Inaugural Dissertation - Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg

2.4. Hochauflösende Mikroskopiemethoden
nach D* ist prinzipiell möglich, ist aber aufgrund der pH-Abhängigkeit und des Anregungsspektrums
unwahrscheinlich. Der reversibel gebleichte Zustand B kann entweder direkt in den fluoreszierenden
Grundzustand D zurückkehren, oder aber zuerst in den angeregten reversibel gebleichten Zustand B*
übergehen, um dann in den fluoreszenten Grundzustand überzugehen. Zweiteres ist wahrscheinlicher,
da die Regeneration durch Bestrahlung beschleunigt wird.
Abbildung 2.4.9.: Modell der Zustände und ihrer Übergänge eines fluoreszierenden Proteins nach
[SVHS05]).
Lokalisationsmikroskopie mit konventionellen Fluorophoren
Im Jahr 2008 wurde der Effekt des reversiblen Photobleichens erstmals in der Lokalisationsmikroskopie
ausgenutzt. Seitdem wurden bereits eine ganze Reihe von Arbeiten zu dieser Weiterentwicklung von
SPDM veröffentlicht [PGB + 08], [LGW + 09], [KLG + 09b], [BDK + 10]. Auch Zweifarben-Messungen
wurden bereits mit dieser Methode verwirklicht [GER + 09]. Bei dieser Methode werden die Fluorophore
durch Bestrahlung mit einer im Vergleich zur konventionellen Fluoreszenzmikroskopie erhöhten Laserleistung
in langlebige Dunkelzustände gebracht [DCTM97], [HFD + 08], [SVHS05], [MZD + 05]. Hierbei
liegen die erforderlichen Leistungsdichten der Anregungsstrahlung im Bereich von einigen kW/cm 2 .
Dieser Übergang funktioniert ebenfalls mit zwei-Photonen-Anregung [CDC + 05]. Das in Abbildung
2.4.9 gezeigte Modell der Übergänge fluoreszenter Proteine kann durch das Übergangsschema zwischen
den drei Zuständen fluoreszent (M f l), reversibel gebleicht (M r b) und irreversibel gebleicht (M i b) vereinfacht
dargestellt werden. Für die Übergänge zwischen den drei Zuständen gilt die Beziehung:
k fl ,k rb
M rb ⇌
k
M
bl
fl → Mib (2.4.14)
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