciones microbianas es posible la
utilización de materiales, subproductos y residuos agroindustriales tales como: las
vinazas, el lactosuero, el afrechillo, entre otros, con el fin de transformarlos en
alimentos de alta calidad nutricional para el ganado, aditivos enzimáticos, entre
otros compuestos.
El impacto ambiental causado por la generación de residuos
agroindustriales, estimula la necesidad de contar con soluciones que permitan el
aprovechamiento de éstos. Los procesos fermentativos se presentan como una
alternativa que posibilita la disminución de la carga contaminante en el ambiente y
permiten obtener nuevos productos de alto valor agregado, lo que se traduce en
beneficios económicos para la nación (BCC, 2003).
El desarrollo de estas técnicas y métodos para la puesta en marcha de los
procesos fermentativos, bien sea en sumergido o en sólido, han sido un importante
requisito para el avance en la enzimología en las últimas tres décadas (Montes y
Magaña, 2002). Es así, que se ha logrado conocer que la mayoría de las enzimas
extracelulares son producidas por organismos pertenecientes a dos géneros:
Bacillus y Aspergillus (Carrera, 2003). Una de las alternativas que se han
contemplado en los últimos años en esta área de estudio, consiste en el uso de
enzimas que ayuden a los animales a utilizar las porciones orgánicas indigestibles
de los alimentos, como la fibra presente en cereales y subproductos como el
afrechillo de trigo, que conforman las raciones en los programas de formulación para

la alimentación animal. De esta forma aumenta el potencial nutricional de los
ingredientes de las dietas y se disminuye la cantidad de materia contaminante
arrojada al medio ambiente (Fernández, 2007).
Tomando en cuenta, que en el caso de las industrias de alimentos
concentrados para animales, el alza en el precio de los cereales y otros insumos
desde 2006, ha sido del 97 por ciento, de acuerdo con las estadísticas de la
Asociación Venezolana de Fabricantes de Alimentos Concentrados para Animales
(Afaca) , ocasionando que los precios del sector se incrementen en cerca del 40 por
ciento y afectando a su vez, los costos de los sectores avícola, porcino, bovino y
acuícola (Tovar, 2008); es razonable el interés que despiertan las fermentaciones
industriales, ya que generan la posibilidad de elaborar aditivos enzimáticos a partir
de materias primas alternativas lo cual reduciría los costos y de este modo, se
provocarían efectos positivos en el mercado interno.
Es por ello, que esta investigación tiene como propósito, producir un aditivo
enzimático por medio de fermentaciones microbianas sumergidas y en estado
sólido, utilizando afrechillo de trigo, subproducto proveniente de la molienda de
harinas de trigo, como fuente de energía y carbono y así, obtener un producto con
alto valor agregado y con posibilidades de uso práctico en la industria alimentaria.

1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
Las investigaciones en el área de la biotecnología en Venezuela, han
mostrado un desarrollo sostenido en el tiempo; sin embargo se hace necesario crear
un programa de biotecnología donde se definan y prioricen líneas de investigación
con un enfoque integral, tomando en cuenta las características socioeconómicas y
culturales de la nación; todo esto, amparado bajo un marco legal sólido y con
normas de bioética y de bioseguridad coherentes que permitan que la biotecnología
constituya un buen soporte para el desarrollo de la nación (García, 2005).
Bajo este panorama, Venezuela podría dirigir sus esfuerzos al mercado de
enzimas para alimentos ya que existen oportunidades en esta para enzimas nuevas
y mejoradas en usos-nicho; además de las grandes posibilidades de crecimiento
que ofrece el sector de alimentos concentrados para animales (The Biotechnology
Center of Excellence Corporation (BCEC), 2003).
El incremento en el uso de enzimas industriales depende de una constante
innovación para mejorar los procesos y reducir costos. Esta innovación es llevada a
cabo mediante la adquisición de conocimientos orientados a la manipulación del
ADN, la obtención y uso de una enorme diversidad de enzimas naturales, y a las
tecnologías de fermentación que permitan una producción diversa de enzimas, a
bajo costo (Cherry y Fidantsef, 2003).

En tal sentido, es de gran relevancia dar respuesta a las siguientes
interrogantes: ¿Es el afrechillo de trigo una alternativa viable en el desarrollo de
procesos fermentativos que permitan obtener productos con alto valor agregado
destinados a la alimentación animal? De ser así, ¿cuál será el proceso tecnológico
que ofrece las mayores ventajas? ¿Uno que emplee fermentación líquida? ¿O uno
que emplee fermentación en estado sólido? Desde el punto de vista de los costos
primarios de producción ¿cuál proceso resultará ser es el más ventajoso?

1.3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
1.3.1. Objetivo general
Comparar el proceso de obtención de un aditivo enzimático a partir de Aspergillus
níger mediante fermentaciones microbianas en estado sólido y sumergido, usando
como sustrato afrechillo de trigo.
1.3.2. Objetivos específicos
1. Estudiar la cinética de fermentación de A. niger cultivado en estado sólido y
líquido.
2. Evaluar el efecto sobre la producción de enzimas, al adicionar al medio de
cultivo diferentes fuentes suplementarias de carbono.
3. Establecer el proceso biotecnológico para la obtención del aditivo enzimático
a partir de las fermentaciones en estado sólido y líquido.
4. Determinar la actividad enzimática y las características fisicoquímicas de los
productos obtenidos a través de los procesos de fermentación estudiados.
5. Comparar los costos de producción primarios preliminares del aditivo
enzimático para cada proceso de fermentación.

1.4. JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA
La Confederación Nacional de Asociaciones de Productores Agropecuarios
(Fedeagro) indicó que en Venezuela, para el año 2007 se produjeron 1.054,857
toneladas de arroz, 2.570,869 toneladas de maíz y 382.116 toneladas de sorgo
(insumo básico en la producción de alimentos balanceados para animales). Mientras
que durante el año 2006, el consumo fue de 130.259,725 toneladas para el maíz y
611.996 toneladas de arroz, lo que a las claras muestra el déficit existente entre la
producción interna y la demanda en el país y obliga a la nación a importar el
faltante. En el mismo sentido, el consumo de productos a base de trigo (pan,
harinas, pastas y galletas) durante el 2006 fue 838.356 toneladas, a pesar de que
este cereal no se produce en el país.
Debido a que Venezuela es deficitaria en su producción de cereales, es
imperativo prestar atención a la producción de biocombustibles en el mundo, la cual
consume gran cantidad de cosechas de maíz, cereal forrajero utilizado en la
elaboración de alimentos concentrados, este fenómeno comercial, de acuerdo a
informes de la Organización de las Naciones Unidas, (ONU), podría reducir la
seguridad alimentaria de la población mundial y elevar los precios de los alimentos y
de los insumos necesarios para su elaboración; asunto que ya se percibe en el
costo del maíz y del azúcar extraída de la caña, también utilizada en la producción
de alcohol para combustible (etanol). Si bien, Venezuela no utiliza su producción de
cereales forrajeros y caña de azúcar, para la formulación de biocombustibles,

también es cierto, que el país no se autoabastece de maíz para la fabricación de
alimentos concentrados, (el índice de autosuficiencia alcanza 80%) y en la medida
en que acuda al mercado internacional para adquirir maíz, y el mismo supere los
costos internos, obviamente se verán impactadas sus estructuras de costos en
general.
De acuerdo con la Asociación Venezolana de Fabricantes de Alimentos
Concentrados para Animales (Afaca, 2008), el sector de los alimentos concentrados
coloca cerca de 77 por ciento de su producción (3.132.000 toneladas) en la cadena
avícola, y 17 por ciento en la cadena porcina (un poco más de 691.000 toneladas).
Esto se refleja en los costos de estos rubros; en el caso de los pollos, las
estimaciones del sector productor indican que desde febrero del 2007 hasta febrero
del 2008 los costos aumentaron un 47 por ciento, pasando de Bs 4,82 por kilo a
7,12 por kilo.
Un reporte de la Afaca (Tovar, 2008), indica que unos 8 rubros empleados
para elaborar alimentos concentrados presentaron incrementos en los precios,
afectando a su vez los costos de los sectores avícola, porcino, bovino y acuícola. En
particular, el maíz amarillo importado se incrementó 56 por ciento, al pasar desde
US$ 225 por tonelada (2006) hasta US$ 350 por tonelada. En cuanto a la harina de
soya, ésta tuvo un incremento de 96 por ciento en los últimos dos años, al pasar de
US$ 275 (2006) por toneladas a US$ 540 por tonelada; mientras que las mezclas de
cereales (maíz, sorgo o trigo) aumentaron 22 por ciento desde el 2006, al pasar de

US$ 644 por tonelada (2006) hasta US$ 786 por tonelada. En tanto que la
Asociación Venezolana de Fabricantes de Pastas Alimenticias (Avepasta) indica
que, el precio del trigo aumentó en más del 200 por ciento, al pasar de US$ 226 por
tonelada en el 2006 a US$ 810 por tonelada en octubre del 2007 (ver Tabla 1.1.).
Tabla 1.1. Evolución de los precios del trigo.
Período 2004 a octubre 2007
Año CIF US$/Tm
2004 233
2005 238
2006 226
2007 (promedio) 488
Octubre 2007 810
Fuente: Avepasta (2008)
Estas cifras, ofrecen suficientes razones que sustentan la búsqueda de
alternativas para la alimentación animal, que complementen o sustituyan
parcialmente a los cereales. Diversos estudios han mostrado el aprovechamiento de
desechos y subproductos alimenticios, como fuente de nutrientes para vacas
utilizando residuos cítricos (Revidatti et al., 2000), residuos agrícolas y desechos
industriales de los cereales (González et al., 2008), residuos de caña de azúcar
(García et al., 2008), entre otros. Así como, para ganado caprino, empleando

desechos de auyama (Madrid et al., 1998); en ganado porcino, usando residuos y
subproductos de la pulpa de café (Rathinavelu y Graziosi, 2005); en pollos con
semillas de jamaica (Cortés et al., 1996), entre otros estudios.
Otras investigaciones han demostrado como los aditivos enzimáticos
favorecen la nutrición animal, aumentando la digestibilidad de las dietas, mejorando
el valor nutritivo de los granos e incrementando el aprovechamiento del valor
energético de los mismos, como los efectuados en: aves (Angelovičová et al., 2007;
Pourreza et al, 2007; Alam et al., 2003 y Cortés et al., 2002), cabras lecheras
(González, 2004) y rumiantes (Rojo-Rubio et al., 2007), entre otros.
Por estas razones, la biotecnología dirige sus esfuerzos en desarrollar
procesos industriales alternativos eficientes y con menores requerimientos
económicos, usando para ello microorganismos en fermentaciones (en estado sólido
o en sumergido), para la obtención eficiente de productos con alto valor agregado,
consumiendo menos energía y adicionalmente, aprovechando los subproductos y
desechos generados por la industria de alimentos, lo cual contribuye con la
reducción de los costos en las operaciones industriales, así como, en el tratamiento
de los desechos sólidos en los basurales.
Es importante resaltar, que la economía de los procesos biotecnológicos
dependen en gran medida de la disponibilidad y del valor monetario del sustrato
utilizado, de tal manera que la correcta selección del medio de cultivo, tiene un

fuerte impacto en el éxito del proceso (Negrin et al., 2007). Por tal razón la
búsqueda de materias primas de bajo costo y fácil adquisición, que puedan ser
utilizados como sustratos fermentables (fuentes de carbono o nitrógeno) en la
preparación de medios de uso microbiológico, constituye uno de los retos más
interesantes de la biotecnología actual (Coello et al., 2003).
En este sentido, puede considerarse el uso del afrechillo de trigo como
sustrato en procesos fermentativos, debido a que es obtenido en cantidades
considerables al ser generado durante el proceso de la molienda del trigo,
representando el 24,60 por ciento del material molido (Bogliaccini, 2004). De
acuerdo con las cifras publicadas por la Asociación de Molinos del Trigo (Asotrigo),
Venezuela importa 1 millón 500 mil toneladas de trigo al año: 50 por ciento va para
el sector panadero, 30 por ciento para los pastificios y 20 por ciento para galletas y
harina familiar. Además, se señala que en Venezuela se importan 480 mil
toneladas/año, de trigo durum (Buttarello, 2008).
En consecuencia, se estima que en Venezuela se generan 118 mil
toneladas/año de afrechillo de trigo, aproximadamente, proveniente de la molienda
del trigo durum. Es decir, que la alta disponibilidad de este subproducto en el
mercado venezolano, adicional a su bajo precio (0,6 Bs/Kg), le hace una alternativa
válida en los procesos fermentativos, orientados a la elaboración de aditivos
enzimáticos para la alimentación animal.

2.1. ANTECEDENTES
2.1.1. Aditivo enzimático:
CAPITULO II
MARCO TEÓRICO
Un aditivo alimentario es aquella sustancia, que puede tener carácter
nutritivo o no, de composición perfectamente conocida y que se incorpora a un
alimento en cantidades pequeñas y controladas para cumplir un determinado
objetivo tecnológico. Este objetivo puede consistir en un mejoramiento, ya sea de la
estabilidad o de la presentación, a través de los caracteres organolépticos y así,
modificar directa o indirectamente las características sensoriales, físicas, químicas o
biológicas del alimento. Asimismo, estos aditivos pueden ser adicionados durante
las fases de producción, fabricación, elaboración, preparación, tratamiento,
envasado, empaquetado, transporte o almacenamiento (COVENIN 910, 2000;
Codex Alimentarius, 1995; Schmidt-Hebbel, 1990)
Entre los aditivos alimentarios se encuentran los preparados enzimáticos o
aditivos enzimáticos que son soluciones o extractos que contienen una proteína, la
cual tiene un efecto catalítico, es decir, modifica la velocidad de una reacción
química, necesaria o deseable para producir un cambio o una característica
determinada en un alimento durante el proceso de fabricación (COVENIN 910:2000)

Estos catalizadores biológicos tienen la capacidad de acelerar ciertas
reacciones químicas, sin sufrir alteraciones y en condiciones compatibles con la
vida. Además, poseen actividades específicas, es decir, se dirigen a un determinado
sustrato y para actuar, requieren de condiciones apropiadas de pH, temperatura y
concentración (Montes y Magaña, 2002).
Asimismo, se sabe que la actividad catalítica de las enzimas ha sido utilizada
por el hombre desde tiempos remotos en fermentaciones y elaboración de quesos.
Sin embargo, no fue sino hasta 1960 cuando se hizo la descripción de las
estructuras enzimáticas. Desde el punto de vista químico, las enzimas son proteínas
globulares que para cumplir su función requieren conservar su estructura nativa, en
la que se destaca una región formada por un número reducido de residuos
aminoacídicos que poseen afinidad por los compuestos que intervienen en la
reacción. Ese lugar se llama sitio activo, y en él se pueden unir y orientar las
moléculas que intervienen en la reacción y de esa forma maximizar la posibilidad de
formación o de ruptura de enlaces necesaria para la obtención de productos (Agius
et al., 2006; Montes y Magaña, 2002; COVENIN 910, 2000)
La producción de enzimas para uso industrial tuvo sus orígenes en
Dinamarca y Japón, a finales del siglo XIX, cuando se produjeron las primeras
preparaciones de renina a partir del estómago de terneros y de amilasa de origen
fúngico. Las enzimas son productos de las células y por lo tanto pueden obtenerse a

partir de tejidos animales, tejidos vegetales o mediante procesos de fermentación
empleando microorganismos seleccionados (Carrera, 2003).
El incremento en el uso de enzimas industriales depende de una constante
innovación para mejorar el desarrollo de los procesos y reducir costos. Esta
innovación es llevada a cabo mediante la profundización en el conocimiento de una
enorme diversidad de enzimas naturales, ADN recombinante y tecnologías de
fermentación, que permitan una producción diversa de enzimas a bajo costo (Cherry
y Fidantsef, 2003).
Es por ello que los procesos catalizados por enzimas en la industria son
cada día más numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los
catalizadores convencionales no biológicos. Una de las principales ventajas de las
enzimas, además de las de índole económica, está asociada a su gran especificidad
de sustrato lo cual asegura que no se produzcan reacciones laterales imprevistas;
por otra parte, presentan una gran actividad catalítica y son muy activas a
temperatura ambiente y presión atmosférica. Además, las enzimas pueden
inactivarse fácilmente cuando se considera que han cumplido su objetivo (Agius et
al., 2006; Montes y Magaña, 2002; Arroyo, 1998).
Algunos ejemplos de estos productos enzimáticos son: la obtención de cuajo,
que es usado en la elaboración de quesos. Ésta es una de las enzimas más
antiguas y está formada por la mezcla de dos enzimas, la quimiosina y la pepsina

que se obtienen del cuajar de las terneras jóvenes. Otra enzima que también es
muy importante, es la lactasa o beta-D-galactosidasa, que es una enzima que
hidroliza la lactosa, el azúcar de la leche. Una gran parte de la población mundial
carece de lactasa intestinal y la ingesta de la lactosa les ocasiona diarreas y otros
trastornos intestinales. La eliminación de este azúcar de la leche se puede
conseguir tratando la leche con beta-galactosidasa, la cual se comercializa
actualmente (Montes y Magaña, 2002).
Existen otras enzimas empleadas en el procesamiento de alimentos
vegetales denominadas genéricamente pectinasas, que digieren la pectina,
substancia presente en las paredes de las células vegetales. En el procesamiento
de jugos de frutas el producto obtenido generalmente es viscoso, debido a la pectina
disuelta, y turbio por los fragmentos de paredes celulares en suspensión. Cuando se
agregan pectinasas, la viscosidad disminuye y las partículas pueden eliminarse
fácilmente, centrifugando el líquido o filtrándolo. Este mecanismo produce un líquido
con una presentación más atractiva para el consumidor (Montes y Magaña, 2002).
Una enzima en franca expansión es la empleada en la obtención de jarabes
de glucosa o fructosa a partir de almidón de maíz. Cerca del 70 por ciento de este
almidón es convertido en jarabes de alta fructosa. Estos jarabes se utilizan en la
elaboración de bebidas refrescantes, conservas de frutas, repostería, etc., como
sustituto del azúcar de caña. La forma antigua de obtener estos jarabes, por
hidrólisis ácida, ha sido prácticamente desplazada en los últimos 15 años por la

hidrólisis enzimática, que permite obtener un jarabe de mucha mayor calidad y a un
costo muy competitivo. Este proceso representa un caso único en la industria en
donde el uso de las enzimas es esencial (Montes y Magaña, 2002).
Adicionalmente, las enzimas pueden cumplir una función importante para
aumentar la competitividad, ya que pueden incrementar la calidad de los alimentos,
al mejorar aspectos como su apariencia, textura, contenido nutricional, además de
sabores y aromas. Más aún, las enzimas se pueden utilizar para reemplazar ciertas
tecnologías de base química en la industria de los alimentos, con la ventaja de
menor impacto ambiental y menor uso de energía. En la industria de los alimentos
concentrados para animales, las enzimas obtenidas mediante procesos
fermentativos, son incorporadas directamente al alimento y actúan como
complementos de enzimas, como las celulasas, las hemicelulasas y otras, presentes
en forma natural en el animal. Estas enzimas microbianas sirven para descomponer
materiales y mejorar la digestión (BCEC, 2003).
La adición de enzimas exógenas (aquellas que no pertenecen al sistema
digestivo endógeno del animal), como las amilasas, fitasas, celulasas, etc., en dietas
para aves, así como para cerdos es cada vez más frecuente (Rojo et al., 2007). Ésta
es una práctica que se lleva a cabo para complementar la actividad desarrollada por
las enzimas propias del tracto intestinal de los animales. Se ha demostrado que
estas enzimas mejoran la digestibilidad de la dieta y el valor nutritivo de los granos
utilizados como alimento (Angelovičová et al., 2007; Pourreza et al., 2007; Alam et

al., 2003; Cortés et al., 2002). En Europa, se ha hecho común el uso de enzimas en
las dietas de cerdos (Bedford, 1993), ya que al tratarse de proteínas, cuando las
enzimas son adicionadas a un alimento, son digeridas en el tracto digestivo, sin
dejar residuos en la orina o en las heces (Gómez-Villalva, E., 2005).
La necesidad de suplementar los alimentos con enzimas se debe a
numerosos factores ya sean fisiológicos, biológicos, dietéticos y/o
medioambientales. En animales jóvenes la producción de enzimas endógenas
puede ser limitada, debido a la inmadurez de su sistema enzimático, por lo que el
suplemento de enzimas alimentarias podría ser una necesidad fisiológica. Factores
antinutricionales, como el ácido fítico, los oligosacáridos y los polisacáridos no
amiláceos, se encuentran abundantemente en los ingredientes de origen vegetal.
Todos estos factores son capaces de formar complejos con nutrientes dietéticos,
afectando su digestibilidad (Gómez-Villalva, E., 2005).
En la Tabla 2.1., pueden observarse algunas de las principales aplicaciones
de las enzimas en el sector alimentario y los microorganismos que las producen.
Como puede observarse en esta Tabla, la mayoría de las enzimas industriales se
derivan de bacterias y hongos que por medio de fermentaciones metabolizan un
medio nutriente estéril para obtener un caldo, en donde los microorganismos liberan
enzimas para llevar a cabo procesos digestivos. Una vez se completa la
fermentación, se emplea la filtración centrífuga para separar las enzimas (BCC,
2003).

Tabla 2.1. Algunas de las principales aplicaciones actuales y potenciales de
enzimas en alimentos
Enzima Aplicación Microorganismo
Amiloglucosidasa
Obtención de glucosa a partir de
hidrolizados de almidón con
amilasa. Aditivo en la elaboración
de cerveza ligera.
Β-Glucanasas Aditivos en cervecerías.
Pectinasas Extracción y clarificación de jugos
de frutas
Narigininasa
Eliminación del sabor amargo en
el jugo de toronja
Tanasa
Lactasa
Proteasa
Glucosa oxidasa
Lipasa
Aditivo en la producción de té
instantáneo
Hidrólisis de la lactosa en leche y
en suero de leche
Obtención de hidrolizados
proteicos. Hidrólisis y
decoloración e hemoglobina.
Obtención de gelatina.
Modificación de propiedades
funcionales de proteínas
En combinación con catalasa para
la eliminación de la glucosa en la
clara de huevo. Estabilizante de
alimentos por eliminación del
oxígeno (bebidas, mayonesa)
Maduración acelerada de quesos.
Aditivo en alimentos para
animales domésticos.
Modificación de grasa (producción
de sustituto de cocoa)
Aspergillus niger, A.
oryzae, Rhizopus
delegar
Penicillum emersonil,
Aspergillus niger,
Bacillus subtilis
Aspergillus niger
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae, A.
niger
Aspergillus niger, A.
oryzae, Kluyveromyces
fragilis
Bacillus licheniformis, B.
subtilis
Aspergillus niger
Mucor mihel, Aspergillus
niger, Rhizopus oryzae

Continuación….
Enzima Aplicación Microorganismo
Antocianinasa Decoloración de jugos y de vinos
Aspergillus niger
Estaquiasa Eliminación de flatulencias en soja Aspergillus niger
Saccharomyces
Invertasa
Producción de azúcar invertido
cerevisie,
carlsbergensis
S.
Inulinasa
Celulasas y
hemicelulasas
Hidrólisis de polímeros de
fructosa (inulina) de ciertos
vegetales (ágave tequilero,
alcachofas)
Hidrólisis de vegetales y residuos
agrícolas. Aditivos en
alimentación animal.
Aspergillus sp., Candida
pseudotropicales, K.
marxianus
Trichoderma viride, T.,
reesel, Aspergillus niger
Antocianinasa Decoloración de jugos y de vinos Aspergillus niger
Estaquiasa
Aspergillus niger
Eliminación de flatulencias en soja
Alfa amilasa
Alfa amilasa
Beta amilasa
Dextranasas
Hidrólisis de almidón residual en
jugo de caña. Aditivo de
cervecería
Obtención de hidrolizados de
almidón con alto contenido de
maltosa. Aditivo en panadería
Obtención de hidrolizados de
almidón con alto contenido de
maltosa.
Eliminación de dextranas en jugo
de caña de azúcar
Bacillus licheniformis, B.
subtilis, B.
amyloliquefaciens
Aspergillus oryzae, A.
sojae, A. effusus
Bacillus polymyxa, B.
cereus.
Penicillum funiculosum,
P. lilacinum, C. gracilae
Pronasa Hidrólisis total de proteínas Streptomyces griseus
Renina Producción de queso
Fuente: García et al. (2002).
Mucor mihei, M pusillus,
Endotia parasitica

En tal sentido, BCEC (2003) señala que las carbohidrasas y las proteasas
son los principales tipos de enzimas utilizadas en la industria de los alimentos para
consumo humano y en los concentrados para animales, con cerca de 14 por ciento
del valor del mercado. De igual forma, se ha señalado que las áreas de alimentos y
de alimentos concentrados para animales dominan el mercado de enzimas
industriales en todo el mundo, al pasar sus ingresos de US$ 705 millones en 1997,
a US$ 833.1 millones en el 2002. Las principales aplicaciones de la tecnología
enzimática son la fabricación de almíbares, bebidas alcohólicas, productos lácteos y
alimentos concentrados para animales. Otras aplicaciones menos importantes son
los productos de panadería, procesamiento de frutas y hortalizas y el procesamiento
de proteínas y extracción de aceites vegetales (BCC, 2003).
Se ha calculado, que el mercado mundial de enzimas industriales representa
entre US$ 1.500 y US$ 2.000 millones anuales con proyecciones de crecimiento a
una tasa promedio de crecimiento anual de, al menos 10 por ciento. Europa ocupa
una posición de liderazgo en enzimas industriales y suministra entre 60 y 70 por
ciento del abastecimiento mundial. En Norte América, donde se observa un agresivo
desarrollo del mercado, se produce el 15 por ciento, al igual que en Japón (BCEC,
2003).
De igual forma, García et al. (2002), afirman que la tecnología enzimática
ocupa un lugar preponderante dentro de la biotecnología y específicamente, dentro
del sector alimentario. Alrededor de un 65 por ciento de las enzimas que se

producen industrialmente están de una u otra manera relacionadas con la industria
alimentaria.
De acuerdo con la información suministrada en la Tabla 2.2., las enzimas
para alimentos tienen la mayor participación en el mercado norteamericano de
enzimas industriales: 50 por ciento, aproximadamente. Cerca de las dos terceras
partes de este porcentaje se utilizan en la industria láctea y de almidones y el resto
se dirige a la industria de la panadería, la elaboración de queso, el procesamiento
de jugos de frutas, la producción de vino y cerveza, entre otros (BCC, 2003).
Estas cifras confirman cómo, durante los últimos años, la biotecnología ha
experimentado grandes avances y, paralelamente sus aplicaciones industriales en la
obtención de productos químicos, en la industria alimentaria y farmacéutica (Agius
et al., 2006; Montes y Magaña, 2002; Arroyo, 1998). Por lo que pueden
considerarse que los procesos para la obtención y el uso de las enzimas,
conforman una de las áreas en las que se han realizado mayores progresos, junto
al empleo masivo de aminoácidos industriales obtenidos, como las enzimas, a partir
de fermentaciones controladas de manera industrial (Durán, 2000).

Tabla 2.2. Proyección del consumo de enzimas industriales en los
Estados Unidos por principal uso final hasta 2005 (en millones de
dólares)
Sector del
mercado
Alimentos, y
concentrados
para
Animales
Detergentes/
limpiadores
Fabricación
de químicos
Textiles,
cuero y
pieles
Pulpa y papel
Total
Fuente: BCC (2003)
2.1.2. El proceso fermentativo:
2000 2005
Participación
en el
mercado (%)
Crecimiento anual
promedio
(%)
251,0 294,5 46,80 3,2
113,4 145,0 23,04 5,0
70,8 89,5 14,22 4,8
48,7 58,7 9,32 3,8
30,2 41,6 6,62 6,6
514,1 629,3 100 4,1
Desde hace varias décadas se dispone de enzimas relativamente puras y
con una gran variedad de aplicaciones en los distintos procesos industriales. La
producción de una enzima por los métodos de la biotecnología clásica incluye dos
etapas principales: la de fermentación, en la que se multiplica el microorganismo
productor de la enzima y la de recuperación y purificación, en la que se aísla la
enzima y se lleva al grado de pureza adecuado para su uso. El desarrollo de
técnicas y métodos para la puesta en marcha de estos procesos, han sido un

importante requisito para el avance de la enzimología en las últimas tres décadas
(Montes y Magaña, 2002). En cuanto a esto, se sabe que la mayoría de las enzimas
extracelulares son producidas por organismos pertenecientes a dos géneros:
Bacillus y Aspergillus, que en su mayoría son del tipo hidrolítico (Carrera, 2003).
Los procesos biocatalíticos para la obtención de estos aditivos, normalmente
involucran el cultivo y uso de microorganismos en medios acuosos o sólidos, que
contienen compuestos orgánicos como substrato, cuya estructura es alterada o que
dan como resultado, la síntesis de nuevos compuestos. Estos procesos pueden ser
llevados a cabo a pequeña escala, como por ejemplo en la producción de
esteroides, o bien a gran escala como sería la utilización de invertasa para la
obtención de jarabes fructosados (Montes y Magaña, 2002).
Con el uso de las fermentaciones microbianas, la biotecnología ha logrado
una serie de avances tendentes a abaratar los precios, a ahorrar energía, eliminar
residuos contaminantes y sustituir productos y aditivos para la alimentación humana
y animal (García et al., 2002).
El cultivo de células microbianas fuera de su ambiente natural, como es el
caso de las fermentaciones en biorreactores, implica conocer y proveer las
condiciones favorables para su crecimiento y para la generación de productos
celulares de interés. Es decir, el desarrollo de un proceso fermentativo requiere
necesariamente del aprendizaje de cómo proveer los estímulos necesarios para que

las células trabajen beneficiosamente. Así que, la preparación de medios para el
desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la
productividad de los mismos. Los componentes de los medios, constituyen los
efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los
procesos, ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de
formación de productos y de suministro de energía para la síntesis de metabolitos y
para el mantenimiento celular. Asimismo, el medio puede afectar a la competitividad
económica de un proceso concreto (Galindo et al., 2007; OEA, 2006; Prescott et al.,
2003).
Los microorganismos varían considerablemente respecto de los nutrientes
que pueden necesitar, es así como es posible efectuar la distinción de las siguientes
categorías de componentes: a) Macronutrientes, agregados en cantidades de
gramos por litro que están representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg; b)
Micronutrientes o elementos trazas, representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca,
Zn y Co, que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos
por litro; y c) Los factores de crecimiento, que están constituidos generalmente por
componentes orgánicos suministrados en baja concentración y que no son
sintetizados ni metabolizados por las células, sino incorporados a estructuras
celulares y de función metabólica específica, como las vitaminas, algunos
aminoácidos, ácidos grasos no saturados, etc. (OEA, 2006).

En resumen, un medio de cultivo o de fermentación debe proporcionar todos
los requerimientos necesarios para el crecimiento de los microorganismos y así
asegurar un proceso óptimo dentro del fermentador. Además, el mismo debe ser
considerado desde el punto de vista económico, de forma tal, que su elaboración no
encarezca el proceso fermentativo.
En consecuencia, el comportamiento de un microorganismo en crecimiento
es el resultado de la interacción que se produce entre éste y el medio ambiente en
el reactor, y que en rigor es el resultado de los llamados efectores intra y extra
celulares del proceso fermentativo. Los efectores internos están representados por
la dotación genética intrínseca del organismo considerado y por sus mecanismos de
regulación metabólica. Por otra parte, los efectores extra celulares están
representados por las condiciones presentes en el medio ambiente, es decir, valores
de pH, temperatura, la agitación, la aireación, etc. Por lo tanto, éstos efectores
externos están constituidos por las variables de manipulación física que se fijan o se
programan en el curso del proceso de producción. Estos últimos pueden ser
modificados por alteraciones del medio ambiente, mientras que la existencia de un
gen, depende de la especie del microorganismo considerado. Un gen está o no
está, sólo su expresión puede modificarse (OEA, 2006).
Además, los procesos fermentativos se presentan como una respuesta al
manejo indiscriminado de antibióticos en la producción animal y plantean nuevas
alternativas que promueven una producción más limpia, sin el uso de aditivos que

pongan en riesgo la salud humana y animal, a la vez que permite el uso de residuos
y subproductos agroindustriales (Demain y Adrio, 2008; Quiles y Hevia, 2008;
Gullian y Rodríguez, 2002).
En este sentido, Diorio et al. (2003), señalan que los productos obtenidos a
partir de fuentes reciclables, tales como los residuos y los subproductos
agroindustriales, han merecido un interés creciente, debido a que permiten aminorar
el impacto ambiental y los costos en el tratamiento y disposición de dichos residuos
en las industrias. La disposición final de los residuos orgánicos sólidos es un
problema que afecta al medio ambiente en todas las regiones del mundo.
Actualmente se trata de reducir la masa de este tipo de residuos, aplicando métodos
biotecnológicos que tienden a reducir su volumen y a favorecer su reutilización.
Los sustratos empleados en la industria de las fermentaciones son
generalmente complejos, siendo importante considerar diferentes aspectos como el
costo de los mismos, la disponibilidad y la estabilidad en su composición química. Si
se tiene en cuenta que el costo de los nutrientes representa entre el 10 y el 60 por
ciento de la inversión total de muchos productos obtenidos por fermentación, se
hace prioritario disminuir el costo de éstos. Para ello, se emplean efluentes de
industrias que por su contenido en fuentes de carbono son interesantes para
algunos procesos, tales como las vinazas de destilería. Sin embargo, las materias
primas más importantes en estos procesos, corresponden a fuentes de nitrógeno
como: el amoníaco y las sales de amonio, la harina de soja o los nitratos; y fuentes

de carbono como: melaza, suero, semillas y desechos agrícolas (OEA, 2006:
Prescott et al., 2003).
Por estas razones, se han usado residuos del pastificio y del procesamiento
de papas en procesos de fermentación microbiana. La pasta húmeda es obtenida
durante el proceso de extrusión donde se emplea un molde para dar la forma
deseada al producto (Giardina, 1995). Asimismo, se obtienen cantidades
apreciables de esta pasta durante el proceso de arranque de la producción,
mientras son calibrados los equipos. Aunque una parte de esta pasta puede ser
reincorporada al proceso, existen limitaciones para el reproceso, originadas por su
alto contenido de humedad (31 por ciento), lo cual le hace susceptible a la
descomposición. La pasta húmeda que no es reprocesada, es comercializada para
ser usada como alimento para animales (Mujica, 2006).
En Venezuela, el consumo de pastas es de aproximadamente 13 kg por
persona al año, uno de los más elevados en el mundo. A partir de las cantidades de
pasta alimenticia producidas para el año 2001 (264.000 toneladas anuales), se
estima que se producen unas 528 toneladas anuales de pasta húmeda (0,2 por
ciento de la producción), las cuales son consideradas como desecho (FEDEAGRO,
2008; Asociación Venezolana de Fabricantes de Pastas Alimenticias (AVEPASTAS),
1999).

Entre las empresas que producen pastas en Venezuela, se encuentra la
empresa Sindoni, C.A. (Maracay, estado Aragua). Esta empresa obtiene un
estimado de 4.000 toneladas de pasta alimenticia al mes, generando
aproximadamente unas 8 toneladas de pasta húmeda como desecho (Mujica, 2006).
De acuerdo con Espinal et al. (2005), se ha incrementado la demanda de
productos procesados o semiprocesados, lo que ha forjado expectativas muy
favorables respecto al crecimiento del subsector de la industria manufacturera de
papas. La FAO (2008), calcula que el consumo mundial de la papa está pasando del
producto fresco a los productos alimentarios industriales, con valor añadido, como
por ejemplo: las papas a la francesa (cuyo consumo mundial, se ha calculado, en
más de 11 millones de toneladas al año); las hojuelas crocantes de papa; los copos
para elaborar el puré de papas que se vende en cajas y también, como ingrediente
para preparar aperitivos; o la harina de papa, que se obtiene a nivel industrial a
partir de la papa cocida entera y representa hasta el 96 por ciento del almidón que
contiene la papa.
Asimismo, el almidón de la papa es ampliamente utilizado por las industrias
farmacéutica, textil, de la madera y del papel, como adhesivo, aglutinante,
texturizador y relleno, y por las compañías que perforan pozos petroleros, para lavar
los pozos. El almidón de papa es un sustituto 100 por ciento biodegradable del
poliestireno y se utiliza, por ejemplo, para hacer platos y cubiertos desechables
(FAO, 2008).

Por otra parte, la cáscara de la papa y otros desechos de la industria de la
papa tienen un abundante contenido de almidón, que se puede licuar para obtener
etanol apto para la producción de combustibles. Un estudio realizado en Nueva
Brunswick, provincia de Canadá productora de papa, reporta que 44.000 toneladas
de desechos industriales de la papa podrían producir de 4 a 5 millones de litros de
etanol (FAO, 2008).
Actualmente, no existen estadísticas de consumo industrial de papas o de la
producción de productos procesados a base de papas en Venezuela. Sin embargo,
la industria venezolana reporta que durante el procesamiento de las papas fritas, se
pueden generar entre 20 y 25 por ciento de residuos con más de 70 por ciento en
contenido de almidón (Ver Tabla 2.3.) (Morocoima, 2008).
Tabla 2.3. Composición proximal de la pasta húmeda y de los desechos
de papas
Componente Pasta húmeda
(base seca) 1
Desechos de
papas (base
seca) 2
Proteína 13,2 6,97
Grasa 1,98 0,52
Carbohidratos:
Almidón
79,2
89,61
Glucosa
4,09
0,56
Fibra 0,48 2,12
Ceniza 0,7 2,75
Fuente: 1 Mujica, 2006; 2 Morocoima, 2008.

Otro subproducto empleado en procesos fermentativos, es el afrechillo de
trigo, el cual es utilizado en las dietas para animales y presenta alta disponibilidad
en el mercado nacional. Además, su bajo costo (sólo Bs 0,6 por kilogramo), le hacen
sumamente atractivo como sustrato en procesos orientados a la obtención de
productos con valor agregado.
2.1.3. Afrechillo de trigo:
De acuerdo con COVENIN 1878-83, el afrechillo de trigo es el material
formado por las partes finas de las capas externas del grano de trigo, resultante de
un proceso de molienda, pudiendo contener partes del endospermo y del germen
del grano de trigo.
Desde el punto de vista nutricional el afrechillo de trigo puede definirse como
un alimento de tipo energético-proteico, con valores intermedios tanto de energía
como de proteínas. Puesto que es un subproducto de la extracción de harina de
trigo (almidón), el residuo que le confiere el valor energético deriva
fundamentalmente de la "fibra" de la cubierta de los granos. Por lo tanto, se trata de
una fuente de energía de menor digestibilidad y "metabolicidad" que la del almidón
(Gallardo, 2007).
La composición nutricional del afrechillo de trigo de acuerdo con COVENIN
1878-83, se encuentra expresada en la Tabla 2.4.

Tabla 2.4. Composición proximal del afrechillo de trigo
Fuente: COVENIN 1878-83 (1983)
En la actualidad, hay muchas oportunidades para convertir los subproductos
y residuos de la agroindustria, en productos de alta calidad y de alto valor agregado.
En Venezuela, la utilización de estos productos es todavía incipiente, aún cuando se
sabe que las empresas más competitivas serán aquellas que mejor aprovechen
estos subproductos y residuos, pues garantiza la reducción de los costes de
producción, incrementado la rentabilidad de sus procesos productivos.
En el país, se importan 1 millón 500 mil toneladas de trigo al año según cifras
de Asotrigo (Butarello, 2008), lo que se traduce en 369.000 toneladas de afrechillo
de trigo, disponibles para el consumo.
Componente Contenido (%)
Humedad 13
Proteína cruda 16
Grasa cruda 4
Fibra cruda 9
Cenizas totales 5,5
Cenizas insolubles
en ácido
1,5

Este subproducto de la industria molinera, ha sido empleado en diversas
investigaciones como sustrato en procesos de fermentación en estado sólido, tales
como: en la producción de poligalacturonasa y pectinlinasa usando Moniliella SB9 y
Penicillium sp EGC5 (Martin et al., 2004) y con Aspergillus awamori para obtener
poligalacturonasa (Blandino et al., 2002). De igual forma, se han efectuado
fermentaciones sumergidas en varias investigaciones empleando: Acetobacter
xylinum TISTR 967 y Monascus purpureus TISTR 3090 para la obtención de
pigmentos purpúreos (Ochaikul et al., 2006), Trichoderma viride para producir beta-
glucosidasa (Ikram-ul-Haq et al., 2006) o Aspergillus awamori en la síntesis de
xylanasa (Velkova et al., 2007), entre otros.
Se constata así, que en la producción de aditivos enzimáticos se han
empleado tanto la fermentación en estado sólido, como las fermentaciones
sumergidas. En cada proceso fermentativo particular, el esquema tecnológico, las
condiciones de trabajo y el sustrato a utilizar conforman los factores relevantes del
mismo, por lo que es de suma importancia elegir el método fermentativo que permita
reducir los tiempos de trabajo, los riesgos de contaminación, el consumo de
energía y los costos, en pro de lograr los mayores rendimientos y la máxima
actividad enzimática posible.

2.1.4. Fermentación sumergida (FS) y en estado sólido (FES):
Como ya se mencionó, la fermentación microbiana es aquel proceso donde
ocurre la transformación de ciertas materias orgánicas bajo la acción de enzimas
segregadas por microorganismos y que tiene una naturaleza bioquímica. Este
proceso tiene lugar en ambientes aeróbicos o anaeróbicos y en él, se degradan
sustancias orgánicas en compuestos intermedios que actúan como donadores y
aceptores de electrones con liberación de energía. Es decir, que es un proceso de
óxido-reducción (Casp y Abril, 2003; Prescott et al., 2003).
En el transcurso del proceso fermentativo, el microorganismo va aumentando
su concentración y al mismo tiempo, el medio se va modificando y se forman
productos nuevos como consecuencia de las actividades catabólicas y anabólicas
de dichos microorganismos. El fermentador tiene dos objetivos primordiales: a)
proporcionar oxígeno a las células que se están cultivando en suspensión y b)
mantener las condiciones ambientales básicas (como la temperatura, el oxígeno
disuelto y el pH), en los niveles que sean óptimos para la producción del metabolito
de interés (Galindo et al., 2007; OEA, 2006).
Estas fermentaciones pueden llevarse a cabo tanto en medio líquido como
en medio sólido. Una fermentación sumergida o en suspensión (FS), es aquella que
se lleva a cabo con los agentes biológicos inmersos en fase acuosa (García et al.,
2002). En contraparte, la fermentación en estado sólido (FES) es aquel proceso

ioquímico, que aprovecha el crecimiento de microorganismos en un medio o matriz
sólida, con una humedad entre 12 y 80 por ciento. La FES ocurre naturalmente en
muchos sustratos. Por ejemplo, la madera en descomposición y una gran variedad
de procesos de alimentos, como en la maduración del queso, el vino de arroz, el
miso y la salsa de soya. Una de las FES más antiguas y que, al mismo tiempo es
una solución ecológica al problema de los desechos putrescibles, ha sido el llamado
composteo vegetal, humificación o “producción de abono” orgánico (Alfonso, 2005).
Otros ejemplos de productos de la fermentación en estado sólido incluyen enzimas
industriales, combustibles y nutrientes para el enriquecimiento de alimentos para
animales.
Diferencias entre la fermentación sumergida (FS) y la fermentación en
estado sólido (FES):
En general, la fermentación en estado sólido es simple, en términos del
equipo y del control del proceso, es menos costoso y con frecuencia ofrece mejores
resultados si se le compara con la fermentación sumergida (Papagianni et al., 2001).
Las diferencias básicas entre la FES y la FS de acuerdo con Ruiz et al.
(2007) se resumen como sigue:

1. En FES, la distribución microbiana se produce en una superficie sólida, y el
crecimiento microbiano y la formación del producto también se producen
principalmente en la superficie. El sustrato no es uniforme y no es fácil agitarlo. El
cultivo se hace al medio ambiente, por lo tanto, es heterogéneo.
2. El contenido de humedad de una FES es normalmente bajo, en función de las
características físicas o químicas del sustrato. Para los medios de cultivo con alto
contenido de humedad, la aireación constante es difícil.
3. El calor derivado del metabolismo y el crecimiento del microorganismo aumenta
la temperatura del sustrato sólido y causa pérdida de la humedad.
4. En la FES se suele usar como sustratos, materiales naturales como por ejemplo,
cereales, soja, la biomasa agrícola y de residuos sólidos.
5. Los microorganismos utilizados en la FES generalmente son hongos que
pueden producir enzimas para degradar el material y penetrar en el sustrato
sólido.
6. La agitación del sustrato cama es muy difícil y el cultivo es normalmente
estacionario, a excepción de los procesos realizados en fermentadores de tambor
rotatorio y de lecho fluidizado.

En la producción industrial de enzimas extracelulares, tales como
amilasas, celulasas y pectinasas, tanto la FES y la FS son utilizadas. La decisión de
cuál método usar, se basa principalmente, en el costo y la eficiencia del proceso.
Por lo tanto, es importante conocer las ventajas y desventajas de la FES, en
comparación con la FS (Ruiz et al., 2007).
Ventajas de la fermentación en estado sólido (FES):
Entre las ventajas que presenta la FES con respecto a la FS, se tiene:
1. La FES es relativamente resistente a la contaminación bacteriana, puesto
que el crecimiento bacteriano está limitado por la baja actividad de agua, así
que rara vez ocurre la contaminación en un medio sólido.
2. Los fermentadores son compactos, es decir que la carga volumétrica del
sustrato es mucho mayor en la FES que en la FS, porque el grado de
humedad es menor.
3. Si la extracción del producto de la FES es necesario, requiere mucho menos
esfuerzo y la recuperación de los costos es mayor que a partir de la FS.

4. El tratamiento de los residuos de la fermentación es muy sencillo en la FES,
ya que el contenido de humedad en los residuos de la fermentación es muy
bajo, pueden ser secados y usados como piensos para animales o abono.
5. La utilización microbiana de gases del oxígeno reduce los costos por el uso
de energía para la aireación.
Desventajas de la fermentación en estado sólido (FES):
Ruiz et al. (2007), indican que la FES tiene como desventajas:
1. La agitación del sustrato cama es difícil. Por lo tanto, la distribución de la
masa celular, los nutrientes, la temperatura, el contenido de humedad, etc,
es irregular, lo que resulta en una mezcla heterogénea fisiológica, física,
química y en medio ambiente del sustrato cama. Esta complejidad hace que
el control del proceso sea muy difícil.
2. El único medio para controlar la temperatura del cultivo es la aireación.
3. La determinación del crecimiento microbiano y otros parámetros
fermentativos es muy difícil.

4. La microflora se limita a aquellos capaces de crecer con bajo contenido de
humedad. Mohos u otros hongos filamentosos son adecuados, pero
el crecimiento bacteriano es raro, a excepción de las bacterias xerófilas.
En cualquier caso, el desarrollo de las fermentaciones industriales requiere
de medios de cultivos apropiados y la selección a gran escala de los
microorganismos. Sea en estado sólido o líquido, el diseño del biorreactor debe ser
de tal naturaleza, que garantice las condiciones óptimas para el crecimiento
microbiano y la obtención del producto deseado (Ruiz et al., 2007; Prescott et al.,
2003).
2.1.5. Microorganismos usados en las fermentaciones.
Entre los microorganismos empleados para obtener diversos bioproductos,
se encuentran los hongos. El término hongo (del latín fungus, seta) incluye
organismos eucariotas portadores de esporas con nutrición por absorción, carentes
de clorofila, que se reproducen de forma asexual y sexual. Estos organismos son
importantes para los seres humanos, tanto como fuente de beneficio como de
perjuicio, de los cuales se han descrito unas 90.000 especies. Sin embargo, algunas
estimaciones sugieren que puede haber 1,5 millones de especies. Los hongos
degradan la materia orgánica compleja del ambiente a compuestos orgánicos
simples y moléculas inorgánicas. De esta forma, se liberan y se ponen a disposición

de los seres vivos: carbono, nitrógeno, fósforo y otros componentes (Prescott et al.,
2003).
El uso de hongos filamentosos para la producción comercial de importantes
metabolitos se ha incrementado rápidamente, desde la mitad del siglo pasado,
estableciéndose la producción de enzimas en fermentaciones sumergidas. Se han
realizado investigaciones en la fermentación en estado sólido, empleando diversos
desechos los cuales pueden ser utilizados por los hongos y dirigiendo los esfuerzos
a la obtención de productos innovadores y de alto valor, como por ejemplo; la
proteína unicelular, alimentos enriquecidos, etanol, enzimas, etc. (Papagianni et al.,
2001).
De acuerdo con Prescott et al. (2003), los hongos son esenciales para
muchos procesos industriales en los que participa la fermentación. Son ejemplos de
ello la elaboración de pan, el vino y la cerveza. También desempeñan un importante
papel en la preparación de algunos quesos, la salsa de soja y la producción
comercial de muchos ácidos orgánicos (cítrico, gálico), de ciertos fármacos
(cortisona) y en la manufactura de muchos antibióticos (penicilina).
2.1.6. Aspergillus niger
Entre los organismos eucariotas que han sido objeto de numerosas e
importantes investigaciones, se encuentra el hongo Aspergilus níger. Este hongo

pertenece al género Aspergillus, que fue descrito por primera vez por Micheli en
1729 en su obra Nova Plantarum genera, siendo validado por Haller, en sus tratados
de 1742 y 1768 y más tarde, por Link en el año de 1809. Estos hongos, causan el
deterioro de muchos productos alimenticios (ajo, alimentos para aves, arvejas,
avena, berenjena, bananas, cebolla, harina de trigo, entre otros). Los productos
metabólicos de la invasión fúngica suelen ser muy tóxicos, tanto para el hombre
como para otros animales (Accensi, 2000).
Sin embargo, algunas especies del género Aspergillus tienen gran
importancia en la industria y son utilizadas en la producción de ácidos orgánicos,
básicamente cítrico y glucónico, además de que en ciertas regiones se utilizan
diversas especies de Aspergillus como fermentos naturales en la producción de
alimentos tradicionales (Accensi, 2000; Kozakiewicz 1989).
Dentro del género Aspergillus, los que componen la sección Nigri se
encuentran entre los hongos de mayor importancia, hallándose distribuidos a nivel
mundial y siendo capaces de crecer en una gran variedad de sustratos: semillas,
granos, forrajes, piensos, frutas, verduras y cuero, entre otros (Samson et al., 2006;
Accensi, 2000; Gams et al., 1985).
El color es la principal característica macroscópica para la identificación de
los grupos de los aspergilos. Todas las especies de Aspergillus con cabeza conidial
oscura se incluyeron en el grupo A. niger (Ver Figuras 2.1. y 2.2.). En particular,

Aspergillus niger presenta cabezas conidiales globosas de color negro. Los
conidios, de diámetros inferiores a 6 μm, constituyen cadenas que se originan en la
célula conidiógena o fiálide. Además, en Aspergillus niger hay células adyacentes a
las fiálides denominadas métulas o células de soporte (Accensi, 2000: Kozakiewicz
1989).
Figura 2.1. Aspergillus niger. Figura 2.2. Aspergillus niger.
(Levitus, G., 2007)
Por otra parte, se ha señalado que la temperatura óptima de
crecimiento para las cepas de Aspergillus niger se encuentra dentro del rango que
va desde 28 hasta los 37 ºC (Alvarez et al., 2006; Lagunas et al., 2006; Papagianni
et al., 2006; Gomes et al., 2002; Accensi, 2000; Peñaloza et al., 1985) y que el
metabolismo secundario de estos mohos es capaz de generar la ocratoxina A
(OTA). La OTA es una de las micotoxinas más estudiada y contamina
frecuentemente, granos de cereales, vinos, cerveza, café y cacao. Se ha
demostrado que la OTA posee un potente efecto nefrotóxico y nefrocancerígena;

esta micotoxina se absorbe rápidamente del tracto gastrointestinal y se elimina
lentamente. Además, la OTA presenta una alta afinidad por las proteínas
plasmáticas, siendo la fracción de toxina libre en el plasma menor a 0,2 por ciento
en todas las especies estudiadas, incluido el ser humano. Se ha determinado que la
OTA se excreta en las heces y la orina, lo cual indica su circulación por el hígado y
los riñones (Jiménez, 2007; Soriano, 2007; Rousseau, 2004; Perusia y Rodríguez,
2001).
Sin embargo, a pesar de que el Aspergillus niger es capaz de generar esta
micotoxina, algunas especies de Aspergillus sección nigri se utilizan a nivel
industrial como fuente de enzimas extracelulares y ácidos orgánicos para ser
utilizados en la industria alimentaria, ya que los productos obtenidos poseen la
categoría GRAS (Generally Recognised As Safe, “Generalmente reconocidos como
seguros”) de la FDA (Food and Drug Administration) y se utilizan en cantidades
significativas como aditivos alimentarios. Entre estos productos industriales, se
tienen la obtención de: alfa-amilasas, catalasas, celulasas, glucoamilasas, lipasas,
pectinasas y proteasas, así como ácido cítrico y ácido glucónico (Papagianni et al.,
1994).
2.1.7. Usos del Aspergillus niger en la agroindustria.
Como ya se ha indicado, Aspergillus niger es ampliamente utilizado en la
agroindustria. Los procesos de fermentación para la obtención de ácido cítrico

utilizando este hongo, representan uno de los más importantes procesos
microbiológicos industriales; varios de los aspectos de este proceso fermentativo
han aparecido en una gran cantidad de publicaciones tales como los estudios
efectuados por: Papagianni y Mattey (2006), Soccoll et al. (2006), Priede y Viesturs
(2005), Papagianni et al. (1994), entre otros.
Asimismo, se ha investigado ampliamente al Aspergillus niger en la
producción de enzimas: xylanolíticas (Cao et al., 2008; Pang e Ibrahim, 2005; Loera.
y Córdova, 2003; De Vries y Visser, 2001); pectinasas (Favela-Torres et al, 2006;
Pandey et al., 2005. Boccas et al., 1994); glucosidasas (Onsori et al., 2005: Kang et
al., 1999), alfa y gluco-amilasas (Abu et al., 2005: Omemu et al., 2005: Juge et al.,
2002; Santerre Henriksen et al., 1999; Li et al., 1984), tanasas (Pinto et al., 2001),
poligalacturonasa, carboximetilcelulasa y proteasa (Gomes et al., 2002) y fitasas
(Godoy et al., 2002)
Como ya se señaló, la suplementación de enzimas de origen exógeno en
alimentación animal, pretende suplir las deficiencias enzimáticas de los animales,
para mejorar la utilización de materias primas y permitir el uso de materias primas
alternativas. En este sentido destaca la utilización de beta-glucanasas, xilananasas
y fitasas. Éstas últimas se emplean para aumentar la retención de fósforo puesto
que libera los nutrientes “atrapados” por el ácido fítico.

El ácido fítico está presente en muchos alimentos de origen vegetal,
principalmente cereales y legumbres y es considerado un factor no nutritivo ya que
puede estar ligado a proteínas y almidones y se comporta como un fuerte agente
quelante reduciendo la biodisponibilidad de elementos tales como: el zinc, el cobre,
el hierro, el manganeso, el magnesio y el calcio. Debido a la ausencia o reducida
actividad fitasa presente en el tracto digestivo de los animales monogástricos,
elementos tales como el zinc forman complejos con el ácido fítico, los cuales
acabarán siendo excretados en las heces (Gómez-Villalva, 2005; Mendez, 1998;
Piquer, 1996).
Las fitasas endógenas de los vegetales tienen un pH óptimo de actividad
alrededor de 5, siendo muy sensibles a las variaciones de pH y de temperatura. Por
esta razón, las fitasas endógenas son poco eficientes para aumentar la
disponibilidad del fósforo fítico. En contraparte, las fitasas obtenidas por vía
fermentativa a partir de Aspergillus niger, tienen un rango de actividad en pHs más
amplio, entre 2,5 y 5,5, lo que les da muchas más posibilidades a nivel digestivo
(Simons et al., 1990). Ya que el fin último de la utilización de fitasas en la actualidad,
es disminuir la excreción de fósforo al medio ambiente, en algunos casos también
pueden suponer cierto ahorro económico, especialmente en piensos de ponedoras
(Mendez, 1998).
Otra importante área en la investigación de los procesos fermentativos con
Aspergillus niger, es la producción de alimentos o harinas fermentadas para el

consumo de animales no rumiantes, empleando como sustrato desechos de la
agroindustria tales como: bagazo de naranjas (Bustamante et al., 2003; Arias,
2001), residuos de café (Lagunas et al., 2006), pulpa de café (Peñaloza et al.,
1985), banano de rechazo (Alvarez et al., 2006; Cerda et al., 2003), maní bambara
(Oloyede et al., 2007) y yuca (Obadina et al., 2006). En otros estudios, Piray y
Kermanshahi (2008), Torres et al. (2004) y Khan et al. (2000), adicionaron el
prebiótico Fermacto®, el cual es obtenido por fermentación de granos de destilería
empleando Aspergillus sp., a la dieta de pollos de engorde, reportando una mayor
ganancia de peso y menor conversión alimenticia en los animales. En la Tabla 2.5.
se puede observar la composición proximal de algunos productos fermentados.
Tabla 2.5. Composición de diferentes sustratos fermentados usando
Aspergillus niger.
Componente
(%)
Banano
1,2
Pulpa de
café 3
Maní
bambara 4
Yuca 5 Fermacto® 6
Fuente: 1 Alvarez et al., 2006; 2 Cerda et al., 2003; 3 Peñaloza et al., 1985;
4 Oloyede et al., 2007; 5 Obadina et al., 2006; 6 Khan et al., 2000.
(Aspergillus sp.)
Proteína 9,56 14,32 29,25 12,6 16,40
Cenizas 5,75 12,64 7,00 - 10,30
Grasa 1,49 2,39 7,00 - 1,80
Fibra 8,77 13,14 2,04 30,6 28,90
Carbohidratos 74,43 -- 33,4 35,60

Asimismo, se han efectuado diversos estudios empleando el afrechillo de
trigo como sustrato en procesos de fermentación sólida y sumergida con Aspergillus
niger. Algunas de estas, son la producción en FES de: mevastatina (Zaffer et al.,
2006), amiloglucosidasa (Ikram-ul-Haq et al., 2002), pectinasa (Martin et al., 2004) y
celobiasa (Tsao et al., 2000). Llevando a cabo FS, se ha producido: xylanasa (Cao
et al., 2008; Okafor et al., 2007; Ikram-ul-Haq et al., 2002 2 ) y celulasa (Devathan et
al., 2007). Además de utilizar FS y FES para obtener: antioxidantes (Kawai et al.,
1994) y proteasa (Esparza et al., 2000), entre muchos otros trabajos.
Por todas las razones antes expuestas, se inició la presente investigación
con el fin de obtener un aditivo enzimático a partir de fermentaciones con
Aspergillus niger (microorganismo GRAS) usando afrechillo de trigo como sustrato.
Dichas fermentaciones se realizarán tanto en estado sólido como líquido, para así
comparar los aditivos resultantes y determinar con cuál metodología se logra el
producto con mayor actividad enzimática, rendimiento y rentabilidad.

CAPITULO III
MARCO METODOLOGICO
En este capítulo se describen los procedimientos o métodos utilizados en la
investigación a fin de lograr los objetivos propuestos.
3.1. Tipo de estudio y de investigación.
El trabajo que se llevó a cabo es exploratorio, ya que este tipo de
investigación es útil para incrementar el grado de conocimiento del investigador
respecto al problema en estudio y constituye la primera fase dentro del proceso de
caracterización de un estudio. La recopilación de información de interés, la cual
incluye la revisión de literatura conceptual, artículos científicos y estadísticas; forma
parte de este tipo de investigación (Gómez y Gómez, 2007; Naghi, 2000).
Asimismo, se considera que la investigación es de tipo descriptivo pues se
logró saber el qué, el cómo y el por qué del tema en estudio. Es decir, que esta
investigación permitió identificar características o establecer propiedades
importantes, posibilitando informar sobre el fenómeno estudiado (Landeau, 2007;
Naghi, 2000).
Por último, se define el trabajo realizado como de tipo experimental-
comparativo, pues se proyectó una investigación científica a nivel de laboratorio, en
la cual se controló una o más variables independientes y se midió el efecto de esta

manipulación sobre los parámetros controlados. Se definió un diseño para el
experimento, el cual se empleó en la investigación comparativa, que permitió
conocer cuál de los dos procesos estudiados, presenta los resultados más
favorables o ventajosos al analizar las semejanzas o diferencias entre los aspectos
bajo estudio (Rodríguez, 2005; Tamayo, 2004; Naghi, 2000).
3.2. Diseño de la Investigación.
3.2.1. Descripción de la Metodología de Trabajo
Este trabajo de investigación se ejecutó en 3 fases, la primera de ellas
consistió en una revisión bibliográfica sobre los procesos fermentativos, bien sea en
suspensión o en sólido, usando A. niger como microorganismo fermentativo y
afrechillo de trigo como sustrato. Asimismo, se recolectó información sobre los
métodos analíticos necesarios para la caracterización de la materia prima, de los
procesos fermentativos y de los productos fermentados obtenidos.
La segunda fase, se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología
Agroindustrial (LBA) del Instituto de Química y Tecnología de la Facultad de
Agronomía (Campus Maracay) de la Universidad Central de Venezuela. En esta
fase, se caracterizó al afrechillo de trigo que fue usado como sustrato en las
fermentaciones y se procedió a realizar las fermentaciones, tanto en estado líquido

como en estado sólido. Posteriormente, se analizaron los productos obtenidos para
conocer su composición y determinar su inocuidad.
Finalmente, se calcularon los costos directos de fabricación de los productos
fermentados. Estos costos fueron comparados entre sí, ya que los mismos,
representan un aspecto importante al decidir cuál proceso tecnológico adoptar. De
ésta forma, se dio cumplimiento a la tercera fase de la investigación.
3.2.1.1. Caracterización fisicoquímica del afrechillo de trigo.
Para determinar la composición fisicoquímica de la materia prima
suministrada por la empresa Pastas “Sindoni” C.A. (Maracay, estado Aragua), se
realizaron los siguientes análisis de acuerdo con lo señalado en la norma 1878-83
(COVENIN 1878-83, 1983)
� Humedad: Determinación de humedad. COVENIN 1156-79 (1979).
� Proteínas: Método de Kjeldahl, COVENIN 1195-80 (1980). El porcentaje de
proteína total se calcula multiplicando la cantidad de nitrógeno total por el factor
6,38.
� Cenizas: Determinación de cenizas. COVENIN 1155-79 (1979).
� Grasa: Determinación de grasa cruda COVENIN 1162-79 (1979).
� Fibra: Determinación de fibra cruda COVENIN 1194-79 (1979).

� Fibra detergente ácida (FDA): consiste en someter la muestra a ebullición con
bromuro de cetiltrimetilamonio en medio ácido y subsecuente filtración y lavado
del residuo, permitiendo analizar la celulosa y la lignina (Goering y Van Soest,
1970).
� Fibra detergente neutra (FDN): consiste en la extracción de la fibra insoluble
(celulosa, hemicelulosa y lignina) con una solución caliente de laurilsulfato de
sodio y la subsecuente determinación gravimétrica del residuo (Goering y Van
Soest, 1970).
3.2.1.2. Proceso de fermentación.
Los estudios concernientes con el proceso de fermentación se encuentran
resumidos en la Figura 3.1.
A. Microorganismo.
El inóculo que se empleó en este trabajo es la cepa A. niger ANM-1, aislada
a partir de granos de maíz, perteneciente al cepario del Laboratorio de Microbiología
del Instituto de Química y Tecnología de la Facultad de Agronomía de la
Universidad Central de Venezuela. Dicha cepa fue conservada bajo refrigeración a 4
ºC, en cuñas de papa destroxa agar (PDA) como se observa en la Figura 3.2. El

procedimiento para la conservación del microorganismo es mostrado en los
esquemas de las Figuras 3.3. y 3.4.
Fermentación
sumergida
Cinética
en fiola.
Substrato:
afrechillo
de trigo
Análisis
enzimáticos
(alfa-amilasas,
glucoamilasas,
celulasas)
Proceso
fermentativo
Cinética en
fiola usando
una fuente
“extra” de
carbono
Medición del pH y
determinación de
la concentración
de azúcares en el
medio
Fermentación en
estado sólido
Fermentación
batch
Substrato:
afrechillo de
trigo
Figura 3.1. Esquema de los estudios realizados al proceso fermentativo.

Figura 3.2. A. niger ANM-1 conservado
en cuñas de PDA.

Figura 3.3. Esquema para la preparación de cuñas de PDA.

Figura 3.4. Esquema empleado para la conservación de A. niger.
B. Fermentación sumergida en fiolas.
Se empleó una solución salina cuya composición en gramos litros, es la
descrita a continuación: 0,5 g de carbonato de calcio, 5 g de sulfato de magnesio, 2
g de sulfato de amonio, 2 g de fosfato de potasio, 2 g de extracto de levadura y 50 g
de afrechillo de trigo. El pH de la solución se ajustó a 4,27 usando para ello, ácido
clorhídrico concentrado. Se vertieron 100 mL de solución salina en fiolas con una
capacidad para 500 mL. Las fiolas (ver Figura 3.5.), fueron esterilizadas en
autoclave a 121 ºC durante 15 minutos (Laboratorio de Biotecnología Agroindustrial
del Instituto de Química y Tecnología. Facultad de Agronomía. Universidad Central
de Venezuela). Para 100 mL de ésta solución, se inocularon 10 por ciento del cultivo
de esporas de A. niger ANM-1, obtenidas mediante el raspado de la superficie de la
cuña de una colonia en crecimiento, adicionando agua destilada estéril y usando
ansa de platino, como se observa en el esquema de la Figura 3.6.

Figura 3.5. Preparación de fiolas para fermentación en estado líquido.

Figura 3.6. Esquema empleado para la obtención del precultivo de A. niger
(caldo a partir de afrechillo de trigo).
La suspensión resultante, se filtró en gasas estériles para así, eliminar los
restos de micelio y conidióforo. Se tomó un mL del líquido filtrado y se sembró en
fiola estéril. Las fiolas inoculadas fueron llevadas a incubación a una temperatura
ambiente de 37 ºC y con agitación constante, a razón de 90 oscilaciones por minuto.
El monitoreo de los cambios producidos en el medio inoculado se efectuó, tomando
muestras en los siguientes tiempos de fermentación: 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 32, 40,
48, 56, 64 y 72 horas. Se evaluó las actividades enzimáticas de las alfa-amilasas,
glucoamilasas y carboximetilcelulasa, así como, el pH y la concentración de
azúcares en el medio. De acuerdo con los resultados obtenidos, se determinó el
tiempo adecuado de fermentación del medio en suspensión.
Luego, se procedió a evaluar las actividades enzimáticas al suplementar el
sustrato con cinco, diez y quince por ciento de: pasta húmeda (residuos de
pastificio), desechos de papas, almidón, carboximetilcelulosa y celulosa, una vez
cumplido el tiempo óptimo de fermentación.

C. Fermentación en estado sólido en fiolas.
Para este proceso se utilizaron 5 g de afrechillo de trigo en fiolas con 500 mL
de capacidad, se ajustó la humedad del sustrato a 85 por ciento (usando la solución
salina descrita en el punto C) y se esterilizó a 121 ºC durante 15 minutos. Luego se
procedió a inocular el microorganismo, de acuerdo con lo explicado en el punto
anterior (Ver Figura 3.6.). Por último, la fiola inoculada se incubó en ambiente a 37
ºC. Los cambios producidos en el medio fermentado se midieron al tomar muestras
a los 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, y 7 días del proceso (actividad enzimática, pH y contenido de
azúcares).
Una vez estudiada la producción enzimática en el transcurso de la
experiencia, se determinó el tiempo de fermentación considerado adecuado para el
proceso fermentativo en estado sólido.
De igual forma, se evaluaron las actividades enzimáticas al suplementar el
sustrato con cinco, diez y quince por ciento de: pasta húmeda, desechos de papas,
almidón, carboximetilcelulosa y celulosa, una vez cumplido el tiempo adecuado de
fermentación.
D. Fermentación sumergida en fermentador batch de siete litros.

Se elaboró un precultivo de acuerdo con lo señalado para la fermentación líquida en
fiolas (Figura 3.6.). El precultivo obtenido en el tiempo óptimo de crecimiento, se
empleó para la inoculación de una carga estéril de afrechillo y medio de cultivo, a
razón de 50g/L, en un fermentador por lotes que proporcionó las condiciones
necesarias para el crecimiento de A. niger ANM-1 (37 ºC y 350 rpm de agitación),
este proceso se llevó a cabo de acuerdo con lo expuesto en el esquema de la
Figura 3.7. Durante la fermentación, se tomaron muestras a las 0, 4, 8, 12, 16, 20,

Figura 3.7. Esquema empleado para la obtención del producto fermentado a
partir de fermentaciones sumergidas.
24, 32, 40, 48, 56, 64 y 72 horas; las muestras fueron analizadas para así
determinar el tiempo adecuado de fermentación.
E. Fermentación en estado sólido en fermentador de bandejas.
Para este proceso se utilizaron bandejas en las que el sustrato con una humedad de
85 por ciento fue esterilizado e inoculado, usando un precultivo preparado como ya
se ha señalado (Figura 3.6.). Se colocaron 500 g de afrechillo de trigo en bandejas,
se ajustó la humedad del sustrato a 85 por ciento (usando la solución salina antes
descrita) y se esterilizó a 121 ºC durante 15 minutos. Luego se inoculó el
microorganismo, de acuerdo con lo explicado en el punto anterior. Seguidamente,
se incubó el material de la bandeja en ambiente a 37 ºC, tomándose muestras del
sustrato fermentado a los 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, y 7 días (Figura 3.8.). Dichas muestras
fueron examinadas para medir la actividad enzimática y optar por el tiempo de
fermentación adecuado.

F. Preparación de las muestras.
Las muestras fueron centrifugadas a 12.000 rpm durante 20 minutos en
centrifuga refrigerada a 4 ºC; el sobrenadante o extracto enzimático, se almacenó
en tubos Eppendorf a -5 ºC (ver Figura 3.9.).

Figura 3.8. Esquema empleado para la obtención del producto fermentado a
partir de fermentaciones sólidas con A. niger.
Figura 3.9. Muestras almacenadas en tubos Eppendorf.
G. Estudio de la cinética de fermentación.
Para los métodos fermentativos, se estudiaron los cambios producidos
durante los procesos fermentativos, mediante la medición del pH de acuerdo con la
norma COVENIN 1315-79 (1979), la determinación de azúcares reductores por
método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) y el método de Nelson-Somogyi (1944,
1945). Además, de la cuantificación de las actividades enzimáticas de: amilasa,
glucoamilasa y carboximetilcelulasa. A continuación se describen las metodologías
correspondientes a las determinaciones indicadas.

G.1. Determinación de azúcares por el Método del ácido 3,5-dinitrosalicílico
(DNS).
Fundamento: en presencia de calor el ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), se reduce a
ácido 3-amino-5-nitrosalicílico por los azúcares reductores presentes,
desarrollándose un color amarillo café. La lectura se realiza a 575 nm (Miller, 1959).
Procedimiento:
a. Colocar en tubo 1 mL de muestras y 1 mL de DNS
b. Hacer un blanco con 1 mL de agua destilada y 1 mL de DNS.
c. Calentar en baño de maría en ebullición.
d. Enfriar rápidamente en baño de hielo.
e. Adicionar 8 mL de agua destilada a cada tubo.
Cálculos: con los valores de la curva estándar se hace una regresión lineal, se
determina el coeficiente de correlación, la pendiente y la ordenada. Se sustituye en
la ecuación de la recta:
Y
Donde: Y = Absorbancia m = pendiente
mX
b
X = Concentración (mg de azúcar/mL) b = ordenada

Reordenando la ecuación se obtiene la concentración de azúcares (X).
G.2. Determinación de azúcares por el Método de Nelson-Somogyi.
Fundamento: el método se lleva a cabo en medio alcalino y está basado en la
acción reductora del azúcar sobre los iones cúpricos (Nelson (1944); Somogy
(1945)).
Procedimiento:
a. Pesar 1 g de muestra.
b. Llevar a diluciones según la muestra, 25-50-100 mL, etc.
c. Tomar alícuotas de 2 mL.
d. Preparar el reactivo A-B en una relación 25:1 y agregar 2 mL de esta mezcla
a la muestra
e. Calentar en baño de maría a 100 ºC.
f. Enfriar rápidamente en baño de hielo.
g. Adicionar 2 mL de reactivo arsenomolibdato, dejar en reposo.
h. Leer a 500 nm.
Cálculos: con los valores de la curva estándar se hace una regresión lineal, se
determina el coeficiente de correlación, la pendiente y la ordenada. Se sustituye en
la ecuación de la recta:

Donde: Y = Absorbancia m = pendiente
X = Concentración (mg de azúcar/mL) b = ordenada
Reordenando la ecuación, se sustituyen las lecturas que se obtengan de las
muestras y se obtiene la concentración (X).
G.3. Determinación de actividad enzimática amilásica.
Fundamento: se determina la actividad amilásica utilizando almidón como sustrato,
se cuantifica su desaparición por fotometría (Figura 3.10.). El yodo de la solución
I2/IK se acompleja con la amilasa nativa en su estructura tradicional intacta, el
complejo yodo-almidón se mide a 580 nm (Hophins y Bird, 1954).
Procedimiento:
a. Centrifugar las muestras a 14.000 rpm durante 10 minutos.
b. Tomar 10 l del extracto enzimático.
c. Agregar 0,5 mL de buffer cloruro acetato y 0,5 mL de solución de almidón al
0,1 por ciento.
d. Incubar en baño de maría.
Y
mX
b

e. Detener la reacción enzimática agregando 4,5 mL de solución reveladora
I2/IK.
f. Leer a 580 nm.
Cálculos: se obtiene la actividad enzimática amilásica en Unidades Amilolíticas
(UA/mL), las cuales se definen como la capacidad de 1 mL de sustrato para
hidrolizar 0,1 mg de almidón, al sustituir los términos en la siguiente ecuación:
UA /
ml
Absorbancia
patrón
Absorbancia
Absorbancia
patrón
muestra

Figura 3.10. Esquema empleado para el análisis enzimático de los productos
fermentados.
G.4. Determinación de actividad enzimática glucoamilasa.
Fundamento: de acuerdo con Olmos (1987), el almidón utilizado como sustrato, se
desdobla por actividad enzimática, liberando moléculas de glucosa. La presencia de
glucosa se cuantifica por fotometría con la reacción de calor y el ácido 3,5-
dinitrosalicílico, el cual se reduce a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico por azúcares
reductores (Figura 3.10.).
Procedimiento:
a. Centrifugar las muestras a 14.000 rpm durante 10 minutos.
b. Tomar 0,5 mL del extracto enzimático.

c. Agregar 2 mL de solución buffer cloruro y 2,5 mL de solución de almidón al 1
por ciento.
d. Incubar en baño de maría.
e. Detener la reacción enzimática calentando en agua hirviendo.
f. Enfriar en baño de hielo.
g. Tomar 1 mL del sustrato enzimático y colocar en un tubo limpio.
h. Agregar 1 mL de reactivo DNS.
i. Calentar a 100 ºC.
j. Enfriar.
k. Agregar 8 mL de agua destilada.
l. Leer a 575 nm.
Cálculos: se obtiene la actividad enzimática en Unidades Internacionales (UI/mL),
las cuales se definen como la cantidad de enzima que hidroliza 1 mol de glucosa
por cada mililitro de extracto enzimático.
UI
/ ml
Abs 15min
Abs
Abs 0min
0,
1
0min
Donde: Abs 15 min = Absorbancia a los 15 minutos
Abs 15 min = Absorbancia a los 0 (cero) minutos
G.5. Determinación de actividad enzimática carboximetilcelulasa.

Fundamento: según Olmos (1987), la celulosa se compone de una cadena de D-
glucosa con enlaces beta (1,4). El principio de la cuantificación de celulasas se basa
en el aumento del poder reductor de una solución de celulosa en función de la
cantidad de enzima presente medida a 575 nm (Figura 3.10.).
Procedimiento:
a. Centrifugar las muestras a 14.000 rpm durante 10 minutos.
b. Tomar 1 mL del extracto enzimático.
c. Agregar 1 mL de solución carboximetilcelulosa (CMC).
d. Incubar en baño de maría.
e. Detener la reacción enzimática calentando en agua en ebullición.
f. Enfriar en hielo.
g. Tomar 1 mL de reactivo DMS y 1 mL de solución enzimática y colocar en
tubo limpio.
h. Calentar en agua a 100 ºC.
i. Enfriar y añadir 8 mL de agua destilada.
j. Leer a 575 nm.
Cálculos: se obtiene la actividad enzimática Unidades Internacionales (UI/mL), al
sustituir los términos en la siguiente ecuación:
UI /
ml
1
D
C^
C ~
tiempo
3
10

Donde: D = Dilución
tiempo = Duración de la reacción (minutos)
C^ = Concentración de azúcares liberados al finalizar el tiempo.
C~ = Concentración de azúcares al tiempo cero (0).
3.2.1.3. Tratamiento de los productos de las fermentaciones.
Los productos obtenidos mediante las fermentaciones se procesaron como
se indica en la Figura 3.11. Los fermentos fueron secados en un secador de
bandejas a 50 ºC, hasta alcanzar humedad constante. En el caso particular, del
Fermentación sumergida Fermentación sólida

Figura 3.11. Esquema empleado para la obtención de muestras.
producto obtenido por fermentación líquida, éste fue filtrado antes de llevarlo al
secador. Ambos productos fueron analizados para conocer su composición
proximal, de acuerdo con las metodologías empleadas para caracterizar al afrechillo
de trigo. Además, se determinaron las actividades enzimáticas en alfa-amilasas
(Hophins y Bird, 1954), celulasas (Olmos, 1987) y glucoamilasas (Olmos, 1987) de
los aditivos obtenidos. Adicionalmente, se determinaron las actividades de las
enzimas xilanasa (Bailey et al., 1991) y fitasa (Bitar y Reinhold, 1972), así como la
presencia de la ocratoxina A para así verificar la inocuidad del aditivo por el método
inmunoquímico.

A. Determinación de actividad enzimática xilanasa.
Fundamento: una unidad de actividad xilanasa, es la cantidad de enzima que libera
un nmol de azúcares reductores (expresados como equivalentes de xilosa) a partir
del sustrato en un minuto (Bailey et al., 1991).
Procedimiento:
a. Centrifugar las muestras a 14.000 rpm durante 10 minutos.
b. Colocar 0,9 mL de 0,05 M buffer citrato pH 5,3 con xilano al 1% (w/v) en un
tubo limpio.
c. Adicionar 0,1 mL de caldo enzimático.
d. Incubar en baño de María.
e. Adicionar 1 mL de DNS.
f. Detener la reacción mediante ebullición.
g. Enfriar y leer a 540 nm.
Cálculos: se obtiene la actividad enzimática Unidades de Xilanasas (BXU/g), al
sustituir los términos en la siguiente ecuación:
Xilanasas(
BXU / g)
Azúcares 1000 D
PMxyl tiempo
Donde: [Azúcares]= concentración de azúcares (mg/mL)
1000= factor de conversión (nmol/mmol)

D= dilución (mL/g)
PMxyl= 150,13 mg/mmol
Tiempo= 300 s
B. Determinación de actividad enzimática fitasa.
Fundamento: una unidad de actividad fitasa, es la cantidad de enzima que libera un
μmol de fósforo inorgánico a partir del sustrato en un minuto, en las condiciones
Procedimiento:
a. Centrifugar las muestras a 14.000 rpm durante 10 minutos.
b. Colocar 2,4 mL de ácido fítico en un tubo.
c. Adicionar 1 mL de 0,2 M buffer acetato de sodio pH 5,15, 1 mL de agua
destilada y 0,6 mL de caldo enzimático.
d. Incubar en baño de maría.
e. Añadir 0,5 mL de ácido tricloro-acético al 10 por ciento y 1 mL de agua
destilada.
f. Refrigerar durante 20 minutos.
g. Determinar fósforo inorgánico a 700 nm.
Cálculos: se obtiene la actividad enzimática Unidades Internacionales (UI/g), al
sustituir los términos en la siguiente ecuación:

Fitasas(
UI / g)
Pi
caldo
PM
Pi
PO4
testigo
tiempo
Donde: [Pi]= concentración de PO4 (mg de PO4/mL)
1000= factor de conversión ( mol/mmol)
Volumen ensayo= 3 mL
Volumen enzima= 0,6 mL
D = dilución (mL/g)
Volumen
ensayo
Volumen
1000
enzima
C. Determinación de ocratoxina A por el método inmunoquímico.
Fundamento: el método inmunoquímico (OchraTest, Vicam, Watertown, MA, USA)
está basado en el uso de columnas de inmunoafinidad (monoclonales) específicas
para la ocratoxina A, cuantificando la toxina por medio de fluorometría (Alvarado et
al., 2007).
Procedimiento:
a. Homogeneizar la muestra con NaCl y solución (80:20) de metanol (tipo
HPLC)/ agua destilada.
b. Filtrar el extracto obtenido empleando papel Whatman nº 1.
c. Mezclar el líquido filtrado con agua destilada.
d. Filtrar usando microfibra de vidrio.
D

e. Pasar el filtrado a través de la columna de inmunoafinidad (ICA) (OchraTest,
Vicam, Watertown, MA, USA).
f. Lavar la columna con buffer de lavado (5X Micotoxin Wash Buffer).
g. Eluir la toxina con el revelador (eluyente) y recoger el analito en tubo
borosilicatado.
h. Leer la concentración de ocratoxina A en un fluorometro VICAM Serie 4,
reportando los valores en g/kg (ppb).
3.2.1.4. Cálculos parciales de los costos directos de manufactura.
De acuerdo con Gómez y Nuñez (2001), los costos directos de manufactura
son aquellos en los que se incurre específicamente para manufacturar un producto.
Dichos costos están conformados por: la adquisición de materias primas e insumo,
la mano de obra, la supervisión, mantenimiento, material y consumo, royalties y
patentes y servicios.
A efectos de este trabajo, se consideraron únicamente, los costos
relacionados con la compra de materia prima e insumos, además del costo de los
servicios (electricidad, agua, vapor, etc.), relacionados con cada proceso
tecnológico. Este aspecto, influyó sobre la escogencia del proceso tecnológico más
provechoso, no sólo desde el punto de vista productivo, sino también desde el punto
de vista de inversión económica.

3.3. Población y muestra.
Con el fin de evaluar los procesos fermentativos llevados a cabo, se utilizó
un diseño anidado. Este diseño se fundamenta en el anidamiento de un factor B
dentro de otro factor A (o que sus niveles están anidados en los de A) cuando cada
nivel del factor B aparece asociado a un único nivel del factor A. Los factores son
similares pero no idénticos para diferentes niveles del otro factor, de acuerdo con el
siguiente modelo:
Para cada i,
j
b
1
j(
i)
i
a
Y
1
ijk
i
0
A
i
B
i 1 ,...., a j 1,.....,
b
j(
i)
k(
ij)
k
1,...., nij
Existen a niveles del factor A y b niveles del factor B, jerarquizados bajo
cada nivel A, y n réplicas. El subíndice j(i) indica que el j-ésimo nivel del factor B
está anidado bajo el i-ésimo nivel del factor A. Es conveniente considerar que las
réplicas están anidadas dentro de las combinaciones de los niveles de A y B. Así el
subíndice k(ij) se usa para el término del error. Es decir, que se observa que j(i)
representa el efecto medio adicional del nivel j-ésimo anidado en el nivel i
(Montgomery, D., 1991).

Por otro lado, b es el número de niveles anidados en cada nivel i, de modo
que el número total de niveles de B es a.b y la suma de los efectos del factor B
dentro de cada nivel de A es 0 (Montgomery, 1991).
En este trabajo se dispuso de dos bloques para el primer nivel jerarquizado
(fermentación en estado sólido y fermentación en estado líquido) con cinco
tratamientos cada uno, los cuales representan el segundo nivel del anidamiento:
afrechillo con pasta húmeda, afrechillo con desechos de papas, afrechillo con
almidón, afrechillo con carboximetilcelulosa (CMC) y afrechillo con celulosa. A su
vez, cada uno de estos tratamientos contó con tres sub-niveles de suplementación
de 5, 10 y 15 por ciento cada uno, de la fuente adicional de carbono, con tres
repeticiones cada uno. El esquema del anidamiento se observa en la Figura 3.12.:
5 %
10 %
15 %
Fermentación líquida
Af+ph Af+pp Af+alm
Af+CMC Af+cel
5 %
10 %
15 %
5 %
10 %
15 %
5 %
10 %
15 %
5 %
10 %
15 %
Af+ph: Afrechillo con residuos de pasta húmeda; Af+pp:Afrechillo con residuos de papas; Af+alm:
Afrechillo con almidón; Af+CMC: Afrechillo con carboximetilcelulosa; Af+cel: Afrechillo con celulosa.
5 %
10 %
15 %
Fermentación sólida
Af+ph Af+pp Af+alm Af+CMC Af+cel
5 %
10 %
15 %
5 %
10 %
15 %
Figura 3.12. Esquema resumen del diseño anidado.
5 %
10 %
15 %
5 %
10 %
15 %

El análisis estadístico permitió conocer, a través del análisis de la varianza
de los componentes y de un ANOVA cuál o cuáles de los factores en estudio (tipo
de fermentación, fuente de carbono suplementada y/o nivel de sustitución) presenta
la mayor influencia sobre las actividades enzimáticas en estudio. Asimismo, se
efectuó la prueba de medias de Fisher para mínimas diferencias significativas con
un nivel de confianza del 95 por ciento, para conocer cuál de los tratamientos es el
mejor o el que presentó la mayor actividad enzimática y cual proceso resulta más
ventajoso.
Por último, se efectuaron ANOVA y la prueba de medias de Tukey con un
nivel de confianza del 95 por ciento, a las actividades medidas en los aditivos
enzimáticos obtenidos y así conocer si hay diferencias significativas entre estos
productos.

4.1. Proceso de fermentación.
CAPITULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1.1. Fermentación sumergida (FS) en fiolas.
Al inicio del proceso, se observa como el hongo consume los azúcares
disponibles en el medio de fermentación a base de afrechillo de trigo (Figura 4.1.),
provocando la disminución del pH desde 5,33 a 3,42 a las 32 horas del proceso
como consecuencia de la producción de ácidos orgánicos, como lo señalan en sus
trabajos Pelaez et al. (2008) y El-Holi y Al-Delaimy (2003). A lo largo de la
fermentación, el hongo desarrolla su actividad degradativa sobre los componentes
del sustrato, liberando azúcares para ser utilizados como fuente de carbono y
energía. Esto coincide con el comportamiento de las curvas en la Figura 4.2., donde
se observa el incremento en la actividad de la glucoamilasa o amiloglucosidasa, a
las 24 horas de fermentación (224,03 UI/mL) liberando glucosa al medio y de la
carboximetilcelulasa a las 20 horas de fermentación (13,61 UI/mL) degradando la
celulosa a hexosas fermentables (Baldrian y Valaskova, 2008; Norouzian et al.,
2006; Thorsen et al., 2006; Lynd et al., 2002; Wang et al., 2001; Bedford y Partridge,
2001).
En la etapa posterior a las 32 horas de fermentación, el pH se incrementa
conforme disminuye el contenido de azúcares en el medio. Similar comportamiento

eportan Vásquez et al. (2008), Kim (2004) y Díaz (2001), quienes atribuyen la
disminución en la concentración de ácidos orgánicos en el medio a la actividad de
las proteasas quienes liberan grupos aminos provocando el aumento del pH.
Con respecto a la actividad enzimática de la glucoamilasa,
Domínguez (2008), reportó 28,99 UI/mL.de actividad para esta enzima en FS con A.
niger ANM-1 usando un medio de cultivo donde el principal sustrato de la
fermentación eran los desechos del pastificio. Mientras que Ikram-ul-Haq et al.
(2006), señalan haber cuantificado 52,2 UI/mL de actividad glucoamilásica usando
afrechillo de trigo. En ambos casos, los resultados obtenidos por estos autores
fueron menores a los logrados en esta investigación.

Figura 4.1. Comportamiento del pH y de los azúcares reductores durante la
fermentación sumergida en fiolas.
Por otra parte, los trabajos de investigación realizados por Villena y Gutiérrez
(2007) y Narasimha et al. (2006), para medir la actividad de las celulasas excretadas
por A. niger en procesos de FS empleando lactosa y celulosa como sustrato,
reportaron valores de 1,34 UI/mL y de 0,650 UI/mL, respectivamente. Es evidente
que la actividad de 13,61 UI/mL alcanzada en este trabajo resultó superior a lo
encontrado en la bibliografía consultada.
Asimismo, la actividad de la alfa-amilasa para el proceso de FS con afrechillo
de trigo (Figura 4.2.), es cuantificable a partir de las 32 horas de fermentación
(29,33 UA/mL) y alcanza la máxima actividad a las 56 horas (82,53 UA/mL) una vez
que ha disminuido el contenido de azúcares en el medio. Este comportamiento
se asemeja a lo señalado en los trabajos realizados por la OEA (2006), Lehninger
et al. (2002) y Moat et al. (2002), en los que se indica que la glucosa y otras fuentes
de carbono fácilmente metabolizables, pueden actuar como represores en la
síntesis de las amilasas.
La producción de amilasas extracelulares por A. niger ha sido ampliamente
estudiada, reportándose actividades de 21,20 U/mL usando desechos de pan
(Javed et al., 2001), 60,12 U/mL y 70,29 U/mL en aguas de empresas procesadoras
de carne y de cerveza, respectivamente (Salas et al., 2005) y 48,8 U/mL con 0,5 por

ciento de almidón como sustrato (Gupta et al., 2008). Empleando como base
comparativa estos estudios, la actividad amilásica de 82,53 UA/mL alcanzada en
este trabajo resultó mayor a lo encontrado en la literatura
Figura 4.2. Comportamiento de las actividades enzimáticas monitoreadas
durante la fermentación sumergida en fiolas.
Al estudiar las curvas de la Figura 4.2., las 64 horas de fermentación
representan el tiempo de fermentación adecuado para obtener la mejor combinación
en la actividad enzimática analizada con 49,05 UA/mL para las alfa-amilasas (casi
60 por ciento de incremento en la actividad); 33,68 UI/mL en glucoamilasa (15 por
ciento de incremento en la actividad enzimática) y carboximetilcelulasa con 30,05
UI/mL (la mayor actividad registrada durante el proceso). Por lo cual, este será el
tiempo de fermentación en sumergido, que se empleará para el estudio de los

procesos de fermentación de afrechillo de trigo con una fuente adicional de carbono,
una vez se haya estudiado la cinética enzimática para el A. niger en fermentación
sólida de afrechillo de trigo en fiolas.
4.1.2. Fermentación en estado sólido (FES) en fiolas.
En el estudio del proceso fermentativo del A. niger en la matriz sólida se
observa en la Figura 4.3., el comportamiento del pH y del contenido de azúcares en
el sustrato a base de afrechillo de trigo. Al inicio de este proceso el pH disminuye
de 5,69 (0 días) a 4,63 (4 días) como consecuencia de la degradación del medio y
la producción de ácidos orgánicos, coincidiendo con lo señalado por Prado et al.
(2005), para la FES usando A. niger en bagazo de yuca. Al final del proceso, el pH
aumenta hasta 7,05 alcanzando la neutralidad.

Figura 4.3. Comportamiento del pH y de los azúcares reductores durante la
fermentación en estado sólido en fiolas.
En cuanto a los azúcares contenidos en el medio, se observa el incremento
de los mismos durante los días 1 al 3 del proceso, este comportamiento es
indicativo de la conversión del sustrato a consecuencia de la acción de las enzimas
sobre el mismo, generando la producción de azúcares como la glucosa y la xilosa,
por ejemplo, los cuales fueron usados como fuente de carbono así como de energía
para el crecimiento del hongo (Baharuddin et al., 2009; Martínez et al., 2008).
En el caso de la FES llevada a cabo en fiolas, los valores de pH medidos
nunca llegaron a ser tan bajos (4,63 a los 4 días) como los encontrados para la
fermentación en estado líquido (3,39 a las 40 horas). Por otra parte, en la
fermentación en sumergido no se registraron valores de pH cercanos a la
neutralidad durante el lapso de tiempo estudiado, para este proceso se alcanzó un
pH máximo de 5,38 a las 56 horas de fermentación. Esto indica que en la FES hay
una menor producción de ácidos orgánicos en comparación con el proceso en
sumergido, como lo señala Romero (2001) en su investigación. Asimismo, se
observa que al final del proceso fermentativo el pH aumenta por efecto de la
disminución en el contenido de los azúcares, el consumo de los ácidos orgánicos y
probablemente, a la actividad del hongo sobre las proteínas liberando grupos
aminos en el medio (Berradre et al., 2009; Chen et al., 2007; Maciel, 2006; Kim,
2004; Díaz, 2001).

Las variaciones en el pH de este trabajo son similares a los publicados por
Romero (2001), para la fermentación sólida de sacarosa donde los valores de pH
se encontraron entre 2,6 y 4,5 en un proceso que tuvo 72 horas de duración. En
tanto que Maciel (2006), empleó una mezcla de bagazo de caña de azúcar y
afrecho de soya como sustrato en 10 días de fermentación sólida y en el cual, la
actividad del A. niger provocó que el pH oscilara entre 5 y 6,7.
Con respecto a la actividad enzimática, la enzima alfa-amilasa (Figura 4.4.)
se observan valores que van de 61,25 a 91,46 UA/mL. La actividad enzimática
encontrada para la alfa-amilasa es mayor a las 28 UI/mL que reportaron Moreira et
al. (2001), usando maltosa como sustrato en fermentación sólida.

Figura 4.4. Comportamiento de las actividades enzimáticas monitoreadas
durante la fermentación en estado sólido en fiolas.
En cuanto a la actividad de la glucoamilasa (Figura 4.4.), está evidenció una
actividad más regular que la observada en la FS. La glucoamilasa alcanzó
actividades entre 208,73 y 647,64 UI/mL a partir del segundo día de fermentación.
La actividad alcanzada en la fermentación sólida del afrechillo por el A. niger es muy
superior a los resultados logrados por Slivinski (2007) usando residuos del
procesamiento de batatas (11,87 UI/mL).
En la Figura 4.4., la curva para la actividad carboximetilcelulasa muestra
valores que van de 19,13 a 20,85 UI/ mL a partir del quinto día del estudio siendo la
enzima que requirió más tiempo para ser producida en forma continua por el hongo.
Sin embargo, la actividad de esta enzima supera las 0,95 UI/mL reportados por
Márquez et al. (2007) con A. niger en bagazo de caña
Al estudiar la Figura 4.4., en la que se muestran las curvas de actividad de
las tres enzimas en estudio se eligió 7 días de fermentación como el tiempo
adecuado para el proceso. Al séptimo día se reporta 90,46 UA/mL para las alfa-
amilasas (lo que representa un 99 por ciento de incremento en la actividad de esta
enzima), 524,50 UI/mL para las glucoamilasas (81 por ciento de incremento en
actividad glucoamilásica) y 19,13 UI/mL para las carboximetilcelulasas, 92 por ciento
de aumento en la actividad registrada para esta enzima durante todo el proceso.

Bajo estas condiciones se estudiará el efecto sobre la actividad enzimática al
adicionar una fuente extra de carbono al medio de cultivo.
4.1.3. Estudio comparativo de la actividad enzimática en el medio de cultivo
con afrechillo de trigo como único sustrato y en los medios de cultivos
suplementados con una fuente extra de carbono.
Los resultados obtenidos a partir del diseño anidado, permitieron comparar la
actividad de las enzimas obtenida en los medios de cultivo con suplementación a
diferentes niveles (5, 10 y 15 por ciento) y las actividades encontradas en el medio
con afrechillo de trigo como único sustrato. Con base en esta comparación, se
determinó en cuál de los medios estudiados se lograron los resultados más
adecuados, en cuanto a la generación de enzimas en los procesos de fermentación.
A continuación, se presentan los resultados de las pruebas estadísticas aplicadas a
este particular, para cada una de las enzimas en estudio
4.1.3.1. Alfa-amilasas
El análisis estadístico de los datos para el diseño anidado correspondiente a
las fermentaciones realizadas en fiola (FS y FES), para determinar con cual
tratamiento se logra la mayor actividad de enzimas alfa-amilasas, se efectuó a partir
de los resultados obtenidos en el estudio (Tabla 4.1.).

Tratamiento
Alfa-amilasa en
fermentación sumergida
(UA/mL)
Alfa-amilasa en
fermentación sólida
(UA/mL)
Tabla
4.1.
Resultados promedios de la actividad de la alfa-amilasa obtenidos en
los procesos fermentativos realizados en fiola.

Afrechillo 48,81 61,35
Af5%p 5,54 44,61
Af10%p -- --
Af15%p -- 20,74
Af5%pp 78,42 24,09
Af10%pp 60,10 --
Af15%pp 93,55 6,99
Af5%alm -- 27,80
Af10%alm -- 93,60
Af15%alm -- --
Af5%CMC 77,41 77,58
Af10%CMC 58,65 --
Af15%CMC 65,83 --
Af5%cel 61,51 17,25
Af10%cel 52,71 37,92
Af15%cel 52,05 --
Af %p: Afrechillo con % de pasta húmeda; Af %pp: Afrechillo con % de
residuos de papas; Af %alm: Afrechillo con % de almidón; Af %CMC: Afrechillo
con % de carboximetilcelulosa y Af %cel: Afrechillo con % de celulosa.

El análisis estadístico de los datos indican que en FS la actividad de la alfa-
amilasa está relacionada en 90,7 por ciento (Tabla 4.2.) y es afectada de manera
altamente significativa (P0,01; Tabla 4.3.).
Por el contrario, en el proceso de FES, el análisis de la varianza (Tabla 4.4.)
efectuado para la data recolectada en el proceso en sólido, señala que la actividad
de la alfa-amilasa no se ve afectada por la fuente de carbono empleada (4,59 por
ciento). Esto es corroborado por las pruebas de significancia entre grupos (Tabla
4.5.), en las que se señala que la actividad de esta enzima no es influenciada por
las fuentes de carbono empleadas como sustrato ni por los niveles de sustitución
usados en esta investigación (P>0,05).
Tabla 4.2. Análisis de la Varianza de los Componentes. Alfa-amilasa en
fermentación sumergida.
Fuente
TOTAL
(CORRECTED)
Suma de
cuadrados
Df Cuadrados
medios
Var.
Comp.
Porcentaje
(%)
17784,0 17 --- --- ---
Fuente de carbono 16477,4 5 3295,48 1062,2 90,70
ERROR 1306,63 12 108,886 108,886 9,30
Fuente
Entre los diferentes
sustratos
Suma de
cuadrados
16477,4
Df Cuadrados
medios
F P
5 3295,48 30,27 0,0000

Dentro de cada grupo
(nivel de sustitución)
Total (Corr.) 17784,0 17 --- --- ---
Tabla 4.3. ANOVA para las fuentes de carbono. Alfa-amilasa en
fermentación sumergida.
Tabla 4.4. Análisis de la Varianza de los Componentes. Alfa-amilasa en
fermentación sólida.
Fuente
1306,63
Suma de
cuadrados
12 108,886 --- ---
Df Cuadrados
medios
Var.
Comp.
Porcentaje
(%)
TOTAL (CORRECTED) 15767,6 17 --- --- ---
Fuente de carbono 5090,75 5 1018,15 42,8045 4,59
ERROR 10676,8 12 889,737 889,737 95,41
Tabla 4.5. ANOVA para las fuentes de carbono. Alfa-amilasa en fermentación
sólida.
Fuente
Entre los diferentes
sustratos
Dentro de cada grupo
(nivel de sustitución)
Suma de
cuadrados
Df
Cuadrados
medios
F P
5090,75 5 1018,15 1,14 0,3897
10676,8 12 889,737 --- ---
Total (Corr.) 15767,6 17 --- --- ---
El análisis de las medias, mostrado en las gráficas de caja (Figura 4.5.),
destaca que la actividad amilásica en FS para el medio de cultivo suplementado con
residuos de papas presentó una media de 77,3567 UA/mL, superior en un 97,6 por
ciento al medio suplementado con residuos de pasta (1,85 UA/mL) y 13 por ciento
mayor a la actividad medida en el medio suplementado con CMC (67,2967 UA/mL).
Además, se determinó que la media del tratamiento suplementado con residuos de
papas, difiere significativamente con respecto a los demás tratamientos, a excepción

del medio suplementado con CMC, de acuerdo con la prueba de rangos múltiples de
Fisher (Apéndice 1).
Figura 4.5. Diagrama de caja para la enzima alfa-amilasa en los tratamientos
(Fermentación sumergida).
En tanto que en la FES, puede observarse que aún cuando la más elevada
actividad de alfa-amilasa fue de 61,35 UA/mL con el afrechillo de trigo como
sustrato (Figura 4.6.), la prueba de rangos múltiples no registra diferencias
estadísticamente significativas entre los tratamientos en estudio cuando se efectuó
la FES (Apéndice 2).

Figura 4.6. Diagrama de caja para la enzima alfa-amilasa en los tratamientos
estudiados (Fermentación en estado sólido).
4.1.3.2. Glucoamilasas
De igual forma, se estudió estadísticamente la data correspondiente a la
actividad enzimática de las glucoamilasas obtenidas por medio de las
fermentaciones realizadas en fiola (Tabla 4.6.). Al respecto se determinó, que en el
proceso de FS la fuente de carbono empleada no ejerció influencia alguna sobre la
actividad de esta enzima (Tabla 4.7.); lo cual es confirmado mediante la prueba de

significancia entre los grupos (Tabla 4.8.), cuyo resultado muestra que la fuente de
carbono y el nivel de sustitución no son significantes (P>0,05).
Tabla 4.6. Resultados promedios de la actividad de la glucoamilasa
obtenidos en los procesos fermentativos realizados en fiola.

Tratamiento
Glucoamilasa en
fermentación sumergida
(UI/mL)
Glucoamilasa en
fermentación sólida
(UI/mL)
Afrechillo -- 252,8
Af5%p 2,42 252,1
Af10%p 19,46 336,36
Af15%p -- 191,65
Af5%pp 1,32 133,3
Af10%pp -- 100,61
Af15%pp 9,66 248,76
Af5%alm -- 201,75
Af10%alm 19,99 315,27
Af15%alm 2,11 271,82
Af5%CMC 23,81 253,28
Af10%CMC 6,11 261,72
Af15%CMC -- 123,11
Af5%cel -- 323,58
Af10%cel -- 282,68
Af15%cel 2,37 301,13
Af
%p:
Afrechillo con % de pasta húmeda; Af %pp: Afrechillo con % de residuos de
papas; Af %alm: Afrechillo con % de almidón; Af %CMC: Afrechillo con % de
carboximetilcelulosa y Af %cel: Afrechillo con % de celulosa.

Tabla 4.7. Análisis de la Varianza de los Componentes. Glucoamilasa en
fermentación sumergida.
Fuente
Suma de
cuadrados
Tabla 4.8. ANOVA para las fuentes de carbono. Glucoamilasa en fermentación
sumergida.
Para el proceso en sólido se determinó que la actividad de la enzima
glucoamilasa es influenciada sólo en un 24,82 por ciento por el sustrato bajo el cual
se lleva a cabo la fermentación, por lo que esta influencia no es significativa desde
el punto de vista estadístico (Tablas 4.9. y 4.10.).
Df Cuadrados
medios
Var.
Comp.
Porcentaje
(%)
TOTAL (CORRECTED) 1070,6 17 --- --- ---
Fuente de carbono 239,923 5 47,9845 0,0 0,00
ERROR 830,681 12 69,2234 69,2234 100,00
Fuente
Entre los diferentes
sustratos
Dentro de cada grupo
(nivel de sustitución)
Suma de
cuadrados
Df
Cuadrados
medios
F P
239,923 5 47,9845 0,69 0,6384
830,681 12 69,2234 --- ---
Total (Corr.) 1070,6 17 --- --- ---
Tabla 4.9. Análisis de la Varianza de los Componentes. Glucoamilasa
en fermentación sólida.
Fuente
Suma de
cuadrados
Df Cuadrados
medios
Var.
Comp.
Porcentaje
(%)
TOTAL (CORRECTED) 79235,0 17 --- --- ---
Fuente de carbono 35921,0 5 7184,2 1191,56 24,82
ERROR 43314,1 12 3609,51 3609,51 75,18

Tabla 4.10. ANOVA para las fuentes de carbono. Glucoamilasa en
fermentación sólida.
Fuente
Entre los diferentes
sustratos
Dentro de cada grupo
(nivel de sustitución)
Suma de
cuadrados
Df Cuadrados
medios
F P
35921,0 5 7184,2 1,99 0,1525
43314,1 12 3609,51 --- ---
Total (Corr.) 79235,0 17 --- --- ---
Como complemento, se observa en el análisis de las medias en los gráficos
de caja, que la máxima actividad de la enzima glucoamilasa en la FS, se presentó
cuando se suplementó el medio con CMC (9,97 UI/mL, Figura 4.7). Sin embargo, la
prueba de rangos múltiples de Fisher para mínimas diferencias significativas,
mostró que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los

Figura 4.7. Diagrama de caja para la enzima glucoamilasa en los tratamientos
estudiados (Fermentación sumergida).
tratamientos estudiados en sumergido (Apéndice 3). Mientras que en el proceso de
FES, la mayor actividad ocurrió cuando se suplementó el medio con celulosa
(302,46 UI/mL, Figura 4.8); diferenciándose significativamente, los tratamientos
suplementados con celulosa y con residuos de papas, en el proceso en sólido
(Apéndice 4).
Figura 4.8. Diagrama de caja para la enzima glucoamilasa en los tratamientos
estudiados (Fermentación en estado sólido).
4.1.3.3. Celulasas
A continuación, se reportan los datos correspondientes a la actividad
enzimática de las celulasas obtenidas a partir de las fermentaciones realizadas en

fiola en el medio con afrechillo de trigo como único sustrato y en los medios con una
fuente
extra de
carbono
(Tabla
4.11.).
Tratamiento
Celulasa en
fermentación sumergida
(UI/mL)
Celulasa en
fermentación sólida
(UI/mL)
Tabla 4.11. Resultados promedios de la actividad de la celulasa
obtenidos en los procesos fermentativos realizados en fiola.

Afrechillo 30,05 20,85
Af5%p 0,89 6,11
Af10%p -- --
Af15%p -- 7,92
Af5%pp 2,43 7,8
Af10%pp 0,02 8,52
Af15%pp 0,52 10,76
Af5%alm -- 21,09
Af10%alm 2,86 13,16
Af15%alm -- 13,88
Af5%CMC 5,00 1,1
Af10%CMC 1,72 3,84
Af15%CMC 11,88 5,24
Af5%cel -- 9,89
Af10%cel 3,29 7,46
Af15%cel 3,41 9,6
Af %p: Afrechillo con % de pasta húmeda; Af %pp: Afrechillo con % de
residuos de papas; Af %alm: Afrechillo con % de almidón; Af %CMC: Afrechillo
con % de carboximetilcelulosa y Af %cel: Afrechillo con % de celulosa.
Las pruebas estadísticas señalan, que para ambos procesos fermentativos,
la fuente de carbono es altamente significativa ya que influye en un 91,77 por ciento

sobre la actividad de esta enzima en el proceso en líquido (Tabla 4.12.) y en 84,68
por ciento en el proceso en estado sólido (Tabla 4.13.). Además, de acuerdo con la
prueba de significancia entre los grupos (Tablas 4.14. y 4.15.), la influencia de la
fuente de carbono en los procesos en líquido y en estado sólido es altamente
significante (P

cuadrados medios Comp. (%)
TOTAL (CORRECTED) 773,076 17 --- --- ---
Fuente de carbono 680,214 5 136,043 42,768 84,68
ERROR 92,8629 12 7,73858 7,73858 15,32
Tabla 4.15. ANOVA para las fuentes de carbono. Celulasa en fermentación
sólida.
Fuente
Entre los diferentes
sustratos
Dentro de cada grupo
(nivel de sustitución)
Suma de
cuadrados
Df
Cuadrados
medios
F P
680,214 5 136,043 17,58 0,0000
92,8629 12 7,73858 --- ---
Total (Corr.) 773,076 17 --- --- ---
De acuerdo con los análisis estadísticos realizados a las medias observados
en los gráficos de caja (Figuras 4.9 y 4.10), la mayor actividad para la celulasa se
logró cuando el medio de cultivo, fuese en sumergido o en estado sólido, contenía
únicamente afrechillo de trigo, alcanzando 30,05 UI/mL en la FS y 20,85 UI/mL en la
FES. Adicionalmente, se determinó que la actividad de la celulasa obtenida en el
proceso de FS cuando se usó afrechillo de trigo como único sustrato, se diferencia
estadísticamente del resto de los tratamientos según la prueba de rangos múltiples
de Fisher (Apéndice 5). Por otra parte, aún cuando el tratamiento a base de
afrechillo de trigo sin suplementación alcanzó la más alta actividad para la celulasa
en el proceso en sólido este presentó diferencias estadísticamente significativas

Figura 4.9. Diagrama de caja para la enzima celulasa en los tratamientos
estudiados (Fermentación sumergida).
Figura 4.10. Diagrama de caja para la enzima celulasa en los tratamientos
estudiados (Fermentación en estado sólido).

con el resto de los tratamientos, a excepción de aquel que fue suplementado con
almidón (Apéndice 6).
En síntesis, los análisis demostraron que durante las fermentaciones el nivel
de sustitución no fue estadísticamente significativo. En lo que se refiere a las
enzimas celulasas, éstas mostraron una mayor actividad cuando el medio de cultivo
contenía afrechillo de trigo como único sustrato; se determinó que las alfa-amilasas
presentaron la más alta actividad en FS cuando se suplementó el medio de
afrechillo de trigo con residuos de papas (77,36 UA/mL) y en FES, no se
encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos. Con
respecto a las enzimas glucoamilasas, no se observaron diferencias significativas
entre los tratamientos en la fermentación en sumergido; en tanto que en la
fermentación en sólido se obtuvo 302,463 UI/mL en el medio suplementado con
celulosa como la máxima actividad para esta enzima.
Seguidamente, para complementar el análisis estadístico del diseño anidado,
se estudiará la influencia del tipo de fermentación y de la fuente de carbono para
determinar cuál de estos factores presenta la mayor influencia en la actividad de las
enzimas en estudio.

4.1.4. Estudio del efecto del tipo de fermentación (FS/FES) y de la fuente de
carbono en el medio de cultivo en la actividad de las enzimas.
El análisis de los datos mediante las pruebas estadísticas aplicadas en el
diseño anidado demostró, que al comparar el efecto del tipo de fermentación y la
fuente de carbono empleada en el medio de cultivo, éste último es el factor que
determina en un 52,53 por ciento, la actividad de alfa-amilasas (Tabla 4.16.); sin
embargo, el efecto de este factor es no significativo (P>0,05, Tabla 4.17.).
Tabla 4.16. Análisis de la Varianza de los Componentes. Alfa-amilasa.
Número de casos completo: 36
Suma de
Fuente
cuadrados
Df Cuadrados
medios
Var.
Comp.
Porcentaje
(%)
TOTAL (CORRECTED) 34866,9 35 --- --- ---
Tipo de fermentación 1315,27 1 1315,27 0,0 0,00
Fuente de carbono 21568,2 10 2156,82 552,502 52,53
ERROR 11983,5 24 499,311 499,311 47,47
Tabla 4.17. Análisis de la Varianza para Alfa-amilasa. Suma de los cuadrados-
Tipo III.
Fuente
Suma de
cuadrados
Df Cuadrados
medios
F P
Tipo de fermentación 1315,27 1 1315,27 1,51 0,2296
Fuente de carbono 8230,27 5 1646,05 1,89 0,1277
RESIDUAL 25321,4 29 873,151 --- ---
TOTAL (CORRECTED) 34866,9 35 ---- --- ---

La Figura 4.11, muestra como la fermentación en estado líquido
aparentemente presenta la mejor actividad alfa-amilásica con una media de 40,39
UA/mL. No obstante, la actividad amilásica medida en el caldo obtenido en la
fermentación en sumergido, no se diferencia estadísticamente de forma significativa
de la actividad de alfa-amilasa obtenida por FES, de acuerdo con la prueba de
rangos múltiples (Apéndice 7).
Figura 4.11. Actividad de la enzima alfa-amilasa en los procesos fermentativos.
Con respecto a la actividad de la enzima glucoamilasa, el análisis de
varianza señala que el factor que afecta la respuesta en mayor proporción es el
método fermentativo, con 91,99 por ciento (Tabla 4.18), lo cual es confirmado
mediante las pruebas de significancia (Tabla 4.19), en las que se observa que sólo

el tipo de fermentación es altamente significante (P

4.20.). Esto se corrobora al estudiar la Tabla 4.21., en donde las pruebas
muestran que el tipo de sustrato empleado en el medio de cultivo durante el proceso
Figura 4.12. Actividad de la enzima glucoamilasa en los procesos
fermentativos.
es un factor altamente significativo (P

ERROR 233,316 24 9,7215 9,7215 10,09
Tabla 4.20. Análisis de la Varianza de los Componentes. Celulasa.
Tabla 4.21. Análisis de la Varianza para Celulasa. Suma de los cuadrados-
Tipo III.
Fuente
En la Figura 4.13, se observa que la mayor actividad enzimática fue de
10,4956 UI/mL para la celulasa y ocurrió en el proceso en estado sólido, resultando
en una diferencia significativa entre las operaciones de fermentación, a favor del
proceso en sólido (Apéndice 9).
Suma de
cuadrados
Df Cuadrados
medios
F P
Tipo de fermentación 123,729 1 123,729 4,58 0,0410
Fuente de carbono 2146,0 5 429,2 15,88 0,0000
RESIDUAL 784,02 29 27,0352 --- ---
TOTAL (CORRECTED) 3053,75 35 --- --- ---

Figura 4.13. Actividad de la enzima celulasa en los procesos fermentativos.
En consecuencia, el proceso en sólido favorece significativamente la
actividad enzimática de A. niger en la actividad enzimática de la glucoamilasa (lo
supera en 98 por ciento) y la celulasa (35 por ciento superior), en tanto, que no se
presentaron diferencias significativas, desde el punto de vista estadístico en la
actividad de la enzima alfa-amilasa. Estos resultados coinciden con lo señalado por
Alfonso (2005), con respecto a que la FES le resulta “natural” al hongo y además, de
acuerdo con Papagianni et al. (2001), con frecuencia ofrece mejores resultados si
se le compara con la FS.
En síntesis, el análisis estadístico señala que en los procesos llevados a
cabo en fiolas, el afrechillo de trigo sin suplementación resultó ser el mejor sustrato
para la obtención de celulasas (altamente significativo) y el proceso de FES
(significativo) generó las actividades más elevadas. Con respecto a las enzimas
alfa-amilasas, las mayores actividades se registraron cuando el sustrato contenía
residuos de papas en la FS (significativo) y en la FES, cuando el medio sólo
contenía afrechillo de trigo; sin embargo, no se presentaron diferencias
estadísticamente significativas entre las actividades generadas en los procesos
fermentativos en estudio. Finalmente, las actividades de las glucoamilasas
determinadas para los sustratos en estudio, no se diferenciaron estadísticamente
entre sí, debido a que la actividad de estas enzimas fue altamente influenciada por

el método de fermentación, siendo favorecido el proceso de FES (altamente
significativo). Por lo que se empleará el afrechillo de trigo como único sustrato en el
medio de cultivo en los procesos que se llevarán a cabo a mayor escala, en un
fermentador de siete litros para la FS y en un fermentador de bandejas para la FES.
4.1.5. Fermentaciones en sumergido (FS) y en estado sólido (FES) en
fermentadores batch.
Seguidamente, se llevó a cabo el proceso de fermentación a mayor escala
empleando un fermentador de siete litros para el proceso de FS y un fermentador de
bandejas con capacidad para 500 g, para el proceso de FES. En el proceso de FS
es posible controlar las condiciones de agitación, aireación y temperatura en el
proceso de FS, mientras que en el proceso de FES es controlable únicamente la
temperatura de incubación, debido a la naturaleza propia del proceso. Para ambas
metodologías se tiene afrechillo de trigo como sustrato a fermentar por el A. niger
ANM-1, debido a que se consideró que, en general, este sustrato resultó favorecido
en las determinaciones llevadas a cabo para las fermentaciones realizadas en fiola
con o sin suplementación.
4.1.5.1. Estudio de la cinética de la fermentación en sumergido (FS) en
bioreactor batch.

El proceso de fermentación en estado líquido en el bioreactor de siete litros,
se realizó siguiendo el esquema de la Figura 3.6. Este proceso en lote se llevó a
cabo con la finalidad de medir los cambios efectuados por el hongo sobre el sustrato
hasta las 72 horas del proceso (Ver Figura 4.14). Sin embargo, el acelerado
crecimiento del hongo incrementó considerablemente la viscosidad del medio de
cultivo, imposibilitando que el proceso se llevase a cabo durante 72 horas por lo que
se hizo necesario detener el proceso a las 30 horas de fermentación (Figura 4.15).
Figura 4.14. Proceso de fermentación sumergida del A. niger ANM-1 en
fermentador batch.

Figura 4.15. Desmontaje del fermentador batch y recolección del caldo
fermentado por A. niger ANM-1 (Fermentación sumergida).
Durante el monitoreo de los procesos se observó que a lo largo del proceso
de FS, el pH se mantuvo en un valor promedio de 4,7 durante las primeras 16
horas. El proceso comenzó con un pH de 4,82 hasta bajar a 3,76 al final del
proceso. Este descenso en los valores del pH, es indicador de la acción del hongo
sobre el sustrato produciendo ácidos que bajan el pH del medio (Figura 4.16).
Figura 4.16. Cinética de la fermentación sumergida. Variación del pH y
producción de azúcares durante el tiempo de fermentación en
fermentador batch.

La concentración de azúcares al inicio fue de 0,017 mg de azúcar/100 mL de
muestra, manteniéndose la baja concentración de azúcares las primeras horas del
proceso y alcanzar el mayor contenido de azúcar registrado en esta cinética (3,0385
mg de azúcar/100 mL de muestra), a las 26 horas de la fermentación. El
comportamiento de esta curva se relaciona con las curvas de las gráficas de la
Figura 4.17, cuando la actividad de glucoamilasa a las 20 horas (39,26 UI/mL) y
carboximetilcelulasas a las 26 horas (6,48 UI/mL) degradan el sustrato alcanzando
la mayor producción de azúcares.

Figura 4.17. Cinética de la fermentación sumergida. Actividades enzimáticas
monitoreadas durante el tiempo de fermentación en fermentador
batch.
De igual forma, se puede ver en la curva para la cinética de las alfa-
amilasas, que estas alcanzan su mayor actividad una vez que la concentración de
azúcares ha disminuido, es decir, a partir de las 27 horas del proceso con 15,93
UA/mL. A las 30 horas de fermentación la actividad de las alfa-amilasas era de
20,48 UA/mL y para las glucoamilasas y las carboximetilcelulasas, 110,88 UI/mL y
7,037 UI/mL, respectivamente
Seguidamente, el caldo de fermentación recolectado, se filtró y se
deshidrataron los sólidos retenidos por el medio filtrante. Este material deshidratado
fue molido en un molino de martillos para obtener así 70 gramos de una harina
fermentada o aditivo enzimático (Figura 4.18), presentando un rendimiento del 2,67
por ciento.

Figura 4.18. Aditivo enzimático (harina fermentada) obtenida en fermentación
sumergida.
4.1.5.2. Estudio de la cinética de la fermentación en estado sólido en bandejas.
La FES en bandejas (Figura 4.19), se llevó a cabo de acuerdo con la
metodología descrita en la Figura 3.7, durante los 7 días en los que se llevó a cabo
el proceso, se observó que el pH del medio presentó un valor promedio de 5,8. Se
determinó un pH de 5,6 al inicio de la fermentación, en el sustrato inoculado,
alcanzando 6,15 de pH al final de la incubación (Figura 4.20).
Figura 4.19. Fermentación en estado sólido en bandeja a partir de A. niger
ANM-1 empleando como sustrato afrechillo de trigo.

Figura 4.20. Cinética de la fermentación en estado sólido. Variación del pH y
producción de azúcares durante el tiempo de fermentación en
bandeja.
La concentración de azúcares al día cero (0) fue de 0,0135 mg de
azúcar/100 mL, registrándose el contenido de azúcar más alto (57,28 por ciento de
incremento) al tercer día de incubación, 0,0316 mg de azúcar/100 mL. Al momento
de detener el proceso de fermentación (séptimo día), se determinaron 0,0186 mg de
azúcar/100 mL.
Los azúcares contenidos en el medio de fermentación, producto de la acción
del hongo no provocaron la inhibición de la actividad de la enzima alfa-amilasa; esta
fue en progresivo aumento hasta alcanzar 85,41 UA/mL al cuarto día (Figura 4.21).
Posteriormente, la actividad enzimática de las alfa-amilasas disminuyó, siendo 58,86
UA/mL al séptimo día de la fermentación.
El comportamiento de la curva de la actividad de las glucoamilasas y de las
celulasas se corresponde con la del contenido de azúcares en el medio fermentativo

(Figura 4.21). Puede observarse como la actividad de las glucoamilasas provoca el
aumento en la cantidad de azúcar en el medio que pasa de 0,0135 mg de
azúcar/100 mL hasta 0,0316 mg de azúcar/100 mL, este incremento también se
debe a la acción de las alfa-amilasas sobre el almidón nativo, ofreciendo a las
glucoamilasas sustrato sobre el cual actuar (Illanes, 2008). Asimismo, es posible ver
como la producción de azúcares se mantiene en niveles de 0,0186 mg de
azúcar/100 mL de muestra durante los últimos días del proceso, a causa de la
evidente actividad de las celulasas y las glucoamilasas sobre el medio de cultivo.
Figura 4.21. Cinética de la fermentación en estado sólido. Actividades
enzimáticas monitoreadas durante el tiempo de fermentación en
bandeja.

De modo que, al séptimo día del proceso fermentativo en estado sólido, las
actividades enzimáticas para las alfa-amilasas, las glucoamilasas y las
carboximetilcelulasas, fueron de 58,86 UA/mL, 342,90 UI/mL y 34,42 UI/mL,
respectivamente.
Posteriormente, el sustrato fermentado fue sometido a deshidratación y
molienda para producir 437 gramos de una harina fermentada o aditivo enzimático,
presentando un rendimiento del 65,22 por ciento el proceso de FES (Figura 4.22).
Figura 4.22. Aditivo enzimático (harina fermentada) obtenido mediante un
proceso de fermentación en estado sólido.
En síntesis, los análisis han demostrado mayor actividad enzimática en el
sustrato degradado por fermentación en sólido como, a continuación, puede
observarse en la Figura 4.23, lo cual evidencia una ventaja de este método con

especto a la fermentación en líquido. Estos resultados coinciden con lo publicado
por Vintila et al. (2009), Giese et al. (2008), Nisha et al. (2008), Lerchundi (2006),
Figura 4.23. Actividades enzimáticas en el medio de cultivo fermentado por A.
niger en Fermentación sólida y en Fermentación sumergida.
Romero (2001) y lo obtenido en el estudio estadístico realizado en este trabajo para
ambos procesos fermentativos con y sin suplementación con una fuente extra de
carbono, en cuanto a que el cultivo en estado sólido ofrece mayor actividad en los
metabolitos de interés, por lo cual, es de esperar que la harina o aditivo enzimático
obtenido por este método fermentativo conserve estas características.
4.1.6. Análisis de los aditivos enzimáticos obtenidos por fermentación del
afrechillo de trigo usando A. niger.

Los aditivos enzimáticos producidos para este trabajo de investigación fueron
analizados bromatológicamente, obteniéndose los resultados registrados en la Tabla
4.22. Los análisis proximales, revelan que el contenido de humedad de ambos
productos fermentados (5,85 y 6,3 por ciento) es menor a la humedad del afrechillo
de trigo que se utilizó como sustrato (9,61 por ciento), esto como consecuencia del
proceso de secado al que fueron sometidos ambos productos fermentados, lo cual
contribuye a la conservación del producto y a alargar la vida útil del mismo. Por otra
parte, el contenido de proteína cruda en los aditivos enzimáticos, es muy superior al
del afrechillo de trigo (19,02 por ciento), siendo 97,1 por ciento superior en el caso
del producto obtenido por FES (37,49 por ciento) y 53,31 por ciento superior en el
aditivo producido por FS. Este incremento en el contenido de proteínas es causado,
tanto por el crecimiento del hongo en el medio de cultivo, ya que este moho contiene
Tabla 4.22. Análisis bromatológico de los aditivos enzimáticos obtenidos y
del afrechillo de trigo usado como sustrato en los procesos fermentativos
Componente (%)
(valores en base seca).
Aditivo enzimático
de la Fermentación
sumergida
Aditivo enzimático
de la
Fermentación
Sólida
Afrechillo
de trigo
Humedad 5,85 6,30 9,61
Proteína cruda 29,16 37,49 19,02
Extracto etéreo 6,81 1,47 3,28
Cenizas totales 3,15 11,98 5,53
Fibra cruda 21,15 17,90 10,57
FDN 60,45 41,76 37,69

FDA 24,48 18,96 10,71
Lignina 7,29 7,40 2,49
Celulosa 17,40 11,99 8,57
Hemicelulosa 35,97 22,71 26,98*
*: Por diferencia entre FDN y FDA
proteínas en su estructura (Pontón, 2008; Oshoma e Ikenebormeh, 2005); así como
por la actividad del hongo sobre el sustrato mediante la excreción de enzimas
(Baker, 2006). En la Figura 4.24, se puede observar un ejemplo del crecimiento del
hongo en placas de PDA hasta las 72 horas de incubación.
Figura 4.24. Crecimiento en placas de PDA del A. niger.
En cuanto al contenido de fibra, tanto los valores de FDN y FDA resultaron
menores en el aditivo obtenido por fermentación sólida (30,91 por ciento menor y
22,55 por ciento menor, respectivamente) que los determinados para el aditivo de la

FS. De igual forma, los valores para hemicelulosa y celulosa fueron menores en el
aditivo producido mediante fermentación en sólido (36,86 por ciento menor para la
hemicelulosa y 31,09 por ciento menor para la celulosa), que en el aditivo de la FS.
En cuanto a la concentración de lignina en los aditivos, esta no presentó mayor
diferencia entre los aditivos (7,40 por ciento en sólido y 7,29 por ciento en líquido).
No obstante, al comparar la composición en FDN, FDA y fracciones
determinadas en los aditivos se observa que estos componentes se encuentran en
mayor proporción en estos productos que en el afrechillo de trigo sin fermentar.
Estos resultados coinciden con lo reportado por Oseni y Ekperigin (2007), Alvárez
et al. (2006), Montañez et al. (2008) y Ruíz et al. (2009), quienes observaron un
mayor contenido de fibra en el sustrato fermentado o bajo tratamiento enzimático,
con respecto a la materia prima empleada en sus trabajos. La razón de este
incremento, de acuerdo con Schlegel y Zaborosch (1997), puede deberse a que en
la composición de hongos y bacterias existen polisacáridos análogos a la celulosa,
lo cual también podría haber influido en los valores de las fracciones de fibra
reportadas en este trabajo, tomando en cuenta el aporte de biomasa fúngica en los
medios fermentados.
En estudios realizados, se ha usado el contenido de quitina o de
glucosamina para hacer referencia a la biomasa de hongos. La quitina es un
polímero similar a la celulosa y es el segundo polisacárido en abundancia en la
naturaleza. Este polímero, forma parte de la pared celular de hongos filamentosos y

está conformada por unidades de N-acetil-glucosamina con enlaces b-1,4-
glicosídicos (Carrillo, 2003; Peter, 2002; Brum, 1988). La quitina presente se
determina a través de tratamientos con álcalis utilizando una metodología muy
similar a las empleadas para el análisis de las fibras. Es por ello que al emplear
estas técnicas en materiales fermentados por hongos filamentosos, es posible
obtener resultados que sobrevaloren los contenidos de las fracciones de fibra al
adicionar a estas, el contenido de quitina (Calvo y Castro, 1995).
Es importante destacar que los aditivos obtenidos en este trabajo presentan
valores similares a otros productos empleados como aditivos nutricionales en la
dieta de monogástricos. Por ejemplo, el prebiótico Fermacto® (Tabla 2.5.), presenta
en su composición 43,76 por ciento menos contenido de proteína (16,40 por ciento)
que el aditivo obtenido por FS (29,16 por ciento de proteína) y 56,26 por ciento
inferior al contenido de proteína en el aditivo obtenido por FES (37,49 por ciento de
proteína). Con respecto al contenido de humedad de los aditivos producidos en FS
y en estado sólido (5,85 y 6,30 por ciento, respectivamente), se considera que este
es similar al del Fermacto® (7 por ciento).
En cuanto al contenido de grasa y de cenizas, el producto comercial reporta
1,8 y 10,3 por ciento en estas fracciones (Tabla 2.5), respectivamente; estos valores
son similares al 1,47 por ciento de grasa y 11,98 por ciento en cenizas,
determinados para el aditivo obtenido por FES. Por otra parte, este prebiótico es
278,33 por ciento menor en contenido de grasa y presenta 69,42 por ciento más

contenido en minerales en comparación al aditivo obtenido mediante el proceso en
sumergido (6,81 por ciento de grasa y 3,15 por ciento de cenizas). La información
recolectada permite proponer el uso de los aditivos enzimáticos obtenidos a través
de la fermentación de afrechillo de trigo usando A. niger ANM-1 como suplemento
en la dieta de animales monogástricos.
4.1.7. Comparación de las actividades enzimáticas presentes en los aditivos
enzimáticos obtenidos por fermentación sumergida y en estado sólido
del afrechillo de trigo usando A. niger.
Con respecto las actividades enzimáticas (Tabla 4.23.), el producto obtenido por
fermentación en sólido presento mayor productividad en todas las actividades
Tabla 4.23. Actividades enzimáticas de los aditivos obtenidos.
Enzima
Aditivo enzimático
de la Fermentación
sumergida
Aditivo enzimático
de la Fermentación
Sólida
Alfa-amilasa (UA/g) 572,36* 1.431,90* 0,0317
Glucoamilasa
(UI/g)
1.421,6 ns 3.442 ns 0,0819
Celulasa (UI/g) 376,79 ns 535,62 ns 0,0720
Xilanasa (BXU/g) 1 135,90* 419,81* 0,0006
Fitasa (UI/g) 2
1.195* 5.764,8*
1: BXU son las unidades de Xilanasas correspondientes a 1 nmol de xilosa de xilano en 1 segundo bajo las
condiciones del análisis.
P
0,0000

2: UI/g son las unidades internacionales de Fitasas correspondientes a 1 mol de fósforo inorgánico liberado en
una hora
*: Indica diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos a un 95 % de confianza. Prueba de
comparación de medias de Tukey.
ns: Indica que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos a un 95 % de
confianza. Prueba de comparación de medias de Tukey.
enzimáticas medidas: alfa-amilasas (60 por ciento más alta, P

Figura 4.25. Actividad cualitativa de la enzima alfa-amilasa de los aditivos
enzimáticos A) Fermentación sumergida. B) Fermentación en estado
sólido
Figura 4.26. Actividad cualitativa de la enzima fitasa de los aditivos.
Debido a que estos aditivos enzimáticos podrían ser usados como
complementos en la alimentación animal, de manera de promover el mejor
aprovechamiento de las raciones, se determinó el contenido de ocratoxina A (OTA)
en los mismos reportándose 0,84 ppb para el aditivo obtenido en líquido y 2,9 ppb
de OTA para el obtenido por fermentación en sólido. Si se tiene presente que la
Organización Mundial de la Salud (OMS, 2001), propone como máximo, 5 ppb de
OTA en cereales y subproductos para la alimentación animal. Mientras que la Unión
Europea establece un rango que va entre 3 y 5 ppb de OTA (European Commission,
2002); se puede afirmar que los aditivos producidos en este trabajo son seguros y
no perjudicarían la salud animal y/o humana. Además, los aditivos enzimáticos son
adicionados a las dietas animales en muy bajas proporciones, por lo cual, el

contenido de OTA suministrado por los aditivos, sería muy reducido. Por ejemplo,
Domínguez (2008), suministró un aditivo enzimático a pollos de engorde
encontrando que 30 ppm mejora el aprovechamiento de las dietas y la conversión
del alimento, por lo que una dosis similar representaría 0,087 ppb de OTA en el
aditivo obtenido por FES y 0,025 ppb de OTA en el aditivo producido en FS.
Asimismo, Díaz (2010), suministró un aditivo enzimático a base de afrechillo
de trigo por FES con A. niger ANM-1 a cerdos en fase inicial de crecimiento. La
autora reporta que al adicionar 300 ppm del mismo, disminuyó la conversión
alimentaria de forma significativa mejorando el aprovechamiento de la dieta
suministrada a los animales. Con esta proporción de aditivo, el rango de la OTA
sería de 0,25 ppb para el producto obtenido por FES, muy por debajo del valor
mínimo permitido para esta micotoxina en cereales.
Ahora bien, con la información disponible se podría afirmar que el aditivo
enzimático obtenido por FES resulta más conveniente por su mayor actividad
enzimática y su reducido contenido de OTA. Sin embargo, se hace necesario
conocer al menos, los costos parciales que implica la fabricación de estos aditivos a
nivel de laboratorio, antes de elegir el proceso fermentativo que se considere
adecuado.
4.2. Cálculos parciales de los costos directos de manufactura.

En este proyecto se ha establecido la producción de la harina fermentada
empleando A. niger ANM-1 para alcanzar la degradación de los componentes del
afrechillo de trigo y de esta forma lograr un producto con alto valor agregado bien
sea, a través de un proceso de FS o FES.
Los productos a obtener (uno por cada proceso fermentativo) pueden ser
comercializados como aditivos enzimáticos, en particular para mejorar la
digestibilidad y el valor nutritivo de la dieta de animales monogástricos
(Angelovičová et al., 2007; Pourreza et al., 2007; Gómez-Villalva, 2005; Alam et al.,
2003; Cortés et al., 2002; Bedford, 1993).
La ingeniería de producción de los procesos fermentativos está basada en
los esquemas tecnológicos de las Figuras 3.6. (FS) y 3.7. (FES), los cuales
muestran las operaciones involucradas en la producción de las harinas fermentadas
o aditivos enzimáticos.
A continuación se elaboran los balances de materia y energía para cada
proceso fermentativo estudiado. La Figura 4.27 muestra de forma esquematizada
las etapas de los procesos fermentativos estudiados.

Figura 4.27. Esquema tecnológico de los procesos fermentativos empleados
para obtener un aditivo enzimático.
4.2.1. Balance de materiales del proceso para obtener el aditivo enzimático
empleando A. niger en fermentación sumergida.
1.- Operación: Fermentación sumergida o líquida
Medio de cultivo
3000 g
Precultivo 315 g
FERMENTADOR
Afrechillo de trigo 150 g
Caldo fermentado
3225 g
Muestras
240 g

Sistema:
Corrientes de entrada y salida: Medio de cultivo, Precultivo, Afrechillo de trigo,
3000 g Medio 315 g 150 g Afrechillo 3225 g Caldo 240g
de cultivo
Muestras, Caldo fermentado
Componentes: H2O, Sales minerales, Afrechillo de trigo, A. niger
Base: 150 g afrechillo de trigo
Ecuación Global:
Medio de
cultivo
Precultivo
2.- Operación: Filtración
Sistema:
Caldo fermentado
3225 g
Precultivo
detrigo
FILTRO
Afrechillo
de trigo
Torta fermentada 2625 g
Caldo
fermentado
fermentado
Caldo filtrado
600 g
Muestra s
Muestras

Corrientes de entrada y salida: Caldo fermentado, Caldo filtrado, Torta fermentada
Componentes: H2O, Sales minerales, Afrechillo de trigo, A. niger
Base: 150 g afrechillo de trigo
Ecuación Global:
3225 g
Caldo
fermentado
Caldo
fermentado
600 g
Caldo
filtrado
filtrado
3.- Operación: Secado (Secador de bandeja)
Sistema:
Torta
fermentada
Caldo
Material
deshidratado
Torta
fermentada
2625 g
Torta
fermentada
Corrientes de entrada y salida: Torta fermentada, Material deshidratado, Agua
removida
Componentes: H2O, Sales minerales, Afrechillo de trigo, A. niger
Base: 150 g afrechillo de trigo
Ecuación Global:
Torta fermentada
2625 g
SECADOR
Material deshidratado 70 g
Agua removida
2555 g
Agua
removida

2625 g
Torta
fermentada
70 g
Material
deshidratado
2555 g Agua
removida
Considerando la cantidad de material deshidratado obtenido, el rendimiento
al secar la torta fermentada es de 2,67 por ciento, es decir que de una torta
fermentada de 2625 g se obtienen 70 g del complejo enzimático. En consecuencia,
para obtener 1 Kg de este aditivo enzimático en un proceso de FS, se requiere de
aproximadamente 43 litros de medio de cultivo y 2,15 Kg de afrechillo de trigo,
además de 4,3 litros de precultivos para cuya preparación se necesitan: 4,3 litros de
medio de cultivo, 215 g de afrechillo de trigo, 9 cuñas de PDA con colonias viables
de A. niger y 52 tubos con 10 mL de agua destilada.
4.2.2. Requerimientos de energía para la obtención de un lote de caldo
fermentado por A. niger en fermentación sumergida.
Para calcular el requerimiento de electricidad del proceso, sólo se tomará en
cuenta el consumo de energía eléctrica de los equipos. De acuerdo con los equipos
seleccionados en el área de procesamiento se estima el uso de una (1) calefacción
con 1500 watts de capacidad , un (1) autoclave (220 watts), un (1) agitador de fiolas

con un consumo de 110 watts, un (1) baño de María (110 watts), un (1) fermentador
con capacidad para siete (7) litros para 220 watts, un (1) destilador con 13000 watts
y un (1) secador de bandeja de 112.000 y un (1) molino de martillo de 700 watts.
Tomando en consideración las horas de trabajo de cada equipo se estima el
siguiente consumo:
Calefacción 1500 W 30 horas Calefacción
45000 W h 45 Kw
Autoclave 220 W 5 horas Autoclave 1100 W h1,
1Kw
Agitador 110 W 24 horas Agitador 2640 W h 2,
64 Kw
Bañode maría 110 W 30 horas Bañode
maría 3300 W h3,
3 Kw
Fermentador 220 W 30 horas Fermentador
6600 W h 6,
6 Kw
Secador 28000 W 4 horas Secador 112000 W h112
Kw
Molino 700 W 0,
17 horas Molino 119 W h 0,
0119 Kw
En total, los equipos consumen 170,7 Kw-h. Se adicionarán 20 % por
consumo eléctrico de los equipos de laboratorio (34,14 Kw-h), quedando un total de
aproximadamente, 204,9 Kw-h. De acuerdo con las tarifas vigentes para la el
consumo de electricidad publicadas en la Gaceta 37.415 de fecha 03 de abril del
2002, el costo de 1 Kw-h es de Bs 64,57. Entonces:
Costo de energía eléctrica(
equipos)
Costo de energía eléctrica(
equipos)
204,
9Kw
13230,
3Bs
h
13,
25Bs
h
h
h
64,
57Bs/
Kw
h
h
h
h
h

Según lo calculado, se muestra en la Figura 4.28 el esquema tecnológico
empleado y los requerimientos en energía eléctrica del mismo.
Figura 4.28. Esquema del proceso de fermentación en estado líquido
incluyendo el consumo energético
4.2.3. Requerimientos de materiales para la obtención de un lote de caldo
fermentado por A. niger en fermentación sumergida.

El costo total en materiales en el que se incurre para el proceso en
fermentador batch, puede visualizarse en la Tabla 4.24. En esta operación se
requiere la obtención de los 3465 g de caldo fermentado por lo que se necesitan; 3
litros de medio de cultivo y 150 g de afrechillo de trigo, además de 300 mL de
precultivo para los que se necesitan 300 mL de medio de cultivo y 15 g de afrechillo
de trigo. Asimismo, se precisa una cuña con A. niger en crecimiento, es decir, que
se deben contabilizar los gramos de PDA utilizados en la elaboración de la cuña.
Tabla 4.24. Costos totales en materiales empleados en el proceso de
fermentación sumergida con A. niger.
Material
Cantidad total
usada (g)
Costo por gr
(Bs)
4.2.4. Balance de materiales del proceso para obtener el aditivo enzimático
empleando A. niger en fermentación en estado sólido.
Costo total
(Bs)
Afrechillo de trigo 165 0,0006 0,099
Agar papa dextrosa (PDA) 0,39 0,644 0,26
CaCO3 0,5 g/L 1,65 2,89 4,77
(NH4)2SO4 2 g/L 6,6 0,534 3,53
KPO4 2 g/L 6,6 0,275 1,82
MgSO4+7H2O 5 g/L 16,5 0,006 8,62
Extracto de levadura 2 g/L 6,6 0,9 5,94
IVA (12%) 3,01
TOTAL (Bs) 28,05

1.- Operación: Fermentación en estado sólido
Sistema:
Medio
de
de cultivo
Medio de cultivo
2000 g
Corrientes de entrada y salida: Medio de cultivo, Precultivo, Afrechillo de trigo,
cultivo
Muestras, Material fermentado, Humedad.
Componentes: H2O, Sales minerales, Afrechillo de trigo, A. niger
Base: 500 g afrechillo de trigo
Ecuación Global:
Precultivo
Precultivo
Afrechillo
de
trigo
detrigo
Material
fermentado
fermentado
Muestra s
Humedad
2000 g Medio 210 g 500 g Afr 437 g Material 20g
2253g
2.- Operación: Secado (Secador de bandeja)
Material
fermentado
437 g
Precultivo 210 g
FERMENTADOR
Humedad 2253 g
Afrechillo de trigo 500 g
SECADOR
Material deshidratado 285 g
Material fermentado 437 g
Muestras 20 g
Agua removida
152 g
Mue stras
Humedad

Sistema:
Corrientes de entrada y salida: Material fermentado, Material deshidratado, Agua
removida
Componentes: H2O, Sales minerales, Afrechillo de trigo, A. niger
Base: 500 g afrechillo de trigo
Ecuación Global:
437 g
Material
fermentado
Material
fermentada
285 g
Material
deshidratado
Material
deshidratado
Agua
removida
152 g Agua
removida
De acuerdo con la cantidad de material deshidratado obtenido, el
rendimiento al secar la torta fermentada es de 65,22 por ciento, es decir que de 437
g de material fermentado en sólido se obtienen 285 g de aditivo enzimático.
4.2.5. Requerimientos de energía para la obtención de un lote de sustrato
fermentado por A. niger en fermentación en estado sólido.

Para calcular el requerimiento de electricidad del proceso, se tomará en
cuenta únicamente, el consumo de energía eléctrica de los equipos. De acuerdo con
los equipos seleccionados en el área de procesamiento se estima el uso de una (1)
calefacción con 1500 watts de consumo en energía eléctrica, un (1) autoclave (220
watts), un (1) agitador de fiolas con un consumo de 110 watts, una (1) cámara de
fermentación de 2200 watts, un (1) destilador con 13000 watts y un (1) secador de
bandeja de 112.000 watts y un (1) molino de martillo de 700 watts.
consumo:
Considerando las horas de trabajo de cada equipo se estima el siguiente
Calefacción 1500 W 24 horas Calefacción
36000 W h 36 Kw
Autoclave 220 W 5 horas Autoclave 1100 W h1,
1Kw
Agitador 110 W 24 horas Agitador 2640 W h 2,
64 Kw
Secador 28000 W 2 horas Secador 56000 W h56
Kw
Molino 700 W 0,
17 horas Molino 119 W h 0,
0119 Kw
En total, los equipos consumen 95,75 Kw-h. Se adicionarán 20 % por
consumo eléctrico de los equipos de laboratorio (19,15 Kw-h), quedando un total de
115 kw-h, aproximadamente. De acuerdo con las tarifas vigentes para la el consumo
de electricidad publicadas en la Gaceta 37.415 de fecha 03 de abril del 2002, el
costo de 1 Kw-h es de Bs 64,57. Entonces:
Costo de energía eléctrica(
equipos)
Costo de energía eléctrica(
equipos)
115 Kw
h
7425,
75Bs
64,
57Bs/
Kw
7,
43Bs
h
h
h
h
h
h

Por consiguiente, el esquema tecnológico empleado para la fermentación en
estado sólido, presenta los requerimientos en energía eléctrica que se muestran en
la Figura 4.29.
Figura 4.29. Esquema del proceso de fermentación en estado sólido
incluyendo consumo energético
4.2.6. Requerimientos de materiales para la obtención de un lote de material
fermentado por A. niger en fermentación en estado sólido.

De acuerdo con el esquema tecnológico del proceso en sólido (Figura 4.29),
los costos por materiales necesarios para la obtención de 437 g de material
fermentado, incluyen: 2 litros de medio de cultivo y 500 g de afrechillo de trigo,
además de 2 precultivos para los que se necesitan 200 mL de medio de cultivo y 10
g de afrechillo de trigo. Asimismo, se precisa una cuña con A. niger en crecimiento,
es decir, que se deben contabilizar los gramos de PDA utilizados en la elaboración
de la cuña (Tabla 4.25.).
Tabla 4.25. Costos totales en materiales empleados en el proceso de
fermentación sólida con A. niger.
Material
Cantidad total
usada (g)
Costo (Bs/gr)
Costo total
(Bs)
Afrechillo de trigo 500 0,0006 0,3
Agar papa dextrosa (PDA) 0,39 0,644 0,26
CaCO3 0,5 g/L 1,1 2,89 3,28
(NH4)2SO4 2 g/L 4,4 0,534 2,35
KPO4 2 g/L 4,4 0,275 1,21
MgSO4+7H2O 5 g/L 11 0,006 5.75
Extracto de levadura 2 g/L 4,4 0,9 3,96
IVA (12%) 2,06
TOTAL (Bs) 19,17

4.2.7. Costos primarios preliminares para los procesos de fermentación en
sumergido y en estado sólido.
De acuerdo con Gómez y Núñez (2001), la estimación de la inversión total se
expresa de la siguiente manera:
INVERSIÓN TOTAL= CAPITAL FIJO + CAPITAL DE TRABAJO
El capital fijo son los bienes de producción activos, es decir, aquel formado por
aquellas cuentas que representan inversiones tangibles permanentes y destinadas a
la producción de bienes y servicios. Es decir, es aquel capital formado por el costo
de: equipos, tuberías, terreno, edificación, vehículos, entre otros. Mientras, el capital
de trabajo es una cantidad de dinero que en teoría en cualquier momento se puede
recuperar totalmente. El capital de trabajo incluye inventario de materia prima y el
capital requerido para cubrir los pagos de servicios, sueldos y salarios de los
trabajadores (efectivo de caja).
Para los fines de este trabajo se calcularon los costos primarios preliminares
en los cuales se incurren para cada proceso fermentativo, considerando el consumo
de energía eléctrica y los insumos utilizados. De acuerdo con la información
recolectada los costos primarios preliminares para obtener 70 g de harina
fermentada mediante FS serían:

Costos
Costos
.
Costos
Costos
Costos
Costos
primarios
primarios
primarios
primarios
primarios
primarios
Reactivos
28,
05
41,
3
Reactivos
19,
17
26,
6
Bs
Bs
13,
25
7,
43
Consumo eléctrico
Lo cual equivale a Bs 590 en materiales y consumo de energía eléctrica para
la obtención de 1 kg de harina fermentada por este proceso, con un rendimiento de
2,67 por ciento
Por el contrario, para el proceso de obtención de 285 g de un aditivo
enzimático mediante FES, los costos primarios calculados son:
Consumo eléctrico
Bs
Bs

Entonces, para obtener 1 kg de harina fermentada en sólido se requiere de
Bs. 93,33. Los cálculos preliminares efectuados, indican como el proceso de
fermentación en sólido ofrece mayores ventajas en cuanto a los menores costos en
los que se incurren para la obtención del producto fermentado, debido a que la
diferencia en costos entre ambos procesos es de casi 85 por ciento y en
rendimiento, de aproximadamente, 96 por ciento. Los resultados corroboran que una
de las ventajas de la FES es el ahorro de costo debido a que se necesitan menos
bioreactores y a la reducción del tiempo de proceso (Raimbault, M., 1998).
Asimismo, Tengerdy (1998), comparó la producción de celulasas en sistemas en
sumergido y en sólido. Mientras los costos de producción en la fermentación en
líquido fue de cerca de $20/kg, en la fermentación en sólido fue de sólo $ 0,2/kg. La
bibliografía consultada y las estimaciones efectuadas en este trabajo, demuestran
que el proceso en sólido es comparativamente, más eficiente y ventajoso que las
fermentaciones en sumergido, desde el punto de vista de los costos y de la
producción enzimática.
En síntesis, el proceso de FES resulta más provechoso con respecto a la
fermentación en estado líquido para la obtención de un aditivo enzimático usando
afrechillo de trigo como sustrato y A. niger ANM-1 como microorganismo
fermentador. Las ventajas ofrecidas por el proceso en sólido al compararlo con el
proceso de FS, desde el punto de vista de la actividad enzimática, rendimiento,
consumo de energía eléctrica y costos, puede observarse en la Tabla 4.26.

Tabla 4.26. Fermentación en estado sólido vs. Fermentación sumergida
Parámetro
Aditivo enzimático
Fermentación Sólida
Aditivo enzimático
Fermentación
sumergida
Alfa-amilasa (UA/g) 1.431,90 572,36
Glucoamilasa (UI/g) 3.442 1.421,6
Celulasa (UI/g) 535,62 376,79
Xilanasa (BXU/g) 419,81 135,90
Fitasa (UI/mL)
Rendimiento (%)
Energía eléctrica (Kw-h)
Costos primarios (Bs)*
*: para producir 1 kg de aditivo
5.764,8 1.195
65,22 2,67
115 204,9
93,33 590

V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. CONCLUSIONES
5.1.1. El estudio de la cinética de fermentación de A. niger ANM-1 cultivado en
estado sólido y líquido en fiolas permitió conocer el comportamiento en cuanto a la
actividad enzimática del hongo empleando afrechillo de trigo como sustrato.
5.1.2. Al evaluar el efecto sobre la actividad de las enzimas, al adicionar al medio de
cultivo diferentes fuentes suplementarias de carbono, se observó que en la
fermentación en estado líquido, las enzimas alfa-amilasas presentaron la mayor
actividad en el medio de afrechillo de trigo suplementado con residuos de papas y
en fermentación en estado sólido, cuando se empleó afrechillo de trigo sin
suplementación. Con respecto a la actividad de la glucoamilasa, se determinó una
mayor actividad de esta enzima cuando el medio líquido fue suplementado con
CMC; mientras que en la fermentación en estado sólido se encontró la más elevada
actividad glucoamilásica en el medio suplementado con celulosa. Finalmente, las
mayores actividades enzimáticas para celulasas en fermentación líquida y en
fermentación en estado sólido, ocurrieron cuando el medio de cultivo a base de
afrechillo de trigo, no fue suplementado.

5.1.3. Se estableció el proceso biotecnológico para la obtención del aditivo
enzimático a partir de las fermentaciones en estado sólido y líquido.
5.1.4. Al determinar la actividad enzimática y las características fisicoquímicas de
los productos obtenidos a través de los procesos de fermentación estudiados se
destaca una mayor concentración de proteínas en el aditivo obtenido por
fermentación en sólido, así como mayor actividad enzimática, al comparársele con
el aditivo producido por fermentación sumergida.
5.1.5. Los aditivos enzimáticos obtenidos por fermentación sumergida y en sólido,
reportan 0,84 ppb y 2,9 ppb de ocratoxina A, respectivamente. Por ello, puede
afirmarse que los aditivos obtenidos en este trabajo no representan riesgo alguno
para la salud.
5.1.6. El aditivo enzimático obtenido por fermentación en estado sólido usando
afrechillo de trigo como sustrato y A. niger ANM-1 como microorganismo
fermentador presentó mayores ventajas que el obtenido en fermentación en estado
líquido. No sólo presentó las más elevadas actividades enzimáticas, sino que
además, el proceso biotecnológico establecido para este aditivo requiere de sólo
115 kw-h de energía eléctrica y el rendimiento fue superior al proceso en líquido en
casi un 96 por ciento.

5.1.7. Al comparar los costos de producción primarios preliminares del aditivo
enzimático para cada proceso de fermentación, se observa que el proceso de
fermentación en sólido requiere de una menor inversión en materiales y tiene un
rendimiento 96 por ciento superior al proceso en líquido.

5.2. RECOMENDACIONES
1. Evaluar el efecto sobre los parámetros productivos en animales
monogástricos al adicionar el aditivo enzimático en la dieta.
2. Estudiar el efecto sobre la actividad enzimática al adicionar una fuente
“extra” de nitrógeno en un proceso de fermentación con A. niger cultivado en
estado sólido empleado afrechillo de trigo como sustrato.
3. Realizar un estudio que permita sustituir los reactivos o sales con grado para
análisis de laboratorio empleados en el medio de cultivo, por otras fuentes de
nitrógeno, fósforo, carbono y potasio más económicas, como la harina de
soya, fertilizantes y urea, sin afectar negativamente la actividad enzimática.

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APÉNDICES

Apéndice 1. Pruebas de Rango Múltiples para la alfa-amilasa en
fermentación sumergida de acuerdo al sustrato empleado.
Method: 95.0 percent LSD
Fuente de
carbono Count Mean Homogeneous Groups
4 3 0.0 X
2 3 1.85 X
1 3 48.8133 X
6 3 55.4267 X
5 3 67.2967 XX
3 3 77.3567 X
Contrast Diferencia +/- Limits
1 - 2 *46.9633 18.5636
1 - 3 *-28.5433 18.5636
1 - 4 *48.8133 18.5636
1 - 5 -18.4833 18.5636
1 - 6 -6.61333 18.5636
2 - 3 *-75.5067 18.5636
2 - 4 1.85 18.5636
2 - 5 *-65.4467 18.5636
2 - 6 *-53.5767 18.5636
3 - 4 *77.3567 18.5636
3 - 5 10.06 18.5636
3 - 6 *21.93 18.5636
4 - 5 *-67.2967 18.5636
4 - 6 *-55.4267 18.5636
5 - 6 11.87 18.5636
* denota una diferencia estadísticamente significativa.
1: afrechillo 3: afrechillo+res.de papas; 5: afrechillo+CMC;
2: afrechillo+res.de pasta húmeda; 4: afrechillo+almidón; 6: afrechillo +celulosa

Apéndice 2. Pruebas de Rango Múltiples para la alfa-amilasa en fermentación
en estado sólido de acuerdo al sustrato empleado.
Method: 95.0 percent LSD
Fuente de Count Mean Homogeneous
carbono Groups
3 3 10.36 X
6 3 18.39 X
2 3 21.7833 X
5 3 25.8633 X
4 3 40.4633 X
1 3 61.35 X
Contrast Diferencia +/- Limits
1 - 2 39.5667 53.0647
1 - 3 50.99 53.0647
1 - 4 20.8867 53.0647
1 - 5 35.4867 53.0647
1 - 6 42.96 53.0647
2 - 3 11.4233 53.0647
2 - 4 -18.68 53.0647
2 - 5 -4.08 53.0647
2 - 6 3.39333 53.0647
3 - 4 -30.1033 53.0647
3 - 5 -15.5033 53.0647
3 - 6 -8.03 53.0647
4 - 5 14.6 53.0647
4 - 6 22.0733 53.0647
5 - 6 7.47333 53.0647
* denotes a statistically significant difference.
1:afrechillo 3:afrechillo+res.de papas; 5: afrechillo+CMC;
2: afrechillo+res.de pasta húmeda; 4: afrechillo+almidón; 6: afrechillo + celulosa

Apéndice 3. Pruebas de Rango Múltiples para la glucoamilasa en fermentación
sumergida de acuerdo al sustrato empleado.
Method: 95.0 percent LSD
Fuente de
carbono Count Mean Homogeneous Groups
1 3 0.0 X
6 3 0.79 X
3 3 3.66 X
2 3 7.29333 X
4 3 7.36667 X
5 3 9.97333 X
Contrast Diferencia +/- Limits
1 - 2 -7.29333 14.8014
1 - 3 -3.66 14.8014
1 - 4 -7.36667 14.8014
1 - 5 -9.97333 14.8014
1 - 6 -0.79 14.8014
2 - 3 3.63333 14.8014
2 - 4 -0.0733333 14.8014
2 - 5 -2.68 14.8014
2 - 6 6.50333 14.8014
3 - 4 -3.70667 14.8014
3 - 5 -6.31333 14.8014
3 - 6 2.87 14.8014
4 - 5 -2.60667 14.8014
4 - 6 6.57667 14.8014
5 - 6 9.18333 14.8014
* denotes a statistically significant difference.
1: afrechillo 3: afrechillo+res.de papas; 5: afrechillo+CMC;
2: afrechillo+res.de pasta húmeda; 4: afrechillo+almidón; 6: afrechillo + celulosa

Apéndice 4. Pruebas de Rango Múltiples para la glucoamilasa en fermentación
en estado sólido de acuerdo al sustrato empleado.
Method: 95.0 percent LSD
Fuente de Count Mean Homogeneous
carbono Groups
3 3 160.89 X
5 3 212.703 XX
1 3 252.8 XX
2 3 260.037 XX
4 3 262.947 XX
6 3 302.463 X
Contrast Diferencia +/- Limits
1 - 2 -7.23667 106.881
1 - 3 91.91 106.881
1 - 4 -10.1467 106.881
1 - 5 40.0967 106.881
1 - 6 -49.6633 106.881
2 - 3 99.1467 106.881
2 - 4 -2.91 106.881
2 - 5 47.3333 106.881
2 - 6 -42.4267 106.881
3 - 4 -102.057 106.881
3 - 5 -51.8133 106.881
3 - 6 *-141.573 106.881
4 - 5 50.2433 106.881
4 - 6 -39.5167 106.881
5 - 6 -89.76 106.881
* denotes a statistically significant difference.
1:afrechillo 3:afrechillo+res.de papas; 5: afrechillo+CMC;
2: afrechillo+res.de pasta húmeda; 4: afrechillo+almidón; 6: afrechillo + celulosa

Apéndice 5. Pruebas de Rango Múltiples para la celulasa en fermentación
sumergida de acuerdo al sustrato empleado
Method: 95.0 percent LSD
trat1 Count Mean Homogeneous Groups
2 3 0.296667 X
4 3 0.953333 X
3 3 0.99 X
6 3 2.23333 X
5 3 6.2 X
1 3 30.0533 X
Contrast Difference +/- Limits
1 - 2 *29.7567 6.08626
1 - 3 *29.0633 6.08626
1 - 4 *29.1 6.08626
1 - 5 *23.8533 6.08626
1 - 6 *27.82 6.08626
2 - 3 -0.693333 6.08626
2 - 4 -0.656667 6.08626
2 - 5 -5.90333 6.08626
2 - 6 -1.93667 6.08626
3 - 4 0.0366667 6.08626
3 - 5 -5.21 6.08626
3 - 6 -1.24333 6.08626
4 - 5 -5.24667 6.08626
4 - 6 -1.28 6.08626
5 - 6 3.96667 6.08626
* denotes a statistically significant difference.
1: afrechillo 3: afrechillo+res.de papas; 5: afrechillo+CMC;
2: afrechillo+res.de pasta húmeda; 4: afrechillo+almidón; 6: afrechillo + celulosa

Apéndice 6. Pruebas de Rango Múltiples para la celulasa en fermentación en
estado sólido de acuerdo al sustrato empleado.
Method: 95.0 percent LSD
Fuente de Count Mean Homogeneous
carbono Groups
5 3 3.39333 X
2 3 4.67667 XX
6 3 8.98333 X
3 3 9.02667 X
4 3 16.0433 X
1 3 20.85 X
Contrast Diferencia +/- Limits
1 - 2 *16.1733 4.94887
1 - 3 *11.8233 4.94887
1 - 4 4.80667 4.94887
1 - 5 *17.4567 4.94887
1 - 6 *11.8667 4.94887
2 - 3 -4.35 4.94887
2 - 4 *-11.3667 4.94887
2 - 5 1.28333 4.94887
2 - 6 -4.30667 4.94887
3 - 4 *-7.01667 4.94887
3 - 5 *5.63333 4.94887
3 - 6 0.0433333 4.94887
4 - 5 *12.65 4.94887
4 - 6 *7.06 4.94887
5 - 6 *-5.59 4.94887
* denotes a statistically significant difference.
1: afrechillo 3: afrechillo+res.de papas; 5: afrechillo+CMC;
2: afrechillo+res.de pasta húmeda; 4: afrechillo+almidón; 6: afrechillo + celulosa

Apéndice 7. Pruebas de Rango Múltiples para la Alfa-amilasa de acuerdo con
el tipo de proceso fermentativo empleado
Method: 95.0 percent LSD
Tipo de Count LS Mean Homogeneous
Fermentación Groups
2 18 29.7017 X
1 18 41.7906 X
Contrast Diferencia +/- Limits
1 - 2 12.0889 20.145
Apéndice 8. Pruebas de Rango Múltiples para la Glucoamilasa de acuerdo con
el tipo de proceso fermentativo empleado
Method: 95.0 percent LSD
Tipo de Count LS Mean Homogeneous
fermentación Groups
1 18 4.84722 X
2 18 241.973 X
Contrast Diferencia +/- Limits
1 - 2 *-237.126 31.7728
Apéndice 9. Pruebas de Rango Múltiples para la Celulasa de acuerdo con el
tipo de proceso fermentativo empleado
Method: 95.0 percent LSD
Tipo de Count LS Mean Homogeneous
fermentación Groups
1 18 6.78778 X
2 18 10.4956 X
Contrast Diferencia +/- Limits
1 - 2 *-3.70778 3.54476
* denotes a statistically significant difference.
1: Fermentación sumergida 2: Fermentación en estado sólido