Öffnen - eDiss - Georg-August-Universität Göttingen

das Resultat unter UV-Licht begutachtet und mit einer Digitalkamera dokumentiert.
Auch die DNA-Amplifizierungsprodukte wurden gemäß obigem Schema mit Hilfe
der Agarose-Gelelektrophorese kontrolliert, bevor die Fragmentlängenbestimmung
erfolgte. Aufgrund der geringen Größe der Amplifizierungsprodukte betrug die
Agarose-Konzentration hier nur ca. 2%.
3.2.3 Amplifizierung von Mikrosatelliten-Sequenzen
Insgesamt wurden acht derzeit verfügbare und erprobte Mikrosatelliten-Marker für
die Untersuchung der Vogelkirsche verwendet. Dabei wurden sechs SSRs (UDP96-
005, UDP98-021, UDP98 -410, UDP98-412, BPPCT034 und BPPCT040) zur Beschreibung
populationsgenetischer Strukturen und weitere zwei SSRs (UDP96-001
und UDP98-411) bei Bedarf bei Vaterschaftsanalysen eingesetzt. Die Primer-Sequenzen,
die Wiederholungssequenzen sowie die Anlagerungstemperaturen sind in
Tabelle 3.4 dargestellt.
Die Amplifikation wurde in einem PTC-200 (MJ Research) durchgeführt. Für die
später erfolgende rechnergestützte Kapillarelektrophorese wurden floureszenzmarkierte
Primer mit zwei Farbstoffen (grün (HEX) und blau (FAM)) verwendet (siehe
Tabelle 3.4). Dadurch war es möglich, die Amplifizierungsprodukte zweier Mikrosatelliten-Loci
gleichzeitig zu analysieren (Multiplex-System). Die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) erfolgte in einem Reaktionsvolumen von 10 μl. Darin enthalten
waren 10 ng DNA-Templat, 1.5 mM MgCl 2 , 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 50 mM KCl,
0.15 mM der einzelnen Nucleotide (dNTPs) (QIAGEN), 0.5 Einheiten des Enzyms
HotStar-Taq TM DNA-Polymerase (QIAGEN) sowie 0.2 μM der jeweiligen
Primer. Der Ablauf der Amplifizierungsreaktion sah wie folgt aus:
Zykluszahl
1 X
Temperatur
95 °C
Dauer
15 min
30 X
94 °C
1 min
Annealing-Temp. 0.5-1 min
72 °C 1 min
3.2.4 Die Kapillarelektrophorese
1 X 72 °C 12 min
Die PCR-Produkte wurden zunächst verdünnt im Verhältnis von 1:250 bis 1:500.
Zu 2 μl dieser Verdünnung wurden 12 μl Hi-Di Formamid gegeben, worin ein interner
Längenstandard (GS 500 ROX) enthalten war. Die Proben wurden anschließend
bei 95°C für 2 min denaturiert und auf Eis gestellt.
Danach wurden die Amplifizierungsprodukte auf dem ABI PRISM 3100 Genetic
Analyser (Applied Biosystems/HITACHI) visualisiert und mit den Computerprogrammen
GeneScan 3.7 und Genotyper 3.7 analysiert.
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