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Material und Methoden 66
NON338
Pae444
Jede Probe wurde nun mit je 9 µl Hybridisierungspuffer (0,9 M NaCl; 20 mM Tris-HCl, pH
8,0; 0-80% Formamid, deionisiert; autoklaviertes Millipore-Wasser ad 2 ml; 0,01% SDS) und
1 µl Sonde überschichtet. Nun wurden die Objektträger vorsichtig in ein steriles, mit Zellstoff
ausgelegtes 50 ml-Zentrifugenröhrchen (VWR, Deutschland) gegeben, wobei der Zellstoff
mit dem restlichen Hybridisierungspuffer überschüttet wurde. Die Hybridisierung fand
anschließend in einem Wärmeschrank bei konstanten 46°C für mindestens 2 Stunden statt.
Währenddessen wurde der Waschpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 3,5-900 mM NaCl; 1,75-5
mM EDTA; autoklaviertes Millipore-Wasser ad 50 ml; 0,01% SDS) in 50 ml-
Zentrifugenröhrchen hergestellt und im Wasserbad auf 48°C vorgewärmt.
Nach erfolgter Hybridisierung wurden die Hybridisierungsröhrchen geöffnet und das
Hybridisierungspuffer-Sondengemisch von den Objektträgern mit wenig vorgewärmtem
Waschpuffer abgespült. Die Objektträger wurden rasch in die Waschpuffer-Gefäße überführt,
für 15 Minuten im Wasserbad bei 48°C gewaschen und anschließend vorsichtig mit
Millipore-Wasser abgespült und luftgetrocknet.
Nun wurden pro hybridisiertem Probenfeld 10 µl DAPI-Lösung (1 µg/ml) aufgetragen und
die Objektträger für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Schließlich wurden sie mit reichlich
Millipore-Wasser abgespült, mit etwas Ethanol (70%) nachgewaschen und luftgetrocknet. Um
die hybridisierten Zellen vor dem Ausbleichen zu schützen, wurden die Objektträger mit
einem dünnen Film des Mounting-Mediums Vectashield (AXXORA, Deutschland)
überschichtet und mit einem Deckglas (24x60 mm; Roth, Deutschland) abgedeckt.
Formamidkonzentration:
0-80%
EUB338I/II/III
Abb. 18: Verteilung der Proben auf den diagnostischen Objektträgern. Felder 1-3 wurden mit fixierten,
aus Anhangsdrüsen isolierten Endosymbionten-Zellen und Felder 5-7 mit fixierten Zellen von
Pseudomonas aeruginosa beschickt und mit den drei Sonden hybridisiert.