Word-Dokument Diss. komplett zusammengefasst - OPUS Bayreuth ...
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Material und Methoden 68<br />
fixierte Zellen des Symbionten (Gewinnung siehe 2.9.12) und von Pseudomonas aeruginosa<br />
mit verschiedenen Kombinationen der beiden Sonden (siehe Abb. 19) unter ansteigender<br />
Stringenz (0-80% Formamid) hybridisiert (Vorgehensweise siehe 2.10.7.2). Als<br />
Negativkontrolle wurden fixierte Zellen von Escherichia coli unter denselben Bedingungen<br />
mithybridisiert.<br />
Pae444Cy3<br />
cPae444Cy3 +<br />
Pae444 (1:1)<br />
Pae444Cy3<br />
Stringenz: 0-80%<br />
Endosymbiont:<br />
Felder 1-3<br />
P. aeruginosa:<br />
Felder 5-7<br />
E. coli:<br />
Felder 4 und 8<br />
cPae444Cy3<br />
Pae444Cy3 +<br />
cPae444 (1:1)<br />
cPae444Cy3<br />
Abb. 19: Verteilung der Proben auf den neun diagnostischen Objektträgern. Felder 1-3 wurden mit<br />
fixierten, aus Anhangsdrüsen isolierten Endosymbionten-Zellen, Felder 5-7 mit fixierten Zellen von<br />
Pseudomonas aeruginosa und Felder 4 und 8 mit fixierten Zellen von Escherichia coli beschickt und mit<br />
den zwei Sonden hybridisiert.<br />
Nun wurden auf jedem der acht Felder für jede Formamidkonzentration mindestens 300<br />
hybridisierte Zellen von willkürlich ausgewählten Bereichen (1000-fache Vergrößerung mit<br />
Immersionsöl) ausgezählt und ins Verhältnis mit DAPI-fluoreszierenden Zellen der<br />
entsprechenden Bereiche gesetzt. Anhand der errechneten Durchschnittswerte für jede<br />
Stringenz konnte schließlich die optimale Hybridisierungstemperatur (50% der Sonde sind<br />
dissoziiert) für die Endosymbionten-Sonde erhalten werden.<br />
2.10.7.5 Verwendete Lösungen<br />
Für die vollständige Zusammensetzung der im Folgenden aufgeführten Lösungen, die für<br />
die FISH benötigt wurden, siehe Anhang 2.
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