Online Publikation - im ZESS - Universität Siegen

EXPERIMENTELLE GRUNDLAGEN 19
a)
Zellprobe aus
Experiment
b)
Abschütten des
Überstands
Zentrifugation
bei -20 o C
Zellaufschluss mit
Perchlorsäure
c)
Ultrazentrifugation
Überstand
Abgetrennte Enzyme
und Zelltrümmer
d)
Metabolite ohne
Enzyme
Abbildung 2.6: Um die Metabolitkonzentrationen der Zellen messen zu können, müssen
zunächst die Zellen aufgeschlossen und ihre Bestandteile aufbereitet wer-
den.
Abbildung 2.7: Messergebnisse für zwei ausgewählte Metabolite aus einem Stimulus-
2.4. Zellaufschluss und Analytik
Response-Experiment. Die horizontalen Linien zeigen die Grenze der
Messgenauigkeit an, die vertikalen den Zeitpunkt des Substrat-Pulses.
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Vorbereitung und Aufbau des Experiments sind zeitintensive Prozeduren die aber
noch von den analytischen Methoden zur Metabolit-Quantifizierung und der dafür
nötigen Aufbereitung der Zellproben übertroffen werden. Jede der 160 Proben aus dem
Experiment muss aufbereitet, die Zellen aufgeschlossen und die Metabolite quantifi-
ziert werden. Die Dauer eines Experiments und Analyse beträgt derzeit ca. 2-3 Monate.
Nach dem Experiment werden die Zellproben im Gefrierschrank zwischen gela-
gert bis die Quantifizierung der intrazellulären Metabolite vorgenommen wird. Um
die Metabolitkonzentrationen der Zellen messen zu können, müssen sie aufgeschlos-
sen und ihre Bestandteile aufbereitet werden. Zunächst werden die Zellen von der
Methanol-Lösung durch fünfminütige Zentrifugation bei -20 o C und 10000 g ge-