Word-Dokument Diss. komplett zusammengefasst - OPUS Bayreuth ...

Material und Methoden 40
2.9.2 Herstellen von Verdünnungsreihen zur Anreicherung des Endosymbionten
Alle Verdünnungsreihen, die mit Käferhomogenisat beimpft wurden, bestanden aus neun
27 ml-Glas-Kulturröhrchen, in die jeweils 9,0 ml des entsprechenden Anreicherungsmediums
(alle unter 2.8.2 aufgeführten Flüssigmedien) eingefüllt wurden. Die Röhrchen wurden
anschließend mit Aluminiumkappen verschlossen und autoklaviert. Verdünnungsreihen
hingegen, die mit Ei-Homogenisat beimpft wurden, bestanden aus neun sterilen 2 ml-
Eppendorf-Reaktionsgefäßen, die mit 0,9 ml des entsprechenden sterilen Flüssigmediums
befüllt wurden (siehe 2.8.2).
Die Verdünnung beider Homogenisate erfolgte in 1:10er Schritten. Dabei wurden im Falle
des Käferhomogenisats (siehe 2.9.1) 1,0 ml mit einer sterilen Pipettenspitze in das erste
Kulturröhrchen mit 9,0 ml Anreicherungslösung überführt, welches dann auf einem
Wirbelmischer ca. 30 Sekunden lang gut durchmischt wurde (Verdünnungsstufe 10 -1 ). Aus
diesem Röhrchen (10 -1 ) wurden erneut 1,0 ml steril entnommen, in das nächste
Kulturröhrchen überführt und wieder gut durchmischt (Verdünnungsstufe 10 -2 ). In dieser
Weise wurde so lange fortgefahren, bis schließlich die Verdünnungsstufe 10 -9 erreicht war.
Analog wurde mit dem Ei-Homogenisat verfahren. Das Volumen lag hier jedoch eine
Zehnerpotenz niedriger.
Von allen Verdünnungsstufen der beiden mit Käfer- bzw. Ei-Homogenisat beimpften
Pepton-Salz-Verdünnungsreihen (anschließend für weitere Untersuchungen zusammen mit
allen anderen Verdünnungsreihen bei 37°C inkubiert; siehe 2.9.4) wurden sofort 100 µl auf
alle unter Punkt 2.8.1 als Universalmedium aufgeführten Plattenmedien aufgebracht. Die
Suspension wurde anschließend mit einem Drigalsky-Spatel, welcher zuvor abgeflammt
wurde, mit kreisenden Bewegungen vorsichtig in das jeweilige Medium eingearbeitet. Alle
diese Arbeiten wurden unter einer Sterilbank durchgeführt.
Die mit dem Bakterienmaterial beimpften Platten wurden anschließend in einen
Inkubationsschrank gestellt und bei 37ºC für 24-72 Stunden - je nach Zellwachstum -
bebrütet. Beimpfte Medien für Anaerobier wurden in einem Anaerobentopf unter
Sauerstoffausschluss ebenfalls bei 37°C für 24-72 Stunden inkubiert. Von bewachsenen
Platten (aerob und anaerob) wurden optisch unterschiedliche Kolonien (Farbe und Struktur
der Kolonien, Zellmorphologie) einer jeden Verdünnungsstufe auf frischen, geviertelten
Platten des entsprechenden Mediums vereinzelt. Nach einer erneuten Bebrütungsdauer von
24-72 Stunden bei 37°C wurden die gewachsenen, vereinzelten Kolonien auf alle unter 2.8.1
aufgeführten hemmstoffhaltigen Selektivmedien überimpft, die anschließend wiederum bei