Untersuchungen zur Bedeutung mesenchymaler Stammzellen in ...

2.1.14.5 L929-Kulturmedium
RPMI1640 PAA, Cölbe
5% NKS Gibco BRL, Schottland
40000 Einheiten Penicillin PAA, Cölbe
40 mg Streptomycin PAA, Cölbe
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Material und Methoden
2.1.15 Zytokine / Wachstumsfaktoren
bFGF Strathmann Biotec, Hamburg
EGF Sigma, Steinheim
HGF Sigma, Steinheim
IL-1ß Roche, Mannheim
Plasminogen american diagnostica, Greenwich, USA
TGF-ß CellSystems, St. Katharinen
2.2 Methoden
2.2.1 Molekularbiologische Methoden
2.2.1.1 RT-PCR
Die Polymerasekettenreaktion dient der Amplifizierung eines spezifischen
Genabschnitts. Soll es sich um den Nachweis auf RNA-Ebene handeln, wird die
isolierte RNA zunächst mittels einer reversen Transkriptase in DNA umgeschrieben,
genannt cDNA (copyDNA), welche daraufhin in die PCR-Reaktion eingesetzt wird.
Gesamt-RNA wird mit Hilfe der Guanidinium-Thiozyanat-Methode (Rneasy Kit,
Qiagen, nach Herstellerangaben) isoliert und die Ausbeute photometrisch bestimmt.
Hierzu wird 1 µl der RNA in 99 µl RNase freies Wasser gegeben und dann die
Absorption sowohl bei 260 als auch bei 280 nm Wellenlänge gemessen. Bei einer
Absorption von 260 nm wird die Menge an Nukleinsäure bestimmt, bei 280 nm die
Menge an Proteinen. Der Quotient aus der Absorption bei 260 nm zu 280 nm ist ein
Maß für die Reinheit der RNA. Eine Verunreiniung durch Proteine führt zu einem
niedrigeren Quotienten. Hinreichend reine RNA liegt vor, wenn das Ergebnis
zwischen 1,4 und 1,8 liegt. Um die Konzentration zu bestimmen, wird der
Absorptionswert bei 260 nm mit dem Verdünnungsfaktor (hier 100) und dem Faktor
40 multipliziert. Als Ergebnis erhält man die RNA-Konzentration in µg/ml.
Um evtl. noch vorhandene genomische DNA zu entfernen, wird an die RNA-Isolation
ein DNA-Verdau angeschlossen. Hierzu wird pro 30 µg RNA 1 µl DNAseI (entspricht