Revista_Analytica Ed 97

artigo 1
Autores:
Margareth B. C. Gallo*1,
Diogo D. do Nascimento2,
Nelson M. Nunes2, José Luiz N. de Aguiar3,
Ana Lúcia P. Cerqueira2,
Juliana J. S. Medeiros2, Lucas G. I. Regis2,
Rafael C. Seiceira2, Janine Boniatti2
Métodos analíticos
Todos os métodos aqui reportados usaram a coluna cromatográfica especificada em equipamentos. Os
métodos de iniciação e limpeza da coluna foram executados à temperatura de 35ºC e comprimento de
onda de 315 nm.
O método preliminar: conforme Farmacopeia Americana (USP 39), solvente A: água; solvente C:
metanol; modo de eluição isocrático usando solventes A/C na proporção 80:20 por 30 minutos ao fluxo
de 1mL/min, temperatura da coluna de 30ºC, comprimento de onda 319 nm, volume injeção 30 µL
(solução 1mg/mL).
Método otimizado: solvente A: água, solvente B: acetato de amônio 10 mM pH 4, solvente C: metanol,
volume de injeção 10 µL (solução 1mg/mL), temperatura 35ºC, comprimento de onda 315 nm. Eluição
gradiente e fluxo conforme tabela 3.
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REVISTA ANALYTICA - OUT/NOV 18
Materiais e Métodos
Reagentes
MTZ do fabricante Aarti Drugs
(Mumbai, India), lote 1070486.
A mistura dos comprimidos,
lote 1603EX031, o placebo, lote
1603PL032, e comprimidos submetidos
ao estudo de estabilidade
de longo prazo (30º C, 75% UR),
lote 13080736, foram preparados
por Farmanguinhos (FIOCRUZ-RJ).
Metanol grau HPLC, acetato cúprico
e peróxido de hidrogênio 30%
(Merck, Alemanha); ácido clorídrico,
acetato de amônio, hidróxido
de sódio e hidróxido de amônio
(Sigma-Aldrich, EUA).
Equipamentos
Cromatógrafo líquido Elite Lachrom
VWR/Hitach/Merck conectado
ao dispositivo de diodo L-2450,
gerenciador de amostra L-2200 e
bomba L-2130. Coluna cromatográfica
ACE C8 150 x 4,6 mm, tamanho
de partícula 5µm, tamanho
de poro 100Å e 9% de carbono.
Câmara de fotoestabilidade Ethik
modelo 424/CF (SP, Brasil).
Reações de degradação
forçada
Os testes de estresse foram
realizados de acordo com a RDC
53/2015, a saber: hidrólises ácida
e alcalina, oxidação com peróxido
de hidrogênio, reação com íon
metálico de transição (cobre II), degradação
térmica seca e úmida e
fotodegradação. Procurou-se obter
degradação superior a 10% e inferior
à degradação completa, conforme
preconizado pela resolução.
Para cada reação foram preparados
um branco (diluente água/
metanol 9:1 e/ou acetato de amônio
10mM pH 4), um controle da
reação (reagente + diluente), um
material de referência (IFA, produto
ou placebo na concentração final
de 0,5 mg/mL de MTZ) e um material
degradado (IFA, produto ou
placebo na concentração final de
0,5 mg/mL de MTZ + diluente +
reagente). Todas as reações foram
realizadas à temperatura ambiente
e ao abrigo da luz (em balões volumétricos
âmbar acondicionados
dentro de um armário). Todas as
amostras foram previamente filtradas
em filtro de seringa de nylon
25mm x 0,45µm (Sigma) antes de
serem injetadas. Tanto o material
de referência quanto o degradado
foram injetados em duplicata e o
restante somente uma vez.
Na hidrólise ácida, usou-se HCl
na concentração final de 1M, durante
114 horas e, após o tempo
preconizado, a reação foi neutralizada
com NaOH 1M.
Na hidrólise alcalina, usou-se
NaOH na concentração final de 0,1
e 0,01M, durante 70 horas e a reação
foi neutralizada com HCl 0,1M.
Na reação com peróxido de hidrogênio,
usou-se H2O2 na concentração
final de 15% por 70h e, ao final,
a amostra não foi neutralizada.
Na fotodegradação, IFA, medicamento
e placebo foram expostos à
incidência de luz visível, 1,2 milhões
de lux/hora e energia integrada de
UV de 200 w h/m2 por 24 e 220h, à
temperatura de 25º C, em placas de
Petri lacradas com fita transparente
e em placas embrulhadas em papel
alumínio (controle de ausência de
luz) lado a lado no interior da câmara
de fotoestabilidade.
Na termodegradação a seco,
IFA, medicamento e placebo foram
acondicionados dentro de placas
de Petri lacradas com fita transparente
e embrulhadas em papel
alumínio no interior de uma estufa
com vácuo (1000 mbar = 1 kgf/
cm2) a 105ºC por 24 horas.
Na termodegradação úmida, as
amostras foram acondicionadas
em placas de Petri abertas, em
estufa previamente saturada com
vapor de água, a 105ºC por 24 horas.
O vidro da porta da estufa foi
coberto com papel alumínio para
evitar incidência de luz sobre as
amostras durante a exposição.
A reação com íon metálico de
transição foi realizada com acetato
cúprico na concentração final de 3
mM, o qual foi preparado em tampão
acetato de amônio pH 4 para
facilitar sua dissolução, por 114
horas. Ao final, a solução foi neutralizada
com EDTA 100 mM.
Preparo do produto em estudo
de estabilidade
Vinte comprimidos do produto
submetido ao estudo de estabilidade
a longo prazo (30º C, 75% UR) foram
triturados a pó fino em gral com pistilo.
Foi pesada, em duplicata, quantidade
de pó equivalente a 50 mg de
MTZ e transferida para balão volumétrico
âmbar de 100 ml (0,5 mg/
mL de MTZ). Foram adicionados 80
ml de H2O/metanol 9:1 e a mistura
foi sonicada por 10 minutos e, após,
completado o volume qsp.
Métodos analíticos
Todos os métodos aqui reportados
usaram a coluna cromatográfica
especificada em equipamentos.
Os métodos de iniciação e limpeza
da coluna foram executados à temperatura
de 35ºC e comprimento
de onda de 315 nm.
O método preliminar: conforme
Farmacopeia Americana (USP 39),
solvente A: água; solvente C: metanol;
modo de eluição isocrático
usando solventes A/C na proporção
80:20 por 30 minutos ao fluxo de
1mL/min, temperatura da coluna
de 30ºC, comprimento de onda
319 nm, volume injeção 30 µL (solução
1mg/mL).
Método otimizado: solvente A:
água, solvente B: acetato de amônio
10 mM pH 4, solvente C: metanol,
volume de injeção 10 µL (solução
1mg/mL), temperatura 35ºC, comprimento
de onda 315 nm. Eluição
gradiente e fluxo conforme tabela 3.
Tabela
Tabela
3. Métodos
3. Métodos
utilizados
utilizados
na análise
na
das
análise
amostras
das amostras
provenientes
provenientes
do estudo de
do
degradação
estudo de
forçada
degradação forçada
Método de iniciação da coluna
Solvente B
Solvente A
Solvente C Fluxo
Tempo (min)
(%Acetato de amônia
(%Água)
(%Metanol) (mL/min)
10 mM pH 4)
0 10 0 90
10 30 0 70
20 60 0 40
30 40 50 10
30,1 0 99,5 0,5
50 0 99,5 0,5
Método otimizado para análise das amostras
0-2 99,5 0 0,5 0,5
2,1-3 3 92 5 0,5
3,1 0 92 8 0,6
16 0 91 9 0,6
18-19 0 70 30 0,5
19,1-28 99,5 0 0,5 0,5
Método de limpeza da coluna
0-5 90 0 10
10 70 0 30
60 50 0 50
80 20 0 80
90 10 0 90
120 10 0 90
Análises de TG, DSC e estéreo microscopia
Análises de TG, DSC e estéreo dos experimentos.
(cAD) foi comparada à razão entre
Os ensaios de TG foram realizados em um analisador termogravimétrico Mettler Toledo modelo 851E,
microscopia
Todas as amostras foram analisadas
em duplicata.
degradada (AND) e sua concentra-
a média das áreas da amostra não
sob atmosfera dinâmica de nitrogênio com vazão de 50mL/min e razão de aquecimento de 10°C/min, no
Os ensaios de TG foram realizados
em um analisador termogra-
As imagens foram obtidas em ção (cAND), de acordo com a se-
intervalo de temperatura de 25 a 300°C. As amostras foram cuidadosamente pesadas, sendo a faixa de
massa de 9,5 a 10,5mg, em cadinhos de alumínio de 100uL.
vimétrico Mettler Toledo modelo um estéreo microscópio Olympus guinte equação:
Os ensaios de DSC foram realizados em um calorímetro exploratório diferencial Mettler Toledo modelo
851E, sob atmosfera dinâmica de modelo SZX9 acoplado a uma câmera
Olympus modelo OLY 220. cAD)/(AND/cAND)] * 100
% degradação = 100 – [(AD/
822E, sob atmosfera dinâmica de nitrogênio com vazão de 80mL/min e razão de aquecimento de
nitrogênio com vazão de 50mL/min
10°C/min, no intervalo de temperatura de 25 a 200°C.
e razão de aquecimento de 10°C/ Pequena quantidade das amostras
A faixa de massa das amostras foi de 3 a 3,5 mg, em cadinhos de alumínio de 40uL que foram
min, no intervalo de temperatura foram gentilmente depositadas em Resultados e Discussão
posteriormente lacrados com tampas de alumínio e perfuradas no momento dos experimentos.
de 25 a 300°C. As amostras foram suporte específico do equipamento. Degradação forçada
Todas as amostras foram analisadas em duplicata.
cuidadosamente pesadas, sendo a Em seguida, o foco a magnificação Um método indicativo de estabilidade
(MIE) desenvolvido tanto
As imagens foram obtidas em um estéreo microscópio Olympus modelo SZX9 acoplado a uma câmera
faixa de massa de 9,5 a 10,5mg, (6,3) e a objetiva (1x) foram ajustados
para captura das imagens. para o IFA quanto para o PRO é
Olympus modelo OLY 220. Pequena quantidade das amostras foram gentilmente depositadas em suporte
em cadinhos de alumínio de 100uL.
específico do equipamento. Em seguida, o foco a magnificação (6,3) e a objetiva (1x) foram ajustados
Os ensaios de DSC foram realizados
em um calorímetro exploratório Cálculos
tificar todos os produtos de degra-
aquele capaz de detectar e quan-
para a captura das imagens.
diferencial Mettler Toledo modelo Para o cálculo da área percentual
relativa de cada pico detecta-
durante o período de validade dos
dação (PDegs) que podem ocorrer
Cálculos
822E, sob atmosfera dinâmica de
Para o cálculo da área percentual relativa de cada pico detectado, foi realizada a média das áreas
nitrogênio com vazão de 80mL/min do, foi realizada a média das áreas mesmos. No entanto, amostras
percentuais obtidas nas injeções em duplicata, cujo DPR foi igual ou menor que 2%.
e razão de aquecimento de 10°C/ percentuais obtidas nas injeções do IFA ou do medicamento, ao final
do estudo de estabilidade de
Para o cálculo do percentual de degradação obtido, a razão entre a média das áreas obtidas nas injeções
min, no intervalo de temperatura de em duplicata, cujo DPR foi igual ou
em duplicata da amostra degradada (AD) e sua concentração (cAD) foi comparada à razão entre a média
25 a 200°C.
menor que 2%.
longa duração (30º C, 75% UR,
das áreas da amostra não degradada (AND) e sua concentração (cAND), de acordo com a seguinte
A faixa de massa das amostras Para o cálculo do percentual de 24 meses), podem ou não apresentar
alteração de teor aceitável
equação:
foi de 3 a 3,5 mg, em cadinhos de degradação obtido, a razão entre a
% degradação = 100 – [(AD/cAD)/(AND/cAND)] * 100
alumínio de 40uL que foram posteriormente
lacrados com tampas de ções em duplicata da amostra de-
detectados PDegs, o que poderia
média das áreas obtidas nas inje-
sem que necessariamente sejam
RESULTADOS E DISCUSSÃO
alumínio e perfuradas no momento gradada (AD) e sua concentração acarretar numa interpretação er
Degradação forçada
Um método indicativo de estabilidade (MIE) desenvolvido tanto para o IFA quanto para o PRO é aquele
capaz de detectar e quantificar todos os produtos de degradação (PDegs) que podem ocorrer durante o
período de validade dos mesmos. No entanto, amostras do IFA ou do medicamento, ao final do estudo de
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