Untersuchungen zur Bedeutung mesenchymaler Stammzellen in ...

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Material und Methoden
2.2.1.2 Real-Time-PCR
Der LightCycler kombiniert einen PCR-Thermocycler, eine Fluoreszenzdetektions-
Einheit, sowie die Möglichkeit, die Ergebnisse online am Computer zu verfolgen. Für
einen LightCycler-Reaktionsansatz benötigt man, im Gegensatz zur herkömmlichen
PCR, SYBR Green, sowie spezielle Glaskapillaren. Das SYBR Green enthält neben
der Polymerase und den dNTPs einen Farbstoff, der ausschließlich doppelsträngige
DNA markiert. Ein typischer Reaktionsansatz sieht folgendermaßen aus:
• 2 µl SYBR Green (inklusive Polymerase, dNTPs und Puffer)
• 2,4 µl MgCl2
• 0,5 µl Primer 3´ (10 pmol)
• 0,5 µl Primer 5´ (10 pmol)
• 12,6 µl H2O
• 2 µl cDNA
Der Reaktionsansatz wird in eine Glaskapillare pipettiert und bei 3000 upm in einer
Eppendorfzentrifuge 15 Sekunden abzentrifugiert. Daraufhin werden die Kapillaren in
den Rotor des LightCyclers gestellt und die Reaktion gestartet. Folgende
Temperaturänderungen werden durchlaufen:
• 95°C, 30 Sekunden
• 95°C, 3 Sekunden, Denaturierung
• 60°C, 5 Sekunden, Annealing 40 Zyklen
• 72°C, 16 Sekunden, Extension
Neben dem zu amplifizierenden Genabschnitt, für den die spezifischen Primer
zugegeben werden, muß für jede eingesetzte cDNA auch eine ß-Aktin PCR im
LightCycler durchgeführt werden. Außerdem muß mit einer cDNA und den ß-Aktin-
Primern eine Standard-Kurve erstellt werden, wobei die cDNA einmal unverdünnt,
einmal 1:10 verdünnt und einmal 1:100 verdünnt eingesetzt wird. Dies ist notwendig,
um die Menge der eingesetzten cDNAs in Relation zueinander zu setzen, was eine
relative Quantifizierung des gewünschten Produktes ermöglicht. Dazu wird der am
Ende der Reaktion von der Software angegebene Wert der ß-Aktin cDNA durch die
unverdünnte Standard cDNA dividiert und der entstehende Faktor mit dem Wert der
cDNA des gewünschten Genabschnittes multipliziert. Dies gilt nicht für gleiche
cDNAs in unterschiedlichen Reaktionsansätzen.
Für jedes neue Primerpaar muß neben der Annealing-Temperatur auch die
Meßtemperatur eingestellt werden. Bei Erreichen der Meßtemperatur wird die in