ATTI DEL XV CONVEGNO NAZIONALE SIPI Società Italiana di ...

Abstract Comunicazioni
SAGGI DI PCR PER L’IDENTIFICAZIONE E LO SCREENING DI ISOLATI
ITTICI APPARTENENTI AL GENERE VIBRIO
Prearo M., Colussi S., Corvonato R., Serracca L., Giorgi I., Zuccon F., Acutis P.L.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Via Bologna,
148 – 10154 Torino.
Nell‟ambito del progetto di ricerca denominato: “Approccio polifasico nell‟identificazione
di isolati appartenenti al genere Vibrio in materiale ittico” è stata messa a punto una nuova
metodica di multiplex PCR che consente la contemporanea identificazione di V.
alginolyticus e V. parahaemolyticus con l‟uso di primer specifici appositamente disegnati
per il gene della collagenasi e per il gene tl (emolisina termolabile). La metodica descritta
ed altre tecniche di PCR precedentemente pubblicate sono state utilizzate per eseguire la
classificazione degli isolati presenti nella collezione del laboratorio di Ittiopatologia
dell‟Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Torino.
Per valutare l‟accuratezza della multiplex PCR sono stati utilizzati 14 ceppi certificati
DSMZ, 1 ceppo certificato ATCC appartenenti al genere Vibrio e al genere Aeromonas e
44 ceppi isolati da prodotti ittici. Lo screening è stato condotto su 106 isolati di campo:
all‟estrazione del DNA, eseguita mediante freeze-boiling, è seguita l‟applicazione della
multiplex PCR e della PCR per V. anguillarum basata sull‟amplificazione del gene rpoN
(fattore sigma). Le PCR sono state condotte in un volume di reazione pari a 50 μl,
mediante utilizzo di Platinum ® qPCR Supermix-UDG (Invitrogen) 25 μl, con aggiunta dei
rispettivi primer (300 nM) specifici.
V. parahaemolyticus è identificato da una banda caratteristica di 450 bp, mentre V.
alginolyticus da una banda di 737 bp. Campioni non appartenenti alle due specie in esame,
utilizzati come veri negativi, quali V. anguillarum e differenti specie del genere
Aeromonas, hanno invece mostrato assenza di banda. La sensibilità e la specificità, del
metodo, calcolate ad un livello di confidenza del 95%, sono risultate del 100%,
rispettivamente (86,3-100%) e (85,0-100%).
Lo screening ha fornito i seguenti risultati: il 100% dei campioni ritenuti V. anguillarum
dalle analisi biochimiche è risultato tale anche con il metodo molecolare, mentre per V.
alginolyticus e V. parahaemolyticus l‟identità di risultato tra metodi fenotipici e molecolari
è stata del 95% e del 66% rispettivamente. Sono state evidenziate quattro coinfezioni (due
V. parahaemolyticus/V. alginolyticus e due V. anguillarum/V. alginolyticus). La PCR è
stata inoltre determinante nell‟assegnazione della specie dei ceppi caratterizzati
fenotipicamente come Vibrio spp. La concordanza complessiva tra metodi biochimici e
molecolari è stata valutata tramite indice K, pari a 0,84 (i.c. 95% = 0,63-0,99), indice
ritenuto molto buono secondo la tabella di valutazione Altman.
La multiplex PCR si è rivelata di semplice e rapido utilizzo ed applicata a isolati ittici ha
inoltre consentito di rilevare alcuni casi di coinfezione, evidenziando ulteriormente
l‟inefficacia delle tecniche biochimiche che conducono invece all‟identificazione di un
unico patogeno.
Lo studio ha mostrato come i metodi molecolari presentino alcuni vantaggi rispetto
all‟utilizzo dei metodi biochimici tradizionali, messi a punto su isolati clinici e non sempre
efficaci nel riconoscimento di isolati ittici, così come scarsamente attendibili nel
riconoscimento di specie con un‟elevata similarità genetica come nel caso di V.
alginolyticus e V. parahaemolyticus (> del 99%).
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