Inaugural Dissertation - Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg

2.3. Fluoreszenz
(a)
(b)
Abbildung 2.2.1.: (a) k x -k z -Schnitt einer konfokalen Optischen Transferfunktion (OTF)(b) 3d-
Simulation einer OTF bei Weitfeld-Detektion. Die OTF gibt an welche Raumfrequenzen durch das optische
System übertragen werden (Achsen um 2, 2 · 10 −4 nm −1 skaliert) [Gun11].
kontrast (in der Phasenkontrastmikroskopie) des Präparates, gezielt bestimmte Proteine innerhalb der
Zelle zu markieren und zu untersuchen. Der hierbei zugrundeliegende Prozess [CSW07], [VWS02] ist
in dem vereinfachten Jablonski-Energiediagramm in Abbildung 2.3.1 schematisch dargestellt. Die quantenmechanisch
erlaubten Übergänge sind mit Pfeilen markiert. Bei Einfall eines Photons, dessen Energie
der Energiedifferenz zwischen dem Grundzustand S 0 und einem der energetisch höher liegenden Schwingungszustände
S 1 entspricht, kann dieses absorbiert werden, indem das Farbstoffmolekül von S 0 in den
entsprechenden Energiezustand S 1 übergeht. Für die Energie des Photons muss demnach die Bedingung
∆E = hν erfüllt sein. Diese Absorption erfolgt innerhalb von Femtosekunden. Bei Zimmertemperatur
gibt das Molekül innerhalb von Picosekunden durch Stöße Energie an Nachbarmoleküle oder Atome ab
und relaxiert in den energieärmsten Schwingungszustand von S 1 . Von dort kann es über den umgekehrten
Prozess durch spontane Emission eines Fluoreszenzphotons in einen beliebigen Schwingungszustand
von S 0 zurückkehren. Hierbei entspricht die Energie des emittierte Photons wiederum der Energiedifferenz
der beiden beteiligten Energieniveaus. Der Prozess dieser spontanen Emission erfolgt im Bereich
von Nanosekunden, wohingegen die Relaxation aus einem S 0 -Schwingungszustand in den Grundzustand
innerhalb von Picosekunden geschieht. Durch den durch Stöße erfolgten Energieverlust, besitzt das emittierte
Photon eine etwas geringere Energie als das einfallende Photon. Diese Energiedifferenz zeigt sich
in der Rotverschiebung des Emissionslichts um ca. 20-50nm gegenüber dem Anregungslicht. Dieser als
Stokes-Verschiebung bezeichnete Effekt wird in der Fluoreszenzmikroskopie dazu verwendet, um das
Fluoreszenzlicht vor der Detektion mit entsprechenden dichroitischen Filtern spektral vom Anregungslicht
zu trennen.
Neben der spontanen Emission eines Photons existieren noch strahlungslose Übergänge. Das Molekül
kann entweder über innere Konversion (IC) vom S 1 -Zustand in den Grundzustand zurückkehren oder
über das sogenannte Inter System Crossing (ISC) in den Triplettzustand T 1 übergehen, der aufgrund der
quantenmechanischen Auswahlregeln nicht direkt vom Grundzustand aus erreichbar ist. Von dort gibt es
wiederum die Möglichkeit des strahlungsfreien Übergangs durch ISC zurück in den Grundzustand oder
der Übergang unter Aussendung eines Phosphoreszenz-Photons. Aufgrund dieser alternativen Prozesse
zur Fluoreszenz liegt die Quanteneffizienz der Fluorophore bei einem Wert von η ≈ 0, 8.
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