BULETINUL ИЗВЕСТИЯ JOURNAL

More documents

Recommendations

Info

Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii. Nr. 3(318) 2012 Genetica, Biologia moleculară şi Ameliorarea offi cinalis L. - Allium cepa L. - Magnolia sp. - Buxus sempervirens L. - Anethum graveolens L. Depus la redacţie: 22 octombrie 2012 --------------------------------------------------------------------------------------------------------- Adresa pentru corespondenţă: Paşa Lilia, Institutul de Genetică şi Fiziologie a Plantelor al AŞM, laboratorul Genetică moleculară, str. Pădurii 20, MD – 2002 Chişinău, Republica Moldova, tel. (+37322)660434, e-mail: lilia-pasa@mail.ru Introducere Elementele transpozabile (ET) reprezintă elemente genetice, care se pot deplasa dintr-un site al unui cromozom, în un alt site al aceluiaşi cromozom sau al unuia diferit şi, prin urmare, sînt capabile să modifi ce constituţia genetică a organismului [1]. În funcţie de mecanismul transpoziţiei, ET se clasifi că în două clase. Din clasa I fac parte elementele transpozabile ARN numite şi retrotranspozoni sau retroelemente, care prezintă un mecanism de transpoziţie „copie-inserează” mediat de ARN [2]. Elementele clasei II, sau transpozonii, utilizează un intermediar ADN, transpoziţia lor asigurîndu-se printr-un proces de tipul „taie-inserează”. Transpozonii constituie clasa majoritară de ET identifi cate în genomul plantelor, dar majoritatea transpozonilor sînt transcripţional inactivi şi imobili [3, 4]. Fiind prezentate în genom într-un număr diferit de copii şi avînd o localizare aleatorie, ET prezintă interes practic prin perspectiva utilizării lor în studiul polimorfi smului molecular al speciilor. Astfel au fost propuse procedee în baza tehnicii PCR (polymerase chain reaction – reacţia polimerazei în lanţ) cu utilizarea primerilor ET, atît a retrotranspozonilor, cum ar fi IRAP ( Inter Retrotransposon Amplifi ed Polymorphism), REMAP ( Retrotransposon Microsatellite Amplifi ed Polymorphism), RBIP ( Retrotransposon-Based Insertion Polymorphisms), S-SAP ( Sequence-Specifi c Amplifi cation Polymorphism) [5, 6], cît şi a transpozonilor, de exemplu, polimorfi smul speciilor şi hibrizilor interspecifi ci ai g. Helianthus utilizînd primerii ET MuDR [7]. Scopul prezentei lucrări a fost evaluarea primerilor omologi ET din clasa a II-a – Activator (Ac) în calitate de marcheri în evidenţierea polimorfi smului molecular al unor specii de plante angiosperme distanţate fi logenetic. Materiale şi metode Obiectul de cercetare l-au constituit genomurile speciilor de angiosperme – Asparagus offi cinalis L. (sparanghel), Allium cepa L. (ceapă), Magnolia sp. (magnolia), Buxus sempervirens L. (cimişir), Anethum graveolens L. (mărar), în genomul cărora au fost identifi cate secvenţe nucleotidice omoloage ET Ac [8]. ADN-ul genomic a fost izolat utilizînd metoda “CTAB (cetiltrimetilamonium bromide) - cloroform” modifi cată (Shaghai-Maroof) [9]. Au fost testaţi opt primeri, creaţi în Laboratorul Genetică moleculară al IGFP al AŞM, în baza secvenţei nucleotidice complete a Ac (4565 p. b.) din genomul de Zea mays L., prezentate în baza de date GeneBank [10]. Primerii E16, D3, E17, E18 sînt de la extremitatea 5’ a Ac, E19, E20, E21, E22 – de la extremitatea 3’ a Ac, E16, E19 şi E20 au orientarea 5’ → 3’, iar D3, E17, E18, E21, E22 – 3’ → 5’ (fi gura 1). Modelul structurii Ac (4565 p. b.) al Zea mays L., a fost executat cu utilizarea softului Vector NTI Delux40, în baza secvenţei nucleotidice complete a Ac şi descrierii acestea [11]. 113
Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii. Nr. 3(318) 2012 Genetica, Biologia moleculară şi Ameliorarea Figura 1. Modelul structurii transpozonului Activator (4565 p. b.) al Zea mays cu indicarea poziţiei primerilor utilizaţi în studiu. TIR (terminal inverted repeats) – repetiţii terminale inversate, ORFa (open reading frame) – cadru deschis citirii A fost utilizată tehnica “single primer PCR” (reacţia polimerazei în lanţ cu un singur primer), care s-a desfăşurat în 8 cicluri: denaturarea 95 0 C – 1 min., alinierea 40 0 C – 2 min., extensia 72 0 C – 1 min., urmate de 35 cicluri: denaturarea 95 0 C– 0,5 min., alinierea 65 0 C – 1 min., extensia 72 0 C – 1 min.. Amestecul reactiv pentru PCR a inclus 5 pM primer, 5-10 ng ADN, soluţie tampon: 66 mM tris-HCl (pH-8,4), 16 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 2,5 mM MgCl 2 , 0,1% Tween 20, 7 % glicerol, 100 μg · ml -1 BSA (Bovin Serum Albumin), cîte 0,2 mM de fi ecare dNTP, 1,25 U Taq DNA polymeraza (Fermantas). Amplimerii au fost separaţi prin electroforeză (5-8 V/cm) în gelul de agaroză de 2%, cu bromură de etidiu, în soluţia tampon de migrare tris-borat-EDTA (pH 8,3), vizualizate prin diafonoscopie în unde UV scurte (302 nm) şi fotografi ate (DigimaxS600/ KenoxSamsung). Pentru calcularea dimensiunilor amplimerilor, s-a utilizat marcherul de referinţă “100 bp Ladder DNA marker” ( Axygen biosciences), softurile Paint Shop Pro 7 şi Microsoft Offi ce Excel 2003 (curba exponenţială y = a*e^bx). Rezultate şi discuţii Spectrele polimorfe de ADN ale genomurilor studiate, obţinute în rezultatul “single primer PCR” sînt prezentate în fi gura2 şi tabelul 1. Numărul fragmentelor polinucleotidice amplifi cate, de fi ecare primer, pentru diferite genomuri nu diferă semnifi cativ. Astfel primerul E16 a asigurat amplifi carea a 3-4 amplimeri specifi ci pentru fi ecare din genomurile analizate, D3: 2 - 5 şi 7 - 8 fragmente, E17: 4 - 5 fragmente (excepţie Allium cepa L.), E18: 4 - 7 fragmente, E19: 6 - 8 fragmente, E20: 5 - 8 fragmente, E21: 6 - 9 fragmente, E22: 7 - 11 fragmente. Se observă că, primerul E22 a determinat amplifi carea unui număr mai mare de fragmente pentru toate genomurile analizate. Fragmentele sintetizate de acelaşi primer pe ADN-ul genomic al diferitor specii diferă după mărime, ponderea fragmentelor de dimensiuni identice fi ind neglijabilă în raport cu numărul total de fragmente polimorfe. De exemplu, primerul E20 determină sinteza a 32 fragmente polimorfe şi doar a două fragmente identice, ca mărime (847 p. b.), pentru Magnolia sp. şi Anethum graveolens L.. Sînt sau nu, aceste fragmente, identice în ceea ce priveşte succesiunea nucleotidelor, rămîne de a fi stabilit prin cercetări de secvenţiere. 114
Page 1 and 2:
Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii
Page 3 and 4:
Page 5 and 6:
Page 7 and 8:
Page 9 and 10:
Page 11 and 12:
Page 13 and 14:
Page 15 and 16:
Page 17 and 18:
Page 19 and 20:
Page 21 and 22:
Page 23 and 24:
Page 25 and 26:
Page 27 and 28:
Page 29 and 30:
Page 31 and 32:
Page 33 and 34:
Page 35 and 36:
Page 37 and 38:
Page 39 and 40:
Page 41 and 42:
Page 43 and 44:
Page 45 and 46:
Page 47 and 48:
Page 49 and 50:
Page 51 and 52:
Page 53 and 54:
Page 55 and 56:
Page 57 and 58:
Page 59 and 60:
Page 61 and 62:
Page 63 and 64:
Page 65 and 66:
Page 67 and 68:
Page 69 and 70:
Page 71 and 72:
Page 73 and 74:
Page 75 and 76:
Page 77 and 78: Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii
Page 127: Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii
Page 179 and 180:
Page 181 and 182:
Page 183 and 184:
Page 185 and 186:
Page 187 and 188:
Page 189 and 190:
Page 191 and 192:
Page 193 and 194:
Page 195 and 196:
Page 197 and 198:
Page 199 and 200:
Page 201 and 202:
Page 203 and 204:
Page 205 and 206:
Page 207 and 208:
Page 209 and 210:
Page 211 and 212:
Page 213 and 214:
Page 215:
show all

BULETINUL ИЗВЕСТИЯ JOURNAL

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?