Manuscrit - laboratoire PROTEE - Université du Sud - Toulon - Var

IV.B Paramètres d’acquisition des MEEF
Les paramètres d’acquisition des MEEF ont été standardisés aux longueurs d’onde d’excitation et
d’émission, les résolutions spectrales, la vitesse de balayage, le temps de réponse, les largeurs de
fente des monochronateurs, la tension appliquée au tube PM afin de les appliquer sur l'ensemble des
échantillons. En effet, chaque changement de ces paramètres peut modifier les intensités et formes
des MEEF. C’est pour cela qu'il est important pour le traitement des données de fluorescence de bien
respecter cette contrainte. Ils doivent être identiques du début jusqu’à la fin des mesures de MEEF,
en particulier si l'on traite les mesures par le logiciel PARAFAC. Le choix de ces paramètres
d’acquisition (Tableau 4) se fait à l’issue de mesures préalables, et sont un compromis entre la
résolution des mesures et le temps d'analyse d'une MEEF.
Le spectrofluorimètre utilié est le modèle HITACHI F-4500, qui corrige automatiquement la
variation de l’intensité lumineuse en excitation.
Les intervalles spectraux d’excitation et d’émission ont été choisis de telle sorte qu’ils contiennent
les pics de fluorescence les plus représentatifs de MON (Coble, 1996). Autrement dit, la majorité de
pics représentant les MONF se situe dans ces intervalles. Après différentes mesures préalables, les
longueurs d’onde d’excitation sont définies dans l’intervalle allant de 200 à 500 nm (une suppression
des signaux aux basses longueurs d’onde est appliquée à cause des influences de bruits), et les
longueurs d’onde d’émission allant de 250 à 600 nm, par pas de 5 nm dans les deux cas.
Les MEEF sont construites en mesurant une série de spectres d’émission pour une longueur d’onde
d’excitation fixée qui varie par pas de 5 nm. La vitesse de balayage est fixée à 2400 nm.min -1 . Elle
est un compromis entre la vitesse de balayage et le rapport signal/bruit de l’appareil.
Le temps de réponse a été choisi et fixé à des fins de comparaison et d'analyse des données, l’option
automatique qui laisse l’appareil définir la valeur n’a pas été sélectionnée. Le temps d'intégration
choisi et le temps le plus grand n'entrainant pas de déformation de pic à la vitesse de 2400 nm.min -1 .
Il est donc fixé à 0.1 s pour toutes les MEEF mesurées au cours de ce travail.
La tension appliquée au photomultiplicateur est fixée à 700 V.
Les fentes d’excitation et d’émission influencent par définition la résolution finale en longueur
d'onde. Comme la résolution de sortie des MEEF qui seront traitée par PARAFAC est de 5 nm, il est
inutile de prendre de fente plus petite, cela diminuerait le signal pour une meilleure résolution qui
sera perdu par la suite, et il n'est inutile de prendre une résolution plus grande que 5 nm, car cela
reviendrait à traiter des données à une résolution meilleure que celle des conditions d'acquisition. En
conclusion, les fentes sont fixées à 5 nm pour l'excitation et l'émission.
Début de λEX: 200.0 nm
Fin de λEX: 500.0 nm
Intervalle de λEX: 5.0 nm
Début de λEM: 250.0 nm
Fin de λEM: 600.0 nm
Paramètres d’acquisition de MEEF
Vitesse: 2400 nm/min
Fente EX: 5.0 nm
Fente EM: 5.0 nm
Tube PM: 700 V
Temps d’intégration: 0.1 s
Intervalle de λEM: 5.0 nm
Tableau 4: Paramètres d’acquisition des mesures de MEEF
Les échantillons de MON sont placés dans une cuve en quartz miroitée avec deux faces adjacentes
recouvertes par une couche d’argent (Hellma, 101R-QS, Tableau 5). Contrairement au verre, le
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