Inaugural Dissertation - Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg

1. Einleitung
1.1. Motivation
Jegliche Form lebender Organismen basiert auf einem komplexen Zusammenschluss einzelner Zellen
und auf ihrer Wechselwirkung im Zellverband. Daher ist man im Bereich der Lebenswissenschaften von
jeher an dem Verständnis dieser Grundbausteine und ihrer einzelnen Kompartimente interessiert. Die
Gößenordnung von Zellen liegt im Mikrometerbereich, weshalb die Mikroskopie seit ihrer Entdeckung
eine wesentliche Rolle bei der Erweiterung der Kenntnisse über zellinterne Strukturen spielt. Die erreichbare
Auflösung ist jedoch bei optischer Fernfeld-Mikroskopie aufgrund der Wellennatur des Lichts durch
die Beugung begrenzt. Diese Auflösungsgrenze, die bereits im Jahr 1873 von Ernst Abbe [Abb73] theoretisch
beschrieben wurde, ist proportional zur Hälfte der Wellenlänge der elktro-magnetischen Strahlung.
Eine Möglichkeit, die Auflösung abbildender System zu verbessern, besteht demnach darin, die Wellenlänge
der Strahlung zu verringern. Dieser Ansatz wird bei der Elektronenmikroskopie verfolgt. Die
Wellenlänge von Materiewellen ist abhängig von ihrem Impuls. Damit lassen sich in der Elektronenmikroskopie
Auflösungen im einstelligen Angström-Bereich erzielen, was in der Größenordnung einzelner
Moleküle liegt. Für eine Vielzahl biologischer Fragestellungen besitzt die Elektronenmikroskopie (EM)
jedoch einige Nachteile gegenüber optischer Mikroskopie. So erfodert sie das Betrachten der Probe im
Vakuum und ist bei Transmissions-EM auf sehr dünne Zellschnitte beschränkt, was die Analyse strukturell
intakter Systeme sowie dynamischer Prozesse ausschließt. Somit bestand auch nach der Entwicklung
der Elektronenmikroskopie noch der Bedarf an alternativen optischen Mikroskopieverfahren. Zumal bereits
in einem Größenbereich, welcher geringfügig unterhalb der klassischen Auflösungsgrenze liegt,
biologisch ungeklärte Fragen auftreten.
Der mit klassischer optischer Durchlichtmikroskopie erreichbare Kontrast ist von intrinsischen absorbierenden
Eigenschaften der Probe abhängig. Zur Beobachtung von Objekten mit geringem Amplitudenkontrast
wurde die Phasenkontrastmikroskopie entwickelt. Aber auch hierbei lässt sich der Kontrast einzelner
Zellkompartimente nicht beeinflussen. Erst die Entwicklung der Fluoreszenzmikroskopie machte
es möglich, einzelne zellinterne Strukturen mit fluoreszenten Farbstoffen zu markieren, sie mit Laserlicht
der entsprechenden Absorptionswellenlänge zur Fluoreszenz anzuregen und mit sensitiven Kameras zu
detektieren. Das bestehende Interesse an Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie zeigt sich an der Tatsache,
dass die Verfahren zur spezifischen Fluoreszenzmarkierung biologischer Strukturen konsequent
weiterentwickelt wurden. So ermöglicht die Fluoreszenz In-Situ-Hybridisierung (FISH) zum Beispiel
die direkte Markierung von spezifischen Gensequenzen der DNA [BFA95], [SBW96]. Damit kann durch
gentechnische Veränderungen die Zelle dazu veranlasst werden, das zu beobachtende Protein mitsamt
der Fluoreszenzmarkierung selbst herzustellen. Diese Methode erspart das Einbringen fluoreszenter Proteine
von außen in die Zelle [LSP03]. Ermöglichen diese Fortschritte die Fluoreszenzmarkierung einzelner
Moleküle, so verlangen sie optische Abbildungssysteme, die diese Strukturen auflösen können. Im
nächsten Abschnitt werden verschiedene Verfahren vorgestellt, mit denen Strukturen untersucht werden
können, deren Größe unterhalb der konventionellen Beugunsgrenze liegt.
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