Inaugural Dissertation - Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg

4. Nanoskopie mit fokussierter Beleuchtung:
4Pi Mikroskopie
4.1. Messungen an fluoreszenten Nanokugeln
Die durch die Nebenmaxima entstehenden sogenannten ’Geisterbilder’, die typisch für 4PI-Bilder sind,
können theoretisch mithilfe von Entfaltung entfernt werden. Bedingung für ein vollständiges Entfernen
der Nebenmaxima ist zum einen eine maximale relative Höhe der Nebenmaxima von ∼45% (vom
Hauptmaximum) und zum anderen im Idealfall auch die gleiche Höhe der beiden Nebenmaxima.
Messungen von fluoreszenten Nanokugeln (Beads) zeigten, dass diese Bedingungen in der experimentellen
Realität nicht einfach zu erfüllen sind. Selbst bei sorgfältiger Probenpräparation mit Anpassung
des Brechungsindexes des Einbettungsmediums können lokale Änderungen des Brechungsindexes nicht
komplett vermieden werden und führen zu lateralen und axialen Phasendifferenzen. Zur Kompensation
des axialen Phasenschubs implementierte Leica eine zusätzliche Phasenkompensation. Die zusätzliche
Justage der Phasenkompensation zur ohnehin zeitaufwendigen 4PI-Justage vor dem Start der eigentlichen
Messung führt zu einem weiteren Ausbleichen der Probe, was nicht akzeptabel ist. Dies muss auch
vor dem Hintergrund des ohnehin höheren Ausbleichproblems von fokussierenden Abbildungsverfahren
im Vergleich zu Weitfeldbeleuchtung gesehen werden. Des Weiteren bringt das für die Anpassung des
Brechungsindexes nötige Einbettungsmedium TDE (Thiodiethanol; für Ölobjektive) eine geringere
Effizienz der Fluoreszenz vieler gemeinhin gebräuchlichen Fluoreszenzfarbstoffe mit sich [SLM + 07].
Bei der Auswertung der 4Pi-Aufnahmen einer grün fluoreszierenden Nanokugel (Abb. 4.1.1) zeigt
sich der laterale Phasenschub daran, dass sich das Verhältnis von linken zu rechtem Nebenmaximum
innerhalb von acht y-Schritten von 1,5 auf 0,7 ändert (Tabelle 4.1.1). In allen drei y-Ebenen können die
Nebenmaxima durch 5-Punkt-Entfaltung entfernt werden (Abb. 4.1.1 rechte Spalte). Die unterschiedlich
hohen Nebenmaxima führen jedoch zu Artefakten bei der Entfaltung. Die an das Hauptmaximum
angepassten Gaussfunktionen zeigen Halbwertsbreiten von minimal 155 ±7nm vor und 149 ±7nm
nach der Entfaltung. Es zeigt sich, dass sich die Halbwertsbreite durch die Entfaltung um mehrere zehn
Nanometer ändern kann.
Abbildung 4.1.2 zeigt die mit einem Blurfilter bearbeitete 4Pi-Aufnahme eines 100nm großen grün fluoreszierenden
Beads, welcher mit auf Ölimmersion korrigierten Objektiven und Einphotonen-Anregung
aufgenommen wurde. Die Halbwertsbreite des Hauptmaximums von ca. 110nm macht deutlich, dass
4Pi-Mikroskopie mit Ölobjektiven und Einphotonen-Anregung prinzipiell möglich ist. Die in diesem
Fall hohen Nebenmaxima von 70 bzw. 81% machten jedoch eine Entfaltung unmöglich.
An 4Pi-Aufnahmen von sechs Mikrometer großen Beads wurde neben dem lateralen auch der axiale
Phasenschub untersucht. Abbildung 4.1.3 zeigt die 4Pi-Bilder eines 6µm großen Beads an drei unterschiedlichen
y-Positionen sowie die zugehörigen axialen Intensitätsprofile durch die Mitte des Beads.
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