Inaugural Dissertation - Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg

2.4. Hochauflösende Mikroskopiemethoden
ab. Nimmt man eine Transmission durch das Objektiv von 85% an, schätzt die durch die Tubuslinse
mit 90% ab, nimmt den für Interferenzfilter typischen Wert der Transmission von 95% und geht von
einer Quanteneffizienz der CCD-Kamera von 90% aus, so ergibt sich, dass nur ungefähr 10% aller
emittierten Photonen von der Kamera detektiert werden. Abbildung 2.4.10 zeigt den Zusammenhang
zwischen Anzahl detektierter Photonen und Lokalisationsgenauigkeit für typische Werte der Detektion.
Man bedenke aber, dass diese Einschränkung für jegliche Techniken der Fluoreszenzmikroskopie, die
mit vergleichbarem Detektionsstrahlengang arbeiten, gelten. Bei verbreiteten Fluorophoren liegt die
Photonenausbeute pro Molekül bei ca. 10 6 Photonen. Dabei ist zu beachten, dass dieser Wert sowohl
vom Farbstoff als auch von dessen Mikroumgebung abhängt [TM01].
Abbildung 2.4.10.: Zusammenhang zwischen Anzahl detektierter Photonen und Lokalisationsgenauigkeit
für 250nm FWHM der PSF, 65nm Pixelgröße und 30% Rauschen [TLW02].
Der Vorteil der Lokalisationsmikroskopie gegenüber anderen hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie-
Techniken ist die Kenntnis der Positionen der Einzelmoleküle. Eine zusammenfassende Darstellung
des Prozesses der Lokalisationsmikroskopie von der Datenaufnahme bis hin zur Datenanalyse ist in
Abbildung 2.4.11 zu sehen. Bei der Datenaufnahme wird die fluoreszenzmarkierte Probe mithilfe von
Schrittmotoren und einem Objektpiezo in den Fokus des hochnumerischen Objektivs gebracht. Die
Intensität des Anregungslichts (in Abb. 2.4.11 von rechts kommend) wird durch die Linse L1 erhöht,
um die Fluorophore in den reversiblen Dunkelzustand zu bringen. Das durch den Dichroiten DM1 vom
Anregungslicht getrennte Fluoreszenzlicht wird von einer hochsensitiven CCD-Kamera detektiert. Der
komplette bei den Messungen verwendete optische Aufbau wird in Kapitel 5.1 detailliert vorgestellt.
Von der Probe wird ein zeitlicher Bilddatenstapel aufgenommen und kann an die Bildverarbeitungssoftware
übergeben werden. Diese bestimmt in jedem Einzelbild die Positionen der nacheinander
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