Untersuchungen zur Bedeutung mesenchymaler Stammzellen in ...

- 36 -
Material und Methoden
erfolgen zu lassen (Extension). Diese Schritte werden 35 mal wiederholt und zwar bei
folgenden Temperaturen (der Deckel des Thermocyclers wird zuvor auf 95°C
aufgeheizt):
Denaturierung: 95°C 1 Minute
Annealing: X °C 1 Minute 35 Zyklen
Extension: 72°C 1 Minute
Finale Extension: 72°C 10 Minuten
Die Annealing-Temperatur variiert je nach Primerzusammenstellung. Hierbei spielen
sowohl die Menge an G – C –Paaren, als auch die Anfangs- und Endbasen der
Primer eine Rolle. Im Folgenden sind die Annealing-Temperaturen [und Größen] für
die jeweiligen spezifischen Produkte aufgeführt:
HGF: 54°C [266 bp]
c-met: 60°C [440 bp]
tPA: 69°C [347 bp]
uPA: 54°C [341 bp]
uPAR: 56°C [152 bp]
PAI: 55°C [662 bp]
Plasminogen: 54°C [125 bp]
TLR4: 60°C [94 bp]
CD14: 57°C [75 bp]
Zur Größenbestimmung des PCR-Produktes werden jeweils zu 15 µl Produkt 5 µl
loading buffer gegeben und das Gemisch dann in die Slots eines Agarosegels (2%
Agarose in 1 x TBE Puffer aufkochen und in die Gelvorrichtung mit Kamm gießen
und aushärten lassen) gegeben. Das Gel wird in ethidiumbromidhaltigem TBE-Puffer
liegend, für ca. 50 Minuten an ein elektrisches Feld angeschlossen (100 mV). Nach
der Größenauftrennung können die entstandenen Banden im uv-Licht sichtbar
gemacht werden. Als Größenkontrolle wird neben den Proben eine 100bp Leiter
aufgetragen (5 µl in 20 µl Gesamtvolumen).